03.02.05 – энтомология Санкт-Петербург – 2013
реклама
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи ЯКОВЛЕВ Андрей Юрьевич ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ У DIPTERA, CALLIPHORIDAE НА КЛЕТОЧНОМ И ОРГАНИЗМЕННОМ УРОВНЕ 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор биологических наук, заведующий лабораторией биофармакологии и иммунологии насекомых СПбГУ Сергей Иванович Черныш Санкт-Петербург – 2013 2 Оглавление Введение……………………………………………………………………………………………..5 Глава I. Обзор литературы………………………………………………………………………....9 I.1. Иммунная система насекомых……………………………………………………………..9 I.1.1. Распознавание «чужого»……………………………………………………………..10 I.1.2. Элиминация «чужого»………………………………………………………………..11 I.1.2.1. Фагоцитоз………………………………………………………………………..12 I.1.2.2. Инкапсуляция и образование морул…………………………………………...13 I.1.2.3. Коагуляция гемолимфы………………………………………………………...14 I.1.2.4. Цитотоксическая реакция……………………………………………………....15 I.1.2.5. Меланизация…………………………………………………………………….16 I.1.2.6. Антимикробные пептиды……………………………………………………....18 I.2. Антимикробные пептиды насекомых……………………………………………………..19 I.2.1. Структурное разнообразие антимикробных пептидов……………………………..20 I.2.1.1. Цекропины……………………………………………………………………....20 I.2.1.2. Пептиды, содержащие дисульфидные связи………………………………….21 I.2.1.3. Пептиды с регулярно повторяющимися аминокислотами…………………..22 I.2.2. Механизм действия антимикробных пептидов…………………………………….23 I.2.3. Жировое тело и его роль в синтезе антимикробных пептидов……………………24 I.2.4. Другие источники антимикробных пептидов……………………………………...25 I.2.5. Индукция синтеза антимикробных пептидов………………………………………26 I.2.6. Роль эпителия и гемоцитов в индукции синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела…………………………….................................28 I.2.6.1. Роль эпителия в индукции синтеза пептидных антибиотиков……..……….28 I.2.6.2. Роль гемоцитов в индукции синтеза пептидных антибиотиков…………….29 I.2.7. Cинтез антимикробных пептидов у Calliphora vicina……………………………...30 I.3. Взаимодействие иммунной и нейроэндокринной системы……………………………..31 I.3.1. Структурная организация нейроэндокринной системы…………………………...31 I.3.2. Основные гормоны насекомых……………………………………………………....32 I.3.2.1. Экдистероиды…………………………………………………………………...32 I.3.2.2. Ювенильный гормон…………………………………………………………....32 I.3.2.3. Адипокинетический гормон…………………………………………………...33 I.3.2.4. Биогенные амины……………………………………………………………….33 I.3.3 Иммуно-нейроэндокринные взаимодействия……………………………………….33 3 I.3.4. Влияние нейроэндокринной системы на иммунные процессы у Calliphora vicina ..………………………………………………………………………35 I.3.5. Роль гормонов в регуляции иммунных процессов у насекомых…………………...36 Глава II. Материал и методы………………………………………………………………………...38 II.1. Биологический материал…………………………………………………………………...38 II.2. Методы………………………………………………………………………………………39 II.2.1. Микрохирургические вмешательства……………………………………………….39 II.2.1.1. Инфицирование насекомых…………………………………………………....39 II.2.1.2. Наложение лигатур и термическое воздействие……………………………..39 II.2.1.3. Сбор гемолимфы и отделение плазмы………………………………………...40 II.2.1.4. Отделение покровов…………………………………………………………….40 II.2.1.5. Выделение жирового тела……………………………………………………...41 II.2.1.6. Определение жизнеспособности культивируемых клеток…………………..41 II.2.2. Методы концентрации и очистки веществ………………………………………….41 II.2.2.1. Избирательная денатурация под действием температуры…………………...41 II.2.2.2. Метод твердофазной экстракции………………………………………………42 II.2.2.3. Метод ультрафильтрации………………………………………………………42 II.2.2.4. Хроматографическое фракционирование…………………………………….42 II.2.2.5. Масс-спектрометрия……………………………………………………………43 II.2.3. Анализ антимикробной активности материала…………………………………….43 II.2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных…………………………..45 Глава III. Индукция синтеза антимикробных пептидов in vivo…………………………………..46 III.1. Эффект инфицирования…………………………………………………………………...47 III.2. Эффект стрессорного воздействия……………………………………………………….50 III.2.1. Эффект лигатурного стресса………………………………………………………..50 III.2.2. Эффект термического ожога………………………………………………………...52 III.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vivo………………………………53 III.4. Заключение………………………………………………………………………………....57 Глава IV. Синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела in vitro…………………..61 IV.1. Разработка органной культуры жирового тела………………………………………….61 IV.1.1. Выбор базового состава культуральной среды……………………………………61 IV.1.2. Выживаемость культивируемых клеток…………………………………………...65 IV.1.3. Индукция антимикробной активности in vitro…………………………………….67 IV.1.3.1. Роль «фактора плазмы» в активации жирового тела………………………..68 IV.1.3.2. Роль «фактора покровов» в активации жирового тела……………………..70 4 IV.1.3.3. Роль гормонов в активации жирового тела………………………………….72 IV.1.4. Стерилизация культуры жирового тела…………………………………………....74 IV.1.5. Температура культуральной среды………………………………………………...79 IV.1.6. Перемешивание культуры…………………………………………………………..79 IV.1.7. Газообмен в культуре жирового тела………………………………………………81 IV.1.8. Геометрические параметры культуральной ячейки………………………………83 IV.1.9. Продолжительность цикла культивирования……………………………………...85 IV.2. Количественные характеристики метода получения антимикробных пептидов in vitro……………………………………………………………………………………..87 IV.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vitro……………………………..89 IV.4. Заключение………………………………………………………………………………...95 Глава V. Поиск факторов активации жирового тела и изучение их свойств……………………97 V.1. Термостабильность факторов активации жирового тела………………………………..97 V.1.1. Термостабильность факторов активации, локализованных в плазме…………….97 V.1.2. Термостабильность факторов активации, локализованных в покровах………….98 V.2. Молекулярная масса факторов активации жирового тела……………………………....99 V.3. Хроматографические характеристики факторов активации жирового тела…………..101 V.4. Видоспецифичность факторов активации жирового тела……………………………...102 V.5. Заключение…………………………………………………………………………...……104 Глава VI. Обсуждение……………………………………………………………………………....105 VI.1. Травмогенная индукция синтеза антимикробных пептидов…………………………..105 VI.2. Нейрогенная индукция синтеза антимикробных пептидов……………………………111 VI.3. Органная культура жирового тела в иммунологии и биофармакологии насекомых……………………………………………………………………………117 VI.3.1. Органная культура жирового тела как инструмент для изучения механизмов индукции антимикробной активности………….…………………………….117 VI.3.2. Органная культура жирового тела как перспективный источник белков медицинского назначения…………….……………………………………….119 Выводы……………………………………………………………………………………………...122 Список употребляемых в работе сокращений……………………………………………………124 Список литературы………………………………………………………………………………... 125 5 Введение Мясные мухи семейства Calliphoridae распространены во всех зоогеографических регионах планеты. Из приблизительно 1000 видов, представленных в мировой фауне мухкаллифорид (Schumann, 1986), большинство является синантропными (Дербенева-Ухова, 1961). Научный и практический интерес к мясным мухам обусловлен той ролью, которую многие представители данного семейства, в силу своей пищевой специализации, играют в жизни и хозяйственной деятельности человека. Имаго мясных мух потребляют белковую и углеводную пищу. Углеводы служат мухе источником энергии при длительных физических нагрузках, главным образом – при полете. Питаясь нектаром и пыльцой, мясные мухи участвуют в опылении диких и сельскохозяйственных растений. Белковый субстрат необходим, главным образом, для размножения, а также для созревания яиц и их откладки. Пищей мухам служат разлагающиеся мясо, рыба, молочные продукты, трупы и экскременты различных животных. Благодаря развитой системе органов чувств, мухи способны определять местонахождение пищи на расстоянии нескольких километров и залетать в поисках пищи в глубокие шахты, пещеры, тоннели и колодцы (Виноградова, 1991). Характер питания личинок крайне разнообразен (Гапонов, 2003). Большинство мухкаллифорид на личиночной стадии является сапрофагами, развиваясь на трупах животных, сыром и вареном мясе, рыбе, гниющих растительных остатках и в экскрементах животных. Вместе с тем, широкое распространение получили различные формы паразитизма. В роли хозяев личинок мясных мух выступают черви, моллюски, насекомые, амфибии, птицы и млекопитающие. Особой формой паразитизма у мух-каллифорид является питание мягкими тканями хозяина, сопровождаемое образованием миазов. В ряде случаев миазообразование принимает облигатный характер. Отдельные представители семейства перешли к гематофагии и хищничеству. Такой широкий спектр личиночного питания определяет санитарную роль мясных мух в природных и антропогенных биоценозах как утилизаторов животной и растительной органики. Мухи развиваются крайне быстро – масса тела питающейся личинки на протяжении суток может возрастать в сотни раз! Это связано с калорийностью и быстрым разложением пищевого субстрата. Как следствие, переработка мухами органических остатков происходит с высокой скоростью, что делает перспективным применение мясных мух в системах утилизации отходов мясной и рыбной промышленности (Колтыпин, 1977). Склонность личинок мух-каллифорид к некрофагии нашла отражение в судебной энтомологии. Известно, что мясные мухи колонизируют трупы еще на стадии раннего микробного разложения – это обстоятельство позволяет по собранным на трупе 6 личинкам, используя методику ретроспективного анализа, установить время наступления смерти человека (Марченко, 1980). Питаясь трупами и экскрементами животных, мухи-каллифориды на разных стадиях жизненного цикла контактируют с множеством патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: бактерий, вирусов, цист простейших и яиц гельминтов. Этим объясняется большое количество распространяемых мясными мухами трансмиссивных заболеваний: туберкулеза, инфекционного паратуберкулеза, конъюнктивита, полиомиелита, гнойных и бруцеллеза, кишечных туляремии, инфекций ботулизма, (Богоявленский, Прокопович, 1942; Сухова, 1950; Сухова, 1951; Дербенева-Ухова, 1952; Лярский и др., 1985). Санитарно-эпидемиологическое значение мясных мух сделало их классическим объектом медицинской энтомологии и способствовало детальному изучению биологии, экологии и фауны отдельных представителей семейства (Виноградова, 1984; 1991). Становление мясных мух как эффективных механических переносчиков инфекционных заболеваний было бы невозможным без наличия развитой иммунной системы, защищающей насекомое от паразитов, главным образом, от бактерий, концентрация которых в окружающей среде крайне высока. Подавляющая часть бактериальной микрофлоры покровов мясных мух представлена энтеробактериями (Escherichia sp., Klebsiella sp., Providencia sp., Citrobacter sp., Proteus sp. и др.), а также условно-патогенными обитателями кожных покровов человека и животных, в основном, стафилококками разных видов (Daniel et al., 1990; Paraluppi et al., 1996; Sukontanson et al., 2000; Habeeb, Mahdi, 2012). Существенный вклад в защиту личинок мясных мух от бактерий вносит экзосекрет, который насекомые выделяют в окружающую среду при питании. Экзосекрет содержит комплекс ферментов, растворяющих некротические ткани, а также бактерицидные компоненты, действие которых приводит к стерилизации субстрата (Кругликова, Черныш, 2013). Разжиженная пища затем поглощается личинками. Такая стратегия мясных мух нашла отражение в медицине и привела к формированию целого направления – биохирургии – основанного на использовании личинок мух в качестве средства лечения инфицированных ран и язв (Sherman et al., 2000; Sherman, 2009). По сути, «личиночная терапия» представляет собой создание контролируемого миаза и сводится к устранению некротически измененных клеток и стерилизации раневой поверхности, что приводит к заживлению раны. Ключевую роль в защите внутренней среды от патогенных микроорганизмов играют антимикробные пептиды - это касается всех многоклеточных животных (Кокряков, 1999), и мясные мухи не являются исключением (Dimarcq et al., 1988; Chernysh et al., 2000; Cerovský et al., 2010). Основным местом синтеза антимикробных пептидов у насекомых служит жировое тело (Hoffmann, Reichhart, 2002), которое активно выделяет пептидные антибиотики в 7 гемолимфу при травмировании покровов или в ответ на микробную инвазию. Особенности жизненной стратегии синантропных мух привели к возникновению целых комплексов антимикробных пептидов, эффективных в отношении патогенов человека. Прежде всего, это касается постоянного компонента их среды обитания - кишечной палочки, а также других энтеробактерий (Черныш, Гордя, 2011). Несмотря на то, что структура и свойства антимикробных пептидов некоторых мухкаллифорид известны, физиологические механизмы регуляции синтеза этих молекул и, соответственно, включения в систему антиинфекционного иммунитета, до сих пор остаются неясными. Между тем, этот вопрос является ключевым для понимания стратегий адаптации данной группы насекомых к обитанию в экстремальной с точки зрения контаминации потенциально опасными микроорганизмами среде. Его изучение, в свою очередь, невозможно без понимания физиологии жирового тела как основного продуцента антимикробных компонентов у мух-каллифорид. Целью настоящего исследования являлось изучение механизмов регуляции синтеза антимикробных пептидов в процессе иммунного ответа личинок мух-каллифорид. Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи: Оценка влияния различных факторов инфекционной и неинфекционной природы на титр антимикробных пептидов в гемолимфе личинок; Сравнение состава антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами при воздействии на личинку септических и асептических раздражителей; Изучение спектра бактерицидной активности антимикробных пептидов личинки; Разработка культуры жирового тела – модели для изучения механизмов регуляции синтеза антимикробных пептидов in vitro; Сравнение состава антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами in vivo и in vitro; Поиск в организме личинки соединений, влияющих на синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела; Оценка возможностей использования культуры жирового тела в качестве продуцента биологически активных веществ. Автор искренне благодарит своего научного руководителя – Черныша Сергея Ивановича – за чуткое руководство и полезные советы при написании диссертации, а также коллег по лаборатории биофармакологии и иммунологии насекомых СПбГУ: Гордя Н. А., Тулина Д. В., Симоненко Н. П., Несина А. П., Кругликову А. А., Никитина О. М. – за помощь в организации исследовательской работы. Отдельную благодарность автор выражает 8 заведующему лабораторией общей патологии Института экспериментальной медицины РАМН Кокрякову Владимиру Николаевичу, а также сотрудникам лаборатории: Берлову М. Н. и Цветковой Е. В. (сейчас – с.н.с. кафедры биохимии СПбГУ), - за помощь в проведении аналитических исследований. Работа осуществлена при финансовой поддержке Совета по грантам при Президенте РФ для государственной поддержки ведущих научных школ (грант НШ-3332.2010.4) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере. 9 Глава I. Обзор литературы I.1. Иммунная система насекомых Насекомые, достигшие наивысшего уровня эволюционного развития среди беспозвоночных животных, имеют сложную координированную систему защиты от патогенных микроорганизмов. Покровы стенки тела, кишки и трахей являются надежной механической преградой для проникновения паразитов из окружающей среды в полость тела насекомого. В случае повреждения барьерного эпителия чужеродные объекты попадают в гемоцель и становятся мишенью для клеточных и гуморальных факторов гемолимфы. Основными структурными элементами, участвующими в формировании клеточного иммунного ответа у насекомых, являются фиксированные и свободноживущие клетки гемолимфы – гемоциты. Гуморальные механизмы иммунного ответа включают активацию протеолитических каскадов в плазме, ведущих к запуску местных защитных реакций, таких как меланизация и коагуляция, а также системных реакций, ведущее место среди которых занимает синтез антимикробных пептидов (Рис. 1). Рис. 1. Схема иммунного ответа у насекомых (на основе обзора Tzou et al., 2002). 10 I.1.1. Распознавание «чужого» Иммунная система насекомых функционально сходна с системой врожденного иммунитета позвоночных. Системы приобретенного (адаптивного) иммунитета у насекомых нет. В их организме имеется ограниченный набор распознающих молекул, способных избирательно связываться с поверхностными структурами патогена. Последние служат своеобразными маркерами «чужого». К ним относятся липополисахариды, липотейхоевые кислоты, липопротеины, пептидогликаны, β-1,3-глюканы и другие молекулы, либо их фрагменты (Begum et al., 2000). Распознавание иммунокомпетентной клеткой патогенных структур происходит либо напрямую, либо через систему гуморальных посредников, растворенных в плазме. В роли таких посредников выступают, главным образом, лектины и комплементо-подобные белки (Jomori, Natori, 1992; Levashina et al., 2001; Ramet et al., 2002). Распознающие же элементы, локализованные на поверхности иммуноцита, либо синтезируются самой клеткой, либо являются гуморальными сенсорами, «встроенными» в ее мембрану. Результаты исследований, выполненных на дрозофиле, указывают на ведущую роль молекул семейства PGRP (пептидогликан-распознающих белков) в распознавании патогенных структур насекомыми. Общим признаком для белков данного семейства является их структурное сходство с амидазами бактериофагов. По этой причине некоторые из PGRPмолекул обладают ферментативной активностью и способны расщеплять молекулы пептидогликанов; другие представители семейства лишены подобной активности и функционируют исключительно как сигнальные молекулы (Ferrandon et al., 2007). Различия в структуре пептидогликанов грамположительных и грамотрицательных бактерий обусловливают Аминокислотная многообразие последовательность PGRP-молекул белковой части в организме молекулы насекомого. пептидогликана грамотрицательных бактерий (и грамположительных бактерий родов Bacillus и Listeria) содержит диаминопимелиновую кислоту в 3-ем положении, в то время как у подавляющего большинства грамположительных бактерий в этом положении находится лизин. Распознавание пептидогликанов грамотрицательных бактерий – прерогатива молекул PGRP типов LC и LE. PGRP-LC является клеточным рецептором, в то время как PGRP-LE выступает, главным образом, в роли гуморального сенсора. Пептидогликаны грамположительных бактерий – мишень для молекул PGRP типов SA и SD, а также – для белка GNBP1 – представителя семейства GNBP (белков связывания с грамотрицательными бактериями). Белки семейства GNBP связывают преимущественно липополисахариды и β-1,3-глюканы (Lee et al., 1996; Kim et al., 2000; Werner et al., 2000), 11 однако некоторые представители участвуют в распознавании грамположительных бактерий. Распознавание мишени запускает каскад протеолитических реакций, ведущих к активации белка Spatzle – лиганда к Toll-рецептору, локализованному на поверхности иммуноцита. Активация белка Spatzle имеет место также вследствие распознавания грибковых паттернов. Поверхностные структуры грибков, преимущественно, β-1,3-D-глюканы, связываются молекулами GNBP3. Гомологи GNBP3 обнаружены у представителей отрядов Lepidoptera и Hymenoptera. Распознавание грибковых ферментов, в частности протеаз, осуществляется иначе – через их взаимодействие с гуморальным фактором Persephone. Факторы GNBP3 и Persephone являются триггерами каскада протеолитических реакций, ведущих к активации иммунокомпетентной клетки. Некоторые факторы плазмы функционируют как опсонины и способствуют связыванию патогенов фагоцитами. Однако данные по ним весьма фрагментарны и являются результатом изучения иммунитета насекомых самых разных отрядов. Так, например, тиоэфирсвязывающие белки (TEP), играющие роль сигнальных молекул у москита Anopheles gambiae, повышают фагоцитарную активность гемоцитов (Levashina et al., 2001). Интересно, что местом их синтеза являются сами гемоциты, которые выделяют TEP в плазму в ответ на септическое заражение (Lagueux et al., 2000). Белок связывания с липополисахаридами (LBP), обнаруженный у тутового шелкопряда Bombyx mori, ускоряет реакцию инкапсуляции (Koizumi et al., 1999). Другой гуморальный фактор – гемолин – также обладает способностью связывать липополисахариды, однако как это влияет на клеточные механизмы – непонятно (Faye et Kanost, 1998). С другой стороны, для некоторых лектинов доказаны сигнальные фуккции, однако лиганды к этим лектинам пока не найдены (Yu, Kanost, 2000). В литературе также фигурирует мнение о том, что рецептор PGRP-LC, помимо инициации гуморального иммунного ответа, каким-то образом задействован в фагоцитозе, однако подтверждений того, что связывание с этим рецептором может приводить к поглощению частицы без каких-либо вспомогательных молекул, нет (Meister, Lagueux, 2003). I.1.2. Элиминация «чужого» Ключевыми эффекторными компонентами иммунного ответа у насекомых являются активированные кислородные метаболиты, а также антибактериальные белки и гликопротеины с выраженной либо невыраженной ферментативной активностью (Глупов и др., 2009). Клетки жирового тела выделяют антимикробные вещества непосредственно в плазму. У гемоцитов синтез токсических молекул чаще всего опосредован клеточными реакциями – фагоцитозом и инкапсуляцией. 12 I.1.2.1. Фагоцитоз Фагоцитоз является специализированной формой рецептор-опосредованного эндоцитоза. Это один из важнейших механизмов защиты от микробов и эффективный способ элиминации апоптозных телец. Помимо клеточных структур, фагоцитозу подвергаются разнообразные нерастворимые субстанции и инертные частицы, такие как тушь и латекс. Фагоцитирование чужеродного объекта – это многоступенчатый процесс. Первым этапом иммунной реакции является агрегация гемоцитов в месте повреждения. На следующем этапе фагоциты контактируют с мишенью. Это происходит либо напрямую, с помощью рецепторов, расположенных непосредственно на их поверхности, либо опосредованно – через систему опсонинов. Следствием распознавания является перестройка цитоскелета гемоцита, образование клеткой псевдоподий, поглощение чужеродной частицы и формирование фагосомы. Механизм, по которому гемоцит распознает и поглощает мишень, пока остается нераскрытым (Meister, Lagueux, 2003). Захваченная мишень впоследствии разрушается внутри фагосомы с помощью лизосомальных ферментов, активных кислородных радикалов и оксида азота (Jones et al., 1999). Фагоцитарной активностью обладают различные типы гемоцитов, в большинстве случаев – плазматоциты и гранулоциты (Giulianini et al., 2003; Meister, Lagueux, 2003), иногда – эноцитоиды (Giulianini et al., 2003). Примечательно, что у некоторых насекомых наблюдается «распределение ролей» гемоцитов в фагоцитозе: плазматоциты ответственны за элиминацию патогенов, в то время, как гранулоциты поглощают собственные клетки, разрушенные в процессе апоптоза (Ling, Yu, 2006). У дрозофилы, напротив, функциональной дифференциации нет: фагоцитоз как микробных клеток, так и апоптозных телец осуществляется исключительно плазматоцитами (Meister, Lagueux, 2003). Динамика фагоцитоза у мясных мух детально изучена на примере личинок синей мясной мухи Calliphora vicina (Кинд, 2003; 2005; 2007; 2010). Показано, что скорость реакции зависит, главным образом, от популяции вовлеченных в нее фагоцитов. Популяционный состав гемоцитов, обладающих фагоцитарной активностью, определяется, в свою очередь, стадией развития личинки (Кинд, 2007). У питающейся личинки фагоциты представлены ювенильными плазматоцитами (филоподоцитами - по Тулину и Чаге, 2003) – их активность проявляется уже в первые секунды после инокуляции. По завершении личинкой питания эта популяция клеток исчезает, передавая свои «полномочия» менее активным плазматоцитам I (гистолизоцитам - по Тулину и Чаге, 2003) и тромбоцитоидам (пластинкам – по Тулину и Чаге, 2003). 13 I.1.2.2. Инкапсуляция и образование морул Более сложным механизмом изоляции патогена является образование капсул, или инкапсуляция. Формирование капсул может происходить также вокруг собственных поврежденных тканей насекомого – явление, лежащее в основе регенерации. Различают две формы инкапсуляции: 1) образование узелков – многоклеточных образований, способных изолировать сразу несколько мелких патогенов, например группу бактерий; 2) формирование капсул – многослойных скоплений гемоцитов разных типов, изолирующих объекты, размер которых превышает размер иммуноцита: простейших, многоклеточных паразитов, личинки и яица паразитоидов (Lavine, Beckage, 1995; Salt, 1970). Принципиальных различий в механизмах этих процессов нет. Сигнальными молекулами, запускающими образование капсулы, являются молекулярные паттерны микроорганизмов (Lackie, 1988). Как при образовании узелков, так и при образовании капсул, гемоциты формируют псевдоткань, изолирующую проникший в гемоцель объект. Процесс образования капсулы изучен достаточно подробно (Davies, Siva-Jothy, 1991; Gotz, 1986). Распознавание чужеродной частицы инициирует переход гемоцита в активное состояние и делает возможным его прикрепление к мишени и другим гемоцитам. Иммуноцитами, непосредственно контактирующими с чужеродной поверхностью, являются гранулоциты. При контакте происходит лизис и дегрануляция клеток. Клеточное содержимое прилипает к поверхности частицы, а дегранулировавшие клетки образуют агрегаты. Хемоаттрактанты содержимого гранулоцитов воздействуют на свободноциркулирующие плазматоциты и инициируют появление адгезионных молекул на их поверхности (Clark et al., 1997; Strand, Clark, 1999). Плазматоциты взаимодействуют с окруженной разрушенными гранулоцитами мишенью и формируют многослойный каркас капсулы. Образование капсулы заканчивается появлением на ее поверхности структуры, подобной базальной мембране (Liu et al., 1998). Она формируется монослоем нативных гранулоцитов, прикрепившихся к капсуле на конечном этапе ее образования. Сигнальные молекулы, синтезируемые плазматоцитами для привлечения гранулоцитов, неизвестны. Следует отметить, что такой процесс формирования капсулы не является единственно возможным. Было показано, что плазматоциты, как и гранулоциты, могут инициировать процесс изоляции «чужого» – механизм инкапсуляции, имеющий место у дрозофилы (Russo et al., 1996; Gillespie et al., 1997). Сигнал, посылаемый плазматоцитами, воспринимается прогемоцитами, локализованными в гематопоэтических органах. Результатом активации прогемоцитов является их массовая дифференцировка в ламеллоциты и вовлечение последних в процесс образования капсулы (Lanot et al., 2001). 14 У мясных мух механизм инкапсуляции также отличен от «классического». На первом этапе реакции происходит образование агглютината. У личинок Calliphora vicina агглютинация инициируется тромбоцитоидами (пластинками – по классификации Тулина и Чаги, 2003), взаимодействующими с чужеродной частицей спустя 3-5 минут после инокуляции (Кинд, 2010; McKenzie, Preston, 1992). Вторым этапом образования капсулы является присоединение к агглютинату ювенильных плазматоцитов (у питающихся личинок) или плазматоцитов I (у диапаузирующих личинок). Помимо капсул гемоциты личинки Calliphora vicina способны образовывать морулы (Кинд, 2005). Морулы представляют собой скопления плазматоцитов I с прилипшими к ним чужеродными частицами. В отличие от классических нодул, морулы не содержат центрального скопления частиц и не проявляют признаков меланизации. Считается, что капсула выполняет функции механического барьера и ограничивает развитие патогена в организме насекомого. Как правило, изолированный паразит в конечном счете погибает от асфиксии или под действием активных кислородных радикалов, хинонов и семихинонов, образовавшихся в реакциях меланизации (Nappi et al., 1995; 2000). На связь инкапсуляции с фенолоксидазной системой указывает и тот факт, что толщина стенки капсулы пропорциональна количеству содержащегося в ней меланина. Введение ингибиторов реакций синтеза меланина ведет к уменьшению толщины капсульной стенки (Hoffmann, 1993). Наряду с компонентами фенолоксидазной системы, антимикробные пептиды, выделяемые гемоцитами внутрь капсулы, по-видимому, также способны оказывать токсическое действие на патоген (Lavine, Strand, 2002). I.1.2.3. Коагуляция гемолимфы Коагуляция гемолимфы является одной из самых ранних защитных реакций организма насекомого на повреждение. Процесс свертывания протекает при тесной кооперации гуморальных и клеточных компонентов иммунной системы. В связи с этим, ряд авторов правомерно относит коагуляцию к клеточным защитным реакциям, в то время как другие исследователи делают акцент на ее молекулярных механизмах. В результате свертывания происходит образование вторичного механического барьера, препятствующего распространению инфекции и сводящего потери гемолимфы к минимуму. Примечательно, что у имаго, имеющих жесткую кутикулу, коагуляция может отсутствовать вовсе, в то время как у «мягкотелых» личинок, в которых гемолимфа находится под давлением и формирует своего рода гидроскелет, реакции свертывания протекают чрезвычайно интенсивно (Bidla et al., 2004). 15 Наиболее полно механизм формирования сгустка изучен у чешуекрылых (Lavine, Strand, 2002). В реакциях свертывания принимают участие плазматоциты и гранулоциты. На первом этапе происходит дегрануляция и разрушение гранулоцитов. Агрегаты содержимого клеток, клеточного дебриса и живых гемоцитов формируют слой, изолирующий рану (стадия мягкого сгустка). Согласно результатам анализа молекулярного состава таких агрегатов, основным компонентом сгустка у чешуекрылых и двукрылых является гемолектин. Молекула гемолектина содержит домены, сходные по структуре с доменами факторов свертывания млекопитающих. У ряда изученных видов, однако, гемолектин в сгустке не выявлен, в то время как другой компонент – липофорин – встречается регулярно. На следующем этапе реакции происходит затвердевание сгустка. Затвердевание связано, главным образом, с фенолоксидазной, а в ряде случаев – дополнительно с трансглютаминазной и пероксидазной активностью. Продукты реакций, катализируемых фенолоксидазой, образуют сшивки между молекулами липофорина (стадия твердого сгустка). Позже в реакцию вовлекаются плазматоциты: распластываясь на поверхности сгустка, они окончательно ограничивают его содержимое от гемоцеля (стадия корки). На заключительном этапе реакции начинается регенерация покровов: новый эпителий постепенно вытесняет сгусток – происходит заживление раны. У мясных мух коагуляция протекает иначе. Содержимое сгустка личинки Calliphora vicina представлено не клеточным дебрисом, а совокупностью цельных безъядерных структур – пластинок, представляющих собой фрагменты клеток-предшественников (Evans, Crossley, 1974). Способность пластинок к образованию агглютината определяется обратимой перестройкой их цитоскелета: образование ячеистой структуры агглютината может быть полностью подавлено колхицином, предотвращающим сборку субъединиц тубулина в микротрубочки. Как видно из описания процесса, коагуляция имеет существенное сходство с процессом инкапсуляции, различия наблюдаются лишь на заключительном этапе реакции. Возможно, что исход определяется природой индуктора: образование сгустка происходит в ответ на любое повреждение покровов, в то время как образование капсул имеет место лишь при инфицировании раны (Theopold et al., 2004). I.1.2.4. Цитотоксическая реакция Для гемоцитов насекомых характерна цитотоксическая активность в отношении чужеродных эукариотических клеток. Цитотоксические гемоциты были обнаружены сравнительно недавно в гемолимфе личинок мухи Calliphora vicina (Chernysh et al., 2004). 16 Способность этих клеток распознавать и уничтожать раковые клетки лейкемии человека K562 in vitro указывает на их сходство с цитотоксическими лимфоцитами млекопитающих. На первом этапе реакции происходит связывание гемоцита с клеткой-мишенью. Конъюгаты начинают формироваться уже через 5-10 минут после введения чужеродных клеток в культуру гемоцитов и сохраняются в течение нескольких часов. Следствием связывания является деструкция клетки-мишени, при которой наблюдается отшнуровка цитоплазматических фрагментов и разрушение ядра. К цитотоксическим гемоцитам относятся преимущественно плазматоциты I (гистолизоциты – по Тулину и Чаге, 2003), в меньшей степени – недифференцированные клетки – прогемоциты. По этой причине цитотоксическая активность гемолимфы увеличивается после прекращения личинкой питания и достигает пика к началу пупаризации, когда концентрация плазматоцитов в гемолимфе максимальна. Роль цитотоксических гемоцитов в нормальных условиях пока остается под вопросом. Есть мнение, что она заключается в обеспечении защиты насекомого от эукариотических паразитов. Вполне возможно также, что основной функцией этой клеточной популяции является распознавание и элиминация собственных аберрантных тканей при метаморфозе. I.1.2.5. Меланизация Меланизация – реакция образования темного пигмента меланина из тирозиноподобных соединений – широко представлена у членистоногих (Ashida, Brey, 1997; Söderhäll, Cerenius, 1998). Меланизация играет решающую роль в жизненном цикле насекомых, определяя затвердевание кутикулы при образовании новых покровов или при репарации старых. Промежуточные продукты синтеза меланина – это хиноны и фенольные соединения, придающие кутикуле прочность (Lerch, 1988). В ходе реакций меланогенеза образуются высокореактивные соединения: семихиноны и нестабильные кислородные радикалы, которые вызывают закисление среды в месте повреждения покровов и в очаге локализации микроорганизмов. Именно «побочные» продукты, главным образом, и оказывают неспецифическое токсичное действие на патоген. Гибель патогена происходит в результате изменения структуры мембранных белков и липидов, а также – инактивации ферментов и повреждения ДНК (Глупов и др., 2009). Ключевым компонентом фенолоксидазной системы является фенолоксидаза – фермент, состоящий из нескольких субъединиц (Ashida, 1974; Söderhäll et al., 1990; Hara et al., 1993). Фенолоксидаза инициирует преобразование дифенолов в хиноны, которые, в свою очередь, полимеризуясь, образуют конечный продукт реакции – меланин (Глупов и др., 2009). 17 Согласно литературным данным, фенолоксидаза находится в организме насекомого в виде предшественника – профенолоксидазы. Профермент локализован непосредственно в плазме (Mitchell, Weber, 1965; Saul et al., 1987), в покровах (Lai-Fook, 1966; Barrett, Andersen, 1981; Barrett, 1987; Bennington, Barrett, 1988) либо на поверхности гемоцитов (Charalambidis et al., 1996). Продуцентами профенолоксидазы являются главным образом гемоциты (Meister, Lagueux, 2003) и, в меньшей мере, клетки жирового тела и эпителиоциты (Feng et al., 2011). Преобразование профенолоксидазы в активную форму происходит на заключительной стадии серинового протеолитического каскада (Ashida et Yoshida, 1988; Aspan et al, 1990). В свою очередь, активация сериновых протеиназ запускается при распознавании поверхностных структур патогена. Фенолоксидазная активность имеет место не только при инфицировании, но и при воздействии органических растворителей, тяжелых металлов, высокой температуры и поверхностно активных веществ (Pathak, 1993). В ряде случаев фенолоксидазная система имеет принципиально иную организацию. Основным действующим звеном такой системы является особая популяция гемоцитов – кристаллические клетки. Эти клетки были описаны у мухи Calliphora vicina на ранних стадиях личиночного развития (Тулин, Чага, 2003; Тулин, Яковлев, 2007). Оказалось, что в ходе дифференцировки кристаллические клетки накапливают в своей цитоплазме все компоненты фенолоксидазной системы (фермент и фенольный субстрат). Фенолоксидаза в кристаллических клетках находится, по-видимому, в активной форме, а не в виде профермента; субстрат же, напротив, модифицирован – это исключает протекание реакции внутри клетки в отсутствие внешнего стимула (Тулин, неопубликованные данные). У личинок Calliphora vicina, окончивших питание, фенолоксидазная система, очевидно, организована по «классическому» принципу: профермент неактивен и локализован в плазме. При этом из плазмы выделено две профенолоксидазы: субстратом для первой из них является как тирозин, так и дигидроксифенилаланин (ДОФА), для второй – только ДОФА (Finlayson, Hamer, 1949; Pryor, 1955; Pau, Kelly, 1975). Из покровов личинок мух экстрагированы ферменты, добавление которых к профенолоксидазам плазмы инициирует переход последних в активную форму (Ohnishi, 1954; 1958; Schweiger, Karlson, 1962; Ohnishi et al., 1970). Примечательно, что и сами покровы личинки содержат фенолоксидазы, одна из которых изначально активна, а другая – нет (Barrett, 1987). Содержание активной формы существенно возрастает к началу окукливания и снижается при склеротизации. На этом основании выдвинуто предположение, что склеротизация покровов при метаморфозе является ключевой функцией данного фермента. Неактивная форма (профермент) присутствует в покровах блуждающей личинки до начала пупаризации. Ей в качестве основной функции приписывают заживление ран (Lai-Fook, 1966; Barrett, Andersen, 1981; Barrett, 1987). 18 Важно отметить, что промежуточные продукты реакции меланизации токсичны не только для чужеродных, но и для собственных клеток. В связи с этим, фенолоксидазная активность in vivo кратковременна и в большинстве случаев приурочена к начальной стадии иммунного процесса, пока системные механизмы защиты не инициированы. Один из путей регуляции меланогенеза связан с действием ингибиторов сериновых протеаз, включающих представителей суперсемейства серпинов (De Gregorio et al., 2002; Ligoxygakis et al., 2002). В ряде случаев активация профенолоксидазы требует участия вспомогательных белковых и гликопротеиновых кофакторов, не обладающих прямой протеолитической активностью – тогда регуляция меланогенеза сводится к регуляции активности этих кофакторов. Склонность фенолоксидазы к агрегации также является способом ингибирования фенолоксидазной активности (Ashida, Brey, 1997). Часто фенолоксидазная система не в состоянии остановить развитие паразитов из-за высокой скорости их размножения и расселения. Поэтому есть основания полагать, что основной функцией данной системы является не столько защита, сколько – распознавание чужеродных микроорганизмов и последующая активация системных реакций, таких как синтез антимикробных пептидов (Hoffmann, 1993). Выделяемые в ходе реакций меланизации соединения привлекают к защите организма гемоциты. С другой стороны, гемоциты сами являются источником компонентов фенолоксидазной системы – это имеет важное значение при элиминации изолированного гемоцитами патогена (Глупов и др., 1998; Hoffmann, 1993). Кроме того, фенолоксидазная система принимает участие в предварительном восстановлении поврежденного эпителия до включения основных механизмов регенерации, активация которых может потребовать нескольких дней (Lai Fook, 1966). I.1.2.6. Антимикробные пептиды Центральным звеном системного гуморального иммунитета у насекомых являются антимикробные пептиды. К этой группе относятся, главным образом, катионные соединения белковой природы с молекулярной массой от 500 до 10 000 Да и выраженными бактерицидными и (или) фунгицидными свойствами. Антимикробные пептиды свободно циркулируют в гемолимфе либо ассоциированы с пограничным эпителием. Катионные полипептиды с выраженной противомикробной активностью (мелиттин, бомболитин, мастопараны и др.) были обнаружены также в ядах насекомых (Ratcliffe et al., 2011). Синтез антимикробных пептидов носит, преимущественно, индуцибельный характер: низкая в норме концентрация пептидных антибиотиков в гемолимфе существенно возрастает при травме. Поверхностные структуры патогена служат мощным триггером иммунного 19 ответа: сигнал о заражении передается на иммунокомпетентные клетки и запускает в них экспрессию антимикробных генов. Антимикробные пептиды активны в отношении бактерий и грибков, а также – в отношении клеток простейших и опухолевых клеток (Slocinska et al., 2008). Примечательно, что в ряде случаев гуморальный иммунитет насекомых является в некотором смысле параспецифичным: в зависимости от природы патогена синтезируются антимикробные пептиды разных семейств (Hancock and Chapple, 1999). I.2. Антимикробные пептиды насекомых Антимикробные пептиды были впервые обнаружены у насекомых в 50-х гг. XX века (Briggs, 1958). Однако их интенсивное изучение началось с работ коллектива Ганса Бомана, выполненных на сатурнии Hyalophora cecropia (Pye, Boman, 1977). На сегодняшний день в базе данных (http://aps.unmc.edu/AP/main.php) насчитывается более 800 пептидных антибиотиков природного происхождения, и около половины из них «принадлежит» насекомым. Изначально антибактериальную активность гемолимфы в основном отождествляли с активностью лизоцима. Лизоцим представляет собой муколитический фермент, гидролизующий гликозидную связь между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой пептидогликана клеточной стенки бактерий. Как и большинство антимикробных пептидов насекомых, лизоцим характеризуется индуцибельным характером синтеза: титр фермента возрастает в десятки, или даже сотни, раз при септическом заражении (Dunn, 1986). Примечательно, что лизоцим активен исключительно в отношении грамположительных бактерий. Вероятно, это связано с отсутствием у последних наружной мембраны и доступностью пептидогликанового слоя. Однако большинство исследователей полагает, что бактерицидные свойства лизоцима не являются превалирующими. Основная же функция этого фермента, по-видимому, связана с удалением фрагментов клеточных стенок, которые остаются в гемолимфе после действия антимикробных пептидов (Kanost, 1988). Помимо этого лизоцим осуществляет «презентацию» коротких фрагментов петидогликанового слоя другим распознающим молекулам и, в конечном счете, эффекторным клеткам иммунной системы. Результатом распознавания является синтез антимикробных пептидов и запуск клеточных механизмов защиты (Morishima, 1992). 20 I.2.1. Структурное разнообразие антимикробных пептидов В соответствии с особенностями строения все пептидные антибиотики насекомых можно разделить на три группы: - линейные пептиды с α-спиралью, или цекропины; - пептиды, содержащие дисульфидные связи; - пептиды с регулярно повторяющимися аминокислотами. Первые две группы являются естественными и включают в себя гомологичные молекулы. Третья группа представляет совокупность молекул, имеющих, вероятно, разное происхождение. I.2.1.1. Цекропины Цекропины – это линейные катионные пептиды, состоящие из 35-39 аминокислотных остатков. Молекулу цекропина можно условно разделить на полярный положительно заряженный N-концевой срединный отрезок, участок, соединяемый переходящий пролином в преимущественно и/или глицином гидрофобный с С-концевой последовательностью. Все С-концевые аминокислоты известных цекропинов насекомых амидированы. Вторичная структура представляет собой неупорядоченный N-концевой участок, переходящий в классическую амфипатическую α-спираль, которая шарнирной последовательностью соединена с С-концевой, преимущественно гидрофобной α-спиралью (Кокряков, 1999; Holak et al., 1988). Цекропины описаны у представителей отрядов Lepidoptera и Diptera (Cociancich et al., 1994b). На сегодняшний день это, пожалуй, наиболее изученная группа антимикробных пептидов. Цекропины проявляют активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибков, опухолевых клеток, простейших, вирусов и даже некоторых круглых червей (Ratcliffe et al., 2011). Однако спектр активности цекропинов варьирует в зависимости от видовой принадлежности объекта. Так, например, цекропины чешуекрылых активны против грамотрицательных и грамположительных бактерий, но не проявляют активности в отношении эукариотических клеткок (Boman et al., 1991), в то время как цекропины двукрылых активны исключительно против грамотрицательных бактерий (Chernysh et al., 2000). Более узкий спектр действия цекропинов двукрылых вероятно связан с наличием дополнительной группы пептидов – дефензинов, которых у чешуекрылых нет. 21 I.2.1.2. Пептиды, содержащие дисульфидные связи К данной группе относятся преимущественно дефензины – катионные пептиды, состоящие из 34-51 амикокислотных остатков. Для всех дефензинов насекомых характерно присутствие 6 консервативно расположенных цистеиновых остатков, образующих три внутримолекулярных дисульфидных мостика (Hoffmann et Hetru, 1992). В молекуле дефензина можно выделить три участка: гибкий и малоупорядоченный N-концевой, центральный, представленный амфипатической α-спиралью, и С-концевой. С-концевой участок дефензина является β-слоем, сформированным двумя антипараллельными βтяжами (Bonmatin et al., 1992). Дисульфидные мостики стабилизируют вторичную структуру пептида и поддерживают его третичную структуру, которая необходима для максимальной реализации антимикробных свойств молекулы (Bulet, Stocklin, 2005). Два мостика связывают α-спираль с одним из β-тяжей, а третий мостик – другой β-тяж с Nконцевым участком. Дефензины обнаружены у представителей отрядов Diptera, Coleoptera, Hemiptera, Hymenoptera, Trychoptera и Odonata (Dimarcq et al., 1994; Moon et al., 1994; Cociancich et al., 1994a; Chernysh et al., 1996; Rees et al., 1997; Bulet et al., 1992). Антибиотики данной группы токсичны только для грамположительных бактерий и почти не проявляют активности в отношении грамотрицательных бактерий и эукариотических клеток (Lehrer et al.,1993). Помимо дефензинов у насекомых были обнаружены и другие пептиды, стабилизированные дисульфидными мостиками. Один из них – дрозомицин - был описан у плодовой мушки Drosophila melanogaster (Fehlbaum et al., 1994). Молекула дрозомицина состоит из 44 аминокислотных остатков и содержит 4 сульфидных мостика, образуемых 8 остатками цистеина. Дрозомицин оказывает мощное фунгицидное действие. При этом ни на клетки бактерий, ни на клетки животных этот пептид не оказывает токсического эффекта. Другой пептид – танатин – был найден у клопа Podisus maculiventris (Fehlbaum at al., 1996). Танатин – это катионный, относительно гидрофобный пептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка. Единственная дисульфидная связь в молекуле танатина формирует петлю. Танатин обладает широким спектром цитотоксического действия. Он токсичен для многих грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также для клеток грибов. В то же время танатин не проявляет активности в отношении клеток животных. 22 I.2.1.3. Пептиды с регулярно повторяющимися аминокислотами Пептиды с высоким содержанием какой-либо из аминокислот, обычно – пролина, глицина или аргинина, встречаются у насекомых достаточно часто. К данной группе относят апидацин (Casteels et al.,1989) и абецин (Casteels et al., 1990), выделенные из медоносной пчелы Apis mellifera. В молекуле апидацина 29% аминокислотного состава приходится на пролин и 17% - на аргинин. Эти аминокислотные остатки встречаются в виде последовательностей PRP и PP. Пептид, содержащий сходные последовательности – дрозоцин, был выделен из гемолимфы плодовой мушки Drosophila melanogaster (Bulet et al., 1993). К этой же группе пептидов относится пиррокорицин клопа Pyrrhocoris apterus (Cociancich et al., 1994a). И дрозоцин, и пиррокорицин являются гликопептидами. В отличие от пиррокорицина метальниковины – пептиды, обнаруженные в гемолимфе клопов из семейства Pentatomidae, не гликозилированы и проявляют более слабую антимикробную активность (Chernysh et al., 1996). Все перечисленные пептиды активны в отношении грамотрицательных бактерий. Однако есть пептиды, обладающие комбинированной бактерицидной и фунгицидной активностью. К ним, в частности, относится мечниковин, выделенный из дрозофилы (Levashina et. al., 1995). У чешуекрылых обнаружены полипептиды с высоким содержанием глицина – аттацины (Boman, 1991). Существуют две формы аттацинов: кислые и основные. Гомология аминокислотных последовательностей между ними составляет около 79%. Для аттацинов характерен довольно узкий спектр антибактериальной активности, направленный против некоторых грамотрицательных бактерий, обитающих в кишечнике насекомых. Однако этот спектр, вероятно, может быть существенно расширен в присутствии других антимикробных факторов, секретируемых в гемолимфу одновременно с аттацинами. Наиболее близкий аналог аттацинов - полипептид саркотоксин-II был выделен из двукрылого Sarcophaga peregrina (Ando, Natori, 1988). Колеоптерицин и холотрицин - другие глицин-богатые полипептиды с гомологией последовательностей около 30, были обнаружены в гемолимфе жесткокрылых насекомых (Cociancich et al., 1994b; Lee et al., 1994). У клопов пептиды с избыточным содержанием глицина представлены (Cociancich et al., 1994a). Все эти гемиптерицином антибиотики токсичны главным образом для грамотрицательных бактерий. Более широкий спектр антибактериальной активности, который включает также и грамположительные бактерии, характерен для гименоптецина медоносной пчелы (Casteels et al., 1993). Другие глицин-богатые пептиды - диптерицины - описаны у некоторых двукрылых (Chernysh, 1996; Cociancich et al., 1994b; Dimarcq et al., 1988; Ishikawa et al., 1992). 23 Диптерицины состоят из пролин-богатого и глицин-богатого доменов. При этом пос- ледовательность первого домена гомологична таковой апидацина, а последовательность второго - последовательности аттацинов. Диптерицины токсичны только для грамотрицательных бактерий. I.2.2. Механизм действия антимикробных пептидов Амфипатический характер строения молекул большинства антимикробных пептидов обеспечивает их способность к внедрению в билипидный слой мембраны микроорганизма – это ведет к нарушению целостности клетки. Примечательно, что даже в очень высоких концентрациях большинство антимикробных пептидов действует исключительно на патогенные клетки, не повреждая ткани хозяина (Ratcliffe et al., 2011). Дело в том, что в цитоплазматической мембране бактерий содержание кислых фосфолипидов существенно выше, чем в мембране эукариотических клеток (Oren et al., 1998) – в итоге суммарный заряд мембраны становится отрицательным. Это объясняет преимущественное сродство катионных антимикробных пептидов к мембранам микробных клеток. В организме насекомых есть как бактерицидные пептиды, которые более эффективно поражают грамположительную микрофлору, нежели грамотрицательную, так и пептиды, действующие преимущественно против грамотрицательных бактерий. Действие последних, по-видимому, обусловлено взаимодействием с липополисахаридом – основным компонентом наружной мембраны (Boman, 1995). В современной литературе для описания механизма цитотоксического действия антимикробных пептидов предложена модель «бочарной клепки» (Reddy et al., 2004). Первым этапом взаимодействия антибиотика с микробной клеткой является адсорбция нескольких молекул пептида на поверхности мембраны за счет электростатических взаимодействий с ее отрицательно заряженными молекулами. Затем путем гидрофобных взаимодействий молекулы антимикробных пептидов внедряются в липофильную фазу липидного бислоя. Внедрившиеся и ориентированные поперек мембраны молекулы пептида формируют поры с умеренной селективной проницаемостью для анионов. Это приводит к утечке ионов из клетки и, как следствие, деполяризации мембраны. Вода устремляется внутрь клетки, и клетка разрушается (Christensen et al., 1988). Однако, для пролин-богатых пептидов характерен иной механизм действия. Известно, что мишенью для пиррокорицина, дрозоцина и апидацина является белок теплового шока DnaK с молекулярной массой 70 кДа. Связывание антибиотика с DnaK тормозит фолдинг белков патогена (Cudic et al., 2002). Характерно, что время, необходимое для элиминации 24 бактериальной клетки пролин-богатыми пептидами, достигает 6-12 часов, в то время как гибель патогена под действием дефензинов происходит в течение часа (Cudic et al., 2002). Некоторые антимикробные пептиды оказывают не цитотоксический, а цитостатический эффект. Так, например, пептид РР-39 ингибирует белковый синтез в бактериальной клетке и вызывает распад белков, задействованных в процессе репликации бактериальной ДНК. Другой белок, аттацин, ингибирует синтез белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий, не попадая непосредственно внутрь клетки (Reddy et al., 2004). I.2.3. Жировое тело и его роль в синтезе антимикробных пептидов Морфология сформированного жирового тела насекомых различна: в ряде случаев оно представляет собой совокупность рассредоточенных в гемоцеле скоплений клеток, однако преимущественно имеет вид связанных друг с другом тонких лопастей беловатого или желтоватого цвета, обильно пронизанных трахеолами и заполняющих все пространство между внутренними органами. В жировом теле выделяют висцеральный слой, окружающий кишечник, и париетальный слой, расположенный в пространстве между мускулатурой и гиподермой покровов. У двукрылых присутствует еще одна пара лопастей, простирающихся вдоль переднезадней оси тела (Rizki, 1978). На личиночной стадии жировое тело играет роль метаболического центра. В жировом теле происходит запасание питательных веществ, поступающих из кишечника личинки. Помимо пассивного накопления питательных веществ жировое тело является основным органом промежуточного обмена, осуществляя биосинтез и превращение белков, жиров и углеводов. В процессе метаморфоза жировое тело личинки разрушается, и ему на замену приходит имагинальное жировое тело. Первоочередной функцией имагинального жирового тела становится продуцирование вителлогенина – предшественника желтка, необходимого для развития зародыша. Основной тип клеток, составляющих жировое тело, - это трофоциты (адипоциты). Трофоцит имеет одно или несколько ядер неправильной формы и большое количество включений липидной, белковой и углеводной природы. Липиды являются основным запасным веществом. Они обычно сосредоточены в больших вакуолях, заполняющих практически всю цитоплазму клетки. Белковые включения имеют вид электронно-плотных гранул, различающихся по размеру и форме. Углеводы представлены преимущественно гликогеном, сосредоточенным в пространстве, свободном от липидных и белковых гранул (Wigglesworth, 1942; Price, 1973). Цитоплазма, примыкающая к ядру и плазмалемме, лишена 25 каких-либо включений – здесь локализованы клеточные органеллы: митохондрии, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум, лизосомы, пероксисомы и др. (Locke, 1984). Каждый из трофоцитов находится в тесном контакте с гемолимфой (Chapman, 1998). Между жировым телом и гемолимфой происходит постоянный обмен питательными веществами: резервные продукты то поглощаются трофоцитами и откладываются в них про запас, то выделяются в гемолимфу для последующей доставки к различным органам (CruzLandim, 1983). Хотя резервные белки продуцируются жировым телом постоянно, максимальный уровень экспрессии наблюдается на последнем личиночном возрасте (Levenbook, 1985). Белки выбрасываются в гемолимфу, где их концентрация может возрастать до 60 мг/мл. Как только личинка перестает питаться, синтез белков прекращается – трофоциты начинают поглощать белки из гемолимфы и депонировать их в гранулах. Поглощение избирательно: резервные белки захватываются клетками быстро и эффективно, в то время как минорные белковые компоненты гемолимфы – медленно (Kinnear, Thomson, 1975; Marinotti, de Bianchi, 1986). Содержание депонированного белка на этом этапе может составлять 10% от сырой массы жирового тела (Dahlhelm, 1973). У двукрылых процесс поглощения белка является рецептор-опосредованным (Burmester, Scheller, 1992) и обычно происходит в каудальной части жирового тела (Tysell, Butterworth, 1978). Установлено, что именно жировое тело является основным источником плазматических белков (Palli, Locke, 1988), в том числе и антимикробных пептидов (Hoffmann, Reichhart, 2002). При этом антимикробные пептиды составляют лишь часть огромного многообразия гуморальных факторов иммунной защиты, производимых жировым телом. Большой размер и центральное положение в полости тела делают жировое тело ключевым органом иммунной системы, способным не только синтезировать антибиотики, но и быстро создавать эффективные концентрации бактерицидных молекул в гемолимфе. Cпособность синтезировать бактерицидные белки присуща всем клеткам жирового тела (Hoffmann, Hoffmann, 1990). I.2.4. Другие источники антимикробных пептидов Функции иммунокомпетентной ткани жировое тело приобретает лишь на личиночной стадии развития насекомого. Триггером этого процесса, по-видимому, является экдизон. При этом способность продуцировать пептидные антибиотики в ответ на септическое воздействие присуща уже эмбриону, у которого жировое тело еще не развито. Предположительно, на ранних эмбриональных стадиях источником антимикробных пептидов является желток, а на поздних – покровный эпителий (Tzou et al., 2002). 26 Наряду с клетками жирового тела способностью к синтезу пептидных антибиотиков в организме личинки обладают гемоциты. Это заключение основано на данных по изменению уровня экспрессии соответствующих генов в гемоцитах в ответ на воздействие инфекционной (Christophides et al., 2002; Bartholomay et al., 2004; Irving et al., 2005; Johansson et al., 2005) либо неинфекционной (Dimarcq et al., 1997) природы. В одной из работ (Lavine et al., 2005) была предпринята попытка оценить качественный состав антимикробных пептидов, продуцируемых разными типами гемоцитов совки Pseudoplusia includens. Согласно результатам исследования, экспрессия генов, кодирующих антимикробные пептиды, наблюдается лишь в плазматоцитах и гранулоцитах. Муколитический фермент лизоцим при этом синтезируется не только плазматоцитами и гранулоцитами, но и другими типами гемоцитов: сферулоцитами и эноцитоидами. Покровы стенки тела, кишки и трахей обычно рассматриваются как пассивная защита от инфекций. Однако их роль в гуморальном иммунном ответе также велика. Согласно данным фундаментальной работы, проведенной Зу и его коллегами на дрозофиле (Tzou et al., 2000), практически любой барьерный эпителий обладает способностью к синтезу пептидных антибиотиков. Примечательно, что спектр антимикробных пептидов в разных эпителиях неодинаков: дефензин, цекропин, аттацин, мечниковин и диптерицин продуцируются преимущественно эпителием провентрикулюса и средней кишки, в то время как дрозоцин и дрозомицин синтезируются в основном эпителием трахей (Tzou et al., 2000; Tzou et al., 2002). При этом спектр антимикробной активности в любом отдельно взятом барьерном эпителии значительно уступает таковому в жировом теле (Hoffmann, Reichhart, 2002). Участие эпителия в синтезе бактерицидных молекул было продемонстрировано и на других модельных объектах (Brey et al., 1993; Lehane et al., 1997). Так, в покровах тутового шелкопряда в ответ на легкую потертость кутикулы в присутствие бактерий наблюдается экспрессия цекропина в эпителиальных клетках (Brey et al., 1993). Авторы высказывают предположение, что бактерии и компоненты бактериальной клеточной стенки, проникая через кутикулярный матрикс, взаимодействуют с рецепторами эпителиальных клеток, что и приводит к появлению локализованной антимикробной активности. I.2.5. Индукция синтеза антимикробных пептидов Индукция синтеза пептидных антибиотиков у насекомых наблюдается как при септическом заражении, так и при воздействии ряда факторов неинфекционной природы. При этом в литературе детально описаны механизмы исключительно септической индукции, поэтому речь в данном разделе пойдет именно о них. 27 Распознавание поверхностных структур патогена осуществляется либо непосредственно рецепторами иммуноцита, либо через систему плазматических молекул-посредников, передающих информацию о заражении иммунокомпетентной клетке. Следующим этапом иммунного ответа является передача сигнала с рецептора на ядро иммуноцита. Механизмы т. н. ядерного сигналинга у двукрылых детально изучены на примере дрозофилы (Ferrandon et al., 2007). Согласно литературным данным, в клетках жирового тела дрозофилы существует два пути передачи сигнала с рецептора на ядро: Toll и Imd. В основе обоих путей лежит активация цитоплазматических транскрипционных факторов, гомологичных факторам NF-κB млекопитающих (Tzou et al., 2002; Hoffmann, Reichhart, 2002; Hultmark, 2003; Ferrandon et al., 2007). Результатом ядерного сигналинга является экспрессия генов, кодирующих соединения, играющие важную роль в местном и системном иммунном ответе, в частности, антимикробные пептиды. Сигналом к передаче сингала по Toll-пути служит изменение конформации Toll-рецептора при его связывании с лигандом – димером белка Spatzle С-106, локализованным в плазме. Toll-рецептор содержит внеклеточный домен, богатый лейцином, и внутриклеточную часть, гомологичную домену TIR (Toll-IL-1R) рецептора IL-1R млекопитающих. Внутриклеточная часть Toll-рецептора связана с сигнальным комплексом TISC (Toll-induced signaling complex), в состав которого входят белки MyD88, Tube и Pelle, содержащие домен DD (death domain). Связывание Toll-рецептора с лигандом ведет к образованию рецепторного гомодимера и активации TISC. Следствием активации TISC является фосфорилирование и расщепление белка Cactus – ингибитора NF-κB-подобного транскрипционного фактора. В роли транскрипционного фактора у личинок выступает преимущественно Dorsal, у имаго – DIF (Bettencourt et al., 2004). Высвобожденный транскрипционный фактор проникает в ядро иммуноцита и запускает экспрессию генов, кодирующих антимикробные пептиды (Ferrandon et al., 2007). Imd-путь передачи сигнала запускается при связывании рецептора PGRP-LC иммуноцита и, в ряде случаев, плазматического фактора PGRP-LE с пептидогликанами грамотрицательных бактерий. Ключевым элементом этого механизма является белок IMD, который индуцирует фосфорилирование анкиринового белка в комплексе Relish через активацию киназы TAK1 (TGF-β-activated kinase 1) и IκB-киназного комплекса, а также запускает последующий распад комплекса Relish через активацию фактора DREDD (deathrelated ced-3/Nedd2-like protein). Для активации киназы TAK1 и IκB-киназного комплекса необходимы дополнительные белки: FADD (FAS-associated death domain), DREDD и ряд молекул, отвечающих за связывание полиубиквитиновой цепи белка IMD с пока не известным субстратом. Следствием распада комплекса Relish является высвобождение 28 транскрипционного фактора REL, который перемещается в ядро и запускает экспрессию генов, кодирующих антимикробные пептиды (Stöven et al., 2000; Ferrandon et al., 2007). Согласно литературным данным, у насекомых присутствуют только два механизма индукции синтеза антимикробных пептидов: Toll и Imd. Эти механизмы обособлены и независимо активируются при распознавании тех или иных патогенных структур. I.2.6. Роль эпителия и гемоцитов в индукции синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела Вне зависимости от природы повреждения, барьерные эпителии, так или иначе, первыми получают сигнал о разрушающем воздействии и, теоретически, могут являться своеобразным сенсором повреждений, передавая информацию о них жировому телу в обход «классического» механизма распознавания «чужого». Та же роль может быть отведена и гемоцитам, аггрегация которых в месте повреждения наблюдается уже в первые минуты после действия повреждающего агента. I.2.6.1. Роль эпителия в индукции синтеза пептидных антибиотиков Покровы стенки тела, кишки и трахей являются надежной механической преградой для проникновения паразитов из окружающей среды в полость тела насекомого. При повреждении барьерного эпителия запускается каскад реакций, приводящих к свертыванию гемолимфы и меланизации в месте повреждения (Royet, 2004), а также – к появлению в эпителии локализованной антимикробной активности (Brey et al., 1993). Выступая в роли триггера местных иммунных реакций, поврежденный барьерный эпителий синтезирует также ряд регуляторных молекул, активирующих механизмы системной защиты. Связь между местным и системным гуморальным иммунным ответом продемонстрирована на примере некоторых кровососущих насекомых (Hao et al., 2003; Herrera-Ortiz et al., 2011). Являясь зачастую биологическими переносчиками трансмиссивных заболеваний человека и животных, кровососущие насекомые находятся в тесном контакте с патогеном. Это делает кровососущих насекомых прекрасным модельным объектом для изучения механизмов иммунного ответа. Результаты экспериментов на комаре Anopheles albimanus свидетельствуют о том, что индукция системного синтеза антимикробных пептидов имеет место уже тогда, когда паразит Plasmodium berghei локализован еще только в просвете кишки (Herrera-Ortiz et al., 2011). Возможно, это связано с тем, что эпителиоциты способны передавать сигнал о заражении клеткам жирового тела 29 через систему каких-либо химических посредников. На роль таких посредников авторы выдвигают перекись водорода (Н2О2) и окись азота (NO), подтверждая свой выбор рядом фактов. Во-первых, эти соединения активно синтезируются эпителиоцитами средней кишки комаров, инфицированных плазмодием. Во-вторых, устойчивость комаров к инфекции находится в прямой зависимости от концентрации Н2О2 и NO в организме насекомого. И, втретьих, добавление Н2О2 и NO в культуру тканей брюшка, в частности жирового тела, приводит к достоверно значимому повышению уровня экспрессии антимикробных пептидов в иммунокомпетентных клетках. Другим источником эпителиальных регуляторных молекул представляется базальная мембрана, выстилающая гемоцель и внутренние органы насекомого (Lackie, 1988). Содержимое базальной мембраны в норме не контактирует с иммунокомпетентными клетками, однако при повреждении барьерного эпителия компоненты базальной мембраны попадают в гемолимфу и, теоретически, могут оказывать какой-либо иммуностимулирующий эффект на иммуноциты, минуя систему распознающих факторов плазмы. Подобные свойства отмечены у фибриллярного белка – коллагена IV (Altincicek, Vilcinskas, 2006): инъекция фрагментов коллагена личинкам моли Galleria mellonella многократно повышала уровень экспрессии генов, кодирующих антимикробные пептиды, в иммунокомпетентных клетках, в то время как инъекция фрагментов других фибриллярных белков – фибронектина и ламинина – не оказывала подобного эффекта. По мнению авторов, коллаген представляет собой субстрат для действия микробных и эндогенных ферментов – металлопротеаз. Разрушение базальной мембраны и расщепление коллагена металлопротеазами лежит в основе системы, альтернативной системе распознавания «чужого». В этой альтернативной системе наличие поверхностных структур патогена не является необходимым условием для запуска системного иммунного ответа. Кроме того, эпителиоциты покровов, кишки и трахей являются источником молекул семейства PGRP, играющих ключевую роль в распознавании компонентов клеточной стенки бактерий (Werner et al., 2000; Takehana et al., 2004). I.2.6.2. Роль гемоцитов в индукции синтеза пептидных антибиотиков Гемоциты определяют протекание клеточных защитных реакций и, наряду с клетками жирового тела, служат источником пептидных антибиотиков (Lavine et al., 2005). При этом гемоциты, по-видимому, синтезируют ряд соединений, регулирующих синтез антимикробных пептидов другими иммунокомпетентными клетками. Как и эпителиоциты, гемоциты выделяют факторы семейства PGRP (Werner et al., 2000; Takehana et al., 2004). 30 Эксперименты на гемоцитах дрозофилы демонстрируют способность этих клеток к синтезу цитокиноподобных соединений. Одним из таких соединений является белок Upd-3 – лиганд к рецептору Dome, активация которого приводит к экспрессии ряда иммунных генов в клетках жирового тела по JAK/STAT-пути. Другим регуляторным фактором, синтезируемым гемоцитами, является Spatzle. Кроме того, из лизосом гемоцитов дрозофилы выделен белок, кодируемый геном psidin. Данный белок необходим для экспрессии гена дефензина в клетках жирового тела (Brennan et al., 2007). Примечательно, что именно гемоциты принимают участие в восстановлении базальной мембраны (Wigglesworth, 1973) и являются источником коллагена IV, речь о иммуномодуляторных свойствах которого шла в предыдущем разделе (Adachi et al., 2005). I.2.7. Синтез антимикробных пептидов у Calliphora vicina Качественный состав антимикробных пептидов гемолимфы C.vicina детально изучен (Черныш, Гордя, 2011; Chernysh et al., 2000). Согласно литературным данным, эндогенные антибиотики синей мясной мухи принадлежат к четырем семействам: дефензинов, цекропинов, диптерицинов и пролин-богатых пептидов. Группа дефензинов представлена у личинки C.vicina, по крайней мере, четырьмя изоформами с молекулярными массами 3886.6, 4032.0, 4091.3 и 4114.3 кДа. Дефензины C. vicina активны в отношении грамположительных бактерий, а также некоторых гифообразующих грибов. Цекропин каллифоры – это 4156.0 кДа пептид, токсичный только для грамотрицательных бактерий. Группа глицин-богатых пептидов – диптерицинов – представлена четырьмя изоформами с массами 8886.2, 8913.9, 8999.7 и 9029.1 кДа. Им присуща антиграмотрицательная и фунгицидная активность. В дополнение к указанным антибиотикам из гемолимфы инфицированных личинок C.vicina были выделены четыре пролин-богатых пептида с молекулярными массами 2987.0, 3025.7, 3040.0 и 3048.6 кДа, токсичные для грамположительных бактерий. Следует, однако, отметить, что все перечисленные молекулы экстрагированы из плазмы исключительно диапаузирующих личинок. Что касается антибиотиков, продуцируемых иммуноцитами на других стадиях развития синей мясной мухи, – о них практически ничего не известно. В литературе имеются лишь косвенные доказательства того, что состав антимикробных пептидов личинки и пупария синей мясной мухи различаются (Chernysh et al., 2000). Так, по данным хроматографического картирования, к 3-му дню пупаризации в плазме насекомого появляются молекулы с прямой антибактериальной активностью, – более гидрофильные, чем антимикробные пептиды инфицированной личинки. Интересно, что 31 синтез этих гидрофильных антибиотиков конститутивен, т.е. не зависит от наличия иммуногена в организме. С другой стороны, среди антибиотиков, экстрагированных из пупария, присутствуют и индуцибельные молекулы. Часть из них по степени гидрофобности соответствуют антимикробным пептидам личинки, другие – гораздо более гидрофобны, чем антибиотики, описанные для C.vicina. Титр бактерицидных молекул в организме синей мясной мухи подвержен онтогенетической вариабельности. Пик антимикробной активности приходится на период диапаузы. При переходе личинки к активному развитию, титр антимикробных пептидов, выделяемых иммуноцитами в ответ на заражение насекомого бактериями, снижается (Chernysh et al., 2000). В течение первых дней пупаризации антимикробная активность плазмы снова повышается и затем идет на спад (Chernysh et al., 1995). Вопрос о динамике синтеза антимикробных пептидов у имаго и у «питающихся» личинок остается открытым. I.3. Взаимодействие иммунной и нейроэндокринной систем I.3.1. Структурная организация нейроэндокринной системы Строение нейроэндокринной системы насекомых вообще и высших двукрылых в частности детально освещено в литературе (Виноградова, 1984). Нервная система личинок мух отличается высокой концентрацией составляющих ее элементов. Крупная ганглионарная масса (далее – мозг) располагается в 3-ем грудном и 1-ом брюшном сегментах. Она включает большой надглоточный ганглий и синганглий, образовавшийся в результате слияния подглоточного, трех грудных и всех брюшных ганглиев. От этой структуры отходят нервы к различным органам личинки. Доминирующее местоположение в эндокринной системе насекомых занимают нейросекреторные клетки мозга. Они синтезируют тропные факторы, регулирующие работу проторакальных желез (проторакотропный и проторакостатический гормоны) и прилежащих тел (аллатотропный и аллатостатический гормоны), а также ряд пептидов, модифицирующих скорость и направление метаболизма в жировом теле, мальпигиевых сосудах и других тканях (Черныш и др., 2007). Перед выделением в гемолимфу секреторные продукты мозга обычно накапливаются в кардиальных телах. Помимо запасающей функции кардиальные тела личинок выполняют функции секреторного органа: нейросекреторные клетки кардиальных тел синтезируют ряд гормонально активных пептидов и биогенных аминов. Активность этих клеток находится под непосредственным контролем нейронов надглоточного ганглия. Кардиальное тело служит 32 главным нейрогемальным органом. По аллатальным нервам секрет из кардиального тела выводится к прилежащему телу и проторакальным железам (Черныш и др., 2007). Прилежащие продуцируют тела – источник экдистероиды. ювенильного Личинкам высших гормона, проторакальные двукрылых свойственно железы слияние прилежащих тел с кардиальными телами и проторакальными железами в сложное образование – кольцевую железу. Она прилегает к надглоточному ганглию сзади, располагаясь вокруг аорты (Виноградова, 1984). I.3.2. Основные гормоны насекомых Контроль морфогенетических и метаболических процессов со стороны нейроэндокринной системы осуществляется при посредничестве гормонов, важнейшими из которых являются экдизон, ювенильный гормон, адипокинетический гормон и биогенные амины. I.3.2.1. Экдистероиды Экдистероиды синтезируются проторакальными железами. Из гормонов этой группы наибольшее распространение предшественник – экдизон. у насекомых Наиболее получили полно изучено 20-гидроксиэкдизон участие и экдистероидов его в морфогенетических процессах, а именно – в регуляции линек, метаморфоза и репродукции. Уровень синтеза этих гормонов характеризуется строгой цикличностью: в период эмбриогенеза и в межлиночный период у личинок титр экдистероидов минимален, а за несколько часов до линьки происходит повышение титра этих гормонов. У куколки экдистероиды инициируют лизис тканей и развитие зачатков из крыловых дисков, у имаго – стимулируют развитие половых желез. I.3.2.2. Ювенильный гормон Ювенильный гормон синтезируется прилежащими телами. Он регулирует обмен веществ в организме насекомого и опосредует морфогенетические процессы, а также индуцирует вителлогенез и управляет половым поведением у имаго. Ювенильный гормон вызывает задержку метаморфоза и определяет переход насекомого в диапаузное состояние. Метаморфоз всегда проходит при пониженном уровне этого гормона. На эмбриональной и куколочной стадиях ювенильный гормон практически не обнаруживается. На стадии личинки уровень синтеза этого гормона максимален и имеет четко выраженную цикличность: 33 увеличение титра ювенильного гормона наблюдается в предлиночный период. На имагинальной стадии повышение титра происходит в период спаривания и яйцекладки. Кроме того, ювенильный гормон обладает проторакотропной активностью, стимулируя синтез экдистероидов проторакальными железами (Раушенбах, 1990). I.3.2.3. Адипокинетический гормон Мобилизация липидов, депонированных в жировом теле насекомых, осуществляется адипокинетическим гормоном – олигопептидом, синтезируемым преимущественно железистой долей кардиальных тел. Функция этого гормона заключается в энергетическом обеспечении длительных физических нагрузок, в особенности работы крыловой мускулатуры при полете. Помимо влияния на метаболизм липидов и углеводов установлено стимулирующее действие адипокинетического гормона на мотонейроны центральной нервной системы насекомых (Milde et al., 1995) – это может иметь значение для запуска или поддержания репертуара поведенческих реакций. I.3.2.4. Биогенные амины В мозге, кардиальных телах и ганглиях брюшной нервной цепочки насекомых синтезируются вещества из группы биогенных аминов: октопамин, допамин, тирамин, 5гидрокситриптамин и норадреналин. Биогенные амины влияют на метаболизм углеводов и липидов в организме насекомого. Считается, что именно октопамин обеспечивает быструю мобилизацию запасных липидов, в то время как адипокинетический гормон подключается в более поздние сроки. Стимулируя расщепление гликогена, биогенные амины обеспечивают двигательные нейроны энергией (Steel, 1985). Биогенные амины контролируют секрецию адипокинетического гормона и других гормонов (Passier et al., 1995). I.3.3 Иммуно-нейроэндокринные взаимодействия Нейроэндокринная система регулирует и координирует деятельность всех органов и систем, обеспечивая адаптацию организма к меняющимся условиям внешней и внутренней среды. Изучение нейрогуморальной регуляции иммунных процессов представляет собой одно из главных направлений современной иммунологии человека и высших животных. Интерес обусловлен отчасти проблемой предупреждения и лечения аутоиммунных заболеваний, 34 причиной которых является нарушение взаимодействия иммунной и нейроэндокринной систем. Изучение иммуно-нейроэндокринных взаимодействий у беспозвоночных животных началось с опытов С. И. Метальникова (Brey, 1998). Им был исследован эффект оперативного выключения крупных отделов нервной системы на динамику иммунного ответа у инфицированных гусениц восковой моли Galleria mellonella. Полученные результаты свидетельствуют о том, что разрушение одного из грудных ганглиев нервной цепочки вызывает последующую гибель всех опытных насекомых от заражения. Количество фагоцитов в гемолимфе таких насекомых было чрезвычайно низким. Хотя результаты опытов, в частности, характер влияния грудного ганглия на иммунный ответ, не получили объяснения, именно благодаря этим исследованиям впервые была установлена важная роль нервной системы в инфекционных процессах у беспозвоночных. В основе другого подхода к изучению иммуно-нейроэндокринных взаимодействий in vivo лежит изоляция иммунокомпетентных клеток от нейроэндокринного центра путем наложения лигатуры. Изолирующая лигатура позволяет оценить степень влияния нейроэндокринной системы на протекание различных иммунных реакций и, с другой стороны, – степень автономности иммунной системы. На том же модельном объекте – гусеницах восковой моли Galleria mellonella – было показано, что наложение лигатуры позади II сегмента тела приводит к двукратному уменьшению общего количества свободно циркулирующих гемоцитов в организме насекомого, в то время как наложение лигатуры позади головы не оказывает подобного эффекта (Jones, Liu, 1969). Техника лигатур была также использована при изучении взаимодействий «паразит-хозяин» у мухи Drosophila algonquin: наложение личинке изолирующей лигатуры после ее заражения паразитоидом Pseudeucoila bochei приводило к уменьшению количества образуемых гемоцитами капсул в задней части тела. При этом снижалась и фенолоксидазная активность (Nappi, 1975). Нейроэндокринная регуляция иммунных процессов, по-видимому, имеет место при стрессорном воздействии. Так, например, длительное покачивание гусениц восковой моли Galleria mellonella приводит к увеличению количества свободно циркулирующих гемоцитов, также повышается уровень экспрессии антимикробного пептида галиомицина в иммунокомпетентных клетках (Mowlds et al., 2008). Таким образом, влиянию со стороны нейроэндокринной системы подвержены как клеточные, так и гуморальные защитные процессы. На самом деле, разрозненных данных о влиянии нейроэндокринной системы на протекание иммунных процессов у насекомых накоплено немало. Однако единого мнения о том, какие физиологические механизмы лежат в основе этих явлений, нет. 35 I.3.4. Влияние нейроэндокринной системы на иммунные процессы у Calliphora vicina Предпосылку для изучения иммуно-нейроэндокринных взаимодействий у насекомых зачастую создает, прежде всего, онтогенетическая вариабельность иммунного ответа. Так, например, способность иммунокомпетентных клеток выделять антимикробные молекулы в значительной степени зависит от стадии развития, на которой происходит инфицирование. В жизненном цикле насекомого есть периоды, когда иммунный ответ очень слабый и наоборот (Wicker et al., 1990; Samakovlis et al., 1990; Spence et al., 1992). А поскольку все онтогенетические преобразования находятся под строгим контролем со стороны нейроэндокринной системы, есть основания полагать, что и иммунные процессы подчинены этому правилу. Начало изучению иммуно-нейроэндокринных взаимодействий у C.vicina положил Кроссли (Crossley, 1964, 1968). Он обратил внимание на изменение количества фагоцитов в онтогенезе синей мясной мухи. После того, как личинка перестает питаться и начинает готовиться к окукливанию, количество фагоцитов в ее организме резко возрастает. Однако если личинке наложить изолирующую лигатуру (на уровне IV сегмента) в то время, когда она еще не окончила питание, количество фагоцитов в задней части тела останется низким. С другой стороны, досрочное введение личинке β-экдизона провоцирует преждевременное увеличение количества фагоцитов в гемолимфе. Точно так же, инъекция β-экдизона позади изолирующей лигатуры, восстанавливает нормальное содержание фагоцитов в задней части тела насекомого. В опытах по изучению влияния нейроэндокринной системы на синтез пептидных антибиотиков у личинки мухи C.vicina наложение изолирующей лигатуры не оказывает влияния на титр антимикробных пептидов, выделяемых иммуноцитами при заражении насекомого бактериями (Черныш и др., 1998). С другой стороны, известно, что состав антимикробных пептидов C.vicina, продуцируемых в ответ на септическое заражение, подвержен качественным и количественным изменениям в онтогенезе (Chernysh et al., 2000). Результаты сопоставления данных по динамике антимикробных пептидов с данными по изменению титра экдистероидов на протяжении жизненного цикла мухи свидетельствуют о том, что снижение антимикробной активности всегда следует за повышением титра гормона. Этот факт является косвенным доказательством иммуносупрессорных свойств экдистероидов (Chernysh et al., 1995). Следует, однако, отметить, что нейроэндокринная система может выступать не только в роли супрессора, но и в роли индуктора защитных реакций. Нейрогенная индукция синтеза 36 антимикробных пептидов была описана у личинки мухи Calliphora vicina (Черныш и др., 1998). Показано, что хроническое механическое воздействие в виде раздражающей лигатуры, наложенной на уровне I сегмента тела, активирует синтез антимикробных пептидов в организме личинки. Примечательно, что наложение изолирующей лигатуры сразу после начала стрессорного воздействия снимает иммуностимулирующий эффект раздражающей лигатуры. Экспериментальным путем установлено, что время, необходимое для восприятия воздействия и передачи сигнала иммунокомпетентным клеткам, составляет не более 1 минуты. Изоляция мозга по истечении этого срока не влияет на индукцию синтеза антимикробных пептидов. I.3.5. Роль гормонов в регуляции иммунных процессов у насекомых В нейроэндокринологии насекомых гормоны традиционно рассматривают как регуляторы процессов развития и репродукции, уделяя их роли в защитных реакциях существенно меньшее внимание. Тем не менее, работы последнего десятилетия содержат информацию о влиянии морфогенетических гормонов на клеточные и гуморальные иммунные процессы. Но, к сожалению, эти данные разрознены и зачастую противоречивы, однако представляют собой неопровержимые доказательства регуляции иммунных реакций нейроэндокринной системой. Экдистероиды. В нормальных условиях ключевой функциями экдистероидов являются регуляция линек, метаморфоза и репродукции. Однако появление в гемолимфе травмированных насекомых экдистероидов в количестве, не достигающем морфогенетически значимого уровня, вызывает разнообразные протекторные эффекты, сумма которых приводит к стимуляции неспецифической резистентности организма или его отдельных систем к повреждениям (Черныш и др., 2007). В частности, это может быть связано с тем, что экдистероиды регулируют клеточные иммунные реакции, стимулируя образование узелков и капсул гемоцитами (Franssens et al., 2005). Кроме того, под действием экдистероидов возрастает способность эпителия и клеток жирового тела синтезировать гемолин, играющий важную роль в распознавании чужеродных структур (Roxström-Lindquist, 2005; Aye et al., 2008). Экдистероиды активируют экспрессию генов, кодирующих антимикробные пептиды (Dimarcq et al., 1997), подавляя при этом работу другой составляющей гуморального иммунного ответа – фенолоксидазной системы (Zou et al., 2005). В то же время, другими авторами отмечен противоположный, супрессорный, эффект, оказываемый экдистероидами на клетки жирового тела: показано, что добавление гормона при иммунизации вызывает дозозависимое снижение антимикробной активности в гемолимфе (Chernysh et al., 1995). 37 Ювенильный гормон. В противоположность экдистероидам, ювенильный гормон подавляет процессы капсулообразования (Khafagi et Hegazi, 2001; Rantala et al., 2003; Franssens et al., 2006). Так, у фуражиров медоносной пчелы Apis mellifera было обнаружено резкое снижение клеточного иммунитета после выхода из гнезда, связанное с гибелью гемоцитов. Причиной этому явилось повышение титра ювенильного гормона (Amdam et al., 2005). Помимо ингибирования клеточных реакций, ювенильный гормон способен оказывать ингибирующее действие на реакции фенолоксидазной системы – процесс, наблюдаемый в организме жука Tenebrio molitor (Rantala et al., 2003). При этом гормон усиливает секрецию антимикробного пептида цератотоксина А половыми железами Ceratitis capitata (Manetti et al., 1997). Адипокинетический гормон. В нормальных условиях функция адипокинетического гормона заключается в энергетическом обеспечении длительных физических нагрузок (Milde et al., 1995). Роль адипокинетического гормона в инфекционном процессе у беспозвоночных продемонстрирована серией опытов на прямокрылых. Влияние адипокинетического гормона на иммунный ответ саранчи Locusta migratoria выражается в увеличении количества капсул в гемолимфе и пролонгировании фенолоксидазной активности. Подобный эффект имел место при введении гормона одновременно с инъекцией ламинарина или липополисахарида – компонентов клеточной стенки микроорганизмов (Goldsworthy et al., 2002; Goldsworthy et al., 2003). Биогенные амины. Как отмечалось ранее, функции отдельных представителей этого семейства гормонов в нормальных условиях могут существенно отличаться. Участие биогенных аминов в иммунных реакциях, по-видимому, также различно. Под действием октопамина и 5-гидрокситриптамина усиливается связывание гемоцитов таракана Periplaneta americana с бактериями (Dunphy, Downer, 1994) – как следствие, активируются процессы фагоцитоза и инкапсуляции (Baines et al., 1992). Введение насекомым биогенного амина допамина, напротив, приводит к массовой гибели гемоцитов, снижению их фагоцитарной активности и ингибированию инкапсуляции, а также к замедлению реакций фенолоксидазной системы (Khafagi et Hegazi, 2001; Rantala et al., 2003; Amdam et al., 2005; Li et al., 2005). Таким образом, помимо септической индукции синтеза антимикробных пептидов, в организме насекомых присутствуют механизмы асептической индукции антимикробной активности. В основе некоторых из них, по-видимому, лежит гормональная регуляция со стороны нейроэндокринной системы. 38 Глава II. Материал и методы II.1. Биологический материал Простота культивирования мясных мух в лабораторных условиях, возможность массового разведения, высокая жизнеспособность и невосприимчивость к заболеваниям сделали их излюбленным модельным объектом различных физиологических исследований (Виноградова, 1984). Внимание автора данной работы было сосредоточено на мухах семейства Calliphoridae – Calliphora vicina (Россия, Санкт-Петербург), Calliphora vomitoria (Польша), Luculia sericata (Англия), Lucilia сaesar (Россия, Москва) – и, в меньшей мере, – Muscidae – комнатной мухе Musca domestica (происхождение популяции неизвестно). Для выбранных видов мухкаллифорид характерна личиночная диапауза, для комнатной мухи – куколочная. Наступление диапаузы у личинок мух-каллифорид данных видов происходит при сочетании короткого фотопериода во время оогенеза самок и низких температур в период развития преимагинальных фаз (Зиновьева, Виноградова, 1972; Виноградова, 1991; Несин, личное сообщение; Ring, 1967) Диапаузирующим личинкам свойственны остановка развития и неспособность к пупаризации. Возобновление развития наблюдается при повышении температуры либо в результате длительного охлаждения при низких температурах. В связи с этим, имаго выращивали в условиях короткого дня (12С : 12Т) при температуре от +20 °С до +22 °С. Имаго содержали в садках квадратной формы объемом около 30 дм³, обтянутых мельничным газом. Плотность содержания имаго варьировала в пределах 0.3 – 0.5 дм³ на особь. Кормом служили свекловичный сахар, сухое молоко, свежее мясо. Личинок содержали в темноте при следующих температурах: +20 °С (в первые сутки после отрождения), от +8 °С до +12 °С (на стадии активного питания), +6 °С (на стадии очищения кишечника от остатков пищи), от 0 °С до +2 °С (на стадии диапаузы). Исключение составляли Lucilia сaesar и Musca domestica: температура содержания личинок L.caesar не превышала +10 °С, а M.domestica – +20 °С. В опытах использовали исключительно диапаузирующих личинок мух-каллифорид и закончивших питание личинок комнатной мухи. 39 II.2. Методы II.2.1. Микрохирургические вмешательства II.2.1.1. Инфицирование насекомых Иммунный ответ индуцировали проколом кутикулы насекомых тонкой иглой (минуция 00), смоченной в концентрированной суспензии клеток кишечной палочки Escherichia coli штамма D31 (2x1011 клеток/мл) либо кокка Micrococcus luteus штамма А270 (2x1011 клеток/мл), либо смесью этих бактерий. Концентрировали бактерий следующим образом: питательную среду с бактериями центрифугировали в течение 5 минут при 1600 g, после чего надосадок сливали, а осадок использовали в опыте. II.2.1.2. Наложение лигатур и термическое воздействие В качестве других стрессорных агентов использовали раздражающую лигатуру и термический ожог. В первом случае личинок перевязывали хлопковой нитью на уровне I сегмента тела (Рис. 2, А). Во втором – личинок прижигали препаровальной иглой, прокаленной над пламенем спиртовки. Средний размер ожога составлял 3 мм. Ожог выглядел как темноватая полоска в месте прикосновения иглы, окруженная более светлой по сравнению с интактными покровами областью (Рис. 2, В). В случае легкого ожога пораженный участок представлял собой белое пятно. В некоторых случаях при сильном ожоге в области повреждения происходила склеротизация. Для выявления роли нейроэндокринной системы в иммунном ответе некоторым личинкам перед воздействием стрессорного фактора накладывали лигатуру, изолирующую иммунокомпетентные клетки от кольцевой железы (Рис. 2, Б). Рис. 2. Раздражающая лигатура (А), изолирующая лигатура (Б) и термический ожог (В). 40 II.2.1.3. Сбор гемолимфы и отделение плазмы Перед сбором гемолимфы поверхность тела личинок стерилизовали 70% раствором этилового спирта, промывали дистиллированной водой и подсушивали на фильтровальной бумаге. Гемолимфу личинок собирали через прокол кутикулы либо индивидуально от каждой особи в лунки микропланшета, либо от нескольких особей в полипропиленовые пробирки, охлажденные до 0 °C. В одном случае – гемолимфу сразу же использовали в антимикробном тесте (см. далее). В другом – проводили разделение гемолимфы на бесклеточную часть – плазму, и клеточную составляющую – гемоциты. Для этого гемолимфу центрифугировали в течение 5 минут при 70 g в условиях комнатной температуры. Плазму подвергали дальнейшему фракционированию (см. раздел II.2.2.). II.2.1.4. Отделение покровов Перед отделением покровов поверхность тела личинок стерилизовали 70% раствором этилового спирта, промывали дистиллированной водой и подсушивали на фильтровальной бумаге. Заднюю часть тела насекомого отсекали ножницами и переносили личинку на предметное стекло бинокуляра в каплю физиологического раствора. Затем отсекали переднюю часть тела личинки и делали сквозной продольный разрез (Рис. 3). Препаровальной иглой покровы очищали от жирового тела, кишечника и трахей. После предварительной промывки покровы переносили в солевой раствор, из расчета 1 мл культуральной среды на 10 покровов. Культуральная среда содержала пенициллин и стрептомицин в концентрации соответственно 100 ЕД и 100 мкг на 1 мл среды (см. раздел IV.1.4.). Культуру инкубировали при температуре +25 °С. Рис. 3. Принцип отделения покровов 41 II.2.1.5. Выделение жирового тела Перед выделением жирового тела поверхность тела личинок стерилизовали 70% раствором этилового спирта, промывали дистиллированной водой и подсушивали на фильтровальной бумаге. Заднюю часть тела личинки отсекали ножницами и извлекали жировое тело в комплексе с трахеями, кишечником и мальпигиевыми сосудами в чашку Петри, заполненную физиологическим раствором. Затем жировое тело очищали от трахей, кишечника, мальпигиевых сосудов и, после предварительной промывки, переносили в лунку планшета, заполненную культуральной средой. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин из расчета соответственно 100 ЕД и 100 мкг на 1 мл среды, либо норфлоксацин из расчета 30 мкг на 1 мл среды (см. раздел IV.1.4.). Культуру жирового тела инкубировали при температуре +25 °С. II.2.1.6. Определение жизнеспособности культивируемых клеток Жизнеспособность клеток жирового тела оценивали методом включения красителя трипанового синего (Sigma). Краситель разводили физиологическим раствором до концентрации 0,1% и добавляли в культуру в соотношении 700 мкл раствора красителя к 200 мкл культуральной среды. По истечении 5 минут жировое тело переносили в чистый физиологический раствор. После краткосрочной промывки лопасти жирового тела расправляли на предметном стекле. Подсчет погибших клеток проводили, используя 30- или 100-кратное увеличение микроскопа либо бинокуляра. Погибшими считали клетки темнокоричневого (под микроскопом) либо темно-синего (под бинокуляром) цвета. II.2.2. Методы концентрации и очистки веществ II.2.2.1. Избирательная денатурация под действием температуры Плазма интактных личинок обладает прямой антимикробной активностью, и это создает некоторые препятствия для изучения ее иммуномодуляторных свойств. Для инактивации бактерицидных компонентов плазмы материал подвергали предварительной термической обработке. Открытую центрифужную пробирку с плазмой ставили в воду, нагретую до 90-100°С, на 2 минуты и, придерживая пробирку пинцетом, помешивали содержимое металлическим 42 шпателем. За это время основная масса белков плазмы денатурировала, образуя сгустки твердой консистенции. Для удаления денатурированного белка пробирку с плазмой центрифугировали в течение 15 минут при 10 000 g в условиях комнатной температуры. Надосадок (термостабильную составляющую плазмы) использовали в опытах. II.2.2.2. Метод твердофазной экстракции Экстракцию антимикробных пептидов и иммуномодуляторных молекул производили на картриджах Sep-Pak C18 (Waters). Образцы подкисляли равным по объему количеством 0.1% водного раствора кислоты (уксусной – для экстракции регуляторных факторов плазмы; трифторуксусной – для экстракции антимикробных пептидов) и центрифугировали в течение 5 минут при 10000 g для удаления нерастворимого осадка. Картридж активировали 5 мл растворителя (метанола либо ацетонитрила) и промывали 5 мл 0,05% водного раствора кислоты (уксусной либо трифторуксусной). Затем на картридж последовательно наносили образец и 5 мл 0.05% водного раствора кислоты. Элюат представлял собой экстракт гидрофильных соединений. Умеренно гидрофобные вещества элюировали с картриджа 0.05% водным раствором кислоты с 50%-ным содержанием ацетонитрила. На заключительном этапе картридж промывали 5 мл растворителя. Собранный элюат содержал сильногидрофобные соединения. Полученные фракции подвергали лиофилизации на вакуумной сушилке Labconco. II.2.2.3. Метод ультрафильтрации Ультрафильтрацию проводили на колонке Centricon-100 (Amicon), используя фильтр с номинально отсекаемой молекулярной массой 3 кДа. Образец термически обработанной плазмы наносили на указанную колонку и центрифугировали в течение часа при 10 000 g. Фильтрат использовали в опытах. II.2.2.4. Хроматографическое фракционирование Хроматографическое фракционирование осуществляли в режиме ОФ ВЭЖХ (обращенофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии) на хроматографе Gold System с детектором Beckman 166A (Beckman). Выбор данного метода объясняется его высокой эффективностью для разделения пептидов и полипептидов (Chicz, Regnier, 1990). 43 Для хроматографии использовали колонки Chemco Pak C18 (4x100мм, Chemco) и Vydac C18 (5x250мм, Waters). Колонку уравновешивали 0.1% раствором ТФУ и наносили подкисленный образец. Пептиды элюировали линейным градиентом ацетонитрила от 0 до 50% в течение 50 мин. Элюат собирали по 1 мл в виалы при скорости элюции 1 мл/мин, регистрируя изменение поглощения света с длинной волны 220 нм. Полученные фракции сушили в вакууме. II.2.2.5. Масс-спектрометрия Для масс-спектрометрического анализа органических соединений используют два различных метода ионизации: метод ионизации при атмосферном давлении - ионизация в электроспрее (ESI=electrospray ionization) и ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI-TOF= matrix assisted lazer desorption ionization-time of flight). В первом случае используется ионизация электрораспылением анализируемого раствора при атмосферном давлении, позволяющая получать квазимолекулярные ионы термолабильных соединений непосредственно из раствора. Ионы из области ионизации при атмосферном давлении через систему дифференциальной откачки транспортируются в высоковакуумную область масс-анализатора. В качестве масс-анализатора используется времяпролетный анализатор с ортогональным вводом ионов. В методе MALDI-TOF фотоны лазерного луча ионизуют и испаряют матрицу мишени, на которую нанесен образец, а образующиеся из матрицы ионы ионизуют молекулы образца, не разрушая их. Для определения молекулярных масс антимикробных пептидов, содержащихся в хроматографической фракции, автором выбран метод ESI. Исследования с использованием метода ESI выполнены на базе лаборатории масспектрометрии Института аналитического приборостроения (г. Санкт-Петербург). II.2.3. Анализ антимикробной активности материала Бактерицидную активность материала определяли при помощи стандартного метода агаровых пластинок (Lambert et al., 1989), используя в качестве тест-организмов грамотрицательную бактерию Escherichia coli штамма D31 и грамположительный кокк Micrococcus luteus штамма дикого типа А270. Выбор этих штаммов объясняется их высокой чувствительностью к антимикробным пептидам насекомых. Культуры бактерий были предоставлены лабораторией молекулярных основ иммунитета и развития насекомых Института молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция). 44 Тестирование антимикробной активности производили следующим образом. Стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 9 см заливали 7.5 мл агаровой среды (LB agar, Invitrogen, 32 мг сухого вещества/мл), содержащей бактериальные клетки M.luteus (5×107 клеток/мл). Аликвоты анализируемого образца наносили на поверхность твердой агаровой среды, содержащей бактериальные клетки E.coli и M.luteus. Чашки Петри со средами инкубировали в течение суток в термостате при температуре +37 °С. После инкубации среда в чашках становилась непрозрачной вследствие появления видимых бактериальных колоний, за исключением области вокруг нанесенных проб, в пределах которой антимикробные вещества подавляли рост бактерий (Рис.4). Рис.4. Определение антимикробной активности образца методом агаровых пластин. Так как площадь свободной от бактерий области пропорциональна содержанию цитотоксических пептидов в пробе, описанный метод использовали для количественного определения антимикробной активности материала. Суммарную активность пептидов, токсичных для грамотрицательных бактерий, тестировали на E.coli, для грамположительных бактерий - на M.luteus. Помимо оценки титра антибиотиков, содержащихся в образце, данный метод позволяет определить степень стерильности тестируемого материала. Так, появление колоний посторонних бактерий на поверхности агаровой среды в местах нанесения аликвот свидетельствует о контаминации пробы. 45 II.2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных Статистическая обработка включала вычисление среднего арифметического и ошибки среднего. Достоверность количественных различий между разными вариантами опыта определяли с помощью критерия Стьюдента для независимых выборок, парного критерия Стьюдента и однофакторного дисперсионного анализа. Достоверность качественных различий оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни. Различия принимались за достоверные, если вероятность ошибки была меньше 0.05. 46 Глава III. Индукция синтеза антимикробных пептидов in vivo Поскольку жировое тело является основным источником антимикробных пептидов в организме личинки мухи, накопление антибиотиков в гемолимфе насекомого обусловлено, в первую очередь, активностью именно этой популяции иммунокомпетентных клеток. В серии опытов, выполненных на дрозофиле и других модельных объектах, показано, что для двукрылых характерен индуцибельный синтез бактерицидных молекул (Hultmark,1993; Chernysh et al, 1995). Это означает, что в нормальных условиях иммунокомпетентные клетки выделяют незначительное количество антимикробных пептидов либо не продуцируют их вовсе. Как следствие, гемолимфа интактных насекомых имеет очень низкую антимикробную активность. В случае инфицирования насекомого либо при воздействии стрессорных факторов неинфекционной природы иммуноциты, главным образом, клетки жирового тела, начинают активно синтезировать антимикробные пептиды и бактерицидные свойства гемолимфы повышаются. Согласно литературным данным, индуктором антимикробной активности иммунокомпетентных клеток являются компоненты клеточной стенки бактерий и грибков: при их контакте с гемолимфой запускается сложный механизм распознавания «чужого» и передачи информации о заражении клеткам жирового тела (Hoffmann, Reichart, 1997). Результатом распознавания является экспрессия «антимикробных» генов в иммуноцитах и выделение в гемолимфу целого спектра антимикробных пептидов, токсичных для грамположительных и грамотрицательных бактерий, некоторых грибов и простейших. Антимикробная активность гемолимфы заметно повышается уже через несколько часов после инфицирования (Hultmark, 1993) и достигает максимума спустя сутки с момента заражения (Trenczec, Faye, 1988). Помимо механизма септической индукции синтеза антимикробных пептидов у насекомых существуют механизмы асептической, в частности нейрогенной, индукции иммунного ответа. Асептическое стрессорное воздействие, наряду с факторами инфекционной природы, приводит к повышению антимикробной активности клеток жирового тела и, как следствие, накоплению пептидных антибиотиков в гемолимфе. Механизм асептической индукции синтеза антимикробных пептидов пока не ясен. Литературные данные свидетельствуют о вовлечении нейроэндокринной системы в этот процесс (Черныш и др., 1998). В главе III представлены данные экспериментов по влиянию бактериального заражения и стрессорного воздействия неинфекционной природы на антимикробную активность гемолимфы личинок мясных мух. Цель этих экспериментов – выяснить, являются ли пути септической и нейрогенной индукции синтеза бактерицидных белков альтернативными или 47 же они имеют общее звено на каком-либо этапе активации антимикробных генов. Если верно первое утверждение, то, вероятно, и состав антимикробных пептидов, выделяемых иммуноцитами, будет различаться в зависимости от типа воздействия. Если пути перекрываются как минимум на уровне активации транскрипционных факторов, то состав пептидных антибиотиков будет одинаков. Для достижения цели были поставлены следующие экспериментальные задачи: оценить влияние инфицирования и стресорных факторов на титр антимикробных пептидов в гемолимфе личинок; сравнить качественный состав пептидных антибиотиков, выделяемых иммуноцитами в ответ на септическое и стрессорное воздействие; провести количественную оценку содержания отдельных семейств антимикробных пептидов, синтезируемых иммуноцитами в ответ на введение бактерий и при стрессе. III.1. Эффект инфицирования Toll- и Imd- механизмы индукции синтеза антимикробных пептидов у дрозофилы независимо активируются поверхностными структурами соответственно грамположительных и грамотрицательных бактерий. Основываясь на предположении, что у других представителей Cyclorrhapha индукция синтеза бактерицидных молекул реализуется по сходному принципу, личинок мух семейств Calliphoridae (Calliphora vicina, Calliphora vomitoria, Lucilia caesar) и Muscidae (Musca domestica) инфицировали смесью грамположительных и грамотрицательных бактерий (см. «Материалы и методы»). Часть личинок оставляли интактными в качестве контроля. Инфицированных и интактных личинок помещали в условия длинного дня (20С:4Т) с температурой +24 °С. Гемолимфу собирали индивидуально от каждой личинки спустя сутки с момента инфицирования насекомых. Аликвоту цельной гемолимфы объемом 2 мкл наносили на агаровую пластинку (см. «Материалы и методы»). Питательную среду с бактериями инкубировали при температуре +37 °С. Через сутки инкубации в агаровой среде появлялись бактериальные колонии, за исключением области вокруг нанесенного материала, в пределах которой бактерицидные вещества гемолимфы подавляли рост колоний. Поскольку площадь зоны, свободной от бактерий, пропорциональна содержанию антибиотиков в образце, метод использовали для количественной оценки содержания суммы антимикробных пептидов в материале. При этом, например, известно, что антимикробные пептиды личинки Calliphora vicina различаются спектром антимикробной активности, в частности, одни из них токсичны 48 для Escherichia coli, другие – для Micrococcus luteus (Chernysh, 1996). Данное обстоятельство позволяет дифференциально оценить титр антиграмположительных (дефензины и Р-пептиды) и антиграмотрицательных (цекропин и диптерицины) пептидов в гемолимфе насекомых. Рис. 5. Индукция антимикробной активности в гемолимфе личинок круглошовных мух в ответ на инфицирование смесью кокка Micrococcus luteus A270 и палочки Escherichia coli D31. Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Гемолимфа интактных личинок мух обладает фоновой антимикробной активностью. Об этом свидетельствует наличие зон ингибирования роста бактерий в местах нанесения соответствующих образцов (Рис. 5; Рис. 11). При этом содержание антимикробных пептидов в гемолимфе интактных личинок исследуемых видов каллифорид оказалось различным. Так, в гемолимфе интактных личинок Lucilia caesar титр антиграмположительных пептидов оказался очень высоким. Между тем, в последующих экспериментах фоновая активность L.caesar оказалась сопоставима с активностью личинок мух других видов. Зоны ингибирования роста грамположительных и грамотрицательных бактерий в местах нанесения гемолимфы инфицированных насекомых во всех случаях оказались достоверно крупнее, чем в контроле, что указывает на повышенный титр бактерицидных соединений в гемолимфе инфицированных личинок. Последнее, в свою очередь, говорит о том, что введение личинкам мясных мух смеси грамположительных и грамотрицательных бактерий индуцирует синтез и накопление в гемолимфе антимикробных пептидов, токсичных как для грамположительных, так и для грамотрицательных бактерий. Данная закономерность распространяется за пределы семейства Calliphoridae и прослеживается у мух семейства Muscidae (Рис. 5). Примечательно, что изоляция жирового тела от нейроэндокринного комплекса личинки не препятствует развитию иммунной реакции (Рис. 11). 49 Рис. 6. Индукция антимикробной активности в гемолимфе личинок Calliphora vicina в ответ на инфицирование кокком Micrococcus luteus и палочкой Escherichia coli. Достоверность различий при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Для проверки гипотезы о существовании у мух-каллифорид двух независимых механизмов септической индукции синтеза антиграмположительных и антиграмотрицательных пептидов личинок Calliphora vicina независимо инфицировали грамположительным кокком M.luteus и грамотрицательной палочкой E.coli. В качестве контроля использовали интактных личинок и личинок, проколотых стерильной иглой. Согласно результатам эксперимента, инфицирование личинок грамположительными бактериями приводит к накоплению в гемолимфе как антиграмположительных, так и антиграмотрицательных пептидов (Рис. 6). Аналогично, следствием инфицирования насекомых E.coli является синтез иммунокомпетентными клетками не только антиграмотрицательных, но и антиграмположительных пептидов (Рис. 6). При этом, в обоих случаях, титр как антиграмположительных, так и антиграмотрицательных пептидов не зависит от природы иммуногена. Эффект асептического повреждения покровов аналогичен эффекту бактериального заражения (Рис. 6; Рис. 11). Подобно инфицированию, прокол стерильной иглой индуцирует синтез антибиотиков, активных как в отношении грамположительных, так и в отношении 50 грамотрицательных бактерий. Различия состоят лишь в том, что иммунный ответ в случае стерильного повреждения покровов выражен слабее, чем при септической травме. Однако это правило соблюдается не всегда. Так, например, в представленном эксперименте (Рис. 6) наличие бактерий в ране влияло исключительно на титр антиграмположительных, но не антиграмотрицательных пептидов гемолимфы, хотя обычно влияние собственно инфицирования на титр антиграмотрицательных пептидов все же имеет место (Рис. 11). Примечательно, что как и в случае бактериального заражения, запуск синтеза антимикробных пептидов в ответ на стерильное повреждение покровов, по-видимому, происходит без вмешательства нейроэндокринной системы (Рис. 11). III.2. Эффект стресcорного воздействия За время изучения механизмов индукции синтеза антимикробных пептидов у Calliphora vicina было изучено (гравитационные влияние перегрузки, многих внешних электрошок, факторов гипертермия, непатогенной природы углекислотный наркоз, иммобилизация и др.) на гуморальный иммунный ответ личинок. Однако большинство воздействий не приводило к изменению антимикробной активности в гемолимфе. В данной главе описаны лишь те стрессорные воздействия, которые сопровождались активацией синтеза бактерицидных белков. III.2.1. Эффект лигатурного стресса Эффект лигатурного стресса оценивали у диапаузирующих личинок C.vicina через две недели после прекращения питания. Личинок перевязывали хлопковой нитью на уровне I сегмента тела. Раздражая поверхностные механорецепторы, такая лигатура создает постоянно действующий стрессорный фактор. Подвижность личинки при этом сохраняется. Во втором случае лигатуру накладывали на уровне IV сегмента тела - эта операция позволяет изолировать иммунокомпетентные клетки жирового тела от нейроэндокринного комплекса. Наложение изолирующей лигатуры приводит к потере подвижности в задней части тела личинки. Лигатурированных и интактных (контрольных) личинок содержали в условиях длинного дня (20С:4Т) при температуре +24 °С. Сбор гемолимфы проводили спустя сутки с момента наложения лигатур, гемолимфу собирали индивидуально от каждой особи (у лигатурированных личинок – позади лигатуры) Содержание антиграмположительных и антиграмотрицательных пептидов в цельной 51 гемолимфе оценивали по размеру зоны ингибирования роста соответственно M.luteus штамма А270 и E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 2 мкл. Зоны ингибирования роста бактерий в местах нанесения гемолимфы личинок с раздражающей лигатурой оказались достоверно крупнее, чем при тестировании гемолимфы интактных личинок (Рис. 7). Это значит, что титр антимикробных пептидов в гемолимфе лигатурированных на уровне I сегмента тела личинок выше, чем в гемолимфе интактных личинок. Причем данное утверждение справедливо в отношении как антиграмположительных, так и антиграмотрицательных пептидов. Таким образом, при наложении раздражающей лигатуры, как при введении бактерий, в организме личинки запускается синтез бактерицидных белков. Рис. 7. Индукция антимикробной активности в гемолимфе личинок Calliphora vicina в ответ на наложение раздражающей и изолирующей лигатур. Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. При наложении изолирующей лигатуры подобного эффекта не наблюдается – размеры зон ингибирования роста бактерий вокруг образцов гемолимфы личинок с изолирующей лигатурой не отличаются достоверно от контроля (Рис. 7; Рис. 11). Поскольку в последнем случае жировое тело отделено от мозга и кольцевой железы личинки, есть основания 52 полагать, что нейроэндокринная система каким-то образом задействована в запуске синтеза антимикробных пептидов при лигатурном стрессе. III.2.2. Эффект термического ожога Эффект термического ожога оценивали у диапаузирующих личинок C.vicina через две недели после прекращения питания. Методика прижигания личинок описана в разделе «Материал и методы». Рис. 8. Индукция антимикробной активности в гемолимфе личинок Calliphora vicina с термическим ожогом. Достоверность отличий от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Для выявления роли нейроэндокринной системы в иммунной реакции на ожог некоторым личинкам перед прижиганием накладывали изолирующую лигатуру. Часть личинок оставляли интактными в качестве контроля. Всех личинок содержали в условиях длинного дня (20С:4Т) при температуре +24 °С. Сбор гемолимфы проводили спустя сутки после воздействия. К этому времени пораженная область выглядела склеротизированной. У личинок с изолирующей лигатурой склеротизированный участок был менее выражен, задняя часть тела выглядела высохшей, сбор гемолимфы у таких личинок был затруднен. 53 Гемолимфу собирали индивидуально от каждой особи (у лигатурированных личинок – позади лигатуры) и тестировали при помощи стандартного метода определения зон ингибирования роста бактерий (см. «Материалы и методы») на Micrococcus luteus штамма А270 и Escherichia coli штамма D31. Согласно результатам эксперимента, зоны ингибирования роста бактерий в местах нанесения гемолимфы личинок с ожогом достоверно крупнее, чем при тестировании гемолимфы интактных личинок (Рис. 8, Рис. 11). Это значит, что в результате термического ожога антимикробная активность гемолимфы увеличивается. Содержание же антибиотиков в гемолимфе личинок, которым перед прижиганием накладывали изолирующую лигатуру, не отличалась достоверно от такового в контроле – гемолимфе интактных личинок (Рис. 8; Рис. 11). Последнее свидетельствует о том, что нейроэндокринная система участвует в запуске синтеза антимикробных пептидов при ожоге. Характерно, что концентрация бактерицидных белков в гемолимфе возрастает прямопропорционально силе ожога (Рис. 8). III.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vivo Септическая травма и воздействие ряда стрессорных факторов неинфекционной природы приводят к увеличению антимикробной активности в гемолимфе личинок Calliphora vicina. Качественный состав антибиотиков, выделяемых иммунокомпетентными клетками личинки в ответ на септическое воздействие, известен (Chernysh et al., 2000). Вопрос же о том, какие антимикробные комноненты обусловливают бактерицидные свойства гемолимфы личинки, подверженной стрессу, остается открытым. В связи с этим, одной из задач исследования являлось сравнение качественного состава антимикробных пептидов в гемолимфе инфицированных и лигатурированных личинок. Для разделения антимикробных пептидов на отдельные семейства применяли метод хроматографического фракционирования. Содержание антибиотиков в каждой из фракций определяли методом агаровых пластинок. В опыте использовали диапаузирующих личинок через неделю после прекращения питания. Одних насекомых инфицировали смесью бактерий M.luteus штамма А270 и E.coli штамма D31, другим накладывали раздражающую лигатуру на уровне I сегмента тела. В ряде случаев часть иммнокомпетентных клеток изолировали от нейроэндокринного комплекса путем наложения лигатуры на уровне IV сегмента тела личинки. Несколько личинок оставляли интактными в качестве контроля. Всех насекомых помещали в условия длинного дня (20С:4Т) с температурой +24 °С. Сбор гемолимфы проводили спустя сутки с момента заражения бактериями и наложения лигатур. В каждом варианте гемолимфу собирали от нескольких особей в охлажденные полипропиленовые пробирки. Затем из гемолимфы 54 удаляли клеточную фракцию, центрифугируя в течение 5 минут при 70g. Для дальнейшей работы отбирали по 500 мкл бесклеточной гемолимфы. Поскольку известно, что антимикробные пептиды – это умеренно гидрофобные соединения, то перед нанесением образца на хроматографическую колонку производили предварительную очистку плазмы от гидрофильных и сильногидрофобных соединений методом твердофазной экстракции (см. «Материалы и методы»). Органический растворитель и воду из умеренно гидрофобного экстракта удаляли при вакуумной сушке. Лиофилизат хранили при температуре –20 °С. Хроматографическое фракционирование умеренно гидрофобного экстракта осуществляли в режиме обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на хроматографе Gold System (Beckman) с детектором Beckman 166A (Beckman) (см. «Материалы и методы»). Образец наносили на колонку Chemco Pak C18 (4 x 100мм, Chemco), уравновешенную 0.1% раствором ТФУ. Пептиды элюировали линейным градиентом ацетонитрила от 0 до 50% в течение 50 мин. Элюат собирали по 1 мл в виалы с помощью автоматического коллектора фракций Beckman SC (Beckman) при скорости элюции 1 мл/мин, регистрируя изменение поглощения при 220 нм. Фракции сушили в вакууме. Лиофилизат каждой из полученных фракций растворяли в 20 мкл дистиллированной воды. Аликвоты материала объемом 4 мкл наносили на поверхность агаровой пластины. Поскольку размер зон ингибирования роста бактерий отражает содержание антиграмположительных и антиграмотрицательных пептидов, метод позволяет оценить титр тех или иных антибиотиков в каждой из фракций. На рисунке 9 видно, что все антимикробные пептиды плазмы сосредоточены в элюате, вышедшем из колонки при 26-40% ацетонитрила. При этом антиграмположительная активность на графике сосредоточена в одном кластере (28-33% ацетонитрила), а антиграмотрицательная – в трех (26-29%, 30-36% и 37-40% ацетонитрила). Такое распределение антимикробной активности по хроматографическим фракциям характерно и для инфицированных личинок, и для личинок, подверженных стрессу. Поскольку наблюдаемые кластеры распределения антимикробной активности соответствуют основным семействам антимикробных пептидов, можно заключить, что качественный состав пептидных антибиотиков в гемолимфе инфицированных личинок и личинок с раздражающей лигатурой существенно не различается. 55 Рис. 9. Антиграмположительная и антиграмотрицательная активность в гемолимфе интактных личинок (А), инфицированных личинок (Б), личинок с раздражающей лигатурой (В), инфицированных личинок с раздражающей лигатурой (Г), личинок с изолирующей лигатурой (Д) и инфицированных личинок с изолирующей лигатурой (Е). Примечательно, что в гемолимфе интактных личинок и личинок с изолирующей лигатурой третий кластер антиграмотрицательной активности (соответствует элюату, вышедшему с колонки при 37-40% содержании ацетонитрила) отсутствует. Это значит, что данная группа пептидов (предположительно, цекропины – см. далее) не выделяется иммуноцитами в нормальных условиях: индукция их синтеза имеет место лишь при воздействии извне. 56 Другим критерием оценки состава антимикробных пептидов является высота (точнее площадь) наблюдаемых на графике пиков бактерицидной активности, отражающая количественное содержание антимикробных пептидов какого-либо семейства в образце. Анализируя высоту пиков в каждом из вариантов, можно заключить, что титр антимикробных пептидов в гемолимфе интактных личинок минимален. В варианте, где личинкам накладывали лигатуру на уровне IV сегмента тела (позади кольцевой железы), содержание антимикробных пептидов в гемолимфе был выше, чем у интактных личинок. Интенсивнее всего бактерицидные белки синтезируются в ответ на септическую травму. При наложении раздражающей лигатуры уровень синтеза антимикробных пептидов выше, чем в контроле, но несколько ниже, чем при инфицировании бактериями. Рис. 10. Распределение антимикробной активности в плазме личинки C.vicina, инфицированной смесью грамположительных и грамотрицательных бактерий. 57 Следующим этапом было определение молекулярных масс компонентов наиболее «активных» фракций плазмы инфицированных личинок методом ESI. Результаты представлены на рисунке 10. Таблица 1. Антимикробные пептиды личинки Calliphora vicina (по данным Chernysh et al., 2000). Семейство пептидов Молекулярная масса, Да Дефензины 4032.0 3886.6 4091.1 4114.3 ● Грамположительные ● Грибы Цекропины 4156.0 ● Грамотрицательные бактерии ● Грамотрицательные бактерии 8999.7 8886.2 8913.9 9029.1 2987.0 3025.7 3040.0 3048.6 Диптерицины Р-пептиды Мишень ● Грамположительные бактерии бактерии Согласно результатам масс-спектрометрии, фракция №31 (номер соответствует проценту ацетонитрила в элюате) содержит вещества с молекулярными массами 3147.6, 3540.9, 4029.8 и 4187.1 Да. Одна из них – 4029.8 Да – соответствует массе дефензина (Табл. 1). Во фракции №33 мы детектировали массы 8852.4, 8876.3, 8998.9, 9029.6. 9045.4 и 9056.6 Да. Из них массы 8876.3, 8998.9 и 9029.6 Да близки к массам диптерицинов личинки синей мясной мухи (Табл. 1). Фракция №37 содержит лишь одно вещество массой 4153.3 Да – очевидно, это цекропин (Табл. 1). Массы веществ, содержащихся во фракции №28 – 4420.34, 4437.3, 4455.4 и 4936.3 Да – не соответствуют ни одной из масс антимикробных пептидов, описанных в литературе. III.4. Заключение Результаты экспериментов, описанных в данной главе, свидетельствуют о том, что синтез пептидных антибиотиков в организме личинок мух семейства Calliphoridae носит индуцибельный характер. Индукция антимикробной активности имеет место при бактериальном заражении, а также при воздействии ряда факторов неинфекционной природы. В ряде случаев активация иммунокомпетентных клеток – это автономный процесс, реализуемый без вмешательства нейроэндокринной системы. В других, – наоборот, участие 58 мозга и кольцевой железы является необходимым условием формирования иммунного ответа. Ввиду различия природы внешних воздействий и роли нейроэндокринной системы в активации иммуноцитов, необходима классификация механизмов индукции синтеза пептидных антибиотиков у каллифорид (Рис. 11). Рис. 11. Индукция антимикробной активности в гемолимфе личинок Calliphora vicina в ответ на действие факторов инфекционной и неинфекционной природы. Достоверность различий при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Одна из таких классификаций основана на принципе патогенности индуктора. Известно, например, что микроорганизмы являются мощным триггером иммунного ответа: инъекция насекомому бактерий и грибков, либо фрагментов их клеточной стенки сопровождается значительным повышением титра антимикробных пептидов в гемолимфе. Этот феномен носит название септической индукции. Согласно нашим данным, активация синтеза 59 пептидных антибиотиков у личинки C.vicina происходит при введении насекомым грамположительного кокка Micrococcus luteus A270 и грамотрицательной палочки Escherichia coli D31. Примечательно, что титр как антиграмположительных, так и антиграмотрицательных пептидов, выделяемых иммунокомпетентными клетками личинки C.vicina в ответ на заражение M.luteus или E.coli, не зависит от природы иммуногена. Септическая индукция антимикробной активности у личинки C.vicina не требует вовлечения нейроэндокринной системы в иммунный процесс. Это утверждение основано на том факте, что изоляция клеток жирового тела от кольцевой железы не вносит существенных изменений в динамику синтеза пептидных антибиотиков в ответ на инфицирование. Результаты опытов согласуются с результатами, полученными другими авторами на данном модельном объекте (Черныш и др., 1998). В противоположность септической индукции можно выделить другую группу явлений, включающих активацию синтеза эндогенных антибиотиков в ответ на воздействие неинфекционной природы. Для явлений такого типа предложен термин «асептическая индукция». Механизм асептической индукции, по-видимому, не является универсальным, поскольку в одном случае активация иммуноцитов при травме происходит исключительно при участии нейроэндокринной системы, в другом – может протекать автономно. Тот тип активации, который подразумевает обязательное вовлечение нейроэндокринной системы в иммунный процесс, получил название нейрогенной индукции. Характерной особенностью данного типа индукции синтеза пептидных антибиотиков является то, что изоляция иммунокомпетентных клеток от нейроэндокринного комплекса полностью блокирует иммунный ответ – в связи с этим, повышения антимикробной активности изолированных клеток не наблюдается (Черныш и др., 1998). В данной работе представлены экспериментальные доказательства существования нейрогенной индукции антимикробной активности у C.vicina. Установлено, что при воздействии на личинку таких стрессорных факторов, как хроническое механическое раздражение и термический ожог, титр антимикробных пептидов в ее гемолимфе достоверно повышается. Для выявления роли нейроэндокринной системы в регуляции синтеза эндогенных антибиотиков при стрессе мы использовали технику лигатур. При воздействии хронического механического раздражения или термического ожога на личинок с изолирующей лигатурой достоверного увеличения антимикробной активности гемолимфы по сравнению с контролем – интактными личинками – не происходило. Это свидетельствует о том, что нейроэндокринная система задействована в инициации синтеза антимикробных пептидов у C.vicina при стрессе. 60 Хроматографический анализ умеренно гидрофобного экстракта гемолимфы инфицированных и лигатурированных на уровне I сегмента тела личинок показал, что распределение антимикробной активности в образцах идентично: в обоих случаях антиграмположительная активность представлена одним кластером, антиграмотрицательная – тремя. Таким образом, на основании данных хроматографического картирования нами сделан вывод о том, что качественный состав пептидных антибиотиков, выделяемых иммунокомпетентными клетками в ответ на стрессорное воздействие и при септической травме, один и тот же. По-видимому, иммунная реакция клеток жирового тела стереотипна и не зависит от типа раздражения. Различается лишь титр бактерицидных молекул: количество антибиотиков, синтезируемых иммуноцитами при стрессе, несколько уступает содержанию соответствующих антимикробных пептидов в гемолимфе инфицированных личинок. Особого внимания заслуживает другой тип асептической активации синтеза антимикробных пептидов – не требующий вмешательства нейроэндокринной системы. Так, антимикробная активность гемолимфы возрастает при сквозном повреждении покровов личинки стерильной иглой. Природа индукции антимикробной активности в ответ на стерильное повреждение покровов до сих пор остается нераскрытой. Возникает парадокс: антиген отсутствует, но, несмотря на это, происходит усиление выделения антимикробных пептидов иммуноцитами. Участие гормонов в иммунном процессе, по-видимому, в этом случае также исключено: изоляция иммунокомпетентных клеток от нейроэндокринной системы не влияет на их реакцию на асептическую травму. Детальному обсуждению механизмов асептической индукции синтеза антимикробных пептидов в организме личинки C.vicina посвящены следующие главы работы. Тем не менее, даже предварительный анализ двух типов индукции синтеза пептидных антибиотиков – в ответ на инфицирование бактериями и на стерильное сквозное повреждение покровов – позволяет выявить у них две общие черты. Во-первых, как уже было сказано, в обоих случаях иммунный ответ имеет место независимо от участия нейроэндокринной системы. Во-вторых, и в том, и в другом случае имеет место сквозное повреждение покровов. В связи с этим мы свели их в группу «травмогенная индукция», чтобы противопоставить оба эти процесса нейрогенной индукции синтеза антимикробных пептидов. 61 Глава IV. Синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела in vitro IV.1. Разработка органной культуры жирового тела IV.1.1. Выбор базового состава культуральной среды Инкубационные среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды содержат питательные вещества для обеспечения активного размножения и роста культивируемых клеток. Функцией поддерживающих сред является исключительно поддержание жизнеспособности продуцента. Ростовые среды для культивирования клеток насекомых отличаются от сред для клеток млекопитающих повышенным содержанием аминокислот и других органических кислот, а также более высоким осмотическим давлением (Grace, 1962). В настоящее время предложено более 50 вариантов сред для культивирования клеток насекомых – подобное многообразие обусловлено тем, что состав гемолимфы у разных видов различен. При этом ни одна из разработанных ростовых сред не пригодна для ведения культур клеток всех видов насекомых, то есть не является универсальной (Блажевич, 2004). Кроме того, анализ биологии модельного объекта настоящего исследования в принципе заставляет усомниться в необходимости использования многокомпонентной питательной среды для культивирования жирового тела. Дело в том, что жировое тело диапаузирующей личинки синей мясной мухи Calliphora vicina содержит большое количество пластических веществ, достаточное для переживания насекомым в природе длительных неблагоприятных условий. В частности, содержание белка в клетках жирового тела к моменту окончания личинкой питания достигает 10% от его сырой массы (Dahlhelm, 1973). Это означает, что на роль инкубационной среды для жирового тела, теоретически, подойдет любой физиологический солевой раствор, состав которого изотоничен и изоосмотичен гемолимфе личинки синей мясной мухи, содержащий минимум питательных веществ, либо не содержащий их вовсе. И, поскольку клетки жирового тела являются в высокой степени дифференцированными, наличия ростовых факторов в среде не потребуется. Предположение о белковой «самодостаточности» жирового тела, тем не менее, нуждается в дополнительной проверке – необходимо проанализировать способность клеток жирового тела синтезировать антимикробные пептиды в солевом растворе и среде, содержащей экзогенный белок. Следует также помнить, что синтез пептидных антибиотиков у личинки 62 Calliphora vicina является индуцибельным – в связи с этим, перед инокуляцией жирового тела необходима активация синтеза антимикробных пептидов в иммунокомпетентных клетках. Идея эксперимента сводилась к индукции антимикробной активности жирового тела in vivo путем инфицирования личинки бактериями, последующему извлечению жирового тела из личинки и его переносу в физиологический раствор. Для этого, в свою очередь, было необходимо узнать время, необходимое жировому телу для получения сигнала об инфицировании in vivo. Рис. 12. Антимикробная активность жирового тела in vivo и in vitro. I. Динамика изменения титра антимикробных пептидов в гемолимфе интактной личинки (I-1) и личинки, инфицированной E.coli M17 (I-2). II. Антимикробная активность изолированного жирового тела интактной личинки (II-«инт.») и личинки, предварительно инфицированной E.coli M17 (II-«инф.»), при 24-часовом инкубировании в солевом растворе, 0,5%-ном гидролизате лактальбумина и 10%-ной сыворотке (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность различий при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Чтобы получить ответ на последний вопрос, мы проанализировали динамику изменения титра бактерицидных компонентов в гемолимфе личинки, инфицированной кишечной палочкой Eshcherichia coli штамма М17 (Рис. 12, I-2). Из графика следует, что на протяжении 2 часов после инфицирования титр антимикробных пептидов возрастает очень медленно, 63 после чего наблюдается резкое повышение антимикробной активности. По-видимому, 2–3 часов достаточно для того, чтобы жировое тело получило сигнал о заражении и приступило к выработке антибиотиков. С учетом данного предположения было решено перевести жировое тело в культуру спустя 3 часа после инфицирования личинки кишечной палочкой (Рис. 12, I). В качестве культуральной среды был выбран сбалансированный солевой раствор, разработанный Д. В. Тулиным для краткосрочного культивирования гемоцитов Calliphora vicina (Тулин, неопубликованные данные). Физиологический раствор добавляли к жировому телу личинки в количестве 250 мкл. Источником экзогенного белка в альтернативных вариантах служили гидролизат лактальбумина (ООО «Химмед») и сыворотка крупного рогатого скота (ООО «Биолот»). Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.). Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного премешивания (см. раздел IV.1.7.). Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали через 24 часа ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста Escherichia.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 5 мкл. На рисунке 12, II видно, что культуральная жидкость жирового тела интактной личинки, инкубируемого в солевом растворе, обладает выраженной бактерицидной активностью. Это означает, что в клетках жирового тела действительно содержится некоторый запас пластических веществ – и этих веществ достаточно для синтеза антимикробных компонентов in vitro. Тем не менее, дополнительное внесение в культуральную среду аминокислот и олигопептидов (гидролизата лактальбумина) приводит к существенному повышению антимикробной активности жирового тела. По-видимому, клетки жирового тела диапаузирующей личинки все-таки способны поглощать из среды аминокислоты и продуцировать на их основе бактерицидные молекулы. При этом сыворотка, несмотря на содержание в ней белковых компонентов, не оказывает подобного эффекта. Примечательно, что жировое тело инфицированной личинки выделяет пептидные антибиотики более интенсивно, чем жировое тело интактной личинки (Рис. 12, II). Очевидно, жировое тело «сохраняет в памяти» сигнал об инфицировании и при переводе в культуру синтезирует антимикробные пептиды более активно. Следующим этапом работы было более детальное изучение влияния гидролизата лактальбумина (ГЛА) на синтез антимикробных пептидов жировым телом интактной личинки Calliphora vicina. Для этого жировое тело инкубировали в солевом растворе с разным содержанием ГЛА, а затем анализировали батерицидную активность культуральной жидкости. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 13. 64 Рис. 13. Влияние гидролизата лактальбумина на синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела Calliphora vicina (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность отличий от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Результаты свидетельствуют о том, что антимикробная активность жирового тела напрямую зависит от содержания ГЛА в среде. По мере приближения концентрации ГЛА к 10 мг/мл (2,5 мг на одно жировое тело) титр антимикробных пептидов, продуцирумых жировым телом, возрастает. Дальнейшее кратное повышение концентрации ГЛА в среде приводит к снижению антимикробной активности жирового тела. Возможно, это связано с гибелью клеток-продуцентов вследствие интоксикации ГЛА (не проверялось). В результате 1%-ный раствор ГЛА был выбран в качестве контрольного варианта культуральной среды для иммуноцитов в последующих экспериментах, целью которых являлось изучение воздействия регуляторных факторов на антимикробную активность жирового тела. Такой подход позволяет исключить неспецифическое воздействие добавляемых в среду факторов на жировое тело, а именно – те случаи, когда экзогенный белок служит лишь пластическим материалом для построения молекул антимикробных пептидов. 65 IV.1.2. Выживаемость культивируемых клеток В предыдущем разделе мы пришли к выводу о том, что сыворотка крупного рогатого скота не влияет на антимикробную активность жирового тела личинки C.vicina. Наличие же ГЛА в среде, напротив, способствует накоплению антимикробных пептидов в культуре. Постановка следующего эксперимента имела своей целью изучение влияния сыворотки и ГЛА на выживаемость культивируемых клеток. Рис. 14. Оценка жизнеспособности клеток жирового тела методом включения трипанового синего. А: Морфология клеток жирового тела личинки Calliphora vicina (штрих масштаба равен 100 мкм). B-D: Живые (светлые) и погибшие (темно-коричневые на «B» и «D» либо темно-синие на «С») клетки жирового тела под микроскопом. Е: Живые (белые) и погибшие (синие) клетки жирового тела под бинокуляром. Жировое тело выделяли из интактных личинок C.vicina, закончивших питание за 2 недели до начала эксперимента. После предварительной промывки в солевом растворе жировое тело 66 переносили в культуральную среду объемом 250 мкл. Культуральной средой служил собственно солевой раствор либо 10%-ная сыворотка крупного рогатого скота. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.). Каждый из вариантов был поставлен в 12 биологических повторностях. Культуру инкубировали при температуре +26 °С в условиях равномерного премешивания (см. раздел IV.1.7.). Ежесуточно в каждом из вариантов отбирали по 3 жировых тела для подсчета соотношения количества живых и погибших клеток (см. «Материал и методы» и Рис. 14; Рис.15). В оставшейся культуре производили замену культуральной среды, затем цикл культивирования повторяли. Рис. 15. Выживаемость жирового тела в солевом растворе (1) и в 10%-ной сыворотке (2). Согласно результатам эксперимента, вне зависимости от наличия сыворотки в среде на вторые сутки культивирования более 90% клеток жирового тела сохранили жизнеспособность (Рис. 15). На 4-е сутки почти все клетки, культивируемые в солевом растворе, погибли, в то время как в среде, содержащей сыворотку, выжило более половины клеток. Между тем, сравнительный анализ с использованием критерия Манна-Уитни не выявил достоверного влияния сыворотки на жизнеспособность клеток. То же касается и ГЛА: количество жизнеспособных клеток в жировом теле, инкубируемом на протяжении 3-х суток в 1%-ном ГЛА, не отличалось значимо от количества жизнеспособных клеток, инкубируемых в безбелковом солевом растворе. 67 Таким образом, антимикробную при изучении активность влияния жирового тела различных регуляторных можно ограничиться факторов на бессывороточной культуральной средой – сыворотка не влияет ни на уровень синтеза антимикробных пептидов, ни на жизнеспособность культивируемых клеток. Как и сыворотка, ГЛА не способствует выживаемости клеток, однако его использование в качестве источника пластических компонентов для построения бактерицидных молекул клетками жирового тела вполне оправдано. IV.1.3. Индукция антимикробной активности in vitro Индукция синтеза пептидных антибиотиков в организме мускоидных двукрылых является следствием сквозного либо поверхностного повреждения покровов (см. Главу III). Исходя из этого, можно предположить, что и для активации жирового тела in vitro потребуется внесение в среду дополнительных регуляторных компонентов. Вопрос о том, какие гуморальные факторы могут быть выбраны на роль потенциальных индукторов антимикробной активности жирового тела, заслуживает детального обсуждения. Согласно результатам экспериментов, сквозное повреждение покровов в стерильных условиях приводит к индукции антимикробной активности иммуноцитов личинки C.vicina. Возможно, это связано с тем, что, как и при инфицировании, в случае асептической травмы имеет место активация молекулярных факторов плазмы, стимулирующих синтез антимикробных пептидов иммунокомпетентными клетками. Если это так, то добавление плазмы травмированных личинок в культуру жирового тела приведет к увеличению титра антимикробных пептидов в культуральной среде. Более того, если источником этих молекулярных факторов является поврежденный барьерный эпителий, то добавление к жировому телу инкубата покровов либо их содержимого (экстракта) также окажет стимулирующее действие на иммуноциты. В итоге было решено оценить реакцию жирового тела на плазму и инкубат покровов интактных личинок. Воздействие стрессорных факторов, таких как хроническое механическое раздражение и термический ожог, также приводит к повышению титра антимикробных пептидов в гемолимфе личинки Calliphora vicina (см. раздел III.2). Наложение лигатуры на уровне IV сегмента тела личинки блокирует эффект стрессорного воздействия – это обстоятельство указывает на возможную роль центрального нейроэндокринного комплекса в формировании иммунного ответа. Согласно литературным данным, центральный нейроэндокринный комплекс насекомых способен чрезвычайно быстро реагировать на действие сильных раздражителей (Черныш и др., 2007). Суть этой реакции сводится к экстренному выбросу в 68 гемолимфу содержимого кардиальных тел, в состав которого, вместе или по-отдельности, входят проторакотропный гормон, адипокинетический гормон, гипертрегалоземический фактор, биогенные амины и ряд других биологически активных веществ. Наиболее постоянными компонентами реакции стресса у насекомых являются биогенные амины и адипокинетический гормон (Orchard et al., 1981; Singh, 1984; Pence et al., 1975). Их функция в экстремальных условиях связана, в частности, с быстрой мобилизацией запасных липидов и углеводов (Steel, 1985; Downer, 1979). Поскольку основной мишенью для этих гормонов является жировое тело, есть основания полагать, что именно биогенные амины и адипокинетический гормон, прямо или опосредованно, могут регулировать синтез антимикробных пептидов в иммунокомпетентных клетках. С другой стороны, действие стрессорных факторов приводит к формированию неспецифической резистентности насекомых к повреждающим агентам, обусловленной, главным образом, экдистероидами (Черныш и др., 2007). Таким образом, на основании литературных данных, на роль потенциальных индукторов антимикробной активности жирового тела были выбраны экдистероиды, адипокинетический гормон и биогенные амины. IV.1.3.1. Роль «фактора плазмы» в активации жирового тела Анализ иммуномодуляторной активности плазмы проводили следующим образом. От интактных личинок C.vicina, окончивших питание за 2 недели до начала эксперимента, собирали гемолимфу через прокол стенки тела стерильной иглой. Гемолимфу центрифугировали в течение 5 минут при 70 g в условиях комнатной температуры для отделения клеточной фракции. Надосадок (плазму) подвергали термической обработке, денатурированный белок удаляли (подробнее о плазматическом факторе активации см. в разделе V.1.). В качестве культуральной среды для жирового тела использовали 1%-ный ГЛА, содержащий 12,5%, 25%, 50% и 100% термически обработанной плазмы (далее – ТОП). В контрольном варианте плазму в физиологический раствор не добавляли (0% ТОП). Жировое тело выделяли через разрез в задней части тела личинки и, после предварительной промывки, переносили в культуральную среду объемом 250 мкл. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.) Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного премешивания (см. раздел IV.1.7.). Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали через 24 часа ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 5 мкл. 69 Рис. 16. Влияние фактора термически обработанной (1) и необработанной (2) плазмы интактных личинок на антимикробную активность клеток жирового тела (комментарии – в разделах IV.1.3.1. и V.1.1.). Антимикробная активность в культуральной жидкости жирового тела (А) и в культуральной среде (Б). Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Результаты анализа представлены на рисунке 16. Из рисунка видно, что сама культуральная среда, в которой содержание ТОП не превышает 25%, не содержит детектируемого количества антимикробных компонентов. Об этом свидетельствует отсутствие зон ингибирования роста бактерий E.coli в местах нанесения на агаровую пластинку соответствующих образцов. В тех вариантах, где содержание ТОП превышает 25%, наблюдается низкая фоновая бактерицидная активность среды (Рис. 16, Б). Культуральная жидкость жирового тела, инкубируемого в отсутствие ТОП, содержит антимикробные компоненты (Рис. 16, А, подробнее – см. IV.1.1.). Однако внесение в культуру жирового тела ТОП приводит к более чем двукратному повышению титра антимикробных пептидов в культуральной жидкости. При этом титр выделяемых жировым телом бактерицидных молекул напрямую зависит от количества добавляемого «индуктора». Достоверно значимое стимулирующее воздействие на иммуноциты оказывает уже 12,5%-ная ТОП, однако пик иммуномодуляторной активности наблюдается при 50% содержании индуктора в среде. Дальнейшее повышение концентрации ТОП не оказывает видимого эффекта. 70 Поскольку в культуральной среде антимикробной активности обнаружить не удалось (при содержании ТОП менее 25%), в культуре существует только один потенциальный источник новых бактерицидных молекул – клетки жирового тела. Это значит, что повышение титра антимикробных пептидов в культуре с ТОП обусловлено исключительно метаболической активностью иммунокомпетентных клеток. Важно отметить, что плазма для жирового тела является в первую очередь источником именно регуляторных молекул, а не «строительного материала». В пользу этого утверждения свидетельствует тот факт, что в контрольном варианте, где в качестве культуральной среды использовали 1%-ный ГЛА (т. е. содержалось избыточное количество пластических компонентов для построения белковых молекул клетками жирового тела), уровень синтеза бактерицидных молекул остался сравнительно низким. IV.1.3.2. Роль «фактора покровов» в активации жирового тела Плазма, собранная от интактных личинок C.vicina и добавленная в культуральную среду жирового тела, способна иммунокомпетентных индуцировать клетках. Открытым синтез антимикробных остается вопрос о пептидов в локализации иммуномодуляторных факторов in vivo. Теоретически, иммуномодуляторные молекулы могут как присутствовать в плазме изначально, так и попадать в нее из барьерного эпителия при повреждении покровов во время сбора гемолимфы. Цель экспериментов, описанных в настоящем разделе – оценить способность покровов личинки продуцировать какие-либо факторы, оказывающие прямое стимулирующее воздействие на жировое тело in vitro. Для выявления роли покровов в регуляции синтеза антимикробных пептидов в организме личинки C.vicina был поставлен следующий эксперимент. У интактных насекомых отделяли покровы по схеме, описанной в «Материалах и методах», и помещали их в солевой раствор из расчета 10 покровов на 1 мл среды. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.) Культуру покровов инкубировали при температуре +25 °С в течение 30 минут либо в течение 4 часов. Затем проводили отбор культуральной жидкости, которую в дальнейшем использовали в качестве культуральной среды для жирового тела. Жировое тело выделяли через разрез в задней части тела личинки и, после предварительной промывки, переносили в среду объемом 250 мкл. Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного премешивания (см. раздел IV.1.7.). Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали на вторые сутки 71 ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 3 мкл. Рис. 17. Влияние покровов личинки на антимикробную активность клеток жирового тела (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано); комментарии – в разделах IV.1.3.2. и V.1.2. Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Результаты теста представлены на рисунке 17. Культуральная жидкость жирового тела, инкубируемого в отсутствие инкубата покровов (в 1%-ном ГЛА), обладает выраженным бактерицидным действием. Вместе с тем, добавление к жировому телу культуральной жидкости покровов приводит к достоверному повышению титра пептидных антибиотиков в культуре жирового тела. При этом следует учесть, что сама культуральная жидкость покровов (собранная через 4 часа культивирования) антимикробной активностью не обладает. Очевидно, повышенное содержание антимикробных пептидов в культуре жирового тела является следствием активации клеток жирового тела компонентами инкубата покровов. 72 Характерно, что иммуномодуляторные свойства инкубата покровов напрямую зависят от длительности их культивирования. Это выражается в том, что культуральная жидкость, собранная спустя 4 часа инкубирования покровов, индуцирует антимикробную активность жирового тела сильнее, чем жидкость, собранная через 30 минут ведения культуры. Таким образом, покровы действительно являются источником соединений, напрямую стимулирующих синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела. IV.1.3.3. Роль гормонов в активации жирового тела Целью экспериментов, описанных в данном разделе, явилось изучение прямого влияния основных «стресс-гормонов» насекомых: экдизонов, октопамина, допамина и адипокинетического гормона, - на синтез антимикробных пептидов клетками изолированного жирового тела личинки синей мясной мухи C.vicina. В опытах использовали личинок, окончивших питание за неделю до начала эксперимента. Жировое тело выделяли через разрез в задней части тела насекомого. Очищенное от трахей, кишечника и мальпигиевых сосудов жировое тело промывали в инкубационной среде дважды, затем переносили в инкубационную среду – безбелковый солевой раствор объемом 50 мкл. Для стерилизации культуры в инкубационную среду добавляли антибиотик норфлоксацин в концентрации 30 мкг/мл (0,5 мкл препарата «Нормакс», Ipka на одно жировое тело) – см. раздел IV.1.4. Культуру инкубировали при температуре +24 °С. Гормоны насекомых (Sigma) добавляли в культуральную среду в следующих концентрациях: α- экдизон и β-экдизон – 0.02, 0.2, 2, 20 и 200 мкг/мл, адипокинетический гормон – 0.2, 2, 20 и 200 мкг/мл, октопамин и допамин – 0.2, 2 и 20 мкг/мл. Антимикробную активность клеток жирового тела оценивали на вторые сутки ведения культуры. Данные по влиянию гормонов на антимикробную активность клеток изолированного жирового тела диапаузирующих личинок C.vicina представлены на рисунках 18 и 19. В инкубате жирового тела личинок, не содержащем гормонов (контрольном варианте), была обнаружена фоновая антиграмположительная активность. При этом, как было отмечено ранее, в гемолимфе, выделенной из интактных личинок, подобной антимикробной активности обнаружено не было. То есть in vivo метаболическая активность клеток жирового тела ниже, чем in vitro. По-видимому, причина различного «поведения» клеток жирового тела in vivo и in vitro состоит в спонтанной активации жирового тела при инкубировании в не свойственной ему среде. 73 Рис. 18. Влияние α-экдизона (А) и β-экдизона (Б) на антимикробную активность изолированного жирового тела личинок Calliphora vicina (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Из рисунка 18 видно, что α- и β-экдизоны в концентрациях 0.2 – 20 мкг/мл не влияют на антимикробную активность иммунокомпетентных клеток. В то же время, добавление высоких доз α-экдизона оказывает супрессорное действие на синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела: при инкубировании жирового тела с α-экдизоном в концентрации 200 мкг/мл происходило иммунокомпетентных клеток. достоверное снижение Низкие концентрации же антимикробной α -экдизона активности оказывают противоположное, иммуностимулирующее, действие: в концентрации гормона 0.02 мкг/мл гормон достоверно усиливал синтез антимикробных пептидов жировым телом. В случае с βэкдизоном достоверного повышения или понижения антимикробной активности отмечено не было, однако тенденция влияния гормона на синтез антибиотиков иммуноцитами, характерная для α-экдизона, сохранялась. 74 Рис. 19. Влияние адипокинетического гормона (А), октопамина (Б) и допамина (В) на антимикробную активность изолированного жирового тела личинок Calliphora vicina (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. При добавлении адипокинетического гормона в культуральную среду антимикробная активность культуральной жидкости жирового тела повышается: в концентрациях 20 мкг/мл (данные не представлены) и 200 мкг/мл (Рис. 19, А) гормон оказывает достоверно значимый иммуностимулирующий эффект. Октопамин также усиливает синтез бактерицидных белков клетками жирового тела – эффективными являются концентрации 0.2 и 20 мкг/Ж.Т. (Рис. 19, Б). Что касается допамина, нам не удалось обнаружить статистически значимого влияния этого гормона на антимикробную активность иммунокомпетентных клеток C.vicina (Рис. 19, В). IV.1.4. Стерилизация культуры жирового тела При постановке иммунологического эксперимента насекомых принято промывать 70% этиловым спиртом. Однако, в нашем случае, несмотря на стерилизацию поверхности тела личинки, неизбежно сохраняется вероятность контаминации культуры жирового тела за счет бактерий, населяющих, по-видимому, пищеварительный тракт насекомого (Рис.20, ряды А и Б). Видовой состав симбиотических бактерий личинок мух семейства Calliphoridae детально описан в соответствующей литературе (Toth et al., 2005; Ahmad et al., 2006). 75 Традиционно для стерилизации культур клеток насекомых используют сочетание пенициллина и стрептомицина (рекомендации Sigma, Invitrogen и др. компаний). Обычно пенициллин и стрептомицин добавляют в солевые растворы и питательные среды из расчета 100 ЕД (для пенициллина) и 100 мкг (для стрептомицина) на 1 мл среды – в этих концентрациях антибиотики не влияют на жизнеспособность эукариотических клеток, подавляя при этом развитие бактерий. Рис. 20. Стерилизация культуры клеток жирового тела с помощью пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл): Ряд А. Жировое тело в инкубационной среде, не содержащей антибиотики; Ряд Б. Жировое тело в инкубационной среде, содержащей термически обработанную плазму и не содержащей антибиотики; Ряд В. Жировое тело в инкубационной среде, содержащей термически обработанную плазму и антибиотики; Ряд Г. Жировое тело в инкубационной среде, содержащей антибиотики. Существенным препятствием для внесения в культуру дополнительных антибиотиков является то, что они могут искажать картину анализа титра антимикробных пептидов в инкубационной среде. Однако используемый в нашем тесте штамм D31 Escherichia coli является устойчивым как к пенициллину (Burman et al., 1968), так и к стрептомицину (Bobrowski et al., 1976). По этой причине размер зоны ингибирования роста кишечной палочки в тесте будет обусловлен исключительно антимикробной активностью клеток жирового тела (Рис. 20, ряды В и Г). 76 На сегодняшний день пенициллин и стрептомицин являются антибиотиками выбора при стерилизации культуры клеток жирового тела в нашей лаборатории. При этом данная методика имеет два существенных недостатка. Во-первых, она позволяет оценивать содержание в культуральной жидкости исключительно антиграмотрицательных пептидов. Причина в том, что другая тест-бактерия – грамположительный кокк Micrococcus luteus штамма А270 – чувствительна как к пенициллину, так и к стрептомицину. Второй недостаток связан с тем, что данная методика подходит лишь для стерилизации жирового тела личинок мух рода Calliphora. При инкубировании жирового тела личинок мух рода Lucilia в среде, содержащей пенициллин и стрептомицин, наблюдается контаминация культуры. По этим причинам возникает необходимость поиска иных подходов к стерилизации жирового тела личинок мух-каллифорид. Рис. 21. Двухэтапное хроматографирование антимикробной композиции культуральной жидкости методом ОФ ВЭЖХ. Одним из решений первой проблемы – невозможностью оценки титра антиграмположительных пептидов в культуральной жидкости – является предварительное инкубирование жирового тела в среде, содержащей пенициллин и стрептомицин, с последующей отмывкой антибиотиков и переносом продуцента в культуральную среду, лишенную стерилизующих компонентов. Такой подход имеет один существенный 77 недостаток: временная обработка антибиотиками лишь частично предупреждает контаминацию культуры. В связи с этим методика подходит исключительно для непродолжительного ведения культуры и анализа антимикробной активности жирового тела по истечении не более чем одних суток культивирования. Другим решением является ведение культуры в присутствии стрептомицина и пенициллина с последующим устранением «вспомогательных» антибиотиков из культуральной жидкости каким-либо биохимическим методом, например, ОФ ВЭЖХ. Стрептомицин и пенициллин более гидрофильны, чем антимикробные пептиды насекомых, поэтому они выходят с хроматографической колонки раньше – когда содержание ацетонитрила в колонке не превышает 5%. Комплекс антимикробных пептидов жирового тела при этом остается на колонке и может быть элюирован 50%-ным раствором ацетонитрила (Рис. 21). Третий вариант – использование в качестве стерилизующего агента норфлоксацина – антибиотика группы хинолонов. Уже в концентрации 10 мкг/мл норфлоксацин снижает контаминацию культуры, при этом размер зоны ингибирования роста M.luteus штамма А270 в антимикробном тесте также уменьшается (Рис. 22). Данный факт свиделельствует о влиянии «посторонних» бактерий на рост тест-бактерий. Вероятно, симбиотические бактерии личинки синтезируют собственные антибиотики, ингибирующие рост кокка. При увеличении концентрации норфлоксацина до 50 мкг/мл происходит дальнейшее ингибирование роста «посторонних» бактерий. Опытным путем установлено, что эффективной является концентрация норфлоксацина 30 мкг/мл, при которой колонии этих бактерий не появляются. Данная концентрация антибиотика использовалась в некоторых последующих экспериментах, целью которых являлось изучение антиграмположительной активности жирового тела in vitro. Что касается прямого влияния норфлоксацина на тест-бактерии, то на M.luteus штамма А270 антибиотик не оказывает никакого видимого воздействия, рост же кишечной палочки подавляется норфлоксацином, и при повышении концентрации антибиотика размер зон ингибирования роста E.coli штамма D31 увеличивается. То есть при использовании норфлоксацина оценивать антимикробную активность жирового тела целесообразно исключительно по степени ингибирования роста M.luteus, но не E.coli. 78 Рис. 22. Влияние норфлоксацина на рост «посторонних» бактерий и тест-бактерий. Верхняя шкала – влияние культуральной жидкости жирового тела на размер зоны роста «посторонних» бактерий. Нижняя шкала – влияние содержащей норфлоксацин инкубационной среды (незакрашенные фигуры) и культуральной жидкости жирового тела (закрашенные фигуры) на размер зоны ингибирования роста M.luteus A270 («кружки») и E.coli D31 («квадратики»). Существенным недостатком использования норфлоксацина является то, что он, как и остальные антибиотики группы хинолонов, растворим исключительно в слабых растворах кислот. В частности, норфлоксацин обычно разводят уксусной кислотой. По-видимому, именно присутствие уксусной кислоты в инкубационной среде оказывает токсическое действие на клетки жирового тела, и через 2-3 дня ведения культуры (с посуточной заменой культуральной среды) клетки погибают. Поэтому норфлоксацин подходит исключительно для кратковременного, но никак не долгосрочного ведения культуры. 79 IV.1.5. Температура культуральной среды Клетки насекомых сохраняют способность к росту и размножению в достаточно широком диапазоне температур: от 22 °С до 34 °С (Vaughn, 1984; Agathos et al., 1990; Reuveny et al., 1993). Однако в качестве оптимальной для размножения клеток и поддержания высокой метаболической активности (речь, главным образом, идет о продукции рекомбинантных белков in vitro) рекомендована температура 27 °С (Vaughn, 1984; Agathos et al., 1990; Stockdale, Priston, 1981; Cruz et al. 1999). Повышение температуры с 27 °С до 34 °С приводит к заметному снижению уровня белкового синтеза (Reuveny et al., 1993). Понижение температуры с 27 °С до 22 °С не сказывается на количестве выделяемого клеткой белка; зависимой от температуры является лишь скорость накопления белка в культуральной среде (Reuveny et al., 1993). При этом умеренное понижение температуры – с 27 °С до 25 °С – позволяет компенсировать нехватку растворенного в среде кислорода (Reuveny et al., 1993), что особенно актуально в нашем случае, когда жесткая регуляция газообмена в культуре отсутствует. Таким образов, для культивирования жирового тела личинки Calliphora vicina была выбрана температура +25 °С – +27 °С. IV.1.6. Перемешивание культуры Существенным недостатком закрытого (непроточного) глубинного культивирования клеток является риск кислородного голодания культуры, перепадов температуры и рН среды, а также накопления токсичных продуктов метаболизма в межклеточном пространстве. Все эти факторы могут создавать стрессовые условия для клеток, что, в свою очередь, негативно сказажется на конечном выходе целевого продукта. Гомогенность культуры достигается, главным образом, за счет ее непрерывного перемешивания. При эффективном перемешивании стерилизующие агенты, регуляторные молекулы плазмы и продукты метаболизма жирового тела, равномерно распределяются по всему объему культуральной среды. Клетки при этом находятся в одинаковых условиях. Кроме того, с ростом интенсивности перемешивания культуры увеличивается скорость абсорбции кислорода средой (по данным компании «Bioengineering», Швейцария). Для суспензионного культивирования клеток насекомых рекомендовано применение шейкеров с частотой вращения платформы 60-100 оборотов/мин (рекомендации компании «AB Vector», США). 80 Рис. 23. Влияние перемешивания культуры на антимикробную активность клеток жирового тела (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность различий при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. В опыте по изучению влияния перемешивания культуры на метаболическую активность жирового тела C.vicina использовали диапаузирующих личинок, окончивших питание за две недели до начала эксперимента. Жировое тело извлекали из личинки и помещали в лунку планшета, заполненную 500 мкл культуральной среды с термически обработанной плазмой. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.). В одном из вариантов опыта планшет с культурой был установлен на платформу орбитального шейкера OS-10 (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) с заданной частотой вращения платформы 90 оборотов/мин. В другом варианте жировое тело культивировали в статичных условиях. Оба планшета хранили в температуре +25 °С. Анализ антимикробной активности культуральной жидкости проводили на вторые сутки ведения культуры. 81 Результаты анализа представлены на рисунке 23. На рисунке видно, что титр антимикробных пептидов, выделяемых клетками жирового тела при покачивании культуры, достоверно выше, чем в статичных условиях. При этом потери антимикробных пептидов во втором случае могут достигать более 30%, как в представленном эксперименте. Таким образом, перемешивание инкубационной среды является неотъемлемой составляющей культивирования жирового тела. В дальнейшем мы регулярно использовали орбитальный шейкер для перемешивания культуры. IV.1.7. Газообмен в культуре жирового тела Необходимым условием нормального роста клеток насекомых и продукции белка in vitro является поддержание постоянной концентрации кислорода в культуре – этого мнения придерживается большинство исследователей (Jain et al., 1991; Zhang et al., 1994; Agathos, 1996). С другой стороны, в литературе описаны результаты экспериментов, согласно которым концентрация растворенного в культуральной среде кислорода не влияет ни на скорость увеличения клеточной массы, ни на титр синтезируемого клетками насекомых белка (Hensler et al.,1994). Согласно литературным данным, интенсивная аэрация культуры необходима не столько для сверхсинтеза целевого метаболита, сколько для наращивания биомассы продуцента. Оптимальной для роста культуры считается концентрация кислорода 50–60 % от полного насыщения, в то время как для биосинтеза целевых метаболитов достаточно 10–20 % (по данным компании «Bioengineering», Швейцария). Таким образом, если наша цель – изучение синтеза антимикробных пептидов in vitro, жесткая система поддержания газообмена нам, вероятно, не нужна, и умеренной вентиляции культуры будет достаточно для поддержания высокой метаболической активности продуцента. Изучение газообмена в культуре жирового тела особенно актуально, поскольку данная проблема неразрывно связана с проблемой выбора культуральной посуды. На сегодняшний день для культивирования клеток наиболее широко используются изделия из полипропилена (микропробирки типа эппендорф, центрифужные пробирки) и полистирола (планшеты, чашки Петри, флаконы). Полипропиленовые пробирки закрываются герметично, в то время как посуда из полистирола в подавляющем большинстве случаев имеет зазоры или встроенные фильтры для вентиляции. В работе по изучению влияния вентиляции культуры на антимикробную активность жирового тела использовали диапаузирующих личинок C.vicina, окончивших питание за две недели до начала эксперимента. Жировое тело извлекали из 20 личинок и помещали в 82 центрифужную пробирку, заполненную культуральной средой – солевым раствором – на 2/3 из расчета 500 мкл среды на 1 жировое тело. В альтернативном варианте жировое тело, выделенное из 20 личинок, инкубировали в чашке Петри диаметром 9 см. Культуральной средой служила 30% ТОП. В контрольных вариантах плазму в среду не добавляли. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.). Рис. 24. Влияние аэрации культуры на антимикробную активность клеток жирового тела (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность различий при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного премешивания (см. раздел IV.1.7.). Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали на вторые сутки ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 10 мкл. 83 Результаты теста представлены на рисунке 24. Согласно полученным данным, титр антимикробных пептидов, выделяемых жировым телом в центрифужной пробирке, значительно ниже, чем при его культивировании в чашке Петри. Так, культивирование жирового тела в герметично закрытой посуде чревато более чем двукратным снижением антимикробной активности продуцента. Причем данное утверждение справедливо и в отношении контрольных образцов, и в отношении тех вариантов, где жировое тело стимулировали внесением в среду индуктора – термически обработанной плазмы. Таким образом, культивирование жирового тела требует вентиляции культуральной ячейки. По этой причине в качестве посуды для культивирования жирового тела C.vicina целесообразно использовать изделия из полистирола, снабженные системой вентиляции и разработанные для ведения суспензионных культур. Для решения научных задач, связанных с изучением индивидуальной метаболической активности жирового тела и подразумевающих построение репрезентативной выборки, оптимальны многолуночные планшеты (как вариант – 24-луночный планшет с объемом лунки 3,6 мл). IV.1.8. Геометрические параметры культуральной ячейки С проблемой выбора эффективной аэрации культуры неразрывно связана другая проблема – выбора геометрических параметров культуральной ячейки. Главным образом, это касается глубины (высоты) ячейки. Теоретически, с увеличением объёма культуральной среды жизнеспособность клеток должна возрастать, прежде всего – за счет снижения концентрации накапливаемых в культуре токсичных метаболитов. Однако при нерациональном распределении среды, результат от увеличения её объема может быть и прямо противоположным: логично предположить, что с увеличением глубины культуральной ячейки эффективность аэрации культуры будет уменьшаться. Кроме того, при чрезмерном погружении клеток в среду, будет затруднена гомогенизация культуры. Тогда жизнеспособность клеток, а, следовательно, и титр антимикробных пептидов в среде, вопреки ожиданиям, снизятся. В опыте по изучению влияния глубины культуральной ячейки (h) на метаболическую активность жирового тела C.vicina использовали диапаузирующих личинок, окончивших питание за две недели до начала эксперимента. Жировое тело извлекали из личинки и помещали в лунку 24-луночного плоскодонного планшета (площадь дна лунки – 188,6 мм2), заполненную 250 мкл (h = 1,3 мм), 500 мкл (h = 2,7 мм) либо 1000 мкл (h = 5,3 мм) культуральной среды, содержащей либо не содержащей термически обработанную плазму. 84 Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.). Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях постоянного премешивания (см. раздел IV.1.7.). Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали на вторые сутки ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31. Объем аликвоты, наносимой на поверхность агаровой среды, составлял 1% от объема культуральной жидкости, т.е. 2,5, 5 и 10 мкл соответственно. Рис. 25. Влияние глубины культуральной ячейки (h) на антимикробную активность клеток жирового тела (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Результаты анализа представлены на рисунке 25. Из рисунка следует, что количество антимикробных пептидов, выделяемых жировым телом в присутствии индуктора, прямо пропорционально глубине культуральной ячейки (либо же – общему количеству индуктора, содержащегося в среде). Антимикробная активность в контроле (инкубирование в солевом растворе, не содержащем ТОП) с увеличением объема среды, наоборот, снизилась. Последнее, по-видимому, связано с гибелью иммуноцитов: минимальная смертность клеток наблюдалась в варианте «h = 1,3 мм», максимальная – в варианте «h = 5,3 мм» (данные по 85 анализу выживаемости клеток не представлены). Следует, однако, отметить, что однофакторный дисперсионный анализ не позволяет считать влияние объема среды на антимикробную активность жирового тела значимым (при P<0.05). Тем не менее, для долгосрочного культивирования жирового тела целесообразно ограничить глубину культуральной ячейки 3 мм. Дальнейшее увеличение данного параметра потребует дополнительной аэрации культуры. Рис. 26. Геометрические параметры культуральной ячейки Из вышесказанного следует, что распределение среды в культуральной ячейке влияет на метаболическую активность продуцента. Так, антимикробная активность жирового тела, инкубируемого в узкой и высокой емкости, будет ниже, чем при его культивировании в широкой и низкой емкости того же объема (Рис. 26). IV.1.9. Продолжительность цикла культивирования Выбранный режим культивирования жирового тела является периодическим. Это значит, что в культуру сразу вносят все компоненты, которые необходимы иммуноцитам для продукции бактерицидных молекул in vitro. Затем культуру инкубируют в течение определенного времени, по истечении которого процесс приостанавливают, проводят сбор культуральной жидкости, содержащей антимикробные пептиды, добавляют новую культуральную среду и запускают цикл повторно. Открытым остается вопрос о продолжительности цикла культивирования. Сложность решения этого вопроса обусловлена следующим противоречием. С одной стороны, жировое тело способно синтезировать антимикробные пептиды до тех пор, пока в культуральной среде присутствуют молекулы, стимулирующие его антимикробную активность – руководствуясь этим правилом, культуру целесообразно инкубировать до полного «истощения» среды. С другой стороны, длительное культивирование жирового тела без замены среды чревато 86 гибелью клеток вследствие их интоксикации продуктами метаболизма (при этом регуляторные молекулы в среде могут присутствовать в избытке). Поиск «золотой середины» неизбежно сводится к изучению динамики накопления бактерицидных молекул в культуре жирового тела. От интактных личинок C.vicina, окончивших питание за 2 недели до начала эксперимента, собирали гемолимфу через прокол стенки тела стерильной иглой. Гемолимфу центрифугировали в течение 5 минут при 70 g в условиях комнатной температуры для отделения клеточной фракции. Надосадок (плазму) подвергали термической обработке, денатурированный белок удаляли (подробнее о плазматическом факторе активации см. в разделе V.1.). В качестве культуральной среды для жирового тела использовали 30%-ную ТОП. В контрольном варианте плазму в солевой раствор не добавляли. Рис. 27. Динамика синтеза антимикробных пептидов при культивировании жирового тела в солевом растворе (– –◊–) и в 30%-ной ТОП (– –●–). В культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано. Достоверность различий при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Жировое тело выделяли через разрез в задней части тела личинки и, после предварительной промывки, переносили в культуральную среду объемом 500 мкл. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.). Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного премешивания (см. раздел IV.1.7.). Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости 87 оценивали через 12, 24 и 48 часов ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 5 мкл. Результаты теста представлены на рисунке 27. Согласно результатам эксперимента, жировое тело в отсутствие регуляторных факторов плазмы не проявляет антимикробной активности (экспозиции «12 часов» и «24 часа»), незначительное повышение титра антибиотиков в контроле наблюдается лишь на вторые сутки ведения культуры (экспозиция «48 часов»). Внесение в культуру жирового тела 30% ТОП приводит к достоверному накоплению антимикробных метаболитов в культуральной среде уже через 12 часов инкубирования культуры. Изучение динамики антимикробной активности жирового тела в присутствие плазмы показало, что накопление бактерицидных компонентов в культуральной среде происходит лишь в течение первых суток инкубирования. За вторые сутки увеличения титра антибиотиков в среде не наблюдается (Рис. 27). Руководствуясь этими данными, можно заключить, что при длительном ведении культуры жирового тела целесообразно ограничить продолжительность цикла культивирования одними сутками. Это позволит накопить высокий титр антимикробных пептидов в культуральной жидкости и предупредит гибель клетокпродуцентов вследствие отравления токсичными метаболитами. По истечении 24 часов среду необходимо полностью заменить и повторить цикл культивирования. IV.2. Количественные характеристики метода получения антимикробных пептидов in vitro Условия, выбранные нами для культивирования жирового тела Calliphora vicina, позволяют сохранить суточную метаболическую активность иммунокомпетентных клеток in vitro на высоком уровне. Роль индуктора метаболической активности клеток в этой системе выполняют регуляторные компоненты термически обработанной плазмы. На следующем этапе необходимо сравнить количество антимикробных пептидов, выделяемых жировым телом in vitro, с количеством антибиотиков, синтезируемых иммунокомпетентными клетками in vivo в ответ на заражение личинки бактериями. Для решения этой задачи было сделано следующее. Жировое тело трёх диапаузирующих личинок C.vicina, окончивших питание за 3 недели до начала эксперимента, помещали в герметично закрывыющуюся полипропиленовую пробирку, заполненную культуральной средой из расчета 1 мл среды / жировое тело. Содержание термически обработанной плазмы в среде составляло 30%. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили антибиотики: пенициллин и стрептомицин. Культуру инкубировали при температуре +25 °С в 88 условиях равномерного перемешивания. Замену культуральной среды проводили через каждые сутки ведения культуры. Из собранной культуральной жидкости отбирали аликвоты объемом 2 мкл и оценивали количественное содержание антимикробных пептидов в образце. Оставшуюся культуральную жидкость, полученную в течение первых суток ведения культуры (около 3 мл), использовали для определения качественного состава антимикробных пептидов, выделяемых жировым телом in vitro (см. следующий раздел). Рис. 28. Динамика синтеза антимикробных пептидов при культивировании жирового тела в 30%-ной ТОП (А) и титр антимикробных пептидов в разведенной солевым раствором гемолимфе инфицированной личинки (Б). Параллельно проводили сбор гемолимфы личинок, инфицированных смесью бактерий M.luteus штамма A270 и E.coli штамма D31. Гемолимфу собирали спустя сутки с момента заражения, через прокол стенки тела от нескольких особей в охлажденные полипропиленовые пробирки. Клеточную фракцию осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 70 g в условиях комнатной температуры. Для опыта отбирали 60 мкл надосадка – количество, эквивалентное содержанию плазмы в трёх диапаузирующих личинках (~20 мкл в одной личинке), и растворяли в 3-ёх мл физиологического раствора. Из полученной смеси брали аликвоту объемом 2 мкл и оценивали количественное содержание антимикробных пептидов в образце. Оставшееся количество (около 3 мл), использовали для определения качественного состава антимикробных пептидов, выделяемых жировым телом in vivo (см. следующий раздел). Результаты количественного анализа антимикробной активности материала представлены на рисунке 28 и рисунке 29, А. По нашим данным, даже в субоптимальных условиях 89 (отсутствие вентиляции, чрезмерно большой объем культуральной среды) жировое тело сохраняет способность к синтезу антимикробных пептидов in vitro в течение более чем одной недели (Рис. 28). Антимикробная активность иммуноцитов остается на неизменно высоком уровне в течение 6 дней культивирования. На 7-ой и 8-ой день наблюдается некоторое снижение метаболической активности клеток жирового тела. Важно отметить, что антимикробной активности в контролях – культуральной среде, содержащей ТОП, а также в культуре жирового тела, лишенной ТОП, – выявлено не было. Согласно полученным результатам, суточная продуктивность жирового тела in vitro выше, чем in vivo. Так, согласно результатам чашечного теста, титр антимикробных пептидов в культуральной жидкости, собранной по истечении первых суток ведения культуры, примерно вдвое превышает содержание антибиотиков в плазме инфицированной личинки. Об этом свидетельствуют соответствующие различия в размерах зон ингибирования роста бактерий в области аликвот культуральной жидкости и разведенной плазмы (Рис. 28, А, Рис. 29, А). Кроме того, как было отмечено ранее, метаболическая активность клеток жирового тела in vitro в заданных условиях сохраняется на стабильно высоком уровне в течение недели. С учетом этого факта можно заключить, что уровень синтеза антимикробных пептидов в культуре иммунокомпетентных клеток более чем на порядок выше, чем в гемолимфе инфицированной личинки. IV.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vitro Активация синтеза антимикробных пептидов in vivo имеет место при септической травме, а также при воздействии некоторых стрессорных факторов неинфекционной природы (см. разделы III.1. и III.2.). При этом основные группы выделяемых иммуноцитами бактерицидных молекул в обоих случаях, по-видимому, одни и те же (см. раздел III.3.). Синтез пептидных антибиотиков в изолированном жировом теле запускается под действием регуляторных факторов плазмы (см. раздел IV.1.2.1.) Состав антибиотиков, выделяемых иммунокомпетентными клетками in vitro, неизвестен. В связи с этим, целью экспериментов, описанных в данной главе, являлось сравнение качественного состава антибиотиков, выделенных из гемолимфы инфицированной бактериями личинки и экстрагированных из культуральной жидкости жирового тела. Получение образцов описано в разделе IV.2. В качестве метода для разделения содержащихся в материале антибиотиков на отдельные группы, была выбрана обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ). Пробоподготовка к 90 хроматографии включала очистку образцов от гидрофильных и сильногидрофобных соединений методом твердофазной экстракции. Хроматографическое фракционирование умеренно гидрофобного экстракта осуществляли на хроматографе Gold System (Beckman) с детектором Beckman 166A (Beckman) (см. «Материалы и методы»). Образец наносили на колонку Vydac C18 (5x250мм, Waters), уравновешенную 0.1% раствором ТФУ. Пептиды элюировали линейным градиентом ацетонитрила от 0 до 50% в течение 50 мин. Элюат собирали по 1 мл в виалы с помощью автоматического коллектора фракций Beckman SC (Beckman) при скорости элюции 1 мл/мин, регистрируя изменение поглощения при 220 нм. Фракции сушили в вакууме. Лиофилизат каждой фракции растворяли в 40 мкл дистиллированной воды, для чашечного теста брали аликвоту объемом 4 мкл. Антимикробную активность полученных фракций оценивали на M. luteus штамма A270 и E.сoli штамма D31 по стандартной схеме, основываясь на том, что размер зон ингибирования роста тест-бактерий отражает содержание антиграмположительных и антиграмотрицательных пептидов в каждой из фракций. Результаты измерений представлены на рисунке 29. Согласно результатам хроматографического картирования, антиграмположительные пептиды плазмы инфицированных личинок элюируются с колонки 30-32% ацетонитрила, антиграмотрицательные пептиды вымываются соответственно 28-29%, 31-32% и 36% ацетонитрила. Таким образом, картина распределения бактерицидных молекул плазмы по хроматографическим фракциям полностью соответствует наблюдаемой ранее (см. раздел III.3.); различия состоят лишь в высоте пиков антимикробной активности, обусловленной разным количеством плазмы в образцах (60 и 500 мкл соответственно). В культуральной жидкости антиграмположительная активность была сосредоточена в двух группах фракций, вышедших с колонки при 30-33% и 35-36% ацетонитрила, а антиграмотрицательная – в трех, вышедших при 28-29%, 31-34% и 35-39% ацетонитрила. Косвенно это указывает на то, что распределение антиграмотрицательных пептидов антибиотиков культуральной жидкости аналогично распределению таковых в плазме инфицированных личинок – соответственно, можно предположить, что и состав бактерицидных молекул, активных в отношении грамотрицательных бактерий, в образцах идентичен. В то же время, что касается пептидов с грамположительной активностью, то лишь один кластер является общим (фракции №30-33) – это свидетельствует о способности клеток выделять дефензины in vitro. Природа второго кластера (фракции №35-36) остается неизвестной. Примечательно, что высота пиков, соответствующих одним и тем же группам фракций плазмы иммунизированных личинок и культуральной среды, различна. Это означает, что и 91 титр антимикробных пептидов разных семейств в образцах отличается: концентрация антибиотиков всех групп антимикробных пептидов, синтезированных жировым телом in vitro, выше, чем синтезированных in vivo. Таким образом, данные тестирования антимикробной активности в отдельных фракциях подтверждают результаты, полученные при тестировании цельной плазмы инфицированных личинок и культуральной жидкости жирового тела (см. раздел IV.2. и рис. 29, А). Еще одним косвенным доказательством идентичности состава пептидных антибиотиков культуральной жидкости жирового тела и плазмы инфицированных личинок может служить схожий спектр их бактерицидной активности. В связи с этим, следующей задачей явилось сравнение спектра антиграмположительной и антиграмотрицательной активности плазмы и культуральной жидкости жирового тела. Плазму инфицированных личинок получали по методике, описанной выше. Умеренно гидрофобный экстракт плазмы сушили в вакууме, лиофилизат разводили дистиллированной водой. Количество добавляемой воды определяли исходя из того, что выделенные описанным способом умеренно гидрофобные вещества содержатся в гемолимфе живой личинки в концентрации 3,5 мг/мл – эту концентрацию воссоздавали in vitro. Изолированное жировое тело инкубировали в 30%-ной ТОП объемом 500 мкл (см. раздел IV.1.3.1.). Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.). Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного премешивания (см. раздел IV.1.7.). Экстракцию умеренно гидрофобных компонентов из культуральной жидкости проводили на вторые сутки культивирования по методике, описанной выше. Экстракт сушили в вакууме, лиофилизат подвергали хроматографическому фракционированию для отделения антибиотиков, привнесенных в культуру извне. Хроматографию проводили в два этапа: сначала вещества элюировали 20%-ным, а потом – 50%-ным раствором ацетонитрила. Пенициллин и стрептомицин выходили с колонки на первом этапе, антимикробные пептиды – на втором. Обе хроматографические фракции сушили в вакууме, лиофилизат разводили дистиллированной водой. Количество добавляемой воды определяли исходя из того, что объем гемолимфы, содержащейся в личинке (т. е. объем жидкости, приходящийся на одно жировое тело in vivo), составляет ~20 мкл – это соотношение воссоздавали in vitro. 92 Рис. 29. Определение суммарной антимикробной активности плазмы иммунизированных личинок и культуральной жидкости жирового тела (А). Хроматографическое картирование плазмы (Б) и культуральной жидкости (В). 93 Аликвоты материала объемом 4 мкл наносили на поверхность твердой агаровой среды, содержащей бактериальные клетки. В эксперименте использовали штаммы микроорганизмов из коллекции лаборатории биофармакологии и иммунологии насекомых СПбГУ: Escherichia coli штаммов D31, 774, ATCC 25922 и M17, Micrococcus luteus штамма А270, Staphilococcus aureus штамма 203, MRSA штамма ATCC 33591, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis thuringiensis, Bacillus finitimus, Listeria monocytogenes штамма EGD. Согласно результатам чашечного теста, спектр антимикробной активности культуральной жидкости жирового тела охватывает грамотрицательные палочки Escherichia coli (штаммы D31, 774, ATCC 25922 и M17), грамположительные кокки: Micrococcus luteus (штамм А270) и Staphilococcus aureus (штамм 203), бациллу Bacillus subtilis, в меньшей степени - Listeria monocytogenes (штамм EGD), Bacillus thuringiensis thuringiensis и Bacillus finitimus. Т. е. спектр активности культуральной жидкости полностью соответствует спектру антимикробной активности гемолимфы инфицированных личинок (Таблица 2). Устойчивым к антибиотикам личинки оказался стафилококк MRSA (штамм ATCC 33591). Таким образом, на основании сходства спектра бактерицидной активности плазмы и культуральной жидкости жирового тела (фракция 20-50% ацетонитрила), можно заключить, что качественный состав антимикробных пептидов, синтезируемых жировым телом in vivo и in vitro, одинаков. Характерно, что фракция культуральной жидкости, содержащая антимикробные пептиды (вариант «20%-50% ацетонитрила»), в данном тесте продемонстрировала активность в отношении палочки Escherichia coli штамма D31, в то время как фракция, содержащая стрептомицин и пенициллин (вариант «0%-20% ацетонитрила»), не оказала видимого воздействия на этот штамм (Таблица 2). Таким образом, результаты теста подтверждают литературные данные об устойчивости штамма D31 к пенициллину и стрептомицину, а значит – свидетельствуют о рациональном выборе метода очистки антимикробной композиции, получаемой в культуре жирового тела, от антибиотиков, привносимых в среду дополнительно. 94 Таблица 2. Спектр бактерицидной активности антимикробной композиции, полученной из гемолимфы инфицированных личинок и в культуре жирового тела (площадь зоны Площадь зоны ингибирования роста бактерий, мм2 ингибирования роста бактерий в мм2; в скобках – площадь зоны неполного ингибирования). Гемолимфа инфицированных личинок Культуральная жидкость (0%-20% ACN) Культуральная жидкость (20%-50% ACN) 113 64 0 13 + (51) 95 64 57 13 + (66) 64 50 10 + (29) 50 346 79 + (98) 346 50 104 87 0 0 (13) Listeria monocytogenes EGD (39) 50 (28) Bacillus thuringiensis thuringiensis (28) 113 + (170) (39) Bacillus subtilis 50 13 + (82) 50 Bacillus finitimus 0 95 + (320) (28) Escherichia coli D31 M17 ATCC 25922 774 Micrococcus luteus A270 Staphylococcus aureus 203 MRSA ATCC 33591 95 IV.4. Заключение В данной главе проведен анализ качественного и количественного состава антимикробных пептидов, выделяемых жировым телом личинки Calliphora vicina, и рассмотрено влияние ряда факторов на интенсивность синтеза бактерицидных молекул in vitro. Первостепенной задачей при изучении данного вопроса явилась разработка биотехнологической системы, в которой возможен синтез антимикробных пептидов иммунокомпетентными клетками. На роль такой системы выбрана первичная культура жирового тела личинки синей мясной мухи, где культуральной средой служит сбалансированный солевой раствор, лишенный белковых компонентов либо содержащий экзогенный белок. По классификации, предложенной Блажевичем (Блажевич, 2004), предлагаемое культивирование жирового тела личинки Calliphora vicina можно охарактеризовать как: - глубинное (суспензионное): жировое тело погружено в культуральную среду и плавает в ней свободно; - динамическое: культивирование проводят при постоянном перемешивании с помощью орбитального шейкера (частота вращения платформы 60-100 оборотов/мин.) – суточная продуктивность жирового тела при этом возрастает на 60%; - аэробное: ведение культуры производится в вентилируемой ёмкости – суточная продуктивность жирового тела при этом возрастает на 35%; - закрытое, периодическое: в культуре содержится ограниченное первоначальное количество питательного и строительного субстрата (в продуценте и культуральной среде), а также регуляторных молекул (в культуральной среде); через фиксированное время (обычно – 24 часа) производится полная замена среды, и цикл культивирования повторяется. Для предупреждения контаминации среды отработана схема стерилизации культуры. Культивирование подразумевает внесение в среду дополнительных стерилизующих агентов: стрептомицина и пенициллина, в концентрациях 100 мкг и 100 ЕД на 1 мл среды соответственно (при анализе антиграмотрицательной активности жирового тела) либо норфлоксацина, в концентрации 30 мкг/мл среды (при тестировании антиграмположительной активности жирового тела). Интенсивный синтез антимикробных пептидов жировым телом in vitro возможен лишь при добавлении в культуральную среду аминокислот (гидролизата лактальбумина). Активаторами синтеза пептидных антибиотиков в системе служат растворимые факторы покровов и термически обработанной плазмы интактных (неинфицированных) личинок. 96 Ответная реакция изолированного жирового тела на добавление иммуномодуляторных факторов плазмы изучена нами достаточно подробно. При инкубировании жирового тела в среде, содержащей термически обработанную плазму, достоверное повышение уровня синтеза бактерицидных молекул наблюдается уже через несколько часов ведения культуры. Нарастание титра антимикробных пептидов в культуре происходит неравномерно: метаболическая активность иммунокомпетентных клеток максимальна в течение первых суток культивирования, на вторые же сутки интенсивность накопления антибиотиков в среде снижается (в отсутствие смены культуральной среды). Кроме того, в данном разделе исследовано прямое влияние гормонов насекомых на антимикробную активность жирового тела in vitro. Нами обнаружен стимулирующий эффект низких концентраций α-экдизона, а также высоких доз адипокинетического гормона и биогенного амина – октопамина – на синтез бактерицидных белков. Согласно данным хроматографического картирования, качественный состав антимикробных пептидов, синтезируемых жировым телом in vitro, в основном, идентичен составу антибиотиков, экстрагированных из гемолимфы инфицированной личинки. Об этом свидетельствует одинаковое распределение антимикробной активности по хроматографическим фракциям культуральной жидкости и плазмы. Другим косвенным доказательством сходного состава антибиотиков, продуцируемых жировым телом in vivo и in vitro, является схожий спектр их бактерицидной активности. Что касается количественных характеристик синтеза антимикробных пептидов, то следует отметить, что суточный выход антибиотиков в культуре клеток жирового тела, содержащей плазму, сопоставим с количеством бактерицидных молекул, синтезируемых иммунокомпетентными клетками in vivo. Однако, поскольку предлагаемая методика культивирования жирового тела позволяет поддерживать антимикробную активность иммуноцитов на высоком уровне в течение более чем одной недели, суммарный выход бактерицидных белков in vitro на порядок выше, чем in vivo (в перерасчете на одно жировое тело). 97 V. Поиск факторов активации жирового тела и изучение их свойств Добавление плазмы либо экстракта покровов личинки Calliphora vicina в культуру жирового тела приводит к активации клеток жирового тела и накоплению антимикробных пептидов в культуральной среде. Мы объясняем это явление действием на иммунокомпетентные клетки гуморальных факторов, локализованных в плазме и покровах личинки. Целью дальнейшей работы является предварительная очистка этих факторов и изучение их свойств. V.1. Термостабильность факторов активации жирового тела Белки имеют разную степень тепловой денатурации. Это значит, что можно подобрать температуру, при которой один белок полностью денатурирует, тогда как другой белок более чем на 95% останется интактным (Скоупс, 1985). Метод избирательной денатурации под действием температуры был выбран для предварительной концентрации и очистки факторов активации жирового тела, а также – определения степени их термостабильности. V.1.1. Термостабильность факторов активации, локализованных в плазме В опытах использовали личинок, окончивших питание за неделю до начала эксперимента. Гемолимфу, собранную от нескольких особей, центрифугировали в течение 5 минут при 70 g в условиях комнатной температуры для отделения клеточной фракции. Надосадок подвергали термической обработке. При погружении пробирки с плазмой на 2 минуты в воду, температура которой достигала 90-100 °С, основная масса белков плазмы денатурировала, образуя сгустки твердой консистенции. Денатурированный белок осаждали центрифугированием, а надосадок смешивали с физиологическим раствором в соотношении 3:7. Для стерилизации культуры в среду добавляли пенициллин и стрептомицин. Жировое тело выделяли через разрез в задней части тела личинки и, после предварительной промывки, переносили в среду объемом 500 мкл. Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного перемешивания. Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали спустя сутки ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 5 мкл. 98 Результаты теста свидетельствуют о том, что антимикробная активность в культуре жирового тела, содержащей термически обработанную плазму, достоверно выше, чем при инкубировании жирового тела в 1%-ном ГЛА (Рис. 16, А1). При этом сама термически обработанная плазма содержит минимум соединений с прямой бактерицидной активностью (варианты 50% ТОП и 100% ТОП), либо антимикробной активности в плазме не удается обнаружить вовсе (12,5% ТОП и 25% ТОП). Это значит, что единственным потенциальным источником антимикробных пептидов в системе являются иммуноциты. Повышенную активность жирового тела, в свою очередь, можно объяснить лишь воздействием на иммунокомпетентные клетки компонентов термически обработанной плазмы. Примечательно, что иммуномодуляторная активность термически обработанной плазмы сопоставима с активностью плазмы, не подвергавшейся нагреву (Рис. 16, А1 и А2). Следует отметить, что в интактной (не подвергавшейся нагреву) плазме присутствует фоновая антимикробная активность, превышающая таковую в ТОП (Рис. 16, Б1 и Б2). Зачастую эта активность сохраняется даже при трехкратном разведении гемолимфы культуральной средой. Содержание антибиотиков в плазме интактных личинок варьирует в разных популяциях объекта и зачастую очень велико – тогда «вклад» непосредственно жирового тела в антимикробную активность культуры оценить очень сложно. По этой причине в экспериментах по изучению иммуномодуляторных свойств плазмы необходима предварительная инактивация содержащихся в ней антимикробных компонентов каким-либо способом, например, нагреванием. На основании полученных данных мы можем заключить, что фактор активации жирового тела, содержащийся в плазме травмированных личинок, является термостабильным соединением и сохраняет иммуномодуляторные свойства в диапазоне температур 90-100 °С. V.1.2. Термостабильность факторов активации, локализованных в покровах В опытах использовали личинок, окончивших питание за две недели до начала эксперимента. Покровы отделяли по методике, описанной в разделе II.2.1.4., и переносили в солевой раствор, из расчета 1 мл культуральной среды на 10 покровов. Культуру покровов инкубировали при температуре +25 °С в течение 4 часов. По истечении этого времени производили сбор культуральной жидкости. В первом случае культуральная жидкость покровов непосредственно служила культуральной средой для жирового тела. Во втором – инкубат покровов предварительно подвергали термической обработке. 99 Термическую обработку культуральной жидкости покровов проводили на водяной бане при температуре 90-100°С в течение 2 минут. Часть белков инкубата при этом денатурировала, образуя сгустки плотной консистенции. Денатурированный белок осаждали центрифугированием, а надосадок использовали в качестве культуральной среды для жирового тела. Жировое тело выделяли через разрез в задней части тела личинки и, после предварительной промывки, переносили в среду объемом 250 мкл. Для предупреждения контаминации культуры в среду добавляли пенициллин и стрептомицин. Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного перемешивания. Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали спустя сутки ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 5 мкл. Результаты теста представлены на рисунке 17. Покровы являются источником факторов активации жирового тела. Подтверждением этому является тот факт, что перенос жирового тела в культуральную жидкость покровов приводит к активации иммунокомпетентных клеток, которая выражается в выделении антимикробных пептидов. Как следствие, титр бактерицидных молекул в среде возрастает (см. раздел IV.1.3.2.). При этом сама культуральная жидкость покровов не содержит компонентов с выраженной бактерицидной активностью. Термическая обработка культуральной жидкости не влияет существенным образом на ее иммуномодуляторные свойства. Так, добавление термически обработанного инкубата покровов, равно как и интактного инкубата, к жировому телу приводит к активации иммуноцитов (Рис. 17). Следовательно, фактор активации жирового тела, локализованный в покровах личинки, также является термостабильным соединением и сохраняет биологическую активность в диапазоне температур 90-100 °С. V.2. Молекулярная масса факторов активации жирового тела Следующим этапом было определение относительного размера фактора активации иммуноцитов, содержащегося в плазме травмированной личинки. Для этого термостабильную составляющую плазмы (см. раздел V.1.1.) наносили на колонку Centricon100 (фильтр с номинально отсекаемой молекулярной массой 3 кДа, Amicon) и центрифугировали в течение 1 часа при комнатной температуре на скорости 10 000 g. Фильтрат смешивали с культуральной средой в соотношении 3:7. Для стерилизации культуры в среду добавляли пенициллин и стрептомицин. 100 Рис. 30. Влияние термически обработанной плазмы интактных личинок и ее низкомолекулярной фракции на антимикробную активность клеток жирового тела (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Жировое тело выделяли через разрез в задней части тела личинки и, после предварительной промывки, переносили в среду объемом 500 мкл. Для предупреждения контаминации культуры в среду добавляли пенициллин и стрептомицин. Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного перемешивания. Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали спустя сутки ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 10 мкл. Согласно полученным данным (Рис. 30), антимикробная активность в культуральной жидкости жирового тела, инкубируемого на протяжении суток в присутствии 3 кДа-фракции термически обработанной плазмы, достоверно выше, чем в контроле. При этом сам фильтрат не содержит соединений, обладающих прямой бактерицидной активностью. Это значит, что потенциальным источником антимикробных пептидов в культуре являются исключительно клетки жирового тела. Повышенную активность жирового тела, в свою очередь, можно 101 объяснить лишь тем, что в 3 кДа-фракции термически обработанной плазмы травмированной личинки содержатся соединения, стимулирующие продукцию антимикробных пептидов иммунокомпетентными клетками. Иммуномодуляторная активность фильтрата сопоставима с активностью термически обработанной плазмы. Таким образом, искомый индуктор имеет молекулярную массу, не превышающую 3 кДа. V.3. Хроматографические характеристики факторов активации жирового тела Разделение термостабильной составляющей плазмы на фракции, различающиеся по степени гидрофобности содержащихся в ней молекул, проводили методом твердофазной экстракции на картриджах SepPak C18 (см. «Материал и методы»). Рис. 31. Влияние экстракта гидрофильных (0% ACN), умеренно гидрофобных (0%-50% ACN) и сильногидрофобных (50%-80% ACN) веществ термически обработанной плазмы на антимикробную активность клеток жирового тела (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. 102 Лиофилизат каждой из фракций растворяли в 1%-ном ГЛА. Объем добавленного 1%-ного ГЛА был эквивалентен объему темически обработанной плазмы, нанесенной на колонку. Полученный раствор дополнительно разводили 1%-ным ГЛА в 4 раза (1:3) либо в 2 раза (1:1) и использовали в качестве культуральной среды для жирового тела. Для стерилизации культуры в среду добавляли пенициллин и стрептомицин. Жировое тело выделяли через разрез в задней части тела личинки и, после предварительной промывки, переносили в среду объемом 250 мкл. Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного перемешивания. Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали спустя сутки ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 3 мкл. Результаты теста, представленые на рисунке 31, свидетельствуют о том, что и экстракт гидрофильных, и экстракт умеренно гидрофобных, и экстракт сильногидрофобных соединений термически обработанной плазмы оказывают стимулирующий эффект на иммунокомпетентные клетки. Тот факт, что все три экстракта активируют синтез антимикробных пептидов в клетках жирового тела, позволяет предположить, что в плазме C.vicina содержится не один, а несколько факторов активации жирового тела, различающихся степенью гидрофобности. V.4. Видоспецифичность факторов активации жирового тела Для определения видоспецифичности плазматического фактора активации жирового тела личинки Calliphora vicina, к жировому телу личинки C.vicina добавляли термически обработанную плазму личинок мух семейства Calliphoridae (Calliphora vicina, C. vomitoria, Lucilia sericata, L. caesar) и Muscidae (Musca domestica). В опытах использовали личинок, окончивших питание за 1 день (Muscidae) либо – за 3 недели (Calliphoridae) до начала эксперимента. Гемолимфу, собранную от нескольких особей, центрифугировали в течение 5 минут при 70 g в условиях комнатной температуры для отделения клеточной фракции. Надосадок (плазму) подвергали термической обработке (см. Материал и методы). Термостабильную составляющую плазмы смешивали с культуральной средой – 1%-ным ГЛА – в соотношении 1:3. Для стерилизации культуры в среду добавляли антибиотики: пенициллин и стрептомицин. 103 Рис. 32. Влияние термически обработанной плазмы личинок разных видов мух на антимикробную активность клеток жирового тела Calliphora vicina (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность отличия от контроля при Р: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. Жировое тело выделяли через разрез в задней части тела личинки C.vicina и, после предварительной промывки, переносили в среду объемом 250 мкл. Культуру инкубировали при температуре +25 °С в условиях равномерного перемешивания. Содержание антимикробных пептидов в культуральной жидкости оценивали спустя сутки ведения культуры по размеру зоны ингибирования роста E.coli штамма D31 вокруг аликвоты материала объемом 2 мкл. Результаты теста представлены на рисунке 32. Согласно полученным данным, активация клеток жирового тела C.vicina происходит в ответ на добавление в культуральную среду плазмы личинок всех исследуемых видов мух-каллифорид. Плазма Musca domestica не оказывает достоверного влияния на антимикробную активность иммунокомпетентных клеток. Это позволяет предположить, что фактор активации жирового тела C.vicina является специфичным для мух семейства Calliphoridae. 104 V.5. Заключение В ходе исследований в плазме гемолимфы травмированных личинок обнаружен растворимый фактор активации, введение которого в инкубационную среду резко повышает антимикробную активность жирового тела. Предварительный анализ показал, что фактор активации является термостабильным, гидрофильным соединением с молекулярной массой менее 3 кДа, специфичным для мух семейства Calliphoridae. Согласно результатам исследований, покровы личинки C. vicina также являются источником факторов активации клеток жирового тела. Как и плазматический фактор активации, фактор активации жирового тела, локализованный в покровах, является термостабильным соединением. 105 Глава VI. Обсуждение Гемолимфа выраженными интактных личинок бактерицидными всех исследованных свойствами, мух-каллифорид обусловленными наличием обладает в плазме антимикробных пептидов. Это означает, что пептидные антибиотики в норме продуцируются иммуноцитами личинок. Тем не менее, влияние ряда факторов инфекционной либо неинфекционной природы приводит к активации иммунокомпетентных клеток, и титр антимикробных пептидов в гемолимфе насекомого возрастает в несколько раз. То есть, синтез антимикробных пептидов у мух-каллифорид носит индуцибельный характер. В настоящей работе продемонстрировано влияние различных факторов на интенсивность синтеза антимикробных пептидов в организме личинок мух-каллифорид. Установлено, что индукция синтеза бактерицидных соединений в организме личинки может протекать по двум сценариям. В одном случае иммунный ответ реализуется независимо от нейроэндокринной системы, в другом – является результатом влияния мозга и кольцевой железы на активность иммунокомпетентных клеток. Основываясь на критерии вовлеченности нейроэндокринной системы в иммунный процесс, мы выделили, соответственно, два типа индукции синтеза антимикробных пептидов: травмогенную индукцию (не зависящую от нейроэндокринной системы) и нейрогенную индукцию (опосредованную нейросекреторными клетками). VI.1. Травмогенная индукция синтеза антимикробных пептидов Под термином «травмогенная индукция» мы понимаем все те механизмы активации синтеза пептидных антибиотиков, которые не подпадают под влияние нейроэндокринной системы и неизбежно связаны с травмированием покровов. Кллассическим примером травмогенной индукции антимикробной активности является септическое заражение. Инфицирование личинок мух смесью грамположительных и грамотрицательных бактерий приводит к многократному увеличению антимикробной активности в гемолимфе. При этом механизм, лежащий в основе данного явления у мух-каллифорид, остается неясным. Прежде всего, мы задались вопросом, откуда иммунокомпетентные клетки получают пластический материал для построения бактеридидных компонентов. Ответ на данный вопрос, казалось бы, очевиден. Известно, что основным местом синтеза антимикробных пептидов в организме личинки является жировое тело (Hoffmann, Reichhart, 2002). К моменту окончания личинкой питания содержание белка в жировом теле достигает 10% от его сырой массы (Dahlhelm, 1973), и логично было бы предположить, что для синтеза антимикробных пептидов жировое тело использует именно эндогенные пластические вещества. Отчасти, это 106 предположение подтверждается результатами наших исследований: жировое тело, выделенное из интактной личинки C.vicina и помещенное в безбелковый солевой раствор, выделяет антимикробные пептиды в культуральную среду. Таким образом, пластические компоненты в жировом теле диапаузирующей личинки действительно присутствуют, и оно использует их для построения бактерицидных молекул. Вместе с тем, добавление аминокислот (гидролизата лактальбумина) в культуру жирового тела интактной личинки приводит к достоверному увеличению его антимикробной активности. То есть, по-видимому, жировое тело диапаузирующей личинки все-таки способно поглощать аминокислоты из культуральной среды. При этом следует помнить, что гемолимфа личинки характеризуется высоким содержанием в ней свободных аминокислот. В частности, у C.vicina обнаружены следующие аминокислоты: аланин, тирозин, пролин, валин, изолейцин, гистидин, фенилаланин, глицин, лейцин, лизин, серин и аспарагиновая кислота (Finlayson, Hamer, 1949). Есть все основания полагать, что если жировое тело поглощает аминокислоты in vitro, оно будет поглощать их и in vivo. Рис. 33. Cтадии травмогенной индукции синтеза антимикробных пептидов у личинки Calliphora vicina: 1 – распознавание бактериальных паттернов (Б), 2 – поглощение аминокислот (АК) из плазмы и 3 – синтез антимикробных пептидов (АМП) клетками жирового тела (ЖТ). Однако результаты сравнения антимикробной активности жирового тела интактной личинки in vivo и in vitro свидетельствуют о том, что титр пептидных антибиотиков в гемолимфе насекомого на один-два порядка ниже, чем в культуральной жидкости жирового тела (при соответствующем разведении). Таким образом, жировое тело интактной личинки in vivo продуцирует существенно меньше антибиотиков, чем in vitro. Это значит, что выделение жирового тела и перемещение в несвойственную ему среду само по себе стимулирует активность иммунокомпетентных клеток либо же in vivo присутствует какой-либо механизм 107 подавления синтеза антимикробных пептидов. В то же время, если личинок перед выделением жирового тела инфицировать бактериями, то титр антимикробных пептидов в культуре иммуноцитов инфицированных личинок будет выше, чем в культуре иммуноцитов интактных личинок и сопоставим с титром антибиотиков в гемолимфе инфицированных насекомых. Этот факт свидетельствует о том, что при септическом заражении иммунокомпетентные клетки получают сигнал, инициирующий поглощение аминокислот из культуральной среды, и, вероятно, из гемолимфы – если речь идет об иммунном ответе in vivo. Основываясь на полученных данных, мы выделили три этапа индукции синтеза пептидных антибиотиков у мясных мух (Рис. 33). На первом этапе происходит прямое или опосредованное распознавание бактериальных паттернов клетками жирового тела, на втором – поглощение жировым телом из гемолимфы аминокислот, на третьем – собственно, выделение иимунокомпетентными клетками антимикробных пептидов. Теперь проанализируем эффект от септического заражения. Согласно результатам экспериментов, у личинок C.vicina отсутствует какая-либо специфичность иммунного ответа. Инфицирование личинок грамположительным кокком M.luteus приводит к накоплению в гемолимфе как антиграмположительных, так и антиграмотрицательных пептидов. Аналогично, следствием инфицирования грамотрицательной палочкой E.coli является синтез иммунокомпетентными клетками не только антиграмотрицательных, но и антиграмположительных пептидов. При этом ни титр антиграмположительных, ни титр антиграмотрицательных пептидов не зависят от типа иммуногена. Схожие результаты получены на каллифоре другими авторами (Гордя, неопубликованные данные). В то же время, данные по дрозофиле – самому изученному с точки зрения иммунологии представителю круглошовных мух – указывают на возможную дифференцировку иммунного ответа у плодовой мушки и зависимость количества синтезируемых иммунокомпетентными клетками бактерицидных молекул от типа патогена. Исследователи отмечают, что инфицирование личинки дрозофилы только лишь грамположительными или, наоборот, только лишь грамотрицательными бактериями запускает экспрессию всех антимикробных генов. Но при этом уровень экспрессии «антиграмположительных» генов значительно выше в случае инфицирования насекомого грамположительными бактериями. (Hoffmann, Reichhart, 2002). С другой стороны, из результатов более ранней работы той же группы авторов следует, что грамположительный кокк M.luteus является более слабым активатором экспрессии всех (!) антибактериальных генов, чем грамотрицательная палочка E.coli (Lemaitre et al., 1997). Но, так или иначе, ни те, ни другие результаты не согласуются с данными, полученными нами на синей мясной мухе. 108 Нетрудно заметить, что септическая травма представляет собой совокупность двух типов раздражителей: бактерий и травмирования покровов. При изучении влияния асептического сквозного повреждения покровов на синтез пептидных антибиотиков у мух, выяснилось, что даже в отсутствие бактерий травмирование сопровождается повышением титра антимикробных пептидов в гемолимфе, однако эффект от травмы несколько слабее, чем от септического повреждения. Тем не менее, «вклад» травмы в иммунный ответ может быть очень значительным. Особенно это касается активации синтеза пептидов с антиграмотрицательной активностью: в ряде случаев достоверных различий между титром антиграмотрицательных пептидов в гемолимфе травмированных и инфицированных личинок обнаружить не удалось. Что касается антиграмположительных пептидов, то инфицирование раны во всех случаях достоверно повышало активность иммунокомпетентных клеток. Данные по влиянию асептической травмы на антимикробную активность иммуноцитов у C.vicina согласуются с данными, полученными на мясных мухах другими авторами. Так, например, у мухи Phormia terranovae введение живых либо убитых грамположительных и грамотрицательных бактерий, липополисахаридов, пептидогликанов, дистиллированной воды и даже простое повреждение покровов в стерильных условиях приводило к продуцированию одних и тех же семейств антимикробных пептидов. Однако иммунный ответ при асептическом повреждении покровов, как и в нашем случае, был выражен слабее и, кроме того, имел более короткое время проявления, чем при инфицировании (Dimarcq et al., 1990; Hoffmann, Hoffmann, 1990). Природа асептической травмогенной индукции синтеза антимикробных пептидов у насекомых неясна. Возможно, что у мух в случае стерильного повреждения покровов, как и при инфицировании, имеет место активация молекулярных факторов плазмы, стимулирующих синтез антимикробных пептидов иммунокомпетентными клетками. Тогда остается непонятным, чем инициируется распознающий каскад, поскольку патогенассоциированные молекулярные паттерны при стерильном повреждении в гемолимфе отсутствуют. Участие гормонов в иммунном процессе, по-видимому, также исключено: изоляция иммунокомпетентных клеток от нейроэндокринной системы не влияет на продуцирование ими антимикробных пептидов. Другим потенциальным источником регуляторных молекул при травме являются покровы. Причем в последнем случае может иметь место как активное (опустошение клеточных депо либо синтез de novo), так и пассивное (разрушение гиподермальных клеток или кутикулярного матрикса) выделение иммунотропных факторов в гемолимфу, прямо или опосредованно влияющих на антимикробную активность жирового тела. Но, в любом случае, если травмирование личинок приводит к активации синтеза 109 антимикробных пептидов, то плазма травмированных насекомых (либо выделенная через прокол стенки тела интактных насекомых) будет содержать иммуномодуляторные факторы – при добавлении такой плазмы к жировому телу антимикробная активность иммуноцитов повысится. Данное предположение подтверждается результатами экспериментов in vitro – плазма действительно стимулирует выделение бактерицидных компонентов клетками жирового тела. Поиску и очистке плазматических факторов активации жирового тела в работе уделено особое внимание. Предварительный анализ позволяет предположить, что в плазме присутствуют несколько соединений с иммуномодуляторной активностью: одни имеют гидрофильную, а другие – гидрофобную природу. Плазматические факторы активации являются термостабильными соединениями с молекулярной массой в пределах 3 кДа, специфичными для мух семейства Calliphoridae. Покровы личинки также являются источником факторов активации жирового тела. Установлено, что при инкубировании «цельных» покровов происходит накопление иммуномодуляторных факторов в культуральной среде. Так, культуральная жидкость, собранная через 4 часа культивирования покровов, стимулирует клетки жирового тела к синтезу антимикробных пептидов сильнее (достоверное влияние отмечено в 100% случаев), чем культуральная жидкость, собранная через 30 минут (достоверное влияние отмечено в 50% случаев). Это свидетельство того, что источником индуктора антимикробной активности жирового тела, возможно, является не кутикулярный матрикс, а именно живые клетки – эпителиоциты, которые при повреждении покровов активно выделяют регуляторные факторы в плазму. Характерно, что накопление фактора активации жирового тела в культуре покровов происходит уже в течение получаса – настолько короткий временной интервал наводит на мысль о депонировании активационного фактора в эпителиальных клетках. Следующим вопросом является вопрос об изначальной локализации факторов активации жирового тела в организме личинки. Например, следует учитывать тот факт, что плазматические факторы активации могут как изначально присутствовать в плазме, так и попадать туда вследствие разрушения эпителиальных клеток, имеющего место при сборе гемолимфы. Кроме того, если индуктор локализован в плазме изначально, то неясно, активен ли индуктор в организме личинки в норме, либо же он представлен в виде неактивного предшественника, активация которого происходит в случае повреждения покровов. Рассмотрим все возможные варианты с учетом результатов, полученных на модели изолированного жирового тела. Вариант первый: индуктор активен и изначально локализован в плазме. Если это так, то синтез антимикробных пептидов жировым телом in vivo в нормальных (неэкстремальных) 110 условиях должен поддерживаться на предельно высоком уровне. Как следствие, плазма интактных личинок будет содержать большое количество бактерицидных компонентов. На самом же деле ситуация обратная: антимикробная активность плазмы, выделенной из интактных личинок, чрезвычайно низка. Тем не менее, в пользу первого варианта может быть высказано предположение о том, что в организме личинки существует сложная система регуляции антимикробной активности жирового тела, основанная на действии не только активаторов, но и ингибиторов синтеза антимикробных пептидов. То есть в нормальных условиях ответная реакция жирового тела на воздействие активного индуктора in vivo блокируется каким-либо другим фактором. Тогда плазма, добавленная в культуру жирового тела, будет содержать и активаторы, и ингибиторы пептидного синтеза. Вследствие этого, ответ жирового тела in vitro в присутствии цельной плазмы будет настолько же слабым, как и in vivo. Однако из результатов нашей работы следует, что это не так – активность жирового тела in vitro не лимитирована. Рассмотрим второй вариант: индуктор изначально локализован в плазме личинки в виде неактивного предшественника, активация которого имеет место в случае повреждения покровов (Рис. 35, 4). Эта гипотеза имеет право на существование, тем более что подобный механизм индукции антимикробной активности иммунокомпетентных клеток описан у дрозофилы и ряда других модельных объектов (Tanaka et al., 2008). Согласно литературным данным, лиганд к рецептору Toll иммуноцита дрозофилы – белок Spatzle – изначально неактивен и переходит в активное состояние на заключительном этапе каскада протеолитических реакций при распознавании поверхностных структур микроорганизмов (Hoffmann, Reicchart, 2002; Hoffmann et al., 2008). Более того, нельзя исключать, что индуктором антимикробной активности жирового тела C.vicina и является Spatzle. Последнее предположение подкреплено тем, что высокая термостабильность, свойственная активатору жирового тела Calliphora vicina, присуща и белку Spatzle (Hoffmann et al., 2008; Tanaka et al., 2008). Однако в нашем случае отсутствует главное условие активации Spatzle – наличие иммуногена (поверхностных структур микроорганизмов) в среде. Дело в том, что сбор гемолимфы у личинок Calliphora vicina проводится в стерильных условиях. Это значит, что в добавляемой к жировому телу плазме белок Spatzle может присутствовать только в виде неактивного предшественника. Нельзя, однако, исключать, что активация предшественника Spatzle имеет место на более позднем этапе эксперимента – в культуре жирового тела. Поскольку жировое тело, выделенное из личинки, нестерильно, т. е. в культуральной среде присутствует иммуноген (предположительно, симбионт личинки), то in vitro, теоретически, возможно протекание каскада протеолитических реакций и активация Spatzle. 111 Другим камнем преткновения являются различия в молекулярных массах регуляторных факторов. Так, молекулярная масса индуктора антимикробной активности жирового тела Calliphora vicina, по нашим данным, не превышает 3 кДа, в то время как массы «активных» фрагментов С-106 8.19 и С-106 11.7 белка Spatzle D.melanogaster составляют соответственно 23 кДа и 26 кДа. Эти различия свидетельствуют о том, что функцию индуктора антимикробной активности клеток жирового тела у синей мясной мухи, по-видимому, выполняет какой-то другой фактор. Еще одним аргументом в пользу уникальности искомого фактора активации является его видоспецифичность. В то время как Spatzle представлен у насекомых самых разных отрядов (An et al., 2010), плазматический фактор активации жирового тела C.vicina, по данным настоящей работы, специфичен исключительно для мух семейства Calliphoridae. Не исключена и такая ситуация – индуктор антимикробной активности жирового тела изначально активен, локализован в покровах личинки и попадает в плазму при сборе гемолимфы (Рис. 35, 3). Как уже было отмечено, покровы являются источником фактора активации жирового тела. Культивирование поврежденных покровов приводит к высвобождению этого фактора из эпителиальных клеток, и тогда добавление культуральной жидкости покровов к жировому телу приводит к стимуляции иммуноцитов. То есть теоретически эпителиальный фактор активации жирового тела может попасть в плазму при сборе гемолимфы – тогда и плазма окажет аналогичное действие (Рис. 35, «?»). Именно это мы и наблюдаем в соответствующих экспериментах. В пользу третьего варианта свидетельствует одно общее свойство индуктора плазмы и интуктора покровов – высокая термостабильность. Несмотря на всю неопределенность процесса, мы можем констатировать одно – повреждение покровов приводит к появлению в плазме личинки гуморальных факторов, способных стимулировать синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела. Таким образом, есть все основания полагать, что описанный тип активации иммунокомпетентных клеток лежит в основе травмогенной индукции антимикробной активности у синей мясной мухи in vivo. VI.2. Нейрогенная индукция синтеза антимикробных пептидов К нейрогенной индукции мы относим все те механизмы активации синтеза пептидных антибиотиков, которые опосредованы нейроэндокринной системой. Впервые явление нейрогенной индукции синтеза антимикробных пептидов у насекомых было описано в 1998 г. (Черныш и др., 1998). Оказалось, что хроническое механическое раздражение в виде 112 лигатуры, наложенной на уровне I сегмента тела, активирует синтез антимикробных пептидов в организме личинки C.vicina. Изоляция иммунокомпетентных клеток от нейроэндокринного комплекса (наложение изолирующей лигатуры – позади мозга) сразу после начала стрессорного воздействия снимает стимулирующий эффект раздражающей лигатуры – этот факт свидетельствует о том, что «инициатором» иммунной реакции является мозг личинки. Наши данные подтвердили существование феномена нейрогенной индукции у C.vicina – наложение раздражающей лигатуры действительно приводит к повышению титра антимикробных пептидов в гемолимфе насекомого. Качественный состав антимикробных пептидов, экстрагированных из гемолимфы лигатурированных личинок, оказался идентичен таковому в гемолимфе инфицированных насекомых – эти данные еще раз подтверждают наше предположение о неспецифичности иммунного ответа у C.vicina. Кроме того, мы показали, что другое повреждающее воздействие – термический ожог – оказывает сходный с лигатурой эффект. Ожог индуцирует синтез как антиграмположительных, так и антиграмотрицательных пептидов в организме личинки. При этом интенсивность иммунного ответа пропорциональна силе ожога. Как и при лигатурном стрессе, изоляция иммуноцитов от нейроэндокринного комплекса блокирует синтез антимикробных пептидов – как следствие, их титр в гемолимфе лигатурированных личинок с ожогом остается неизменным. В связи с этим, термический ожог был отнесен к нейрогенным индукторам антимикробной активности. Следует, однако, отметить, что все изложенные факты касаются исключительно поверхностных ожогов, не приводящих к сквозному повреждению покровов. Экспериментальным путем установлено, что время, необходимое для нейрогенной индукции синтеза антимикробных пептидов при лигатурном стрессе, составляет не более 1 минуты (Черныш и др., 1998, Gordya et al., 2011). Основываясь на данных по скорости реакции, а также на отсутствии литературных данных по иннервации жирового тела, мы предположили, что нейрогенная индукция синтеза антимикробных пептидов в нашем случае обусловлена действием гормонов, в первую очередь тех, которые накапливаются в кардиальных телах личинки. В качестве потенциальных кандидатов на роль индукторов антимикробной активности жирового тела были выбраны те гормоны, которые являются ключевыми в создании так называемого адаптационного синдрома, возникающего в организме насекомого в ответ на действие чрезвычайных раздражителей (Черныш и др., 2007). Известно, что первой по скорости реакцией на раздражитель является секреция биогенных аминов, обеспечивающих мобилизацию резервных энергетических субстратов в жировом теле и нервной системе. Поскольку в высокой концентрации биогенные амины являются токсичными соединениями, 113 их действие ограничено во времени и уступает место процессам, регулируемым адипоконетическим гормоном и, далее, экдистероидами. Таким образом, мы сконцентрировали внимание на биогенных аминах – допамине и октопамине, адипокинетическом гормоне и экдистероидах – α- и β-экдизоне. Причем нашей целью было изучение именно прямого влияния этих гормонов на антимикробную активность жирового тела in vitro. В ходе работы был обнаружен стимулирующий эффект низких концентраций α-экдизона, а также высоких доз адипокинетического гормона и биогенного амина – октопамина – на синтез бактерицидных белков. Высокие концентрации α-экдизона, наоборот, ингибировали антимикробную активность жирового тела. Несмотря на кажущуюся очевидность, полученные данные нуждаются в дополнительном осмыслении. В частности, мы не склонны расценивать видимый иммуностимулирующий эффект адипокинетического гормона как результат специфической активации синтеза антимикробных пептидов в иммунокомпетентных клетках. Вероятнее всего, стимуляция пептидного синтеза в данном случае носит неспецифический характер и является следствием мобилизации всех энергетических ресурсов клеток жирового тела. Аналогично, при анализе данных по влиянию октопамина на клетки жирового тела C.vicina следует учитывать, что биогенные амины в высоких концентрациях, как отмечалось ранее, токсичны для клеток. Поэтому наблюдаемая индукция синтеза защитных белков при воздействии октопамина может являться следствием интоксикации иммуноцитов и также носить неспецифический характер. Что касается экдистероидов, то, согласно литературным данным (Черныш и др., 2007), именно они являются конечным регулятором репараторных процессов при стрессе. По одной из гипотез выживанию насекомых в экстремальных условиях способствует поддержание промежуточного титра экдистероидов: выше фонового, но ниже морфогенетически значимого, необходимого для пупаризации (Черныш и др., 2007). Это предположение подтверждается данными экспериментов, описанных выше. Лишь очень малые концентрации α-экдизона (0.02 мкг/мл) индуцируют синтез антимикробных пептидов. Высокие (200 мкг/мл), морфогенетически эффективные концентрации экдистероидов играют, по-видимому, иммуносупрессорную роль, подавляя гуморальное звено иммунитета. Таким образом, результаты исследований указывают на антагонизм морфогенетического и иммуностимулирующего эффектов экдистероидов. Согласно литературным данным, все физиологические эффекты экдистероидов обусловлены активацией процессов транскрипции. Конечный же результат определяется тем, какие участки генома оказываются открытыми для считывания. Увеличение концентрации экдистероидов, воздействующих на клетку, повидимому, приводит к тому, что экспрессия генов иммунного ответа уступает место 114 считыванию участков генома, регулирующих морфогенетические процессы. С другой стороны, обращает на себя внимание тот факт, что иммуномодуляторным действием обладает исключительно α-экдизон – предшественник линочного гормона – βэкдизона. Не исключено, что у насекомых действие экдистероидов подчинено правилу «два гормона – две функции»: β-экдизон определяет протекание морфогенетических процессов, в то время как его предшественник – α-экдизон – является гормоном стресса и определяет состояние неспецифической резистентности насекомого к чрезвычайным раздражителям. Так или иначе, полученные данные свидетельствуют о том, что адаптивный синдром, повидимому, распространяется и на гуморальные иммунные реакции, включая в себя, как минимум, изменение титра антимикробных пептидов в гемолимфе насекомого. Есть все основания полагать, что индукция синтеза бактерицидных белков находится под контролем классической триады гормонов стресса «биогенные амины – адипокинетический гормон – экдостероиды», последовательно действующих на ключевой эффекторный орган – жировое тело – и стимулирующих его метаболическую активность. На первом этапе активация синтеза антимикробных пептидов, по-видимому, неспецифична и является «побочным действием» биогенных аминов и адипокинетического гормона (Рис. 34, 1). Впоследствии синтез пептидных антибиотиков попадает под контроль экдистероидов, главным образом, αэкдизона, который поддерживает высокий титр эндогенных антибиотиков в гемолимфе, обеспечивая выживание насекомого в экстремальных условиях (Рис. 34, 2). Рис. 34. Cхема нейрогенной индукции синтеза антимикробных пептидов в жировом теле (ЖТ) личинки Calliphora vicina: 1 – экстренный выброс гормонов, депонированных в кардиальных телах (КТ), 2 – последующий синтез гормонов проторакальными железами (ПТЖ) под действием нейросекреторных клеток мозга (НСК). ПТТГ – проторакотропный гормон, ПТСГ – проторакостатический гормон, БА – биогенные амины, АКГ – адипокинетический гормон. 115 Активация синтеза антимикробных пептидов у насекомых путем прямого воздействия гормонов на клетки жирового тела, по-видимому, действительно имеет место при стрессе. Однако есть основания полагать, что данный способ гормональной регуляции синтеза бактерицидных молекул не является единственно возможным. Например, 20- гидроксиэкдизон способен повышать чувствительность иммунокомпетентных клеток к действию иных индукторов антимикробной активности, например, поверхностных структур микроорганизмов. При этом, что характерно, сам гормон в заданной концентрации не проявляет иммуномодуляторных свойств. Так, предварительная обработка клеток Schneider-2 дрозофилы 20-гидроксиэкдизоном повышает их чувствительность к Spatzle либо пептидогликанам E.coli – активаторам синтеза бактерицидных молекул. Как следствие, уровень экспрессии антимикробных генов в таких клетках достоверно выше, чем в клетках, не обработанных гормоном (Tanji et al., 2007). Возможно, что данный механизм регуляции иммунного ответа лежит и в основе онтогенетической вариабельности синтеза антимикробных пептидов в ответ на инфицирование у Calliphora vicina (Chernysh et al., 1995). Характерно, что поддержание повышенной чувствительности иммунокомпетентных клеток синей мясной мухи имеет место в нормальных условиях (т. е. в отсутствие стресса!) и приходится на те моменты, когда организм насекомого наиболее уязвим для паразитов, например, на время морфогенетических преобразований. Картина полного понимания механизмов травмогенной и нейрогенной индукции антимикробной активности у мясных мух далека от завершения (Рис. 35). Если для объяснения септической активации синтеза пептидных антибиотиков у синей мясной мухи представляется возможной экстраполяция данных, полученных на дрозофиле (Рис. 35, за пределами рамки), то природа асептической индукции антимикробной активности у данного модельного объекта не раскрыта вовсе. Мы предполагаем, что механизм активации синтеза пептидных антибиотиков определяется степенью повреждения покровов личинки. При сквозном повреждении активируются регуляторные факторы покровов и плазмы, запускающие синтез антимикробных пептидов в жировом теле (Рис. 35, 3-4). Контаминация раны приводит к дополнительной активации иммунокомпетентных клеток за счет прямого опосредованного распознавания поверхностных структур патогена (Рис. 35, 1-2). либо 116 Рис. 35. Предполагаемая схема индукции синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела в организме личинки Calliphora vicina. За пределами рамки – септическая индукция (экстраполяция литературных данных Hultmark, 1993; Royet, 2004 и Wang, Ligoxygakis, 2006 по дрозофиле): 1 - через активацию каскада сериновых протеаз (СП1, СП2) и фактора Spatzle (SPZ), 2 - путем прямого воздействия патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (ПАМП) на клетки жирового тела. В пределах рамки – асептическая индукция (по результатам данного исследования), опосредованная регуляторными факторами: 3 – эпителиоцитов (РФэп), 4 - плазмы (РФпл), 5 гормонами кольцевой железы (КЖ). При воздействии чрезвычайных раздражителей, не сопровождающемся сквозным повреждением покровов, сигнал о раздражении воспринимается механорецепторами и передается в мозг личинки. Следствием активации нейросекреторных клеток мозга является выброс гормонов, депонированных в кардиальных телах – эти гормоны стимулируют клетки жирового тела к выработке пептидных антибиотиков (Рис. 35, 5). 117 VI.3. Органная культура жирового тела в иммунологии и биофармакологии насекомых VI.3.1. Органная культура жирового тела как инструмент для изучения механизмов индукции антимикробной активности Изучение механизмов регуляции синтеза пептидных антибиотиков клетками жирового тела представляется важным для понимания организации иммунной системы у насекомых. Однако методологическая составляющая данного вопроса далека от совершенства: в основе практически любого современного исследования, имеющего целью изучение влияния какоголибо фактора на синтез антимикробных пептидов, лежит анализ изменения уровня экспрессии антимикробных генов в иммунокомпетентных клетках (Dimarcq et al., 1997, Christophides et al., 2002; Bartholomay et al., 2004; Irving et al., 2005; Johansson et al., 2005). Повышение уровня экспрессии свидетельствует об активации синтеза соответствующих молекул, понижение – об ингибировании. Для определения уровня экспрессии какого-либо антимикробного гена, в свою очередь, традиционно применяют метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), суть которого сводится к детектированию в иммунокомпетентной клетке матричной РНК, несущей информацию о соответствующем пептидном антибиотике. Несмотря на широкое распространение метода и его высокую специфичность, ОТ-ПЦР имеет ряд недостатков, мешающих дать однозначный ответ на вопрос об участии выбранной популяции клеток в синтезе тех или иных антимикробных пептидов и влиянии экзогенных и эндогенных факторов на этот процесс. Дело в том, что, вопервых, изменение уровня экспрессии какого-либо гена не является прямым доказательством синтеза клеткой кодируемого этим геном белка (Спирин, 2000). Во-вторых, полнота изученности спектра синтезируемых клетками пептидов в данном случае напрямую зависит от количества предварительно подобранных праймеров, что затрудняет поиск всего многообразия антибиотиков, выделяемых популяцией клеток. Особенно, это касается тех насекомых, геном которых мало изучен либо не изучен вовсе. Перечисленные ограничения делают необходимой разработку альтернативных методов изучения метаболической активности иммуноцитов. Принципиально иной подход к изучению данного вопроса был предложен в 80-х гг. XX века (Faye, Wyatt, 1980). Суть «альтернативной» методики сводилась не к подсчету клеточной мРНК, а к изучению белкового состава культуральной жидкости. Как следствие, в данном случае подразумевалось относительно долгосрочное культивирование иммунокомпетентных клеток, достаточное для выделения ими в культуральную среду «ощутимого» количества 118 белковых компонентов, в частности, антимикробных пептидов. В ходе исследования авторам удалось детектировать в культуральной жидкости несколько антимикробных пептидов, продуцируемых жировым телом куколки Hyalophora cecropia и показать, что изолированное жировое тело инфицированных насекомых продуцирует больше антимикробных пептидов, чем жировое тело интактных насекомых. Несмотря на то, что второй подход не получил такого широкого распространения, как первый, именно он лег в основу предлагаемой нами методики по изучению антимикробной активности жирового тела личинок мух рода Calliphora. Разработка культуры жирового тела включала в себя: - выбор базового состава культуральной среды, - отработку методики стерилизации культуры, - выбор оптимального температурного режима культивирования, - изучение влияния аэрации культуры на антимикробную активность жирового тела, - изучение влияния гомогенизации культуры на антимикробную активность жирового тела, - выбор оптимальной продолжительности цикла культивирования жирового тела. На основании полученных данных методика Файе и Виатт была несколько модифицирована: 1) в качестве культуральной среды был предложен солевой раствор, изотоничный и изоосмотичный гемолимфе диапаузирующей личинки мухи Calliphora vicina; 2) в качестве источника экзогенного белка был выбран гидролизат лактальбумина; 3) для стерилизации культуры помимо стрептомицина предложено использовать пенициллин; 4) непрерывное культивирование жирового тела заменено периодическим – культуральную среду обновляли ежедневно; 5) для разделения пептидных антибиотиков культуральной жидкости вместо электрофореза использован метод обращенно-фазовой хроматографии с сохранением последующего этапа – анализа суммарной антимикробной активности в каждой из фракций методом агаровых пластинок. Созданные условия позволяют поддерживать жизнеспособность изолированного жирового тела на протяжении нескольких суток культивирования, при этом контаминации культуры не происходит. Модель жирового тела in vitro удобна, в первую очередь, тем, что она, как и ОТ-ПЦР, позволяет изучать прямое воздействие какого-либо отдельно взятого фактора на иммунокомпетентные клетки, исключая посторонние воздействия. При этом в отличие от ОТПЦР модель делает возможным детектирование всех антимикробных пептидов, 119 продуцируемых иммуноцитами, а не только тех, структура которых нам известна и к которым подобраны праймеры. Кроме того, метод позволяет определить степень контаминации культуры и тем самым исключить действие посторонних антимикробных компонентов, продуцируемых микроорганизмами, привнесенными в культуру извне. Следует также отметить, что выбор состава культуральной среды в нашем случае – это особый вопрос, ответ на который диктуется задачами исследования. Так, например, если цель эксперимента – поиск и описание антимикробных пептидов, продуцируемых какой-либо популяцией иммуноцитов насекомого (т. е. подразумевается получение антибиотиков в максимально чистом виде), то в качестве культуральной среды для иммуноцитов целесообразно использовать безбелковый солевой раствор и ограничить культивирование одними сутками. При таком подходе культуральная жидкость будет содержать минимум балластных компонентов – вследствие этого очистку антимикробных компонентов из культуральной жидкости будет произвести проще, чем, например, из плазмы насекомого. Если же цель исследования – наработка максимального количества антимикробных пептидов, имеет смысл обогатить культуральную среду аминокислотами (например, гидролизатом лактальбумина) и продлить культивирование иммуноцитов до недели. Однако в данном случае модель уже будет выступать не столько в роли инструмента для изучения фундаментальных вопросов иммунологии насекомых, сколько в роли биотехнологической системы для получения пептидных антибиотиков и решать принципиально иные, прикладные, задачи. VI.3.2. Органная культура жирового тела как перспективный источник белков медицинского назначения Получение пептидов медицинского назначения служит одной из основных областей применения биотехнологии. Для этой цели используются клеточные культуры различного происхождения, от бактерий и дрожжей до клеток млекопитающих (Ferrer-Miralles et al., 2009). Культуры бактерий и дрожжей экономичны, клетки млекопитающих обеспечивают максимально высокое качество получаемых белков и полипептидов. Однако поиски биологической системы, оптимальной с точки зрения сочетания стоимости и качества получаемых продуктов, остаются одной из главных задач развития биотехнологии. Постоянные культуры клеток насекомых не лишены недостатков, свойственных клеткам других высших эукариот: они характеризуются чрезвычайно медленным ростом и требуют использования дорогих бессывороточных питательных сред. В силу этого данная технология не получила широкого распространения в биотехнологической промышленности, однако в 120 тех научных исследованиях, где чрезвычайно важно сохранить структуру и свойства белка при его получении рекомбинантным способом, данная система экспрессии используется достаточно часто (Ferrer-Miralles et al., 2009). Настоящая работа открывает перспективу создания принципиально новой биотехнологической системы, предназначенной для синтеза гомологичных и гетерологичных пептидов различной степени сложности. Продуцентом в этой системе служит жировое тело личинки Calliphora vicina. Алгоритм создания культуры следующий. Личинок выращивают с использованием недорогих кормов (например, мясных и рыбных отходов). После завершения личинками питания из них извлекают жировое тело, переводят его в культуральную среду и инкубируют в течение времени, необходимого для синтеза целевого продукта. Временная органная культура клеток жирового тела имеет существенные преимущества перед постоянными культурами клеток насекомых. Отчасти эти преимущества обусловлены особенностями жизненного цикла синей мясной мухи (Виноградова, 1984). Известно, что к третьему личиночному возрасту ядра клеток жирового тела насекомого претерпевают ряд эндомитозов. Следствием высокой плоидности клеток является мощное развитие белоксинтезирующего аппарата. К моменту завершения личинкой питания приурочено усиленное образование резервных веществ в клетках жирового тела. Таким образом, жировое тело, выделенное из диапаузирующей личинки, уже содержит запас пластических веществ, достаточный для кратковременной (не более одних суток) наработки целевого продукта in vitro в отсутствие каких-либо питательных веществ. Дальнейшее поддержание культуры требует внесения в среду аминокислот. В отличие от постоянного культивирования, временное культивирование не подразумевает роста культуры – это обстоятельство позволяет использовать в качестве инкубационной среды растворы, не содержащие сыворотки и витаминов (дрожжевого экстракта), что существенно сокращает затраты на поддержание культуры и снижает риск иммуногенности конечного продукта. Поскольку пополнение культуры происходит постоянно и определяется исключительно количеством получаемой биомассы личинок, зависимость от роста клеток исчезает. А по причине того, что цикл ферментации ограничен несколькими сутками, поддержание полной стерильности производственных помещений становится ненужным. В то же время, клетки жирового тела сохраняют все преимущества клеток насекомых: высокую жизнеспособность в широком диапазоне условий культивирования, наличие системы посттрансляционной модификации белков, а также безопасность и относительную простоту очистки целевого продукта. Предлагаемая система апробирована нами на примере получения гомологичных белков – антимикробных пептидов. Уровень синтеза пептидных антибиотиков контролировали путем 121 количественного анализа антимикробной активности культуральной жидкости методом агаровых пластинок с использованием кишечной палочки Escherichia coli штамма D31 в качестве тест-организма. Полученные результаты свидетельствуют о том, что даже в субоптимальных условиях метаболическая активность клеток изолированного жирового тела сохраняется на высоком уровне в течение более чем одной недели. Таким образом, уже на данном этапе предлагаемая технология может быть использована для получения комплекса антимикробных пептидов in vitro, которые, в свою очередь, имеют все шансы найти применение при лечении бактериальных инфекций. Интерес к эндогенным антибиотикам личинки Calliphora vicina обусловлен способностью последних блокировать развитие лекарственной устойчивости у бактерий родов Acinetobacter spp., Escherichia spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp. и др. (Черныш, Гордя, 2011). Госпитальные инфекции, вызываемые резистентными к антибиотикам штаммами этих микроорганизмов, являются одной из самых злободневных проблем современного здравоохранения. Дальнейшее развитие технологии позволит, как можно надеяться, использовать ее не только для синтеза гомологичных, но и синтеза гетерологичных белков медицинского назначения, тем более что методы получения трансгенных насекомых (Heinrich et al., 2002) и трансформации клеток насекомых in vitro (Белжеларская, 2011) хорошо известны. 122 Выводы: 1. Адаптация мух семейства Calliphoridae к среде обитания, максимально насыщенной бактериями, включает многоуровневую систему защиты внутренней среды от бактериальных инфекций. Важным элементом этой защиты служит способность синтезировать и накапливать в гемолимфе комплекс антимикробных пептидов в ответ на микробную инвазию, механическое повреждение покровов и различные стрессорные воздействия. 2. Вне зависимости от природы повреждения, качественный состав антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами личинки, остается неизменным. В этом отношении иммунный ответ у мух-каллифорид носит неспецифический характер. 3. Комплекс антимикробных пептидов Calliphora vicina обладает широким спектром антибактериальной активности. В частности, он токсичен для представителей кишечной микрофлоры человека и животных – кишечной палочки и других энтеробактерий, а также условно-патогенных обитателей кожных покровов (Staphilococcus aureus, Micrococcus luteus). Высокий уровень антимикробной защиты в сочетании с особенностями пищевой специализации делает мясных мух одним из наиболее частых переносчиков кишечных и кожных инфекций. Поэтому изучение механизмов иммунитета мух-каллифорид представляет самостоятельный интерес с точки зрения проблем медицинской энтомологии. 4. Наряду с чувствительными к комплексу антимикробных пептидов бактериями обнаружены устойчивые формы, принадлежащие главным образом к родам Bacillus и Listeria, среди которых встречается много энтомопатогенных бактерий. Чувствительность к антимикробным пептидам, по-видимому, служит важным фактором формирования энтомопатогенной микрофлоры и должна учитываться при разработке энтомоцидных препаратов бактериальной природы. 5. В настоящей работе впервые доказано прямыми экспериментами in vitro, что источником антимикробных пептидов в гемолимфе личинок мух-каллифорид является жировое тело. 6. Качественный состав антимикробных пептидов, синтезируемых клетками жирового тела in vitro, совпадает с составом в гемолимфе личинок и включает, по данным хроматографии, масс-спектрометрии и биологического тестирования, дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые пептиды. Количество антимикробных пептидов, синтезируемых жировым телом in vitro, на порядок превышает их максимальное содержание в гемолимфе личинок в период активного иммунного ответа. 123 7. Исследования in vitro позволили обнаружить в гемолимфе личинок C. vicina неизвестные ранее растворимые факторы, необходимые для запуска синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела. Одним из таких факторов является термостабильное соединение с молекулярной массой менее 3 кДа, выделяемое, по-видимому, клетками покровного эпителия личинок при повреждении. Этот фактор оказывает активирующее действие на клетки жирового тела других видов каллифорид и отличается от аналогичного фактора, выделенного ранее из гемолимфы личинок дрозофилы и имеющего молекулярную массу около 23 кДа. 8. Уровень синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела C. vicina находится под контролем нейроэндокринной системы. В частности, на уровень синтетической активности оказывает значительное влияние концентрация гормона α-экдизона: низкие концентрации гормона активируют синтез, а высокие – оказывают противоположное действие. Адипокинетический гормон и октопамин в высоких концентрациях активируют синтез антимикробных пептидов в жировом теле. 9. Разработанный метод культивирования клеток жирового тела мух-каллифорид, помимо решения исследовательских задач в области физиологии насекомых, в перспективе может быть использован в технической энтомологии для получения фармакологически активных веществ, бактериальных инфекций человека и животных. предназначенных для лечения 124 Список употребляемых в работе сокращений ГЛА – гидролизат лактальбумина; ДОФА – дигидроксифенилаланин; ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; ОФ ВЭЖХ – обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ТОП – термически обработанная плазма; ТФУ – трифторуксусная кислота; GNBP – белки связывания с грамотрицательными бактериями; PGRP – пептидогликан-распознающие белки; TEP – тиоэфир-связывающие белки. 125 Список литературы Белжеларская С. Н. Бакуловирусные системы экспрессии рекомбинантных белков в клетках насекомых и млекопитающих // Молекулярная биология. — 2011. — Т. 45, № 1. — С. 142-159. Блажевич О. В. Культивирование клеток: Курс лекций. — Минск: БГУ, 2004. — 78 с. Богоявленский Н. А., Прокопович К. В. Синяя мясная муха Calliphora erythrocephala зимой в Баку // Мед. паразитология и паразитар. болезни. — 1942. — Т. 11, №3. — С. 133134. Виноградова Е. Б. Диапауза мух и ее регуляция. — СПб.: Наука, 1991. — 255 с. Виноградова Е. Б. Мясная муха Calliphora vicina – модельный объект физиологических и экологических исследований. — Л.: Наука, 1984. — 272 с. Гапонов С. П. Биология размножения и стадия яйца Calliphoridae (Diptera) // Вестник ВГУ. — 2003. — №2. — С. 116-122. Глупов В. В., Бахвалов С. А. Механизмы резистентности насекомых при патогенезе // Успехи современной биологии. — 1998. — Т. 118, вып. 4. — С. 466-482. Глупов В. В., Слепнева И. А., Дубовский И. М. Генерация активированных кислородных метаболитов при формировании иммунного ответа у членистоногих // Труды Золл. ин-та РАН. — СПб., 2009. —Т. 313, № 3. —С. 297-307. Дербенева-Ухова В. П. Мухи и их эпидемиологическое значение. — М., 1952. — 271 с. Дербенева-Ухова В. П. К сравнительной экологии синантропных мух сем. Muscidae и Calliphoridae // Мед. паразитол. и паразит. болезни. — 1961. — Т. 30. — С. 27-37. Зиновьева К. Б., Виноградова Е. Б. Контроль сезонного развития у паразитов мясных мух. II. Экологический контроль зимних адаптаций у Calliphora vicina R.-D. (Diptera, Calliphoridae) // Хозяино-паразитные отношения у насекомых. — Л., 1972. — С. 9099. Кинд Т. В. Агглютинация и фагоцитоз чужеродных абиотических частиц гемоцитами синей мясной мухи Calliphora vicina in vivo. II. Влияние бактериальной иммунной индукции на гемоцитарную активность // Цитология. — 2010. — Т. 52, № 6. — С. 431-441. Кинд Т. В. Агглютинация и фагоцитоз чужеродных абиотических частиц гемоцитами синей мясной мухи Calliphora vicina in vivo. I. Динамика фагоцитарной активности гемоцитов в онтогенезе личинок // Цитология. — 2005. — Т. 47, № 7. — С. 609-622. Кинд Т. В. Гемоциты мясной мухи Calliphora vicina и их динамика при развитии личинок и индукции метаморфоза // Цитология. — 2003. — Т. 45, № 1. — С. 14-25. 126 Кинд Т. В. Гемоциты с различными типами защитной реакции в онтогенезе трех видов мясных мух рода Calliphora // Труды БиНИИ СПбГУ. — СПб., 2007. — Вып. 53. — С. 306-335. Кокряков В. Н. Биология антибиотиков животного происхождения. — СПб.: Наука, 1999. — 162 с. Колтыпин Ю. А. Массовое культивирование синей весенней мухи для кормления молоди карпа // Рыбоводство и рыболовство. — 1977. — №6. — С. 15-16. Кругликова А. А., Черныш С. И. Хирургические личинки и история их медицинского применения // Энтомол. обозр. — 2013. — Т. 92, №1. — С. 12-23. Лярский П. П., Дремова В. П., Брикман Л. И. Медицинская дезинсекция. — М., 1985. — 222 с. Марченко М. И. Классификация энтомофауны трупа. Биология мух и их судебномедицинское значение // Суд. - мед. экспертиза. — 1980. — №2. — С. 17-20. Раушенбах И. Ю. Нейроэндокринная регуляция развития насекомых в условиях стресса. — Новосибирск: Наука, 1990. — 158 с. Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. — М.: Мир, 1985. — 358 с. Спирин А.С. Биосинтез белка: регуляция на уровне трансляции // Соросовский образовательный журнал. — 2000. — Т. 6, №5. — С. 2-7. Сухова М. Н. Материалы по экологии и эпидемиологическому значению основных синантропных мух семейств Calliphoridae, Muscidae, Sarcophagidae (Diptera) средней полосы европейской части СССР // Вопр. краевой, общей и эксперим. паразитологии и мед. зоологии. — 1951. — Т. 7. — С. 88-102. Сухова М. Н. Новые данные по экологии и эпидемиологическому значению синих мясных мух Calliphora uralensis Vill. И C. erythrocephala Meig. (Diptera, Calliphoridae) // Энтомол. обозрение. — 1950. — Т. 31, вып. 1-2. — С. 90-94. Тулин Д. В., Чага О. Ю. Гемоциты личинки Calliphora vicina. I. Гистологический анализ // Цитология. — 2003. — Т. 45, № 10. — С. 976-985. Тулин Д. В., Яковлев А. Ю. Особенности организации фенолоксидазной системы личинок мясной мухи Calliphora vicina R.-D. (Diptera, Calliphoridae) // Проблемы и перспективы общей энтомологии / Тезисы докладов XIII съезда Русского энтомологического общества. — Краснодар, 2007. — C. 366. Черныш, С. И., Гордя Н. А. Иммунная система личинок Calliphora vicina (Diptera, Calliphoridae) как источник лекарственных веществ // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. — 2011. — Т. 47, № 6. — С. 444-452. 127 Черныш С. И., Гордя Н. А., Симоненко Н. П. и др. Нейроиммунология насекомых: опосредуемая мозгом индукция синтеза пептидных антибиотиков у двукрылого Calliphora vicina R.-D. (Diptera, Calliphoridae) // Проблемы энтомологии в России / Сборник научных трудов XI съезда РЭО. — СПб., 1998. – Т. 2. — C. 198. Черныш С. И., Гордя Н. А., Яковлев А. Ю. Гормональная регуляция стресса и резистентности к повреждения у насекомых. // Стратегии адаптаций наземных членистоногих к неблагоприятным условиям среды. — СПб., 2007. — С. 336-382. Adachi T., Tomita M., Yoshizato K. Synthesis of prolyl 4-hydroxylase alpha subunit and type IV collagen in hemocytic granular cells of silkworm, Bombyx mori: involvement of type IV collagen in self-defense reaction and metamorphosis // Matrix Biol. — 2005. — Vol. 24. — P. 136-154. Agathos S. N. Insect cell bioreactors // Cytotechnology. — 1996. — Vol. 20. — P. 173-189. Agathos S. N., Jeong Y.-H., Venkat K. Growth kinetics of free and immobilized insect cell cultures // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1990. — Vol. 589. — P. 372-398. Ahmad A., Broce A., Zurek L. Evaluation of significance of bacteria in larval development of Cochliomyia macellaria (Diptera: Calliphoridae) // Journal of Medical Entomology. — 2006. — Vol. 43, No. 6. — P. 1129-1133. Altincicek B., Vilcinskas A. Metamorphosis and collagen-IV-fragments stimulate innate immune response in the greater wax moth, Galleria mellonella // Dev. and Comp. Immunol. — 2006. — Vol. 30. — P. 1108-1118. Amdam G. V., Aase A. L., Seehuus S. C. et al. Social reversal of immunosenescence in honey bee workers // Exp. Gerontol. —2005. —Vol. 40. —P. 939-947. An Ch., Jiang H., Kanost M. R. Proteolytic activation and function of the cytokine Spätzle in innate immune response of a lepidopteran insect, Manduca sexta // FEBS. — 2010. — Vol. 277, No. 1. — P. 148–162. Ando K., Natori S. Molecular cloning, sequencing and characterisation of cDNA for sarcotoxin II, an inducible antibacterial protein of Sarcophaga peregrina // J. Biochem. — 1988. — Vol. 27. — P. 1715-1721. Ashida M. Activation of prophenoloxidase. Release of a peptide from prephenoloxidase by the activating enzyme // J. Bioch. Bioph. Commun. — 1974. — Vol. 57. — P.1089-1095. Ashida M., Brey P. T. Recent advances in research on the insect prophenoloxidase cascade // Molecular mechanisms of immune responses in insects (eds.: Brey P. T., Hultmark D.). — London: Chapman and Hall, 1997. — P. 135-172. 128 Ashida M., Yoshida H. Limited proteolysis of prophenoloxidase during activation by microbial products in insect plasma and effect of phenoloxidase on electrophoretic mobilities of plasma proteins // Insect Biochem. — 1988. — Vol. 18. — P. 11-19. Aspan A., Sturtevant J., Smith V. J. et al. Purification and characteriyation of a prophenoloxidase activating enzyme from crayfish blood cells // Insect Biochem. — 1990. — Vol. 20. — P. 709-718. Aye T. T., Shim J.-K., Rhee I.-K. et al. Upregulation of the immune protein gene hemolin in the epidermis during the wandering larval stage of the Indian meal moth, Plodia interpunctella // J. Ins. Physiol. — 2008. — Vol. 54. — P. 1301-1305. Baines D., Desantis T., Downer R. G. H. Octopamine and 5-hydroxytryptamine enhance the phagocytic and nodule formation activities of cockroach (Periplaneta americana) haemocytes // J. Ins. Physiol. — 1992. — Vol. 38. — P. 905-914. Barrett. F. M. Phenoloxidases from larval cuticle of the sheep blowfly, Lucilia cuprina: characterization, developmental changes, and inhibition by antiphenoloxidase antibodies // Arch. Insect Biochem. Physiol. — 1987. — Vol. 5. — P. 99-1118. Barrett F. M., Andersen S. O. Phenoloxidases in larval cuticle of the blowfly, Calliphora vicina // Insect Biochem. — 1981. — Vol. 11. — P. 17-23. Bartholomay L. C., Cho W. L., Rocheleau T. A. et al. Description of the transcriptomes of immune response-activated hemocytes from the mosquito vectors Aedes aegypti and Armigeres subalbatus // Infect. Immun. — 2004. — Vol. 72. — P. 4114-4126. Begum N., Matsumoto M., Tsuji S. et al. The primary host defense across humans flies and plants // Curr. Trends Immunol. — 2000. — Vol. 3. — P. 59-74. Bettencourt R., Asha H., Dearolf Ch. et al. Hemolymph-dependent and –independent responses in Drosophila immune tissue // J. Cell. Bioch. — 2004. — Vol. 92. — P. 849-863. Binnington K. C., Barrett F. M. Ultrastructural localization of phenoloxidases in cuticle and haemopoietic tissue of the blowfly Lucilia cuprina // Tissue Cell. — 1988. — Vol. 20, No. 3. — P. 405-419. Bobrowski M. M., Matthew M., Barth P. T. et al. Plasmid-determined beta-lactamase indistinguishable from the chromosomal beta-lactamase of Escherichia coli // J. Bacteriol. — 1976. — Vol. 125, No. 1. — P. 149–157. Boman H. G. Cell-free immunity in Cecropia. A model system for antibacterial proteins // J. Biochem. — 1991. — Vol. 201. — P. 23-31. Boman H. G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immunol. — 1995. — Vol. 13. — P. 61-92. 129 Bonmatin J.-M., Bonnat J. L., Gallet X. et al. Two-dimensional H-NMR study of recombinant insect defensin A in water. Resonance assignments, secondary structure and global folding // J. Biomolec. NMR. — 1992. — Vol. 2. — P. 235-256. Brennan C. A., Delaney J. R., Schneider D. S. et al. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body // Current Biology. — 2007. — Vol. 17, No. 1. — P. 67-72. Brey P. T. The contributions of the Pasteur school of insect immunity // Molecular mechanisms of immune responses in insects (eds.: Brey P. T., Hultmark D.). — N. Y.: Chapman and Hall, 1998. — P. 1-39. Brey P. T., Lee W.-J., Yamakawa M. et al. Role of integument in insect immunity: Epicuticular abrasion and induction of cecropin synthesis in cuticular epithelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1993. — Vol. 90. — P. 6275-6279. Briggs J. D. Humoral immunity in lepidopterous larvae // J. Exp. Zool. — 1958. — Vol. 138. — P. 155-188. Bulet P., Cociancich S., Reuland M. et al. A novel insect defensin mediates the inducible antibacterial activity in larvae of the dragon fly Aeshna cyanea (Paleortera, Odonata) // Eur. J. Biochem. — 1992. — Vol. 209. — P. 977-984. Bulet F., Hetru S. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosilated substitution. // J. Biol. Chem. — 1993. — Vol. 268. — P. 14893-14897. Bulet P., Stocklin R. Insect antimicrobial peptides: Structures, properties and gene regulation // Protein Pept. Lett. — 2005. — Vol. 1. — P. 3-11. Burman L. G., Nordström K., Boman H. G. Resistance of Escherichia coli to Penicillins V. Physiological Comparison of Two Isogenic Strains, One with Chromosomally and One with Episomally Mediated Ampicillin Resistance // J. Bacteriol. — 1968. — Vol. 96, No.2. — P. 438-446. Burmester T., Scheller K. Identification of binding proteins involved in the stage-specific uptake of arylphorin by the fat body cells of Calliphora vicina // Insect Biochem. Mol. Biol. — 1992. — Vol. 22. — P. 211-220. Bydla G., Lindgren M., Theopold U. et al. Hemolymph coagulation and phenoloxidase in Drosophila larvae // Developmental and Comparative Immunology. — 2005. — Vol. 29. — P. 669-679. Casteels P., Ampe C. Isolation and characterisation of abaecin, a major antibacterial response peptide in the honeybee // J. Biochem. — 1990. — Vol. 187. — P.381-386. Casteels P., Ampe C., Jacobs F. et al. Apidaecins: antibacterial peptides from honey bees // EMBO J. — 1989. — No. 8. — P. 2387-2391. 130 Casteels P., Ampe C., Jacobs F. et al. Functional and chemical characterisation of hymenoptaecin, an antimicrobial polypeptide that is infection-inducible in the honeybee // J. Biol. chem. — 1993. — Vol.268. — P. 7044-7054. Cerovský V., Zdárek J., Fucík V. et al. Lucifensin, the long-sought antimicrobial factor of medicinal maggots of the blowfly Lucilia sericata // Cell Mol. Life Sci. — 2010. — Vol. 67, No. 3. — P. 455-66. Chapman R. F. The insect: Structure and Function. — Cambridge: University Press, 1998. — 770 p. Charalambidis N., Foukas L., Zervas C. et al. Hemocyte surface phenoloxidase (PO) and immune response to lipopolysaccharide (LPS) in Ceratitis capitata // Insect Biochemistry and Molecular Biology. — 1996. — Vol. 26. — P. 867-874. Chernysh S. I. Antimicrobial substances from insects // Proceedings of the first Korea/Russia joint symposium on Bioresources and Biotechnology. — 1996. — P. 281-296. Chernysh S. I., Cociancich S., Briand J.-P. et al. The inducible antibacterial peptides of the hemipteran insect Palomena prasina: identification of a novel family of proline-rich peptides and of a novel insect defensin // J. Insect Physiol. — 1996. — Vol. 42, No. 1. — P. 81-89. Chernysh S. I., Filatova N. A., Chernysh N. S. et al. Cytotoxic activity of blowfly Calliphora vicina hemocytes // J. Insect. Physiol. — 2004. — Vol. 50. — P. 777-781. Chernysh S. I., Gordja N. A., Simonenko N. P. Diapause and immune response: induction of antimicrobial peptides synthesis in the blowfly, Calliphora vicina R.-D. (Diptera, Calliphoridae) // Entomol. Science. — 2000. — Vol. 3. — P. 139-144. Chernysh S. I., Kim S. I., Bekker G. et al. Antiviral and antitumor peptides from insects // Proc. Natl. Acad. Sci. — 2002. — Vol. 99, No. 20. — P. 12628-12632. Chernysh S. I., Simonenko N. P., Meister M. Developmental variability of the antibacterial response in larvae and pupae of Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae) and Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) // Eur. J. Entomol. — 1995. — Vol. 92. — P. 203209. Chicz R. M., Regnier F. E. High-performance liquid chromatography: effective protein purification by various chromatographic modes // J. Methods in enzymology. — 1990. — Vol. 182. — P. 392-421. Christensen B., Fink J., Merrifield R. B. et al. Channel-forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1988. — Vol. 85. — P. 5072-5076. 131 Christophides G. K., Zdobnov E., Barillas-Mury C. et al. Immunity-related genes and gene families in Anopheles gambiae // Science. — 2002. — Vol. 298. — P. 159-165. Clark K. D., Perch L. L., Strand M. R. Isolation and identification of a plasmatocyte-spreading peptide from the hemolymph of the lepidopteran insect Pseudoplusia includens // J. Biol. Chem. —1997. — Vol. 272. — P. 23440-23447. Cociancich S., Bulet P., Hetry C. et al. The inducible antibacterial peptides of insects // J. Parasitology Today. — 1994b. — Vol.10, No. 4. — P. 132-139. Cociancich S., Dupont A., Hegy G. Novel inducible antibacterial peptides from a hemipteran insect, the sap-sucking bug Pyrrhocoris apterus // J.Biochem. —1994a. — Vol. 300. — P. 567-575. Crossley A. C. An experimental analysis of the origins and physiology of hemocytes in the blue bottle blowfly Calliphora erythrocephala (Meig.) // J. Exp. Zool. — 1964. — Vol. 157. — P. 375-397. Crossley A. C. The fine-structure and mechanism of break down of larval intersegmental muscles in the blowfly Calliphora erythrocephala // J. Insect Physiol. — 1968. — Vol. 14. — P. 1389-1407. Cruz P. E., Martins P. C., Alves P. M. et al. Proteolytic activity in infected and non-infected insect cells: degradation of HIV-1 Pr55gag particles // Biotechnol. Bioeng. — 1999. — Vol. 65. — P. 133-143. Cruz-Landim C. O corpo gorduroso da larva de Melipona quadrifasciata anthidioides Lep. (Apidae, Meliponinae) // Naturalia, São Paulo. — 1983. — Vol. 8. — P. 7-23. Cudic M., Condie B. A., Weiner D. J. et al. Development of novel antibacterial peptides that kill resistant clinical isolates // Peptides. — 2002. — Vol. 23. — P. 271-283. Dahlhelm D. Untersuchungen zum Reservestoff-Haushalt im Fettkorper des dritten Larvenstadiums von Calliphora erythrocephala // Biol. Zbl. — 1973. — Bd. 92. — S. 4165. Daniel M., Kováčová D., Röslerová V. et al. Synanthropic flies and other insects in a hospital area and the microflora detected on their body surfaces // Československá Epidemiologie, Mikrobiologie, Imunologie. — 1990. — Vol. 39, No. 1. — P. 21-31. Davies D. H., Siva-Jothy M. T. Encapsulation in insects: polydnaviruses and encapsulationpromoting factors // Immunity of Insects and Other Artropods. — 1991. — P. 120-132. De Gregorio E., Han S. J., Lee W. J. et al. An immune-responsive serpin regulates the melanization cascade in Drosophila // Dev. Cell. — 2002. — Vol. 3. — P. 581-592. 132 Dimarcq J. L., Hoffmann D., Meister M. et al. Characterization and transcriptional profiles of a Drosophila gene encoding an insect defensin. A study in insect immunity // Eur. J. Biochem. — 1994. — Vol. 221. — P. 201-209. Dimarcq J. L., Imler J. L., Lanot R. et al. Treatment of l(2)mbn Drosophila tumorous blood cells with the steroid hormone ecdysone amplifies the inducibility of antimicrobial peptide gene expression // Insect Biochemistry and Molecular Biology. — 1997. — Vol. 27. — P. 877886. Dimarcq J. L., Keppi E., Dunbar B. et al. Purification and characterization of a family of novel inducible antibacterial proteins from immunized larvae of the dipteran Phormia terranovae and complete amino-acid sequence of the predominant member, diptericin A // Eur. J. Biochem. — 1988. — Vol. 171. — P. 17-22. Dimarcq J. L., Zachary D., Hoffmann J. A. et al. Insect immunity: expression of the two major inducible antibacterial peptides, defensin and diptericin, in Phormia terranovae // EMBO. —1990. — Vol. 9, No. 8. — P. 2507-2515. Downer R. G. H. Induction of hypertrehalosemia by excitation in Periplaneta americana // J. Insect Physiol. — 1979. — Vol. 25. — P. 59-63. Dunn P. E. Biochemical aspects of insect immunology // J. An. Rev. Entomology. — 1986. — Vol. 31. — P. 321-339. Dunphy G. B. Downer R. G. W. Octopamine, a modulator of the haemocytic nodulation response of non-immune Galleria mellonella larvae // J. Insect Physiol. — 1994. — Vol. 40. — P. 267-272. Evans P. D., Crossley A. C. Free amino acids in the haemocytes and plasma of the larva of Calliphora vicina // J. Exp. Biol. — 1974. — Vol. 61. — P. 463-472. Faye I., Kanost M. R. Function and regulation of hemolin // Molecular mechanisms of immune responses in insects (eds.: Brey P. T., Hultmark D.) — N. Y.: Chapman and Hall, 1998. — P. 173-188. Faye I., Wyatt G. R. The synthesis of antibacterial proteins in isolated fat body from Cecropia silkmoth pupae // Cell. Mol. Life Sci. — 1980. — Vol. 36, No. 11. — P. 1325-1326. Faye I., Wyatt G. R. The synthesis of antibacterial proteins in isolated fat body from Cecropia silkmoth pupae // Experientia. — 1980. — Vol.36. — P. 1325-1326. Fehlbaum P., Bulet P., Chernysh S. et al. Structure-activity analysis of thanatin, a novel 21residue inducible insect defense peptide with sequence homology to frog skin antimicrobial peptides // Proc.Natl. Acad.Sci.USA. — 1996. — P. 1221-1225. 133 Fehlbaum P., Bulet P., Michaut L. et al. Insect immunity. Septic injury of Drosophila induces the synthesis of a potent antifungal peptide with sequence homology to plant antifungal peptides // J. Biol. Chem. — 1994. — No. 269. — P. 31159-31163. Feng C., Huang J., Song Q. et al. Parasitization by Macrocentrus cingulum (Hymenoptera: Braconidae) influences expression of prophenoloxidase in Asian corn borer Ostrinia furnacalis // Arch. Insect Biochem. Physiol. — 2011. — Vol. 77, No. 3. — P. 99-117. Ferrandon D., Imler J.-L., Hetru Ch. et al. The Drosophila systemic immune response: sensing and signaling during bacterial and fungal infections // Nature Reviews. — 2007. — Vol. 7. — P. 862-874. Ferrer-Miralles N., Domingo-Espín J., Corchero J. L. et al. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals // Microb. Cell. Fact. — 2009. — Vol. 8. — P. 17. Finlayson L. H., Hamer D. Free amino acids in the haemolymph of Calliphora erythrocephala Meigen // Nature. — 1949. — Vol. 163. — P. 843-844. Franssens V., Simonet G., Bronckaers A. et al. Eicosanoids mediate the laminarin-induced nodulation response in larvae of the flesh fly, Neobellieria bullata // Archives of insect biochemistry and physiology. — 2005. — Vol. 59, No. 1. — P. 32-41. Franssens V., Smagghe G., Simonet G. et al. 20-Hydroxyecdysone and juvenile hormone regulate the laminarin-induced nodulation reaction in larvae of the flesh fly, Neobellieria bullata // Dev. Comp. Immunol. — 2006. — Vol. 30(9). — P. 735-740. Gillespie J. P., Kanost M. R., Trenczec T. Biological mediators of insect immunity // Annu. Rev. Entomol. — 1997. — Vol. 42. — P. 611-643. Giulianini P. G., Bertolo F., Battistella S. et al. Ultrastructure of the hemocytes of Cetonischema aeruginosa larvae (Coleoptera, Scarabaeidae): involvement of both granulocytes and oenocytoids in in vivo phagocytosis // Tissue Cell. — 2003. — Vol. 35. — P. 243-251. Goldsworthy G., Chandrakant S., Opoku-Ware K. Adipokinetic hormone enhances nodule formation and phenoloxidase activation in adult locusts injected with bacterial lipopolysaccharide // J. Ins. Physiol. — 2003. — Vol. 49. — P. 795-803. Goldsworthy G., Opoku-Ware K., Mullen L. Adipokinetic hormone enhances laminarin and bacterial lipopolysaccharide-induced activation of the prophenoloxidase cascade in the African migratory locust, Locusta migratoria // J. Ins. Physiol. — 2002. — Vol. 48. — P. 601-608. Gotz P. Encapsulation in artropods // Immunity in Invertebrates: Cells, Molecules and Defense Reactions (ed.: Brehelin M.). — Berlin, 1986. — P.153-170. Grace T. D. C. Establishment of four straines off cells from insect tissue grown in vitro // Nature. — 1962. — Vol. 195. — P. 788-789. 134 Habeeb M. A., Mahdi M. A. Mechanical transmission of bacteria via animal agents truefly species // Advanced Studies in Biology. — 2012. — Vol. 4, No. 12. — P. 583-591. Hancock R. E. W., Chapple D. S. Peptide antibiotics // Antimicrob. Agents Chemother. — 1999. — Vol. 43. — P. 1317-1323. Hao Zh., Kasumba I., Aksoy S. Proventriculus (cardia) plays a crucial role in immunity in tsetse fly (Diptera: Glossinidiae) // Ins. Bioch. And Mol. Boil. — 2003. — Vol. 33. — P. 11551164. Hara T., Miyoshi T., Tsukamoto T. Comparative studies on larval and pupal phenoloxidase of the housefly, Musca domestica L. // Comp. Biochem. Physiol. — 1993. — Vol. 106, No. 2. — P. 287-292. Heinrich J. C., Li X., Henry R. A. et al.. Germ-line transformation of the Australian sheep blowfly Lucilia cuprina // Insect Mol. Biol. — 2002. — Vol. 11. — P. 1-10. Hensler W., Singh V., Agathos S. Sf9 insect cell growth and -galactosidase production in serum and serum-free media // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1994. — Vol. 745. — P. 149-168. Herrera-Ortiz A., Martines-Barnetche J., Smit N. The effect of nitric oxide and hydrogen peroxide in the activation of the systemic immune response of Anopheles albimanus infected with Plasmodium berghei // Dev. and Comp. Immunol. — 2011. — Vol. 35. — P. 44-50. Hoffmann A., Funkner A., Neumann P. et al. Biophysical characterization of refolded Drosophila Spätzle, a cystine knot protein, reveals distinct properties of three isoforms // J. Biol. Chem. — 2008. — Vol. 283, № 47. — P. 32598-32609. Hoffmann J. A., Hetru C. Insect defensins: inducible antibacterial peptides // J. Immunol.today. — 1992. — Vol.13. — P. 411-415. Hoffmann J. A., Hetru C., Reichhart J.-M. The humoral antibacterial response of Drosophila // FEBS. — 1993. — Vol. 325, No. 1. — P. 63-66. Hoffmann J. A., Hoffmann, D. The inducible antibacterial peptides of dipteran insects // 34-th forum in immunology. — 1990. — P. 910-918. Hoffmann J. A., Reicchart J.-M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective // Nature Immunology. — 2002. — Vol. 3, No. 2. — P 121-126. Hoffmann J. A., Reichhart L.-M. Drosophila immunity // Trends in Cell Biology. — 1997. — Vol. 7. — P. 309-316. Holak T. A., Engstrom A., Kraulis P. J. et al. The solution conformation of the antibacterial peptide cecropin А: a nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing study // Biochemistry. — 1988. — Vol. 27. — P. 7620-7629. 135 Hoskin D. W., Ramamoorthy A. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides // Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Biomembranes. — 2008. — Vol. 1778. — P. 357-375. Hultmark D. Immune reactions in Drosophila and other insects: a model for innate immunity // J. Tr. Genet. — 1993. — Vol. 9. — P. 178-183. Irving P., Ubeda J. M., Doucet D. et al. New insights into Drosophila larval haemocyte functions through genome-wide analysis // Cell Microbiol. — 2005. — Vol. 7. — P. 335-350. Ishikawa M., Kubo T., Natori S. Purification and characterization of a diptericin homologue from Sarcopaga peregrina (flesh fly) // Biochem. J. — 1992. — No. 287, — P. 573-578. Jain D. K, Ramasubramanyan K., Gould S. et al. Large-scale recombinant protein production using the insect cell-baculovirus expression vector system: antistasin and β-adrenergic receptor // Production of biologicals from animal cells in culture (eds.: Spier R. E., Griffiths J. B., Meignier B.). — Oxford Butterworth-Heinemann Press, 1991. — P. 345351. Johansson K. C., Metzendorf C., Soderhall K. Microarray analysis of immune challenged Drosophila hemocytes // Exp. Cell Res. — 2005. — Vol. 305. — P. 145-155. Jomori T. and Natori S. Function of the lipopolysaccharide binding protein of Periplaneta americana as an opsonin // FEBS Lett. — 1992. — Vol. 296. — P. 283-286. Jones S. L., Lindberg F. P., Brown E. J. Phagocytosis // Fundamental Immunology (ed.: Paul W. E.). — Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1999. — P. 997-1020. Jones J. C., Liu D. P. The effects of ligaturing Galleria mellonella larvae on total haemocyte counts and on mitotic indices among haemocytes // J. Ins. Physiol. — 1969. — Vol. 15, No. 10. — P. 1703-1708. Kanost M. R., Dai W., Dunn P. E. Peptidoglycan fragments elicit antibacterial protein synthesis in larvae of Manduca sexta // Arch. Insect Biochem. Physiol. — 1988. — Vol. 8. — P. 147-164. Khafagi W., Hegazi E. M. Effects of juvenile hormones and precocenes on the immune response of Spodoptera littoralis larvae to supernumerary larvae of the solitary parasitoid, Microplitis rufiventris Kok. // Journal of Insect Physiology. — 2001. — Vol. 47. — P. 1249-1259. Kim Y. S., Ryu J. H., Han S. J. et al. Gram-negative bacteria-binding protein, a pattern recognition receptor for lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan that mediates the signalling for the induction of innate immune genes in Drosophila melanogaster cells // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275. — P. 32721-32727. Kinnear J. F., Thomson J. A. Nature, origin and fate of major haemolymph proteins in Calliphora // Insect Biochem. — 1975. — Vol. 5. — P. 531-552. 136 Koizumi N., Imai Y., Moroxumi A. et al. Lipopolyssacharide-binding protein of Bombyx mori participates in a hemocyte-mediated defense reaction against Gram-negative bacteria // J. Insect Physiol. — 1999. — Vol. 45. — P. 853-859. Lackie A. M. Hemocyte behaviour // Adv. Insect Physiol. — 1988. — Vol. 21. — P. 35-178. Lagueux M., Perrodou E., Levashina E. A. et al. Constitutive expression of a complement-like protein in toll and JAK gain-of-function mutants of Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — Vol. 97. — P. 11427-11432. Lai-Fook J. The repair of wounds in the integument of insects // J. Insect Physiol. — 1966. — Vol. 12. — P. 195-226. Lambert J., Keppi E., Dimarcq J.-L. Insect immunity: isolation from immune blood of the dipteran Phormia terranovae of two insect antibacterial peptides with sequence homology to rabbit lung macrophage bactericidal peptides // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1989. — Vol. 86. — P. 262-266. Lanot R., Zachary D., Holder F. et al. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila // Developmental Biology. — 2001. — Vol. 230. — P. 243-257. Lavine M. D., Beckage N. E. Polydnaviruses: potent mediators of host insect immune disfunction // Parasitol. Today. — 1995. — Vol. 11. — P. 368-378. Lavine M. D., Chen G., Strand M. R. Immune challenge differentially affects transcript abundance of three antimicrobial peptides in hemocytes from the moth Pseudoplusia includens // Ins. Biochem. and Mol. Biol. — 2005. — Vol. 35, No. 12. — P. 1335-1346. Lavine M. D., Strand M. R. Insect hemocytes and their role in immunity // Insect Biochem. and Molec. Biol. — 2002. — Vol. 32. — P. 1295-1309. Lee S. Y., Moon H. J., Kurata S. et al. Purification and molecular cloning of cDNA for an inducible antibacterial protein of larvae of a colepteran insect, Holotrichia diomphalia // J.Biochem. — 1994. — Vol. 115. — P.82-86. Lee W., Lee J., Kravchenko V. K. et al. Purification and molecular cloning of an inducible Gram-negative bacteria-binding protein from the silkworm, Bombyx mori // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. — Vol. 93. — P. 7888-7893. Lehane M. J., Wu D., Lehane S. M. Midgut-specific immune molecules are produced by the blood-sucking insect Stomoxys calcitrans // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1997. — Vol. 94. — P. 11502-11507. Lehrer R. I., Lichtenstein A. K., Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells // J.Ann.Rev.Immunol. — 1993. — Vol. 11. — P.105-128. 137 Lemaitre B., Nicolas E., Michaut L. et al. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults // Cell. — 1996. — Vol. 86. — P. 973–983. Lemaitre B., Reichhart J.-M., Hoffmann J. A. Drosophila host defense: Differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganisms // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1997. — Vol. 94. — P. 14614–14619. Lerch K. Protein and active-site structure of tyrosinase // Advances in pigment cell research (ed.: Bangara J. T.). — New York: Alan R Liss, 1988. — P. 85-98. Levashina E. A., Moita L. F., Blandin S. et al. Conserved role of a complement-like protein in phagocytosis revealed by dsRNA knockout in cultured cells of the mosquito, Anopheles gambiae // Cell. — 2001. — Vol. 104. — P. 709-718. Levashina E. A., Ohresser S., Bulet P. Metchnikowin, a novel immune inducible proline-rich pepide from Drosophila with antibacterial and antifunfal properties // Eur.J.Biochem. — 1995. — Vol.233. — P.694-700. Levenbook L. Storage proteins // See Ref. — 1985. — Vol. 34a, No. 10. — P. 307-346. Li J. T., Lee P. P., Chen O. C. et al. Dopamine depresses the immune ability and increases susceptibility to Lactococcus garvieae in the freshwater giant prawn, Macrobrachium rosenbergii // Fish and Shellfish Immunology. — 2005. — Vol. 19, No. 3. — P. 269-280. Ligoxygakis P., Pelte N., Ji C. et al. A serpin mutant links toll activation to melanization in the host defence of Drosophila // EMBO J. — 2002. — Vol. 21. — P. 6330-6337. Ling E., Yu X. Q. Hemocytes from the tobacco hornworm Manduca sexta have distinct functions in phagocytosis of foreign particles and self dead cells // Developmental and Comparative Immunology. — 2006. — Vol. 30. — P. 301-309. Liu C. T., Hou R. F., Chen C. C. Formation of basement membrane-like structure terminates the cellular encapsulation of microfilariae in haemocoel of Anopheles quadrimaculatus // Parasitology. — 1998. — Vol.116. — P. 511-518. Locke M. The structure and development of the vacuolar system in the fat body of insects // Insect ultrastructure (eds.: King R. C., Akai H.). — N. Y.: Plenum, 1984. — Vol. 2. — P. 151-197. Manetti A. G. O., Rosetto M., De Filippis T. et al. Juvenile hormone regulates the expression of the gene encoding ceratotoxin A, an antibacterial peptide from the female reproductive accessory glands of the medfly Ceratitis capitata // J. of Insect Physiol. — 1997. — Vol.43. — P. 121161-121167. Marinotti O., De Bianchi A. G. Uptake of storage protein by Musca domestica fat body // J. Insect Physiol. — 1986. — Vol. 32. — P. 819-825. 138 McKenzie A. N., Preston T. M. Functional stadies on Calliphora vomitoria haemocyte subpopulations defined by lectin staining and density centrifugation // Dev. Comp. Immunol. — 1992. — Vol. 16. — P. 19-30. Meister M., Lagueux M. Drosophila blood cells // Cell. Microbiol. — 2003. — Vol. 5. — P. 573-580. Milde J. J., Ziegler R., Wallstein M. Adipokinetic hormone stimulates neurones in the insect central nervous system // J. Exp. Biol. — 1995. — Vol. 198. — P. 1307-1311. Mitchell H. K., Weber U. M. Drosophila phenol oxidases // Science. — 1965. — Vol. 148. — P. 964-965. Moon H. J., Lee S. J., Kurata S. et al. Purification and molecular cloning of cDNA for an inducible antibacterial protein from larvae of the Coleopteran, Tenebrio molitor // J. Biochem. — 1994. — Vol. 116, No. 1. — P. 53-58. Morishima I., Yamada K., Ueno T. Bacterial peptidoglycan as elicitor of antibacterial protein synthesis in larvae of the silkworm, Bombyx mori // Ins. Biochem. Mol. Biol. — 1992. — Vol. 22, No. 4. — P. 363-367. Mowlds P., Barron A., Kavanagh K. Physical stress primes the immune response of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans // Microbes and Infection. — 2008. — Vol. 10. — P. 628-634. Nappi A. J. Effects of ligation on the cellular immune reactions of Drosophila algonquin against the hymenopterous parasite Pseudeucoila bochei // J. Parasitol. — 1975. — Vol.61. — P. 373-376. Nappi A. J., Vass E., Frey F. et al. Nitric oxide involvement in Drosophila immunity // Nitric Oxide. — 2000. — Vol. 4. — P. 423-430. Nappi A. J., Vass E., Frey F. et al. Superoxide anion generation in Drosophila during melanotic encapsulation of parasites // European Journal of Cell Biology. — 1995. — Vol. 68. — P. 450-456. Nesin A. P., Simonenko N. P., Numata H. et al. Effects of photoperiod and parental age on the maternal induction of larval diapause in the blowfly, Calliphora vicina // Applied Entomology and Zoology. — 1995. — Vol. 30. — P. 351-356. Ohnishi E. Tyrosinase activation in the pupae of the housefly Musca vicina // M. Jap. J. Zool. — 1958. — Vol. 13. — P. 179-188. Ohnishi E. Tyrosinase in Drosophila virilis // Annot. Zool. Jap. — 1954. — Vol. 37. — P. 3339. Ohnishi E., Dohke K., Ashida M. Activation of prephenoloxidase. II. Activation by alphachymotrypsin // Arch. Biochem. Biophys. — 1970. — Vol. 139, No. 1. — P. 143-148. 139 Orchard I., Loughton B. G., Webb R. A. Octopamine and short-term hyperlipaemia in the locust // Gen. Comp. Endocrinol. — 1981. — Vol. 45. — P. 175-180. Oren Z., Shai Y. Mode of action of linear amphipatic α helical antimicrobial peptides // Biopolymers. — 1998. — Vol. 47. — P. 451-463. Otvos Jr. L. The short proline-rich antibacterial peptide family // Cell. Mol. Life Sci. — 2002. — Vol. 59. — P. 1138-1150. Palli S. R., Locke M. The synthesis of hemolymph proteins by the larval fat body of an insect Calpodes ethlius (Lepidoptera: Hesperiidae) // Insect Biochem. — 1988. — Vol. 18. — P. 405-413. Paraluppi N. D., De Vasconcelos J. C., De Aquino J. S. et al. Calliphoridae (Diptera) in Manaus: IV. Bacteria isolated from blowflies collected in street markets // Acta Amazonica. — 1996. — Vol. 26 (1/2). — P. 93-96. Passier P. C., Vullings H. G., Diederen J. H. et al. Modulatory effects of biogenic amines on adipokinetic hormone secretion from locust corpora cardiaca in vitro // Gen. Comp. Endocrinol. — 1995. — Vol. 97. — P. 231-238. Pathak, J. P. N. Cell mediated defense reactions in Insects // Insect Immunity (ed.: Pathak J. P. N.). — Oxford and IBH Publishing Co. Pvt. Ltd., 1993. — P. 47-58. Pau R. N., Kelly C. The hydroxylation of tyrosine by an enzyme from third-instar larvae of the blowfly Calliphora erythrocephala // Biochem J. — 1975. — Vol. 147, No. 3. — P. 565573. Pence R. J., Viray M., Ebeling W. Honeybee abdomen assays of hemolymph from stressed and externally poisoned american cockroaches // Pesticide Biochem. Physiol. — 1975. — Vol. 5, No. 1. — P. 90-100. Price P. W. Parasitoid strategies and community organization // Environmental Entomology. — 1973. — Vol. 2. — P. 623-626. Pryor, M. G. M. Tanning of blowfly puparia // Nature. — 1955. — Vol. 175. — P. 600. Pye A. E., Boman H. G. Insect immunity. III. Purification and partial characterization of immune protein P5 from hemolymph of Hyalophora cecropia pupae // Infect. Immun. — 1977. — Vol. 17. — P. 408-414. Rämet M., Manfruelli P., Pearson A. et al. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli // Nature. — 2002. — Vol. 416. — P. 644-648. Rantala M. J., Vainikka A., Kortet R. The role of juvenile hormone in immune function and pheromone production trade-offs: a test of the immunocompetence handicap principle // Proc Biol Sci. — 2003. — Vol. 7. — P. 2257-2261. 140 Ratcliffe N. A., Mello C. B., Garcia E. S. et al. Insect natural products and processes: New treatments for human disease // Ins. Bioch. and Mol. Biol. — 2011. — Vol. 41. — P. 747769. Reddy K. V. R., Yedery R. D., Aranha C. Antimicrobial peptides: premises and promises // Internal. J. Antimicr. Agents. — 2004. — Vol. 24. — P. 536-547. Rees J. A., Moniatte M., Bulet P. Novel antibacterial peptides isolated from a European bumblebee, Bombus pascuorum (Hymenoptera, Apoidea) // Insect Biochem. Molec. Biol. — 1997. — Vol. 27, No. 5. — P. 413-422. Reuveny S., Kim Y. J., Kemp C. W. et al. Effect of temperature and oxygen on cell growth and recombinant protein production in insect cell cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 1993. — Vol. 38, No. 5. — P. 619-623. Ring R. A. Maternal induction of diapause in the larva of Lucilia caesar L. (Diptera, Calliphoridae) // J. Exp. Biol. — 1967. — Vol. 46, No. 1. — P. 123-136. Rizki T. M. Fat Body // Genetics and Biology of Drosophila (eds.: Ashburner M., Wright T. R. F.). — New York: Academic Press, 1978. — Vol. 2b. — P. 561-601. Roxström-Lindquist K., Assefaw-Redda Y., Rosinska K. et al. 20-Hydroxyecdysone indirectly regulates Hemolin gene expression in Hyalophora cecropia // Insect Molecular Biology. — 2005. — Vol. 14, No. 6. — P. 645-652. Royet J. Infectious non-self recognition in invertebrates: lessons from Drosophila and other insect models // Mol. Immunol. — 2004. — Vol. 41, No. 11. — P. 1063-1075. Russo J., Dupas S., Frey F. et al. Insect immunity: early events in the encapsulation process of parasitoid (Leptopilina boulardi) eggs in resistant and susceptible strains of Drosophila // Parasitology. — 1996. — Vol. 112. — P. 135-142. Salt G. The cellular defense reactions of insects. — London Cambridge Univ. Press, 1970. — 118 p. Samakovlis C., Kimbrell D. A., Kylsten P. et al. The immune response in Drosophila: pattern of cecropin expression and biological activity // EMBO J. — 1990. — Vol. 9. — P. 29692976. Saul S. J., Bin L., Sugumaran M. The majority of prophenoloxidase in the hemolimph of Manduca sexta is present in the plasma and not in the hemocytes // Develop. and Comp. Immunol. — 1987. — Vol. 11. — P. 479-485. Schumann H. Family Calliphoridae // Catalog Palaearctic Diptera. Budapest. — 1986. — Vol. 12. — P. 11-57. 141 Schweiger A., Karlson P. Zum Tyrosinstoffwechsel der Insekten. Die aktivierung der Prophenoloxidase und Aktivatorenzym // Z. Physiol. Chem. — 1962. — Bd. 329. — S. 210-221. Sherman R. A., Hall M. J. R., Thomas S. Medicinal maggots: an ancient remedy for some contemporary afflictions // Annu. Rev. Entomol. — 2000. — Vol. 45. — P. 55-81. Sherman R. A. Maggot therapy takes us back to the future of wound care: new and improved maggot therapy for the 21st century // J. Diabetes Sci. Technol. — 2009. — Vol. 3. — P. 336-344. Singh G. J. P. Hormone release in Locusta migratoria in relation to insecticide poisoning syndrome // Insect Neurochemistry and Neurophysiology / Proc. Int. Conf., College Park, Aug. 1-3, 1983, New. York, — N. Y., 1984. — P. 475-477. Slocinska M., Marciniak P., Rosinski G. Insects antiviral and anticancer peptides: new leads for the future? // Protein Pept. Lett. — 2008. — Vol. 15, No. 6. — P. 578-585. Söderhäll K., Aspan A., Duvic D. The proPO-system and associated proteins: role in cellular communication in arthropods // J. Research in immunology. — 1990. — Vol. 141, No. 9. — P. 896-946. Söderhäll, K., Cerenius, L. Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity // Curr. Opin. Immunol. — 1998. — Vol. 10. — P. 23-28. Spence K. D., Karlinsey J. E. et al. Regulation and synthesis of selected bacteria-induced proteins in Manduca sexta // Insect Biochem. Molec.Biol. — 1992. — Vol. 22, No. 4. — P. 321-331. Steel J. E. Control of metabolic processes // Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology (eds.: Kerkut G. A., Gilbert L. I.). — Pergamon Press, 1985. — Vol. 8. Stockdale H., Priston R. A. J. Production of insect viruses in cell culture // Microbial control of pests and plant diseases 1970–1980 (ed.: Burges H. D.). — London: Academic Press, 1981. — P. 314-328. Stöven S., Ando I., Kadalayil L. et al. Activation of the Drosophila NF-κB factor Relish by rapid endoproteolytic cleavage // EMBO Rep. — 2000. — Vol. 1. — P. 347-352. Strand M. R., Clark K. D. Plasmatocyte-spreading peptide induces spreading of plasmatocytes but represses spreading of granulocytes // Arch. Insect Biochem. Physiol. — 1999. — Vol. 42. — P. 213-223. Sukontason K., Bunchoo M., Khantawa B. et al. Mechanical carrier of bacterial enteric pathogens by Chrysomya megacephala (Diptera: Calliphoridae) in Chiang Mai, Thailand // The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health. — 2000. — Vol. 31, suppl. 1. — P. 157-161. 142 Takehana A., Yano T., Mita S. et al. Peptidoglycan recognition protein PGRP-LE and PGRP-LC act synergistically in Drosophila immunity // EMBO J. — 2004. — Vol. 23. — P. 46904700. Tanaka H., Ishibashi J., Fujita K. et al. A genome-wide analysis of genes and gene families involved in innate immunity of Bombyx mori // Insect Biochem. Mol. Biol. — 2008. — Vol. 38. — P. 1087-1110. Tanji T., Hu X., Weber A. N. R. et al. Toll and IMD pathways synergistically activate an innate immune response in Drosophila melanogaster // Moll. And Cell. Biol. — 2007. — Vol. 27, No. 12. — P. 4578-4588. Theopold U. Proteomic analysis of the Drosophila larval hemolymph clot // J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 279. — P. 52033-52041. Tóth E. M., Hell É., Kovács G. et al. Bacteria isolated from the different developmental stages and larval organs of the obligate parasitic fly, Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae) // Microbial Ecology. — 2006. — Vol. 51, No. 1. — P. 13-21. Trenszec T., Faye I. Synthesis of immune proteins in primary cultures of fat body from Hyalophora cecropia // J. Ins. Biochem. — 1988. — Vol. 18. — P. 299-312. Tysell B., Butterworth F. M. Different rate of protein granule formation in the larval fat body of Drosophila melanogaster // J. Insect Physiol. — 1978. — Vol. 24. — P. 201-206. Tzou P., De Gregorio E., Lemaitre B. How Drosophila combats microbial infection: a model to study innate immunity and host–pathogen interactions // Current Opinion in Microbiology. — 2002. — Vol. 5. — P. 102-110. Tzou P., Ohresser S., Ferrandon D. et al. Tissue-specific inducible expression of antimicrobial peptide genes in Drosophila surface epithelia // Immunity. — 2000. — Vol. 13. — P. 737748. Vaughn J. L. Insect cell culture: techniques and developments // Techniques in life sciences: cell biology (ed.: Kurstak E.). — Ireland: Elsevier, 1984. — Vol. C1. — P. 1-35. Werner T., Liu G., Kang D. et al. A family of peptidoglycan recognition proteins in the fruit fly Drosophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — Vol. 97. — P. 1377213777. Wicker C., Reichhart J.-M., Hoffmann D. et al. Insect immunity. Characterization of a Drosophila cDNA encoding a novel member of the diptericin family of immune peptides // J. Biol. Chem. — 1990. — Vol. 265, No. 36. — P. 22493-22498. Wigglesworth V. B. Haemocytes and basement membrane formation in Rhodnius // J. Insect Physiol. — 1973. — Vol. 19. — P. 831-844. 143 Wigglesworth V. B. The storage of protein, fat, glycogen and uric acid in the fat body and other tissues of mosquito larva // Journal of Experimental Biology. — 1942. — Vol. 19. — P. 56-77. Yu X. Q., Kanost M. R. Immulectin-2, a lipopolyssacharide-specific lectin from an insect, Manduca sexta, is induced in response to gramnegative bacteria // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275. — P. 37373-37381. Zhang J., Kalogerakis N., Behie L. A. et al. Optimum infection conditions for recombinant protein production in insect cell (Bm5) suspension culture // Biotechnol. Prog. — 1994. — Vol. 10. — P. 636-643. Zou Zh., Wang Y., Jiang H. Manduca sexta prophenoloxidase activating proteinase-1 (PAP-1) gene: Organization, expression, and regulation by immune and hormonal signals // Ins. Biochem. Mol. Biol. — 2005. — Vol. 35. — P. 627-636.
