Тараканова Елена Александровна. ЗАО «ЭКОлаб» Лабораторная диагностика сифилиса 1 ХХ век был отмечен значительными успехами как в изучении возбудителя сифилитической инфекции, T.pallidum,, так и развитием новых T.pallidum методов диагностики сифилитической инфекции 2 Динамика антителообразования при сифилисе IgG Рецидив или реинфекция Эффективное лечение IgM Реагины Недели после инфицирования 3 Методы диагностики сифилиса Прямые Темнопольная микроскопия Непрямые (серологические) Нетрепонемные тесты Прямая иммунофлюоресценция ПЦР Трепонемные тесты 4 Серологические исследования являются в настоящее время основным элементом клинической лабораторной диагностики сифилиса. Они решают три задачи: скрининг на сифилис; диагностика сифилиса при наличии подозрений на него; контроль эффективности лечения диагностированного сифилиса 5 Нетрепонемные тесты Сифилис-АгКЛ-РМП реакция микропреципитации и её модификация Сифилис RPR-тест Сифилис VDRL -тест 6 Трепонемные тесты Сифилис-РПГА –тест реакция пассивной гемагглютинации ИФТС ИФА-Антипаллидум-скрин ИФА-Антипаллидум-одностадийный ИФА-Антипаллидум-IgM ИФА-Антипаллидум-IgG иммуноферментный анализ Лайн-блот-сифилис иммунный блоттинг Сифилис-IgG-РИФ и Сифилис-IgM-РИФ реакция иммунофлюоресценции 7 Сифилис-АгКЛ-РМП Для серодиагностики сифилиса и контроля результатов его лечения. Комплект №1 СОСТАВ НАБОРА Антиген кардиолипиновый – раствор холестерина, кардиолипина, лецитина в абсолютированном спирте. Раствор холин-хлорида в 0,9% растворе натрия хлористого Рассчитан на 1000 определений; Комплект №2 Взвесь, содержащая кардиолипин, лецитин, холестерин в 10% растворе холин-хлорида, содержит консервант Положительная контрольная сыворотка (К+) Рассчитан на 500 определений. Срок годности – 2 года. 8 Быстрый скрининговый метод. Время постановки 5 минут Незаменим при мониторинге эффективности лечения Аналитическая чувствительность набора составляет1,5 МЕ/мл Сифилис-RPR-ТЕСТ Для серодиагностики сифилиса и контроля результатов его лечения. СОСТАВ НАБОРА RPR-антиген – водная 0,02 % суспензия угольных частиц сенсибилизированных смесью холестерина, кардиолипина, лецитина; содержит консервант – азид натрия в конечной концентрации 0,095 %. Положительная контрольная сыворотка (К+) Отрицательная контрольная сыворотка (К-) Карточки для реакции Набор выпускается в двух вариантах комплектации: комплект № 1 (на 100 определений); комплект № 2 (на 500 определений). Срок годности – 2 года. Быстрый скрининговый метод. Время постановки 8 минут Незаменим при мониторинге эффективности лечения Аналитическая чувствительность набора составляет-1,5 МЕ/мл 10 19 11 Нетрепонемные тесты Антитело (Ig) Сифилис VDRL –тест (Veneral Disease Research Laboratory) Рекомендован к применению ВОЗ Антиген (Treponema pallidum) Микрофлокуляционный тест на основе кардиолипинового антигена Применение микроскопа с Х100 позволяет рассмотреть микрокомплексы АГ-АТ Исследование образцов cмж редко даёт ложноположительный результат в отличие от исследования инактивированной сыворотки Традиционный диагностический тест для постановки диагноза нейросифилиса Мониторинг эффективности лечения 12 Сифилис-VDRL-тест Для серодиагностики сифилиса и контроля результатов его лечения. СОСТАВ НАБОРА VDRL-антиген – раствор кардиолипина (0,3 г /л),лецитина ( 2,1 г /л) и холестерина (9 г /л) в абсолютизированном этиловом спирте Фосфатный буферный раствор (ФБР) Положительная контрольная сыворотка (К+) Отрицательная контрольная сыворотка (К-) Набор рассчитан на исследование 250 образцов, включая контрольные Срок годности – 1,5 года. 13 Быстрый скрининговый метод. Время постановки 4 минуты Незаменим при мониторинге эффективности лечения Аналитическая чувствительность набора составляет-1,5 МЕ/мл Сифилис -РПГА -тест Набор реагентов для определения антител к Treponema pallidum в реакции пассивной гемагглютинации. ФСР № 2010/08228 от 07.07.10г. Единственный отечественный набор с использованием лизатных антигенов T.pallidum (штамм Nichols), что обеспечивает его эффективность, не уступающую лучшим мировым образцам (фирмы Spinreact, Испания; Newmarket Laboratories Ltd, Великобритания; BioKit, Испания; Human, Германия.), также использующих лизатные антигены T.pallidum 15 15 16 Сифилис--РПГАСифилис РПГА-тест основные характеристики Аналитическая чувствительность метода – 0,05 МЕ/мл Набор выпускается в двух вариантах комплектации: комплект № 1 – только для качественного исследования комплект № 2 – для качественного и полуколичественного исследования Наименование реагента Комплект № 1 Комплект № 2 Тест--эритроциты (ТЭ) Тест 1 фл. (8,5 мл) 2 фл. ( по 8,5 мл) Контрольные эритроциты (КЭ) 1 фл. (8,5 мл) 1 фл. (8,5 мл) Буферный раствор (БР) 1 фл. (20 (20 мл) 1 фл. (25 (25 мл) Контрольный положительный образец (К+) 1 фл. (0,5 (0,5 мл) 1 фл. (0,5 (0,5 мл) Контрольный отрицательный образец (К(К-) 1 фл. (0 (0,5 мл) 1 фл. (0 (0,5 мл) Планшет для микротитрования 2 шт. 2 шт. Объемы реагентов достаточны для исследования 100 образцов, включая контрольные К+ стандартизован по содержанию антител с использованием международного стандарта ВОЗ (NIBSC, London, UK); титр 1:2560. Исследуемые образцы – сыворотка (плазма) крови, ликвор. Время экспозиции до учета результатов – 45 мин. Экспозиция при комнатной температуре. 17 Срок годности набора – 1,5 года Учет результатов РПГА 4+ 3+ 2+ 1+ или + -- Резко положительная реакция - ровный слой ("зонтик") агглютинированных эритроцитов, распределенных по дну лунки (4+) Положительная реакция – эритроциты располагаются на большей части дна лунки, при этом по периферии осадка формируется заметное кольцо (3+). Слабоположительная реакция - эритроциты располагаются на небольшой части дна лунки, формируя плотное кольцо из осадка эритроцитов с заметным просветлением в центре (2+). Неопределенная реакция – наличие небольшого рыхлого осадка эритроцитов в центральной части лунки с нечеткими краями с незначительным просветом в центре (1+ или +) Отрицательная реакция – компактный осадок ("пуговка") в центральной части дна лунки на чистом окружающем фоне (–) 18 Для автоматизации постановки РПГА и учета ее результатов могут быть использованы отечественные аппаратноаппаратно-программные комплексы "Критерий"Критерий-2", "Эксперт "Эксперт--Лаб", импортные ридеры типа Anthos LP400, LP400, MRX MRX,, MR MR7000, 7000, Dynateh MRXII и автоматические анализаторы типа Olimpus РК 3000. 19 Комплекс «Эксперт-Лаб» 20 В серодиагностике сифилиса РПГА может использоваться для: скрининга образцов - (простота, скорость, хорошая воспроизводимость, возможность автоматизации ) подтверждающих исследований - (высокая чувствительность и специфичность реакции ). 21 Источники ошибок Небиологические: Небиологические: загрязнённые плашки неправильное пипетирование наличие вибрации в лаборатории температура воздуха в лаборатории выходит за рамки 1818-25 градусов. Биологические:: Биологические Зарегистрированы ложные позитивы у больных с инфекционным мононуклеозом, боррелиозом, СКВ, у наркоманов, у больных с коллагенозами, лепрой. Из двух стандартных трепонемных тестов (флюоресценция и гемагглютинация), РПГА даёт меньшее количество ложноположительных результатов. В основном , встречаемость ложноположительных результатов в РПГА исследованиях очень редка у «здоровых» людей (меньше 1%). 22 РИФ – реакция иммунофлуоресценции (FTA Fluorescent treponemal antibody) набор реагентов для определения антител к антигенам T.pallidum Сифилис-IgG-РИФ и Сифилис-IgM-РИФ 23 Иммуноферментные тест-системы ИФА-Антипаллидум-скрин (антитела классов M, G, A) ИФА-Антипаллидум-одностадийный (антитела M, G, A) ИФА-Антипаллидум-IgM ИФА-Антипаллидум-IgG Исследуемые образцы – сыворотка (плазма) крови, ликвор Комплектация наборов позволяет использовать их как для ручной постановки, так и с ИФАИФА-анализаторами. Возможно определение титра антител, в том числе по коэффициенту позитивности (КП), т.е. без использования дополнительных стрипов Аналитическая чувствительность метода – 0,025 МЕ/мл Цветная индикация растворов 25 Срок годности = 12 месяцев. Лайн--Блот Сифилис Лайн Тест-система для выявления антител к отдельным антигенам Тествозбудителя сифилиса методом иммунного блоттинга с использованием рекомбинантных антигенов. 27 Состав набора Лайн-Блот-Сифилис Маркировка Зона TpN15 Зона TmpA Контроль интенсивности реакции Стандартная схема нанесения антигенов Treponema pallidum и контролей на стрип Иммуносорбент – тест-полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны, на каждую из которых в виде поперечных полос нанесены рекомбинантные аналоги антигенов Treponema pallidum (TpN15, TpN17, TmpA, TpN47), а также четыре контрольные полосы: контроль специфичности реакции (КАГ), контроли интенсивности окрашивания: • полоса с максимальной интенсивностью окрашивания ("3+"); • полоса со средней интенсивностью окрашивания ("1+") – служит одновременно контролем внесения образца. • полоса с минимальной интенсивностью окрашивания ("0,5+") Контрольный положительный образец (К+) Контрольный отрицательный образец (К–) Конъюгат – антитела козьи к IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой в стабилизирующем растворе; прозрачная фиолетового цвета жидкость. Раствор для разведения образцов (РРО) Субстратный раствор (СР) 10-кратный концентрат промывочного раствора (ПРх10) Образец для анализа:сыворотка (плазма) крови , ликвор Количество определений :24 включая контроли Срок годности 1 год Чувствительность и спцефичность : 100% 28 Принцип технологии иммуноблоттинга Иммобилизация на нитроцеллюлозную мембрану рекомбинантных белков - аналогов антигенов Treponema pallidum p17, p 47, p 41, p15 Проведение иммуноферментного анализа для одновременного дифференцированного выявления антител к каждому из нанесённых на мембрану антигенов Антитела к белкам T. pallidum в разной степени регистрируются на всех стадиях инфекции 29 Реактивность сыворотки оценивают по каждому антигену отдельно, путём сравнения интенсивности окрашивания полученных полос с окрашиванием трёх калибровочных линий Отслеживание белкового профиля помогает при уточнении стадии инфекции и в оценке эффективности проведённого лечения 30 Частота выявления антител к основным иммунореактивным белкам Tr. Tr.Pallidum TpN15 – 67,5% TpN17 – 98,5% TmpA – 95,0% TpN47 – 92,5% За счет высокой степени очистки рекомбинантных антигенов и одновременного выявления антител к наиболее иммуногенным детерминантам возбудителя сифилиса метод обладает высокой чувствительностью ( 99,6--100%) и специфичностью 99,6 (100%), что позволяет рассматривать его как новый подтверждающий тест на сифилис. 31 18 Применение метода иммуноблоттинга целесообразно: Для ранней диагностики сифилиса. В возможном инкубационном периоде и при первичном сифилисе Для подтверждения диагноза скрытого раннего сифилиса ( при противоречивых результатах традиционных серологических методов) При необходимости проведения дифференциальной диагностики с л/положительными результатами серологических реакций на сифилис, особенно, при аутоиммунных заболеваниях: ревматизме,СКВ В сложных диагностических ситуациях, как референсреференсметод. При оценке результатов лечения 32 Производство диагностических систем. 142530, Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1 http://www.ekolab.ru Отдел маркетинга: тел./факс: +7 (496) 433-35-29 E-mаil: market@ekolab.ru; ekolab_market@mail.ru Представительство в г. Москве: тел./факс: +7(495) 938-8165, 938-8174 E-mаil: mosekolab@yandex.ru 33 24 Спасибо за внимание !