космического эксперимента - Координационный научно

Научно-техническое обоснование
космического эксперимента
«Оптимизация свойств бактериальных штаммов-продуцентов путём экспозиции в
условиях орбитального космического полёта и последующей наземной селекции»
Шифр: «ПРОДУЦЕНТ»
1.Сущность исследуемой проблемы. Краткая история и состояние вопроса.
Рекомбинантные штаммы бактерий, как правило, содержат ген целевого продукта в
составе автономных генетических элементов (плазмид) под контролем бактериальных
регуляторных элементов. Это обеспечивает высокую продуктивность за счёт большого
числа копий гена на клетку (копийности плазмиды) и контроль продуктивности в ходе
культивирования. Однако эти же особенности рекомбинантных штаммов определяют
некоторые их недостатки. Плазмидные ДНК распределяются между дочерними клетками
при делении случайным образом, что может приводить к снижению числа копий или даже
полной потере плазмиды и, соответственно, к снижению продуктивности штамма. Для
плазмид также более высока вероятность рекомбинационных событий, чем для
хромосомных генов. Это может приводить к повреждению или полной элиминации гена
целевого продукта или регуляторных элементов, необходимых для его экспрессии.
Бактериальные регуляторные элементы не обеспечивают строгого ограничения синтеза
целевых белков. В определённых условиях, в частности, на поздних стадиях
культивирования наблюдается спонтанный синтез («утечка» промоторов). Многие
чужеродные белки токсичны для бактериальной клетки, поэтому спонтанный их синтез
приводит
к
ухудшению
рекомбинантных
штаммов
ростовых
(явление
характеристик
и
отрицательной
снижению
автоселекции).
продуктивности
В
связи
с
вышеизложенным постоянная селекционная работа является обязательным элементом
технологии при использовании рекомбинантных штаммов-продуцентов в производстве.
Наиболее
изученным
аспектом
действия
микрогравитации
на
культуры
микроорганизмов является изменение ростовых характеристик в жидких культурах. В
ранний период космических исследований ряд исследователей сообщили, что под
действием экспозиции в течение нескольких дней в условия микрогравитации скорость
роста B.subtilis [2] и E.coli [3] возрастает. Поскольку вывод был сделан на основании
анализа на Земле по окончании экспериментов, длительность которых существенно
превышала продолжительность фазы роста бактерий, этот вывод нельзя считать
однозначным.
Последующие более углублённые исследования показали, что на скорость роста
экспоненциально растущих культур бактерий микрогравитация не влияет [4]. В то же
время значительно сокращается lag-период [5,6] и увеличивается продолжительность
экспоненциальной фазы роста [6,7]. В результате существенно растёт конечная
концентрация бактерий в суспензионной культуре [4-7]. Резко повышается также
жизнеспособность бактериальных клеток в стационарной культуре [8], причём явление
автолиза проявляется только после нескольких месяцев экспозиции культур в условиях
микрогравитации.
В экспериментах на станции «Мир» («Максат», «Биоконт») в течение 1993-1997 г.г.
были получены данные об увеличении числа живых клеток в культурах Escherichia coli,
подвергнутых инкубации в условиях орбитального полета [9,10]. В активной фазе роста
наблюдалось усиление роста культур, в период старения культуры повышалась
выживаемость клеток. При работе с рекомбинантными штаммами в отдельных случаях
наблюдалось значительное снижение ростовых коэффициентов культур, что объяснялось
усилением спонтанного синтеза рекомбинантных белков и их токсическим действием на
клетки продуцента. Кроме того, было показано, что в условиях орбитального полета
стабильность рекомбинантных плазмид имела тенденцию к повышению. Вероятно, этот
эффект вызван увеличением копийности (амплификацией) плазмид в период активного
роста культуры в условиях микрогравитации. Для культур некоторых штаммовпродуцентов в стационарной фазе, напротив, наблюдалось ускоренное старение и гибель
клеток, имеющих наибольшее число копий плазмиды и, соответственно, синтезирующих
наибольшее количество рекомбинантного белка.
Анализ полученных результатов привёл к выводам, аналогичным приведённым
выше [6,7], за одним существенным уточнением. Отсутствие седиментации и
конвекционного перемешивания в невесомости приводит к замедлению массопереноса
[1]. Вследствие этого в условиях орбитального полёта замедляется как поступление к
клеткам питательных веществ, так и скорость отвода вредных метаболитов. В результате
фаза экспоненциального роста культур должна быть ограничена временем исчерпания
питательных веществ в ближнем окружении бактериальной клетки и/или временем
накопления в этом окружении токсичной концентрации продуктов её жизнедеятельности.
В то же время продолжительность периода, за который исчерпываются запасы
питательных веществ во всем объёме культуры, существенно возрастает. Таким образом,
в
условиях
микрогравитации
увеличится
продолжительность
не
столько
экспоненциальной
метаболической
фазы
фазы,
роста,
в
сколько
основном
за
общая
счёт
продолжительность
удлинения
периода
активной
перехода
от
экспоненциальной к стационарной фазе.
Известно, что в период перехода микробных культур в стационар ослабевают
механизмы контроля некоторых биосинтетических процессов. Увеличивается уровень
спонтанной
экспрессии
индуцибельных
генов
за
счет
ослабления
действия
соответствующих репрессоров. Репликация плазмидных ДНК продолжается некоторое
время после остановки репликации хромосомы. В результате наблюдается амплификация
плазмид: увеличение среднего числа копий плазмидной ДНК на клетку. Эти явления
полностью объясняют результаты, которые наблюдались в космических экспериментах с
рекомбинантными штаммами бактерий.
В рамках выполнения программы «ОЧБ» путём проведения серии КЭ и
последующей наземной селекции был получен штамм – суперпродуцент Cu,Znсупероксиддисмутазы человека с уровнем синтеза целевого продукта не менее 1 г на литр
культуры.
Очевидно, что для любого рекомбинантного штамма микроорганизмов могут быть
подобраны условия, при которых экспозиция в условиях орбитального полета приведет к
увеличению числа копий плазмиды, кодирующей синтез рекомбинантного белка, по
крайней мере, в части клеток популяции. Полагаем также, что это свойство может быть
закреплено последующей селекцией на Земле. Это означает, что инкубацию в условиях
орбитального полета с последующей селекцией на Земле можно использовать в качестве
метода получения линий штаммов - продуцентов с повышенным числом копий плазмид,
контролирующих синтез целевых продуктов. Это приведет к улучшению, по крайней
мере, двух характеристик штаммов - продуктивности и генетической стабильности.
Основным фактором воздействия условий космического полета на живые
организмы принято считать микрогравитацию. На микроорганизмы, в первую очередь,
действуют обусловленные микрогравитацией факторы: отсутствие всех видов конвекции,
обусловленных
гравитацией:
термоконвекции,
концентрационной
и
плотностной
конвекции, а также седиментации клеток [1].
При
этом
пренебрегают
электромагнитными
эффектами,
обусловленными
движением клетки в магнитном поле Земли и обусловленными этим движением токами в
среде и внутри клетки, а также изменениями поверхностного заряда клетки. Поскольку и
сама клетка, и внутриклеточные структуры электрически заряжены, роль эффектов,
обусловленных
магнитным
полем,
может
быть
не
менее
важной,
чем
роль
микрогравитации. Однако существовавшие до последнего времени методы исследования
не позволяли выделить действие отдельных факторов орбитального космического полета
на биообъекты.
Предварительные результаты, полученные в эксперименте “Биомагнистат” в 1996г.
показали, что экранирование геомагнитного поля улучшает ростовые характеристики
культур рекомбинантных штаммов, подвергнутых экспозиции в условиях орбитального
полета, без снижения сегрегационной стабильности плазмид. Наземные эксперименты с
контейнером “Биомагнистат”, выполненные в 1997 г. в рамках программы РКА-НАСА,
выявили влияние экранирование геомагнитного поля на процессы бактериальной
конъюгации и слияния протопластов.
Цель
эксперимента:
получение
свойствами по результатам
продуктивностью,
штаммов-продуцентов
БАВ
с
оптимальными
экспозиции в условиях космического полета: повышенной
генетической
стабильностью,
улучшенными
ростовыми
характеристиками.
2. Необходимость проведения КЭ в условиях космического полета
Анализ литературных данных и собственных космических экспериментов с
культурами бактерий показал, что именно воздействие уникальных условий космического
полёта (прежде всего, микрогравитации) обеспечивает накопление в бактериальной
популяции клеток продуцента с улучшенными характеристиками. Последующая наземная
селекция должна обеспечить закрепление этих свойств в потомстве и получение линий
штамма-продуцента с повышенной продуктивностью и генетической стабильностью.
Необходимость проведения исследований в реальных условиях космоса определяется
целью и задачами эксперимента и диктуется невозможностью имитировать на Земле
совокупность действия ФКП, присущих орбитальному полету и космическому пространству,
на свойства культур штаммов бактерий – продуцентов рекомбинантных белков с полезными
свойствами.
Эксперимент рассчитан на длительное воздействие микрогравитации на растущие
культуры
микроорганизмов
в
условиях
экранирования
геомагнитного
поля.
Дополнительный эффект могут давать другие (не идентифицированные) факторы
орбитального космического полета, например, космическое излучение. Длительную
экспозицию в условиях микрогравитации, причем в условиях воздействия дополнительных
факторов орбитального полета можно воспроизвести только на орбитальной станции.
3. Описание КЭ
Для проведения КЭ на первом этапе на борт МКС доставляется и используется укладка
«Биоэкология».
При реализации КЭ на втором этапе на борт МКС доставляются и используются НА
«Фактор» и
НА
«Биомагнистат-Ф»,
заправленные
на
Земле
образцами
культур
рекомбинантных штаммов в герметически закрытых микропробирках.
В ходе эксперимента член экипажа обеспечивает размещение образцов на хранение в
термостат ТБУ-В при температуре + 4 ± 2 0С; перенос образцов на место проведения сеанса.
Образцы подвергаются экспозиции по согласованной циклограмме, затем переносятся в
бортовой холодильник до окончания экспедиции. В ходе выполнения КЭ необходимо
регистрировать время и температуру экспозиции образцов.
4.Новизна, оценка качественного уровня по сравнению с аналогичными
отечественными и зарубежными исследованиями
Данные
по
характеристики,
исследованию
сегрегационную
штаммов-продуцентов
БАВ
влияния
электромагнитных
стабильность
при
и
полей
продуктивность
культивировании
и
биотехнологического назначения в условиях микрогравитации,
на
ростовые
рекомбинантных
селекции
биообъектов
об изменении свойств
рекомбинантных штаммов бактерий под воздействием факторов космического полета, на
которых основана постановка задач КЭ, оригинальны.
Новизна
исследований
по
оптимизации
свойств
бактериальных
продуцентов
рекомбинантных белков путём экспозиции в условиях орбитального космического полета и
экранированием магнитного поля и последующей наземной селекции будет также обеспечена
подбором новых штаммов-продуцентов, с которыми работ в России и за рубежом не
проводилось.
5.Ожидаемые результаты и их предполагаемое использование
5.1. Основными результатами КЭ будут следующие:
‒
сравнительные данные о влиянии условий орбитального космического полёта на
свойства культур бактерий
– продуцентов различных рекомбинантных
белков:
жизнеспособность, генетическую стабильность, продуктивность;
‒
фундаментальные данные о роли геомагнитного поля в эффекте условий
орбитального космического полета на генетические и физиологические свойства культур
рекомбинантных штаммов микроорганизмов, а также данные об оптимальных условиях
получения исходного материала для наземной селекции вариантов штаммов продуцентов БАВ с повышенной продуктивностью и генетической стабильностью;
‒
варианты
(линии)
штаммов-продуцентов
с
улучшенными
свойствами:
повышенной продуктивностью, генетической стабильностью, ростовыми свойствами.
5.2. Результаты КЭ найдут практическое применение при производстве препаратов и
в разрабатываемых технологических процессах.
6.
Обоснование
технической
возможности
создания
НА
с
заданными
характеристиками
Аппаратура, необходимая для выполнения КЭ:
-
укладка «Биоэкология», разработана и успешно используется в
настоящее время для КЭ по биотехнологии;
-
аппаратура «Биомагнистат» использовалась на ОС «МИР»
7.Характеристики рисков и дискомфорта для экипажа, связанных с КЭ
7.1.Проведение эксперимента на борту МКС не должно создавать опасных ситуаций
для экипажа и МКС. На всю аппаратуру для проведения КЭ, включая биопрепараты,
доставляемую на МКС, должны быть оформлены сертификаты по безопасности.
7.2. Работы с образцами микроорганизмами должны проводиться без нарушения
герметизации микроконтейнеров.
Список цитируемой литературы
1. Langbein D. Physical parameters affecting living cells in space.// Adv. Space
Res.- 1986.- V.6.- №12.- P.5-14.
2. Mennigmann HD, Lange M. Growth and differentiation of Bacillus subtilis under
microgravity.// Naturwissenschaften.- 1986.- V.73.- №7.- P.415-7
3. Cifferi O., Tiboni O., Di Pasquale G., et al. Effect of microgravity on genetic
recombination in Escherichia coli.// Naturwissenschaften.- 1986.- V.73.- №7.- P.418-421.
4. Gasset G, Tixador R, Eche B, et al. Growth and division of Escherichia coli under
microgravity conditions.// Res. Microbiol.- 1994.- V.145.- №2- P.111-20.
5. Thévenet D, D'Ari R, Bouloc P. The SIGNAL experiment in BIORACK:
Escherichia coli in microgravity.// J. Biotechnol.- 1996.- V.47.- №2-3.- P.89-97.
6. Klaus D, Simske S, Todd P, Stodieck L. Investigation of space flight effects on
Escherichia coli and a proposed model of underlying physical mechanisms.//
Microbiology.- 1997.- V.143.- Pt.2.- P.449-55.
7. Brown RB, Klaus D, Todd P. Effects of space flight, clinorotation, and
centrifugation on the substrate utilization efficiency of E. coli.// Microgravity Sci. Technol.2002.- V.13.- №4.- P.24-9.
8. Kacena MA, Manfredi B, Todd P. Effects of space flight and mixing on bacterial
growth in low volume cultures.// Microgravity Sci. Technol.- 1999.- V.12.- №2.- P.74-7.
9. Зеров Ю.П., Кривоногов С.В., Митичкин О.В., Самарина М.Р. Изучение
влияния
условий
космического
полета
на
рекомбинантные
штаммы
микроорганизмов.// Тезисы Международного космического конгресса, Москва, 1994
г.
10. Зеров Ю.П., Митичкин О.В., Оськин Б.В., Самарина М.Р., Щербаков Г.Я.
Исследование влияния факторов космического полета на генетические свойства
клеток - продуцентов БАВ. Тезисы докл. XI конф. по косм. биол. и авиакосм. мед.,
Москва, Россия, 22-26 июня 1998 г.// Космическая биология и авиакосмическая
медицина.- 1998 - Т.1.- С.278-279.