Эволюция NtcA- и NtcB-регулонов у цианобактерий и

Эволюция NtcA- и NtcB-регулонов у
цианобактерий и
хлоропластов Rhodophyta
Любецкий В.А., Лопатовская К.В.,
Селиверстов А.В.
Институт проблем передачи информации РАН
У одноклеточных цианобактерий и в
хлоропластах багрянок NtcA – основной
транскрипционный фактор, связанный с
метаболизмом азота, обычно в водной среде.
Гетероцисты – спец клетки у нитчатых циано
для усвоения атмосферного азота и в них
регулирует еще и специальная σ-субъед, т.е.
в нитчатых NtcА – один из двух основных
транскрипционных регуляторов. Отсюда роль
в очистке окружающей среды и т.д., превращении азотистых соединений в глутамин.
α-Протео также интенсивно связывают атмос
азот, в корнях растений, у них своя регуляция
Однако регуляция некоторых генов с
участием транскрипционных факторов NtcA и
NtcВ экспериментально показана только у
пяти видов цианобактерий:
Anabaena sp. PCC 7120,
Synechocystis sp. PCC 6803,
Synechococcus sp. WH 8102,
Synechococcus elongatus PCC 7942,
Leptolyngbya boryana.
Это побудило нас предпринять систематический поиск
сайтов связывания с ДНК факторов NtcA и NtcB в геномах
цианобактерий и заодно хлоропластов Rhodophyta.
Предсказали 477 потенциальных сайтов связывания
фактора NtcA, из них 441 сайт – у видов, по которым нет
экспериментальных данных. Предсказали 44 сайта
связывания фактора NtcB, из них 40 – у видов, по которым
нет экспериментальных данных. Сайты располагаются
перед генами из 24-х кластеров ортологичных генов у
51 одного вида.
Наша оригинальная методика была применена к 84
кластерам ортологичных генов. У 33 кластеров сайты
отсутствуют
Показано, что NtcA-регулируемыми генами
являются, в частности, очень разные гены:
glnA, glnN, glnB, icd, amtB (amt1), gifA, gifB, ntcA,
nirA, nirB, narB, narK (nrtP), ntcB, nrtA, urtA, cynA,
speB, mutS, rnc, apcF, som, psaI, petF (fdx),
hupS, ...
Найденные регуляции гена имеют сайты в 5'лидерной области с длиной 600 п.н.;
последующие гены оперона также регулируются этим фактором, но не выписаны
Предсказания получены на основе
выравниваний, включающих много, десятки,
видов перед одним кластером ортологичных
генов.
Приведем типичный пример «52 строки на 50
столбцов», отнюдь не близких видов, почти
всех цианобактерии:
Основные таксономические группы цианобактерий
Одноклеточные формы:
одиночные клетки или колонии
Многоклеточные формы: нитчатые
Chroococcales
Gloeobacterales
(Pleurocapsales )
род
Acaryochloris
Prochlorales
Размножение
бинарным
делением в
одной или
более
плоскостях
или
почкованием.
Размножение
множеств.
делением или
чередованием
бинарного
множеств.
деления.
Размножение Одноклеточные
бинарным
(сферические)
делением.
или
многоклеточн.
(нитчатые),
неподвижные
или
подвижные.
Размножаются
бинарным
делением.
Nostocales
Oscillatoriales
Трихом
однорядный.
Образуются
дифферен.
клетки:
гетероцисты и
акинеты, часто
со спорами, не
ветвящиеся
или ветвящиеся
ложно.
Трихом
однорядный,
неветвящийся,
без
гетероцист и
почти всегда
лишены спор,
подвижен.
метаболизм азота:
- глутамат/глутамин glnA, glnN, gltS, hisH, cobA, cobB
- нитрат/нитрит narB, narK/nrtP, nirA, nirB
- НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа icd
- аргиназа/агматиназа speB
- добавочный белок уреазы ureE, ureG
различные регуляторные белки:
- белок-бековая glnB, gifA, gifB (регуляторные каскады)
- транскрипционные факторы ntcA, ntcB
- белок дифференцирования гетероцист hetC
фиксация углерода: ccmK, rbcL, rpe
транспортёры и порин: urtA, urtB, urtC, urtD, urtE, amtB/amt1, tauA, tauB,
tauC, nrtA, cmpA, cynA, cynB, cynD, cynS, devB, futC, som
фотосинтез и пигменты: psaI, psaB, psaL, psaF, psbA3, psbZ, psbB, psbO,
psbW, psbE, psb27, isiB, isiA, pcbD, pcbA, ndhB, petH, petF/fdx, apcF,
apcE, apcA, cpcB, trxA, trxM
металлопротеины: hypA2, hypB, moaA, moaC, moeA
и другие функции: metG, thrC, mutS, rnc, xisA, gor, aarF, rpoD (σ-субъед)
СИНИМ выделены гены под NtcA-регуляцией почти ВО ВСЕХ ВИДАХ
У 51 вида циано определялся тип регуляции, часто
неизвестный из опыта:
например, у многих цианобактерий фактор NtcA
репрессирует транскрипцию генов gifA, gifB (факторы
инактивации глутаминсинтетазы)
и в тоже время NtcA активирует транскрипцию генов:
ферментов метаболизма азота, но и ферментов, не
связанных с метаболизмом азота, например, рибулозо5-фосфат-3-эпимеразу (Rpe)
Сайты связывания вспомогательного фактора
NtcB обнаружены у многих видов, например:
перед nrtA у порядка Chroococcales,
перед nirA у порядков Chroococcales,
Nostocales, Oscillatoriales, Gloeobacterales
Частотное распределение нуклеотидов в сайтах
связывания димера NtcA у цианобактерий, палиндром!
Частотное распределение нуклеотидов в сайтах
связывания фактора NtcB у цианобактерий, палиндром!
Частотные распределения нуклеотидов для предсказанных нами
сайтов связывания димера NtcA у пяти порядков и пяти родов
цианобактерий
Дерево NtcA-фактора у циано
Виды Cyanothece sp.
PCC7425, Nostoc azollae,
Trichodesmium erythraeum
расположены на дереве
далеко от своих
родственников и
соответственно! у них
сайты связывания
значительно отличаются от
консенсуса или вообще
отсутствуют перед многими
генами
Связь между геном и его регуляцией:
случай «слабой корреляции» между присутствием гена и
его сайта:
например, перед генами icd, glnB, amtB/amt1, nrtA, narB,
narK/nrtP, ntcA, ntcB, nirA, nirB, apcF, petF/fdx, som, psaI;
случай «всегда»: где ген, там и его сайт:
например, для генов glnN, glnA, gifA, gifB;
случай «никогда»: ген присутствует везде, а сайта
обычно нет:
например, ген rbcL (рубиско) везде, а сайт перед ним
присутствует в небольшом количестве видов; этот ген
непосредственно не связан с метаболизмом азота (rbcLS
связывает углекислый газ, источник углерода)
Таксономическое дерево
циано на уровне порядков
«всегда»: ген не бывает
без сайта
--
+glnA
+glnN +glnA
«слабая
корреляция»
--
--
+icd
+narB
+gifA
+gifB
+icd
narB
--
+glnA
+gifA
+gifB
+icd
narB
--
+glnA
+gifA
+gifB
+icd
narB
+glnN +glnA
+gifA
+gifB
icd
+narB
+glnN +glnA
--
--
icd
narB
Примеры на 6 генах.
Обозначения: +··· ген&сайт, ··· только ген, -- и гена нет
Изучена эволюция NtcA-регулона: у циано он
значительно меняется между порядками.
Наиболее широко распространена регуляция
генов glnA, nirA, glnB, ntcA, amtB/amt1, ntcB,
gifA, gifB, glnN, nrtA, icd, ...
Слабо консервативный сайт связывания NtcA
предсказан перед генами gor, petH, rpe,
cmpABCD, ureEFG, urtA, .....
Состав регулона иногда значительно
отличается даже у близких видов. Например,
исчезновение регуляции гена narB у некоторых
Chroococcales связано с включением его в
длинный оперон, в состав которого часто
входят и гены транспорта мочевины. Вероятно,
перед этими генами сайты возникли
эволюционно недавно, после перестройки
хромосом, изменившей состав оперонов.
У видов рода Synechococcus ген icd никогда не
входит в NtcA-регулон, а ген amtB/amt1 входит
в его состав у небольшого числа видов
Редко регулируемые гены:
перед генами cynA, devBCA, rbcL, xisA, sigE, nblA, nrtC, rnpB сайты
изредка встречаются у единичных видов цианобактерий и не
консервативны даже у близких видов.
Хотя имеются экспериментальные указания на NtcA-регуляцию
генов cynA (ABC-транспортер цианата, субстрат-связывающая
субъединица) и rbcL, возникновения сайтов перед ними
представляются случайными событиями, которые оказались
возможными вследствие небольшой длины консервативной части
сайта. Оперон rbcLS (рубиско, связывает углекислый газ, источник
углерода) регулируется в единичных случаях. Предсказаны
единичные случаи регуляции генов rpe (рибулозофосфат-3эпимераза), cmpA (субстрат-связывающий белок транспортной
системы бикарбоната) и ccmK (белковый механизм концентрации
углекислого газа). Совместная регуляция метаболизма азота и
углерода редка, но здесь представлена
Редко регулируемые гены:
сайты перед опероном devBCA предсказаны у
Acaryochloris marina и Cylindrospermopsis raciborskii и
связаны с регуляцией межклеточного взаимодействия, в
частности, с гетероцистами, связывающими
атмосферный азот. Вероятно, эти сайты возникли
эволюционно недавно;
вопреки известной гипотезе [NAR, 2005] для генов psaI и
petF регуляторные сайты встречаются редко и
значительно меняются даже у близких видов
NtcA-регуляции генов фотосистем редка,
но мы предсказали ее в отдельных
случаях: psaI, psaB, psaL, psaF, psbA3,
psbZ, psbB, psbO, psbW, psbE, psb27,
pcbD, pcbA
Часто регулируемые гены:
гены ферментов метаболизма азота в форме
аммония, нитрата, нитрита находятся под NtcAрегуляцией – хотя это разные метаболические пути;
отчасти это можно объяснить белок-белковыми
взаимодействиями с GlnB, модулирующими
активность ферментов;
у некоторых видов имеются хорошие сайты перед
геном som, кодирующим порин;
glnA и glnN кодируют глутаминсинтетазы и обычно
оба регулируются; glnN всегда регулируется,
если присутствует
Сложно регулируемые гены, см. следующий сайт:
Транскрипционный фактор NtcA активирует транскрипцию
гена glnB и репрессирует - генов gifA и gifB. Эти гены
кодируют белки, участвующие в белок-белковых
взаимодействиях и, таким образом, регулируют активность
ферментов.
Точнее, gifA и gifB кодируют факторы IF7 и IF17 инактивации
глутаминсинтетазы. Эти факторы связываются с
глутаминсинтетазой, ингибируя ее. Этим достигается быстрое
подавление активности существующих глутаминсинтетаз в
условиях, когда не происходит активация транскрипции гена
глутаминсинтетазы. glnB кодирует сигнальный белок из
семейства pII. В частности, в присутствии аммония этот
регулятор ингибирует ABC-транспортер нитратов и нитритов
(NRT) и нитратредуктазу (NR) но активирует N-ацетил-Lглутаматкиназу (NAGK) [Plant Cell Physiol. 2006]
Наши результаты, белок-ДНК взаимодействия – черные
стрелки; известные результаты, белок-белковые взаимодействия – красные стрелки:
Красные и криптофитовые водоросли
красные: Cyanidioschyzon merolae, Cyanidium caldarium, Porphyra
purpurea, Porphyra yezoensis, Gracilaria tenuistipitata
криптофитовые: Guillardia theta, Rhodomonas salina
• у всех Rhodophyta присутствует транскрипц. фактор Ycf28;
• ген glnB дивергентно расположен к rps20:
• GlnB – регуляторный белок семейства PII, участвующий в белокбелковом взаимодействии. Ycf28 (=NtcA) – транскрипционный
регулятор в пластидах красных водорослей с crp-доменом;
• указано E-value для crp-консенсуса из базы Pfam и
соответствующего домена в белке Ycf28
Потенциальные промоторы перед геном rps20.
Полужирным выделены (–35) и (–10)-боксы промотора и 5'расширение (–10)-бокса. Цветом выделены консервативные
участки, которые предположительно служат сайтами
связывания фактора NtcA (Ycf28). Числа в последнем
столбце указывают расстояния до инициирующего кодона. У
белка Ycf28 имеется домен PF00325 в тех и только тех
пластомах Rhodophyta, которые показаны в строках 2-4.
показан локус, кодирующий белки РНК-полимеразы и
рибосомы, локус консервативен у Rhodophyta; Porphyra и
Cyanidium содержат ген glnB, а у Gracilaria и Cyanidioschyzon
его нет (здесь делеция длинного участка хромосомы);

найден новый сайт связывания репрессора вблизи
промотора перед rps20 как раз у Porphyra и Cyanidium

Новый механизм, основанный на конкуренции:
•у Porphyra и Cyanidium сайт связывания NtcA
перекрывает промотор перед rps20-rpoB,C1,C2.
•Связывание NtcA уменьшает транскрипцию rps20rpoB,C1,C2;
glnB, который расположен дивергентно к rps20,
начинает интенсивно транскрибироваться за счет
уменьшения встречного потока полимераз;
гипотеза: репрессия оперона rps20-rpoB,C1,C2
ослабляет конкуренцию РНК-полимераз,
транскрибирующих glnB, что активирует транскрипцию
гена glnB за счет конкуренции.
•У цианобактерий фактор NtcA также активирует
транскрипцию гена glnB за счет белок-ДНКового
взаимодействия
Домены PF00325, характеризующие белковое семейство Сrp,
вблизи С-концов белков Ycf28 из хлоропластов Rhodophyta.
По строкам: после консенсуса, характеризующего семейство Сrp,
приводятся имена всех видов Rhodophyta с секвенированными
хлоропластами. Показаны парные выравнивания каждого из найденных
доменов с консенсусом таких доменов у всех белков из семейства Сrp
(по Pfam). Числа указывают координаты начала и конца каждого домена
относительно N-конца белка. Значение Е указывает качество парного
выравнивания; участок с Е-значением большим 1 не приведен:
.
Изучение большого количества видов в связи с регуляторной активностью
факторов NtcA и NtcB перед различными генами позволило:
•предсказать много новых сайтов связывания
существенно уточнить консенсусы сайтов;
этих
факторов
и
•предсказать эволюцию NtcA- и NtcB-регулонов;
•показать, что у цианобактерий фактор NtcA репрессирует транскрипцию
генов gifA, gifB и активирует транскрипцию других генов у цианобактерий
и Rhodophyta; в частности, генов apcF и som;
•показать, что у Rhodophyta эволюционная консервативность фактора
NtcA коррелирует с присутствием его потенциального сайта связывания
в лидерной области гена glnB, и предложить объяснение этого на основе
механизма конкуренции;
•опровергнуть гипотезу о существенной роли у подавляющего
большинства видов NtcA-регуляции генов, вовлеченных в фиксацию
углерода (rbcL, rpe, cmpABCD), или генов фотосистем: например, petH,
хотя его NtcA-регуляция экспериментально подтверждена у Nostoc sp.
PCC 7120; и psaI, кодирующему белок I первой фотосистемы