ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ЯДЕРНОЙ ДНК КЛЕТОК

Вестник Челябинского государственного университета.
2015. № 21 (376). Биология. Вып. 3. С. 84–88.
УДК 597.2/5:612.1
ББК 28.04
ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ЯДЕРНОЙ ДНК
КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПЛОТВЫ РЕКИ ТЕЧА
С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ДНК-КОМЕТ
Е. В. Стяжкина , И. А. Шапошникова , Д. И. Осипов , Е. А. Пряхин
1ФГБОУ
2ФГБУН
ВПО «Челябинский государственный университет», Челябинск, Россия
«Уральский научно-практический центр радиационной медицины», Челябинск, Россия
С помощью метода ДНК-комет проводили исследование состояния ядерной ДНК клеток периферической крови плотвы, выловленной в реке Теча в весенне-летний период 2012–2013 гг. Было показано,
что значения параметров, характеризующих состояние ДНК, могут существенно отличаться как в течение года, так и в разные годы. Зависимости анализируемых параметров от уровня радиационного
воздействия выявлено не было.
Ключевые слова: радиоактивное загрязнение, р. Теча, повреждение ДНК, плотва, метод ДНКкомет.
Введение. В настоящее время в области регулирования безопасности атомной промышленности во всём мире остаются нерешёнными или недостаточно проработанными следующие проблемы: проблема обращения с радиоактивными отходами; проблема ядерного наследия; проблема
защиты биоты в зоне произошедшего ранее либо
текущего радиоактивного загрязнения окружающей среды. Как показывает опыт радиационных
инцидентов, произошедших на производственном объединении (ПО) «Маяк», Чернобыльской
АЭС, аварии на атомных станциях в Японии
и др., вопрос радиоактивного загрязнения следует рассматривать не только в свете воздействия
на здоровье населения, но и в свете реакции объектов окружающей среды, в том числе и гидробиоценозов. Верхним звеном водных экосистем
и наиболее чувствительным к действию широкого спектра токсикантов, а значит, и самым показательным звеном в биологическом мониторинге
являются рыбы [9]. Здесь отдельного внимания
заслуживает проблема влияния радиационного
воздействия на генетический гомеостаз у рыб.
В ранее выполненных исследованиях было показано, что метод ДНК-комет обладает высокой
чувствительностью при оценке уровня повреждения и репарации ядерной ДНК у рыб из радиоактивно загрязнённых промышленных водоёмов
ПО «Маяк» [3; 4].
Поступление в р. Теча жидких радиоактивных
отходов началось с 1949 г. В результате за несколько последующих лет пойма реки, вода, донные отложения, биота подверглись радиоактивно-
му загрязнению [1; 2]. С 1956 по 1964 г. верховье
р. Течи было перекрыто каскадом глухих плотин,
которые позволили локализовать большую часть
депонированных в верховьях реки радиоактивных веществ. В настоящее время эксплуатируется сложная гидрографическая система водоёмов,
плотин и обводных каналов — Теченский каскад
водоёмов [1; 2]. С 1956 г. радиоактивные сбросы ПО «Маяк» в р. Течу прекращены. По оценкам, выполненным в середине 1950‑х гг., с 1949
по 1956 г. в реку поступило 76 млн м3 сточных
вод, общей активностью около 2,86 млн Ки.
Материалы и методы. Район исследования.
Река Теча протекает по территории Челябинской
и северо-восточной части Курганской областей.
Река Теча входит в гидрографическую систему
р. Обь, являясь правым притоком р. Исеть. Речная
система Теча — Исеть — Тобол — Иртыш — Обь
разгружается в Карское море. Река Теча принимает воды из системы оз. Касли и Иртяш и имеет
несколько небольших притоков. Её общая протяжённость составляет около 200 км; глубина колеблется от 0,2–0,5 м на перекатах и до 3 м в заводях, ширина находится в пределах 15–20 м.
В холодные зимы на некоторых участках течения
река промерзает до самого дна. До 1956 г. истоком
реки являлось оз. Иртяш. В настоящее время исток реки формируется ниже плотины П-11 за счёт
сброса воды из лево- и правобережного каналов.
Вылов рыбы. Вылов рыбы проводили в 2012–
2013 гг. с помощью электроудочки SAMUS 725MP,
с катодом длиной 1 м, диаметр сачка анода 0,6 м,
расстояние между катодом и анодом было 4–7 м.
Оценка состояния ядерной ДНК клеток периферической крови плотвы реки Теча с помощью метода ДНК-комет
Использовали следующие параметры электрического разряда для лова рыбы: весной мощность
100–480 Вт, частота 60–90 Гц, летом мощность
100–150 Вт, частота 60–80 Гц.
На р. Тече вылов рыбы осуществляли на трёх
станциях: вблизи плотины П-11 (станция РТ 1),
в среднем течении р. Течи (станция РТ 2) и перед
впадением в р. Исеть (станция РТ 3). Для конт­
роля были отобраны пробы плотвы из р. Миасс,
где была организована одна станция отбора проб
(РМ): в среднем течении между Аргазинским
водохранилищем и Шершнёвским, вода которого используется для питьевого водоснабжения г. Челябинска и соответствует требованиям,
предъявляемым к источникам питьевого водоснабжения [5].
В табл. 1 показаны средние значения доз внутреннего, внешнего облучения и суммарная мощность дозы для плотвы.
Процедура ДНК-комет. Для оценки состояния
ядерной ДНК у плотвы использовали эритроциты
периферической крови. Всего было приготовлено
и проанализировано 46 препаратов для р. Миасс
и 111 препаратов для р. Течи. Состояние ДНК
оценивали с помощью щелочного варианта метода ДНК-комет. Отобранную из хвостовой вены
рыбы кровь разводили физиологическим раствором с гепарином таким образом, чтобы содержание клеток оказалось равным 8 · 103 клеток/см3.
Методику ДНК-комет проводили в полном соответствии с протоколом [8]. Для этого предметные
стёкла покрывались тонким слоем агарозы; 7 мкл
периферической крови, взятой из хвостовой вены
рыбы и разведённой физраствором до концент­
рации 8 · 103 клеток/см3, смешивали с 75 мкл
0,5 %-й агарозы с низкой температурой плавления (LMP-агароза) при температуре 22 °C и укладывали на первый слой агарозы. Препараты помещали на лёд на 10 мин, чтобы позволить ага-
85
розе застыть, и затем покрывали верхним слоем
LMP-агарозы, вновь оставляя на льду на 10 мин.
Далее препараты опускались в холодный лизирующий раствор (2,5 моль/л NaCl; 0,1 моль/л
ЕДТА; 1 % Тriton Х-100; 10 % ДМSO) не менее чем
на 60 мин. После лизиса препараты помещали
в электрофоретическую камеру с буфером pH>13
(10 моль/л NaOH; 1 ммоль/л ЕДТА). Препараты
оставляли в буфере на 40 мин для расплетания
нитей ДНК. После этого проводили электрофорез в течение 20 мин при градиенте падения напряжения 1 В/см. Готовые препараты окрашивали
раствором Sytox Green (0,25 мкмоль/л) — 50 мкл
на препарат. Для регистрации изображения комет использовали микроскоп Nikon Eclipse 50i
(фильтр возбуждения 450–490 нм и запирающий
505–525 нм) с цифровой цветной фотокамерой
Nikon DS-Fi1; всего сделано по 50 снимков комет
для каждого животного. Обработку изображения
кометы проводили с помощью программы CASP
[6]. При анализе комет были использованы следующие показатели: длина миграции ДНК (длина
хвоста, мкм), доля мигрировавшей ДНК (%), «момент хвоста», который рассчитывается как произведение длины хвоста и доли мигрировавшей
ДНК. «Момент хвоста» является интегральным
показателем повреждённости ДНК, и его принято
считать наиболее информативным [7].
Результаты исследования. Параметры состояния ядерной ДНК эритроцитов периферической
крови плотвы, выловленной в 2012–2013 гг., представлены в табл. 2 и 3. Как показано в табл. 2,
все показатели состояния ядерной ДНК клеток
периферической крови у плотвы, выловленной
в р. Тече весной 2012 г., статистически значимо
ниже по сравнению с показателями у рыб из водотока сравнения. Летом 2012 г. несколько повышенный уровень повреждений ДНК был отмечен
у плотвы, выловленной на станции РТ 2, по сравТаблица 1
Средние надфоновые мощности доз
внешнего и внутреннего облучения,
а также суммарная мощность дозы для плотвы,
обитающей в р. Тече
Доза облучения (мкГр/сут)
Станция отбора
проб
Внутреннее
Внешнее
Суммарное
РТ 1
19
89
108
РТ 2
13
4
17
РТ 3
8
0,7
9
86
Е. В. Стяжкина, И. А. Шапошникова, Д. И. Осипов, Е. А. Пряхин
Таблица 2
Состояние ядерной ДНК клеток периферической крови плотвы из рек Теча и Миасс, 2012 г.
Станция
Сезон
Доля мигрировавшей ДНК, %
Длина хвоста, мкм
«Момент хвоста»
30,7±2,8
23,6±1,7
8,63±1,26
*14,2±1,7
*12,3±1,5
*2,33±0,56
*16,5±3,5
*13,6±2,7
*3,35±0,88
РТ 1
*16,3±2,2
*12,2±1,3
*3,66±0,86
РМ
10,4±0,6
8,4±0,4
1,11±0,11
10,2±0,9
7,5±0,7
1,06±0,17
14,4±1,2
11±0,6
1,95±0,26
11,1±1,5
7,2±1,2
1,16±0,33
РМ
РТ 3
РТ 2
РТ 3
РТ 2
Нерест
Нагул
РТ 1
Примечание для табл. 2 и 3: приведены средние значения и их ошибки; * — статистически значимые отличия от группы сравнения (РМ), p<0,05.
Таблица 3
Состояние ядерной ДНК клеток периферической крови плотвы рек Теча и Миасс, 2013 г.
Станция
Сезон
Доля мигрировавшей ДНК, %
Длина хвоста, мкм
«Момент хвоста»
18,5±1,2
10±0,6
2,5±0,3
17,2±2,7
9,5±1,7
2,4±0,5
*23,3±2,2
*17,4±2,9
*5,1±1,1
РТ 1
*26,9±3,1
*21,7±3,2
*7,6±2
РМ
49,4±4
20,8±1,5
11,4±1,4
*25,7±2,1
*14,1±1
*4,5±0,5
*35,2±2,7
*15,5±1,1
*6,6±0,8
*30,8±4,1
*13,4±1,4
*5,5±1,1
РМ
РТ 3
РТ 2
РТ 3
РТ 2
РТ 1
Нерест
Нагул
нению с показателями плотвы с других станций
на р. Тече и плотвы из р. Миасс. Значимых отличий от контроля в летний период 2012 г. тем
не менее выявлено не было.
В весенний период 2013 г. при анализе состояния ДНК в клетках периферической крови у плотвы просматриваются изменения, которые можно было бы обозначить как зависимые
от уровня радиационного воздействия. У плотвы
р. Течи значения анализируемых показателей закономерно повышаются с уровнем радиационного воздействия и у животных со станции РТ 2
и РТ 3 достоверно отличаются от значений показателя у животных из р. Миасс. Несмотря на это
при проведении регрессионного анализа не было
выявлено достоверного влияния мощности дозы
на анализируемые показатели состояния ДНК.
У плотвы, выловленной летом на р. Тече, было
отмечено достоверное снижение уровня повреж-
дения ДНК по всем параметрам. При проведении
регрессионного анализа зависимости анализируемых показателей состояния ДНК от уровня радиационного воздействия не было выявлено достоверного влияния радиационного фактора на анализируемые показатели, за исключением доли
мигрировавшей ДНК, которая достоверно снижалась с увеличением суммарной мощности дозы.
Заключение. Анализ параметров состояния
ДНК клеток периферической крови у плотвы,
выловленной в 2012 и 2013 гг., показывает, что
средние значения показателей могут существенно отличаться и в течение года, и в разные годы,
что, очевидно, указывает на присутствие экологических факторов в системе, оказывающих воздействие на генетический гомеостаз у рыб в различные временные периоды.
Проведение исследований по оценке состояния ядерной ДНК клеток периферической кро-
Оценка состояния ядерной ДНК клеток периферической крови плотвы реки Теча с помощью метода ДНК-комет
ви рыб с помощью метода ДНК-комет показало,
что этот метод является очень чувствительным
к действию различных неблагоприятных экологических факторов и зависит от физиологического состояния животных. В условиях, когда на рыб
в естественной среде действует целый спектр
факторов, оказалось довольно сложно использо-
87
вать этот методический подход для регистрации
радиационно-индуцированных изменений состояния ДНК. Зависимости показателей состояния ядерной ДНК клеток периферической крови
плотвы от уровня радиационного воздействия
выявлено не было.
Список литературы
1. Амундсен, И. Источники радиоактивного загрязнения р. Теча и района расположения производственного объединения «Маяк», Урал, Россия / И. Амундсен, Т. С. Берган, С. М. Вакуловский и др. –
Норвегия : Остерас, 2000. – 134 с.
2. Садовников, В. И. Современное состояние и пути решения проблем Теченского каскада водоёмов
/ В. И. Садовников, Ю. В. Глаголенко, Е. Г. Дрожко [и др.] // Вопр. радиац. безопасности. – 2002. – № 1. –
С. 3–14.
3. Стяжкина, Е. В. Оценка уровня повреждения и репарации ядерной ДНК у плотвы (Rutilus rutilus L.)
из водоёмов с разным уровнем радиоактивного загрязнения / Е. В. Стяжкина, Н. А. Обвинцева, И. А. Шапошникова, Г. А. Тряпицына, П. М. Стукалов, Е. А. Пряхин // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2012. –
Т. 52, № 2. – С. 198–206.
4. Стяжкина, Е. В. Оценка уровня повреждения и репарации ядерной ДНК у плотвы (Rutilus rutilus L.)
водоёма В-10 Теченского каскада / Е. В. Стяжкина, Н. А. Обвинцева, И. А. Шапошникова, Г. А. Тряпицына, Е. А. Пряхин, П. М. Стукалов // Вопр. радиац. безопасности. – 2011. – № 2. – С. 67–74.
5. Танаева, Г. В. Влияние факторов среды на развитие фитопланктона в водохранилищах р. Миасс /
Гидробиологическая характеристика водоёмов Урала. – Свердловск, 1989. – 275 с.
6. Konca, K. A Cross-Platform Public Domain PC Image-Analysis Programm for the Comet Assay / K. Konca // Mutation Research. – 2003. – Vol. 534, № 1–2. – P. 15–20.
7. Olive, P. L. Induction and rejoining of radiation induced DNA single-strand breaks: «tail moment» as a
function of position in the cell cycle / P. L. Olive, J. P. Banath // Mutation Research. – 1993. – № 294. – Р. 275–
283.
8. Olive, P. L. DNA doubl × 10strand breaks measured in individual cell subjected to gell electrophoresis /
P. L. Olive, K. D. Wlode, J. P. Banath // Cancer research. – 1991. – Vol. 51. – P. 4671–4676.
9. Der Oost, R. van. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment : a review /
R. Van Der Oost, J. Beyer, N. P. Vermeulen // Environmental Toxicology and Pharmacology. – 2003. – Vol. 13. –
P. 57–149.
Сведения об авторах
Стяжкина Елена Владимировна — младший научный сотрудник экспериментального отдела Уральского
научно-практического центра радиационной медицины, магистрант второго года обучения кафедры радиационной биологии Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. Yelena-st@mail.ru
Шапошникова Ирина Александровна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
экспериментального отдела Уральского научно-практического центра радиационной медицины, магистрант
второго года обучения кафедры радиационной биологии Челябинского государственного университета,
Челябинск, Россия. shaposhnikova@lenta.ru
Осипов Денис Иванович — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник экспериментального
отдела Уральского научно-практического центра радиационной медицины, Челябинск, Россия. osipov_d@list.ru
Пряхин Евгений Александрович — доктор биологических наук, профессор, заведующий экспериментальным отделом Уральского научно-практического центра радиационной медицины, Челябинск, Россия.
pryakhin@yandex.ru
88
Е. В. Стяжкина, И. А. Шапошникова, Д. И. Осипов, Е. А. Пряхин
Bulletin of Chelyabinsk State University.
2015. No. 21 (376). Biology. Issue 3. Рp. 84–88.
EVALUATION OF THE NUCLEAR DNA OF ROACH’ PERIPHERAL BLOOD
CELLS FROM THE TECHA RIVER WITH COMET ASSAY
E. V. Stjazhkina
Chelyabinsk State University, Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk, Russia. Yelena-st@mail.ru
I. A. Shaposhnikova
Chelyabinsk State University, Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk, Russia. shaposhnikova@lenta.ru
D. I. Osipov
Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk, Russia. osipov_d@list.ru
E. A. Pryakhin
Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk, Russia. pryakhin@yandex.ru
With the comet assay research was carried to evaluate of nuclear DNA in peripheral blood cells of roach
caught from the Techa River in the spring and summer in 2012–2013. It was shown that the values of the parameters characterizing the state of the DNA, could differ as within a year, so in different years. Dependence
of the analyzed parameters and radiation exposure haven’t been identified.
Keywords: radioactive contamination, river Techa, DNA damage, roach, comet assay.
References
1. Amundsen I., Bergan T. S., Vakulovskiy S. M. et al. Istochniki radioaktivnogo zagryazneniya r. Techa i
rayona raspolozheniya Proizvodstvennogo obedineniya «Mayak», Ural, Rossiya [Sources of Radioactive Contamination of the Techa river and the area of “Mayak”, the Urals, Russia]. Norway, Asteras Publ., 2000. 134 p.
(In Russ.).
2. Sadovnikov V.I., Glagolenko Yu.V., Drozhko E.G. et al. Sovremennoye sostoyaniye i puti resheniya problem Techenskogo kaskada vodoemov [Current state and ways of solving the problems of the Techa’s cascade of
reservoirs]. Voprosy radiacionnoy bezopasnosti [Issues of National Security], 2002, no. 1, pp. 3–14. (In Russ.).
3. Stjazhkina E.V., Obvinceva N.A., Shaposhnikova I.A., Tryapitsyna G.A., Stukalov P.M., Pryakhin E.A.
Otsenka urovnya povrezhdeniya i reparacii yadernoy DNK u plotvy (Rutilus rutilus L.) iz vodoyemov s raznym
urovnem radioaktivnogo zagryazneniya [Evaluation the level of damage and repair of nuclear DNA of roach
(Rutilus rutilus L.) from reservoirs with different levels of radioactive contamination]. Radiatsionnaya biolo­
giya. Radioyekologiya [Radiation Biology. Radioecology], 2012, no. 2, pp. 198–206. (In Russ.).
4. Stjazhkina E.V., Obvinceva N.A., Shaposhnikova I.A., Tryapitsyna G.A., Pryakhin E.A., Stukalov P.M.
Ocenka urovnja povrezhdenija i reparacii jadernoj DNK u plotvy (Rutilus rutilus L.) vodoyoma V-10 Techenskogo kaskada [Evaluation the level of damage and repair of nuclear DNA in roach (Rutilus rutilus L.) from
the reservoir 10 of the Techa’s cascade of reservoirs]. Voprosy radiatsionnoy bezopasnosti [Issues of National
Security], 2011, no. 2, pp. 67–74. (In Russ.).
5. Tanaeva G.V. Vlijanie faktorov sredy na razvitie fitoplanktona v vodohranilishhah r. Miass [The influence
of environmental factors on the phytoplankton growth in the reservoirs of the Miass River]. Gidrobiologicheskaya kharakteristika vodoyemov Urala [Hydrobiological characterization of the Urals reservoirs]. Sverdlovsk, 1989. 275 p. (In Russ.).
6. Konca K. et al. A Cross-Platform Public Domain PC Image-Analysis Programm for the Comet Assay.
Mutation Research, 2003, vol. 534, no. 1–2, pp. 15–20.
7. Olive P.L., Banath J.P. Induction and rejoining of radiation induced DNA single-strand breaks: «tail moment» as a function of position in the cell cycle. Mutation Research, 1993, no. 294, pp. 275–283.
8. Olive P.L., Wlode K.D., Banath J.P. DNA doubl × 10strand breaks measured in individual cell subjected
to gell electrophoresis. Cancer Research, 1991, vol. 51, pp. 4671–4676.
9. van Der Oost, Beyer R., Vermeulen N.P.E. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk
assessment: a review. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2003, vol. 13, pp. 57–149.