021968 B1 021968 B1 (11) 021968

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
021968
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2015.10.30
(21)
Номер заявки
201101644
(22)
Дата подачи заявки
(51) Int. Cl. A61K 31/728 (2006.01)
A61K 31/194 (2006.01)
A61K 33/14 (2006.01)
A61K 33/00 (2006.01)
A61P 19/00 (2006.01)
A61P 43/00 (2006.01)
2010.05.27
(54)
ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ВНУТРИКОЖНОГО ВВЕДЕНИЯ
B1
021968
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к изделиям
медицинского назначения и лекарственным средствам в виде растворов и гелей для внутрикожного
введения, и может быть применено в дерматологии, эстетической медицине, медицинской
косметологии и пластической хирургии для замедления процессов старения кожи. Лекарственное
средство включает гиалуроновую кислоту, сукцинат натрия, кислоту янтарную, натрия хлорид,
воду для инъекций при следующем соотношении компонентов, в г/л: гиалуроновая кислота
0,5-60,0, сукцинат натрия 1,0-40,0, кислота янтарная 0,001-10,0, натрия хлорид 1,0-10,0, вода для
инъекций до 1 л. Реализован комплексный подход к восстановлению дермального слоя кожи,
достигнута высокая эффективность в обновлении клеток, обновлении упругости и эластичности
кожи, тонуса, цвета и текстуры лица, устранении признаков старения и усталости.
Деркач Наталья Николаевна,
Гуменюк Николай Иванович, Коржов
Максим Витальевич (UA)
Борщ-Компанеец Н.С. (RU)
B1
(56) RU-C1-2159111
RU-C2-2236859
JP-A-9052814
RU-C1-2341268
ФЕДИН И.Ф. Оксидантный стресс и
применение антиоксидантов в неврологии.
Подробно о лекарствах. Неврология и психиатрия,
2005, стр. 1-7 [Найдено 16.09.2010], Найдено из
Интернет: <URL http://www.medi.ru/doc/14441 l.htr
БОРИСОВ Ю.Ю. и др., Влияние натрия
сукцината на слизевыделительную деятельность
желудка у больных язвенной болезнью желудка,
Материалы 8-го международного СлавяноБалтийского научного форума, "Санкт -Петербург
- гастро-2006", 2006, Ns. 1-2, стр. 18
021968
(31) U200905342; U201004464
(32) 2009.05.28; 2010.04.16
(33) UA
(43) 2012.05.30
(86) PCT/UA2010/000028
(87) WO 2010/138095 2010.12.02
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ
ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ
"ИНСТИТУТ ГИАЛУАЛЬ" (UA)
021968
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к изделиям медицинского назначения и лекарственным средствам в виде растворов и гелей для внутрикожного введения, и может быть применено в дерматологии, эстетической медицине, медицинской косметологии и
пластической хирургии для замедления процессов старения кожи.
Известен препарат "Фитоомолаживающие", обладающий общеукрепляющим, тонизирующим и
омолаживающим эффектом, содержащий маточное молочко, цветочную пыльцу и вспомогательные вещества: крахмал, стеарат кальция, тальк и сахар, а также сухой концентрат настоя шафрана, корень имбиря, корицу, мускатный орех, витамин Е, янтарную кислоту, аскорбиновую кислоту и лимонную кислоту при выбранном соотношении компонентов. Препарат выпускается в форме таблеток для перорального
применения [RU 2236859 C2, A61K 35/78, 2004].
Препарат имеет следующие недостатки.
Форма выпуска препарата - таблетки, т.е. очень слабое и опосредованное действие на кожу. Таблетки применяются перорально, что обусловливает существенно более низкую по сравнению с инъекционным препаратом биодоступность действующих веществ, потому что препарат проходит долгий путь в
пищеварительном тракте. В точку назначения действующих веществ, а в данном случае - кожу (дермальный слой кожи, клетки кожи фибробласты и аморфное вещество дермы) янтарная кислота практически
не попадает или попадает в очень незначительном количестве.
Кроме того, данный препарат относится к пищевым добавкам, а не к лекарственным средствам или
изделиям медицинского назначения, что также подтверждает опосредованное очень слабое воздействие
его на кожу.
В составе препарата содержится слишком много компонентов (14 компонентов), а некоторые из них
очень высокоаллергенные (цветочная пыльца, корень имбиря, мускатный орех) и способны вызвать
сильную аллергическую реакцию.
Известно также внутривенное лекарственное средство "Реамберин" (1,5% раствор для инфузий),
представляющий собой сбалансированный полиионный раствор, содержащий N-метиламмония натрия
сукцинат (соль янтарной кислоты), а также хлориды натрия, калия и магния. Данный инфузионный препарат выпускается в инфузионных флаконах по 200 и 400 мл и применяется в качестве антигипоксического и детоксицирующего средства при острых интоксикациях различной этиологии [Инструкция по
применению http://www.lib-med.ru/?article=4823; Реамберин - новое средство для инфузионной терапии в
практике медицины критических состояний. Методические рекомендации, - Санкт Петербургская медицинская академия последипломного образования; http://critical.ru/consult/pages/reamberin.htm].
Реамберин применяют только внутривенно капельно. К недостатку данного лекарственного средства относится то, что препарат применяется только для внутривенного введения и никогда не применялся
для внутрикожного введения. Данное средство не имеет в своем составе янтарной кислоты, оказывающей синергический эффект с сукцинатом натрия и гиалуроновой кислотой. Также данное средство имеет
в своем составе компоненты, которые могут вызвать нежелательные эффекты в коже
(N-(1-дезокси-D-глюцитол-1-ил)-N-метиламмония, калия хлорид (0,03%), магния хлорид (0,012%). Поэтому данное средство нельзя использовать внутрикожно.
Наиболее близким к изобретению является средство медицинского назначения, применяемое для
профилактики старения кожи и омоложения Ial-System 1,8% компании Fidia (Италия). Данное средство
содержит один действующий компонент - гиалуроновую кислоту неживотного происхождения и один
стабилизатор - фосфатный буфер, который содержит натрия фосфат однозамещенный, натрия фосфат
двухзамещенный, натрия хлорид. Каждая упаковка IAL-System включает шприц одноразового использования, заполненный препаратом (1,1 мл). Препарат вводят интрадермально (внутрикожно) тонкими
иглами. Препарат зарегистрирован в Украине - регистрационное свидетельство № 7551/2008
[http://www.ial-svstem.ru].
К недостаткам препарата следует отнести то, что наполненный шприц содержит только один действующий компонент - гиалуроновую кислоту, которая, хотя и является сильным увлажняющим компонентом и стимулирует ее эндогенный синтез, не может обеспечить комплексное воздействие на разные
звенья патогенеза старения кожи (нет метаболического, восстановительного и антиоксидантного эффектов), т.е. данный компонент влияет только на одно звено патогенеза старения кожи - восполнение водного баланса.
Известно, что препараты, содержащие один действующий компонент - гиалуроновую кислоту и
один стабилизатор, имеют не только клинические и морфологические низкие показатели эффективности,
а и ряд других недостатков, к которым относится наличие в своем составе фосфатного буфера. Фосфатный буфер является полностью бесполезным компонентом и не обеспечивает никакие полезные клинические свойства. Фосфатный буфер добавляется в средство как стабилизатор и предназначен только для
стабилизации pH (показателя кислотно-щелочного баланса), т.е. является балластом. Кроме того, фосфатный буфер pH 7,4 не имеет достаточной буферной емкости, и поэтому после стерилизации конечного
продукта pH опускается до 6,9-7,1, не выполняя своей основной функции. К тому же, основные компоненты этого буфера - натриевые соли фосфорной кислоты - производятся нефармакопейного качества,
-1-
021968
т.е. при производстве используются химические реактивы различной степени чистоты, что может привнести в конечный продукт нежелательные неидентифицируемые химические примеси. Так как эти примеси не идентифицируются и их количественное и качественное содержание у разных производителей
может быть не одинаковым, то они могут вызывать отдаленные нежелательные реакции у пациентов.
В основу изобретения поставлена задача создания путем изменения количественного и качественного состава компонентов более эффективного лекарственного средства для восстановления дермального слоя и замедления процессов старения кожи.
Поставленная задача решается тем, что лекарственное средство, содержащее гиалуроновую кислоту, натрия хлорид, воду для инъекций, согласно изобретению содержит сукцинат натрия, кислоту янтарную при следующем соотношении компонентов, в г/л:
Количественное соотношение компонентов, входящих в состав лекарственного средства, в пределах
заявляемых значений было определено экспериментально. Экспериментальным путем также установлено, что при уменьшении количественного содержания его компонентов не обеспечиваются лечебные
свойства лекарственного средства, а при увеличении - существует угроза возникновения побочных реакций (например, псевдоаллергические реакции).
Заявляемое лекарственное средство благодаря наличию гиалуроновой кислоты (натрия гиалуроната), сукцината натрия и кислоты янтарной обеспечивает одновременно несколько механизмов действия.
Гиалуроновая кислота (натрия гиалуронат) - это гликозаминогликан, состоящий из D-глюкуроновой
кислоты и N-ацетил-D-гликозамин дисахаридных соединений. Она содержит не менее 95%, но не более
105% гиалуроната натрия, рассчитанного со ссылкой на высушенную смесь. Гиалуроновая кислота обеспечивает восстановление водного баланса.
Кислота янтарная (бутандионовая кислота, этан-1,2-дикарбоновая кислота - HOOC-CH2-CH2-COOH
- двухосновная карбоновая кислота), соли и эфиры которой называются сукцинатами
[http://ru.wikipedia.org/wiki].
Кислота янтарная имеет сильное воздействие на метаболические процессы, усиливает клеточное
дыхание, является мощным стимулятором энергии, способствуя выработке АТФ, имеет восстановительный и антиоксидантный эффекты на клетки.
Сукцинат натрия и кислота янтарная обеспечивают мощный восстановительный и антиоксидантный эффекты, эффективно блокируют свободные радикалы, обеспечивают модифицирующее воздействие на метаболические процессы тканевого метаболизма, усиливают клеточное дыхание, ионный транспорт, синтез белков и мощную стимуляцию выработки энергии (АТФ), определяющей их высокую эффективность в обновлении клеток, восстановлении упругости и эластичности кожи, тонуса, цвета и текстуры лица, устранении признаков старения и усталости.
Изобретение поясняется примерами.
Пример 1.
Состав лекарственного средства, г/л:
Пример 2.
Состав лекарственного средства, г/л:
-2-
021968
Пример 3.
Состав лекарственного средства, г/л:
Лекарственное средство изготовляют следующим образом.
В качестве исходного сырья используют такие компоненты:
гиалуроновая кислота (натрия гиалуронат) (Европейская Фармакопея 4, 01/2002:1472, С. 1915);
кислота янтарная (Succinic acid) (P. 1228 USP 28);
натрия хлорид (ДФУ: 2004, Дополнение 1, С. 422);
вода для инъекций (ДФУ: 2004, Дополнение 1, С. 307).
В резервуар засыпают в соответствующем количестве натрия хлорид, сукцинат натрия, кислоту янтарную, доводят водой для инъекций до необходимого объема и перемешивают. В полученный раствор
добавляют рассчитанное количество гиалуроновой кислоты и перемешивают в течение 2 ч до получения
гомогенной массы.
Проводят отбор пробы и анализ: pH раствора от 5,0 до 8,5, количественное содержание компонентов препарата в 1 мл приготовленного раствора должно соответствовать минимальному содержанию
всех его компонентов в пределах указанных интервалов.
При соответствии раствора вышеуказанным показателям его разливают в шприцы вместимостью 1,
1,5, 2,25 или 2,5 мл и стеклянные флаконы вместимостью 6, 8, 10 или 15 мл. Шприцы закупоривают резиновыми плунжерами. Флаконы закупоривают резиновыми пробками и герметизируют алюминиевыми
колпачками. Предварительно наполненные шприцы и флаконы с раствором (гелем) стерилизуют в стерилизаторе при температуре 105-121°C (давление 1,1 кПа в течение 15-60 мин.). Стерильные шприцы и
флаконы с препаратом после просмотра на механические включения этикетируют и упаковывают. Для
получения сертификата качества проводят контроль качества препарата в соответствии с ТУ по всем показателям. По получении сертификата качества на готовую продукцию его передают на склад, после чего
он поступает к потребителю.
Раствор (гель) полученного комплексного средства представляет собой бесцветную прозрачную
жидкость (гель). Стабильность раствора (геля) проверена в условиях стерилизации, а также при длительном хранении и методом ускоренного старения. До и после стерилизации, а также в процессе ускоренного старения проводят контроль прозрачности и окраски раствора, а также количественного содержания
действующих веществ. Было установлено, что лечебные свойства заявляемого лекарственного препарата
остаются стабильными после стерилизации и его хранения в течение 2 лет.
Для выяснения эффективности предложенного лекарственного средства, используемого для замедления процессов старения кожи, были проведены экспериментальные доклинические испытания на лабораторных животных. Проводили изучение токсичности и безвредности средства в условиях острого и
хронического опытов. В результате проведенных исследований установлена его практическая безвредность, отсутствие аллергических реакций и негативного воздействия на морфологию клеток кожи животных.
Средство для замедления процессов старения кожи с различными концентрациями входящих в его
состав компонентов вводили путем интрадермальных инъекций в кожу спины кроликов: по шесть животных из каждой группы (контрольной и основной) были использованы для наблюдения за покраснением и поддержанием объема в течение 10 дней, после чего всем животным из каждой группы была сделана эвтаназия на 2, 6, 8, 10, 14 и 21 день (по одному животному в каждый указанный день) для гистологического исследования биосовместимости.
Экспериментальные исследования (гистологические, гистохимические) свидетельствовали о возможности заявляемого средства оптимизировать функцию клеток и возобновлять физиологические свойства кожи. Проведенными исследованиями установлено, что средство для замедления процессов старения кожи с различными концентрациями его компонентов имело длительное время нахождения в тканях,
демонстрируя в то же время значительно лучшее действие на структурированность дермы, образование
коллагена и эластина, также лучший результат по поддержанию объема, чем контрольные образцы препаратов, которые содержали лишь гиалуроновую кислоту, особенно на первоначальной стадии (71% исходного объема против 23 и 21% соответственно на 2-й день). При исследованиях под микроскопом у
подопытных животных не наблюдалось никаких негативных проявлений. Гистологическая проверка
подтвердила отсутствие случаев негативных реакций, стойкого воспаления, дегенерации тканей или некроза. Фагоцитоз промежуточных макрофагов при использовании заявляемого средства был более постоянным по сравнению с препаратом, содержащим лишь гиалуроновую кислоту, что обусловлено его более
длительным временем присутствия в тканях.
-3-
021968
Лекарственное средство для замедления процессов старения кожи вводят интрадермально (внутрикожно), используя следующую технику.
Техника папул: препарат вводят путем микроинъекций до возникновения небольших папул диаметром 1-2 мм на расстоянии 0,5-1 см. Игла вводится в верхнюю треть дермы на глубину 2-3 мм, срезом
вверх.
Линейная техника используется для армирования контура лица и заполнения морщин. Игла вводится параллельно коже, на всю длину, в дерму. Введение препарата осуществляется ретроградно при выведении иглы.
Компоненты лекарственного средства действуют целенаправленно и обоснованно на все основные
патогенетические механизмы старения кожи, эффективно воздействуют на обменные процессы кожи,
тем самым возвращая ей упругость и эластичность, цвет, текстуру и обеспечивают лифтинг. А благодаря
синергическому воздействию указанных компонентов обеспечивается комплекс физиологических эффектов, приводящий к обновлению физиологических свойств кожи.
Лекарственное средство в полной мере обнаруживает свои свойства именно в заявляемых пределах
выбранных компонентов и их количественного соотношения. Лекарственная форма сохраняет специфическую активность и стабильность активного ингредиента во время применения и хранения, а также необходимый уровень качества, т.е. остается прозрачной и бесцветной до и после стерилизации, а также
при хранении в форме раствора длительное время (в течение 2 лет).
Для пояснения изобретения приведены данные морфологическеского и биохимического исследования при применении гиалуроновой кислоты (ГК), сукцината/янтарной кислоты (СК) и комбинации гиалуроновой кислоты с сукцинатом натрия/янтарной кислотой (СК+ГК).
Фибробласты (ФБ) являются основным клеточным элементом среднего слоя кожи, называемого
собственно дермой. Основная функция фибробластов - синтезировать и воссоздавать межклеточное вещество, а также большое количество биологически активных веществ. Среди них можно выделить несколько факторов роста, компоненты внеклеточного матрикса и ферменты, с помощью которых осуществляется деструкция и реновация коллагена и гиалуроновую кислоту. Эти же биохимические системы,
используя соответствующие субстраты, синтезируют эти молекулы заново. Процесс физиологической
реновации кожи происходит непрерывно, благодаря чему межклеточное вещество постоянно обновляется.
Результаты исследования.
Сравнительный анализ подсчета культивируемых фибробластов на третьи сутки после посева в
контрольной (К) и экспериментальных (СК, ГК, СК+ГК) чашках Петри позволил выявить существенные
различия по количеству клеток:
1) контроль (К) - 12 100;
2) сукцинат натрия/янтарная кислота + ростовая среда (СК) - 20 900;
3) гиалуроновая кислота + ростовая среда (ГК) - 24 200;
4) (гиалуроновая кислота + сукцинат натрия/янтарная кислота) + ростовая среда (СК+ГК) - 34 100.
На фиг. 1 показаны пролиферации фибробластов человека под влиянием стимуляторов в контрольном (К) и опытных образцах (СК, ГК, СК+ГК). Подсчет клеток осуществлен на третьи сутки инкубации
(*Р<0,05 по сравнению с контролем).
Таким образом, количество фибробластов во 2-й пробе увеличилось на 73%, в 3-й - на 100%,
в 4-й - на 182% по сравнению с контролем. Иными словами, три стимулятора пролиферации фибробластов произвели ожидаемый положительный эффект.
Для полной уверенности в репрезентативности полученных данных и соблюдения требований
двойного контроля были подсчитаны клетки в ФБ человека на шестые сутки инкубации. Результаты второго эксперимента практически аналогичны предыдущему. В присутствии каждой исследуемой добавки
интенсивность пролиферации возрастала, достигая максимума в группе СК+ГК. На фиг. 2 показана интенсивность пролиферации фибробластов кожи человека под влиянием стимуляторов в контрольном (К)
и опытных образцах (СК, ГК, СК+ГК). Подсчет клеток осуществлен на шестые сутки инкубации
(*Р<0,05 по сравнению с контролем).
Кроме чисто морфологического исследования, проведено также биохимическое исследование метаболической активности культуры ФБ, позволяющее судить о степени напряженности внутриклеточных
процессов. Установлено, что концентрация свободных аминокислот, наиболее значимых для соединительной ткани, синтеза коллагена изменялась по-разному в экспериментальных образцах. Содержание
цистина (укрепляет соединительную ткань) во 2-й пробе повысилось на 9%, в 3-й - практически не отличалось от контроля, в 4-й - увеличилось на 64% соответственно. На фиг. 3 показана концентрация цистина в культуре клеток фибробластов в контрольном (К) и опытных образцах (СК, ГК, СК+ГК) (*Р<0,05 по
сравнению с контролем).
Концентрация аргинина (участвует в образовании коллагена) снизилась на 52 и 19% соответственно
во 2- и 3-й пробах по сравнению с контрольными данными, наиболее значимо возросла на 60% в 4-й
пробе На фиг. 4 показана концентрация аргинина в культуре клеток фибробластов в контрольном (К) и
опытных образцах (СК, ГК, СК+ГК) - (*Р<0,05 по сравнению с контролем).
-4-
021968
Содержание лизина (дефицит замедляет синтез белка в соединительной ткани, участвует в образовании коллагена) во 2- и 3-й пробах практически не отличалось от контроля, в 4-й увеличивалось на 50%
соответственно по сравнению с контрольными величинами. На фиг. 5 показана концентрация лизина в
культуре клеток фибробластов в контрольном (К) и опытных образцах (СК, ГК, СК+ГК) - (*Р<0,05 по
сравнению с контролем).
Концентрация глицина, дефицит которого приводит к нарушениям структуры соединительной ткани, и концентрация метионина - предшественника цистина и креатина - изменялась однонаправленно в
культуре клеток фибробластов. И первый, и второй показатели увеличивались во 2-, 4-й пробах на 27 и
59% соответственно и практически не изменялись по сравнению с контролем в 3-й пробе. На фиг. 6 показана концентрация глицина и метионина в культуре клеток фибробластов в контрольном (К) и опытных
образцах (СК, ГК, СК+ГК) - (*Р<0,05 по сравнению с контролем).
Эти данные практически соответствуют морфологическим показателям - подсчетам интенсивности
пролиферации фибробластов при добавлении в среду инкубации различных стимуляторов физиологической активности клеток.
Содержание треонина (важная составляющая коллагена) во 2- и 3-й пробах практически не отличалось от значений контроля и повышалось в 4-й - на 41% соответственно. На фиг. 7 показана концентрация треонина в культуре клеток фибробластов в контрольном (К) и опытных образцах (СК, ГК, СК+ГК) (*Р<0,05 по сравнению с контролем).
Концентрация пролина (основной элемент коллагена) и оксипролина во всех исследуемых образцах
практически не отличалась от значений контроля.
Содержание фенилаланина (основного элемента в синтезе коллагена) во 2- и 3-й пробах не отличалось от данных контроля. Повышение концентрации наблюдали в 4-й пробах на 36% соответственно. На
фиг. 8 показана концентрация фенила и аланина в культуре клеток фибробластов в контрольном (К) и
опытных образцах (СК, ГК, СК+ГК) - (*Р<0,05 по сравнению с контролем).
Таким образом, сочетание гиалуроновой кислоты с сукцинатом (янтарной кислотой) при добавлении в культуру клеток ФБ способствовало достоверному повышению концентрации свободных аминокислот: цистина (укрепляет соединительную ткань) - на 64%, аргинина (участвует в образовании коллагена) - на 60%, лизина (дефицит замедляет синтез белка в соединительной ткани, участвует в образовании коллагена) - на 50%, глицина (дефицит приводит к нарушениям структуры соединительной ткани) и
метионина (предшественник цистина и креатина) - на 59%, треонина (важная составляющая коллагена) на 41%, фенилаланина - на 36%.
Таким образом, наблюдается очень сильный синергический эффект при применении сочетания
СК+ГК (гиалуроновой кислоты с сукцинатом натрия/янтарной кислотой). Данный эффект отсутствует
при применении этих компонентов отдельно, что раннее не было доказано. И, исходя из полученных
данных, добавление в культуру клеток фибробластов данного сочетания обеспечивает наиболее выраженный, стимулирующий метаболизм, эффект и рост фибробластов, способствует значительному росту
клеток, синтезу коллагена и аминокислот неструктурированного матрикса основного вещества соединительной ткани кожи. Полученные результаты доказывают синергический эффект компонентов и максимально высокие потенциальные возможности заявляемого средства как для физиологического восстановления и омоложения стареющей кожи - редермализации, так и для профилактики старения.
Для пояснения изобретения также приведено сравнительное клинико-морфологическое исследование влияния на кожу двух препаратов (препарата на основе гиалуроновой кислоты и фосфатного буфера
(ГК) и препарата гиалуроновой кислоты с сукцинатом и янтарной кислотой (ГК с сукцинатом).
В исследование было включено 5 пациентов женского пола в возрасте 28-50 лет. Все они дали добровольное письменное информированное согласие на участие в исследовании. Были изучены биоптаты
исходного состояния кожи всех пациенток, без воздействия препаратов, а также биоптаты после курса
монокомпонентного препарата ГК и препарата ГК с натрия сукцинатом.
В исследовании были использованы два инъекционных препарата:
препарат ГК с натрия сукцинатом;
монокомпонентный препарат ГК.
Экспериментальная часть лечения заключалась во введении пациентам указанных препаратов в области внутренней поверхности плеча на разных руках. Введение обоих препаратов производилось одновременно. Для исключения появления возможных артефактов, вызванных длительной регулярной травматизацией кожи, места экспериментального введения препаратов изменялись (смещались по кругу).
Кроме того, производилось фотографирование кожи проблемных зон до и после лечения.
Каждый препарат вводили на разных руках в участок кожи площадью 70×70 мм в области внутренней поверхности плеча. Оба препарата вводили в виде инъекций в одинаковой дозировке - 0,5 мл с применением папульной техники. Частота - 1 введение в 2 недели, всего 5 инъекций (процедур) каждого из
препаратов. После окончания курса воздействия препаратами ГК с натрия сукцинатом и без него была
выполнена биопсия кожи в зонах непосредственного воздействия. Время забора биопсии - через 10 дней
после окончания курса лечения - последней инъекции (для дополнительного исключения последствий
микротравматизации и проявления стойкого эффекта каждого препарата).
-5-
021968
С целью контроля фонового состояния кожи у каждой из этих женщин была выполнена биопсия
кожи в области внутренней поверхности плеча с отступом на 50-70 мм от области эксперимента. Площадь каждого биопсийного кусочка кожи составляла примерно 5×3 мм.
Полученный гистологический материал был подвергнут стандартной фиксации в 10% растворе
формалина и последующей стандартной проводке в спиртовых растворах восходящей концентрации с
заключением обезвоженных кусочков в парафиновые блоки.
Полученные препараты окрашены двумя следующими методами:
традиционная окраска гематоксилин-эозином (для исследования общей структуры тканей);
окраска по Ван-Гизону (для изучения состояния волокон соединительной ткани).
Полученные гистологические препараты изучали методом световой микроскопии на микроскопе
Olympus BX51, микрофото получены с помощью фотокамеры Olympus SP500 UZ.
Гистологические срезы каждой пациентки, окрашенные разными методами, описывали и анализировали в комплексе.
Эффективность воздействия каждого из лечебных препаратов на структуры кожи анализировали с
учетом следующих показателей: общая структурированность дермы; структура и размеры коллагеновых
волокон, эластических волокон, состояние придатков кожи (волос, потовых и сальных желез), кровеносных сосудов дермы, характеристика основного вещества.
Дополнительно учитывали некоторые клинические характеристики: субъективные ощущения пациенток, косметический эффект при внешнем осмотре, а также скорость заживления дефекта кожи после
биопсии.
Вначале проводили макроскопическую оценку состояния кожи в области инъекций после применения препарата ГК с натрия сукцинатом у всех 5 пациенток по сравнению с аналогичной зоной биопсий
"до воздействия". При сравнении темпов заживления дефектов кожи в результате биопсий после воздействия препаратов ГК с натрия сукцинатом и без него отмечено более выраженное ускорение заживления
в месте применения препарата ГК с натрия сукцинатом у 80% пациенток.
Нежелательных (аллергических) реакций в процессе применения как монокомпонентного препарата
ГК, так и препарата ГК с натрия сукцинатом ни у кого из участниц исследования не наблюдали.
Структура эпидермиса практически не изменялась при сравнительной оценке до лечения и после
введения препаратов. В качестве отдельного замечания можно отметить, что клеточный состав и строение эпидермального слоя кожи в наибольшей степени были обусловлены возрастом пациенток. Кроме
того, в ходе выполнения гистологических срезов в некоторых случаях отмечали частичное слущивание
поверхностного слоя (эпидермиса) или его утрату, что наиболее вероятно можно объяснить техническими проблемами гистологической проводки или хирургическими сложностями получения адекватных
биоптатов кожи во всех случаях.
В ходе предварительной оценки влияния обоих препаратов на состояние кожи в полученных биоптатах было выяснено, что основной эффект наблюдается в дерме, причем применение как монокомпонентного препарата ГК, так и препарата ГК с натрия сукцинатом оказало сходное по характеру влияние
на структуру дермы у участников исследования.
С целью объективизации и количественной оценки гистологической картины влияния курса обоих
препаратов на состояние дермы была разработана специальная балльная схема, включающая основные
исследуемые морфологические признаки по аналогии со схемами, используемыми в гистопатологии при
полуколичественном анализе.
Схема для гистологической оценки некоторых признаков состояния дермы (введение бальной
оценки, у.е.).
Структурированность поверхностного и глубокого слоев дермы.
Структурированность поверхностного слоя:
1 - слабая, преобладают рыхловолокнистые, миксоматозные структуры;
2 - умеренная, с незначительными, диффузно представленными рыхловолокнистыми включениями;
3 - отчетливая структурированность, без миксоматозных изменений.
Структурированность глубокого слоя:
1 - слабая, преобладают рыхловолокнистые, миксоматозные структуры;
2 - умеренная, с незначительными, диффузно представленными рыхловолокнистыми включениями;
3 - отчетливая структурированность, без миксоматозных изменений.
Состояние и относительное количество коллагеновых волокон:
1 - слабо представлены, волокна относительно тонкие в диаметре;
2 - хорошо развиты по толщине, количественно преобладают в срезах;
3 - выраженное развитие, с явлениями функциональной гипертрофии части волокон, образуют четкие структуры.
Состояние и относительное количество эластических волокон:
0 - практически не представлены;
1 - в дерме определяются единичные, отдельно расположенные, волокна.
-6-
021968
Состояние и выраженность элементов капиллярного русла:
0 - структуры капилляров практически не представлены;
1 - присутствует умеренное количество молодых капилляров.
Состояние основного вещества (по относительным признакам)*:
0 - сниженный, уменьшенный объем;
1 - умеренный объем;
2 - увеличенный объем.
Об объеме основного вещества судили по совокупности оптически свободных промежутков дермы
между окрашенными структурами (волокнами) соединительной ткани, при одном и том же микроскопическом увеличении.
Анализ количества и представленности в биоптатах коллагеновых, эластических волокон, а также
гладкомышечных структур был выполнен по срезам, окрашенным по Ван Гизону.
Согласно предложенной схеме выполнена количественная оценка каждого наблюдения раздельно
по эффекту действия каждого из препаратов. Результаты представлены в таблице.
Результаты суммарной оценки состояния дермы согласно предложенной
балльной схеме гистологических изменений
Полученные результаты как по каждому отдельному случаю, так и в совокупности, с учетом времени исследования, демонстрируют отчетливые количественные различия в общей оценке состояния дермы до лечения и после курса терапии: и традиционным монокомпонентным препаратом ГК, и новым
препаратом ГК с натрия сукцинатом. Согласно полученным данным, диапазон отдельных сумм гистологической оценки состояния дермы до лечения составил 4-8 баллов, после курса введения монокомпонентного препарата ГК - 8-11 баллов и соответственно после курса введения препарата ГК с натрия сукцинатом - 11-13 баллов.
Предложенный подход дал также возможность объективизировать оценку раздельного эффекта на
структуры дермы каждого из препаратов, а также количественно сопоставить и сравнить уровни эффективности используемых препаратов.
Монокомпонентный препарат ГК, по результатам исследования, вызывает общее умеренное увеличение структурированности дермы, преимущественно в результате умеренного разрастания и пространственной организации коллагеновых волокон, очевидной пролиферации со стороны эластических волокон не обнаружено (фиг. 9), где а - биоптат кожи до начала лечения; б - биоптат кожи после курса инъекций препарата ГК без сукцината натрия. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. ×200.
Не отмечено достоверного исчезновения участков с рыхлыми структурами соединительной ткани в
дерме. В единичном случае отмечено появление вновь образованных капилляров после курса введения
этого препарата.
Умеренный положительный эффект нашел отражение в раздельной и общей суммарной оценке состояния дермы после его применения: конечный диапазон сумм составил 8-11 баллов по сравнению с
исходным уровнем в 4-8 баллов, а по общей сумме - 44 балла по сравнению с 32. Тем не менее, как показывает балльная оценка, существует определенная зона "перекрытия" в оценке эффекта воздействия монокомпонентного препарата ГК с исходной оценкой состояния кожи до лечения по отдельным случаям,
что, собственно, свидетельствует об отсутствии его статистически достоверного выраженного эффекта.
Препарат ГК с натрия сукцинатом согласно полученным результатам способствует существенному
росту общей структурированности дермы - в результате как умеренного или выраженного разрастания и
пространственной организации коллагеновых волокон, отчасти их функциональной гипертрофии, так и
явлений умеренной пролиферации эластических волокон в составе дермы. После курса введения препарата в дерме практически не выявляли участков разрыхления и/или некробиоза. Отмечены умеренные
явления ангиогенеза - формирования молодых капилляров в дерме (фиг. 10), где показан биоптат кожи
после курса инъекций препарата ГК с сукцинатом натрия, окраска гематоксилин-эозином. Ув. ×200.
Выраженный положительный эффект этого препарата нашел отражение и в раздельной суммарной
оценке состояния дермы после его применения: конечный диапазон сумм составил 11-13 баллов по сравнению с исходным уровнем в 4-8 баллов, а общие суммы равнялись соответственно 59 и 32 баллам, что
свидетельствует о статистически значимом эффекте. Кроме того, отмечен более высокий суммарный
балльный эффект препарата ГК с натрия сукцинатом в сравнении с монокомпонентным препаратом ГК
на структуры дермы: 59 и 44 балла соответственно.
-7-
021968
Выводы.
Положительный макроскопический эффект на состояние кожи или косметический эффект наблюдается в результате инъекционного курса как монокомпонентного препарата ГК, так и препарата ГК с
натрия сукцинатом и проявляется, главным образом, в повышении упругости и эластичности кожи. В
области инъекций препарата ГК с натрия сукцинатом отмечено общее более выраженное улучшение
внешнего вида кожи вследствие как значительного повышения упругости и эластичности кожи, так и
исчезновения сухости и шелушения, улучшение цвета.
Исследование показало, что препарат ГК с натрия сукцинатом оказывает более заметный положительный эффект по сравнению с монокомпонентным препаратом ГК. У всех без исключения пациентов
полуколичественный гистологический анализ биоптатов кожи подтверждает существенно более активное влияние препарата ГК с натрия сукцинатом на структуры дермы и капиллярную сеть кожи (выявлен
эффект редермализации).
Препарат ГК с натрия сукцинатом имеет в целом высокую эффективность и может быть рекомендован широкому кругу пациентов благодаря своему позитивному универсальному действию на кожу и ее
структуры.
Заявляемое средство, кроме клинической и морфофизиологической эффективности, имеет значительное преимущество перед препаратами, в состав которых входит фосфатный буфер, являющийся полностью бесполезным компонентом и не обеспечивающий никаких полезных клинических свойств.
В отличие от этого данное средство за счет наличия в составе сукцината натрия и янтарной кислоты
обеспечивает
более физиологичную коррекцию pH препарата, т.е. данные компоненты одновременно обеспечивают синергический, клинический и морфофизиологический эффект и физиологическую коррекцию кислотно-щелочного баланса, что позволяет избежать добавления фосфатного буфера;
достаточную буферную емкость, что обеспечивает неизменность pH после стерилизации конечного
продукта;
наличие фармакопейного качества сукцината и янтарной кислоты, а не реактивного, как у фосфатного буфера, что исключает привнесение в конечный продукт нежелательных неидентифицируемых химических примесей, что исключает возникновение отдаленных нежелательных реакций у пациентов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Лекарственное средство для внутрикожного введения, содержащее гиалуроновую кислоту, натрия
хлорид, воду для инъекций, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит сукцинат натрия, кислоту янтарную при следующем соотношении компонентов: гиалуроновая кислота - 0,5-60 г/л; сукцинат
натрия - 1,0-40 г/л; кислота янтарная - 0,001-10 г/л; натрия хлорид - 1,0-10 г/л; вода для инъекций - до 1 л.
Фиг. 1
Фиг. 2
-8-
021968
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
-9-
021968
Фиг. 7
Фиг. 8
Фиг. 9
- 10 -
021968
Фиг. 10
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 11 -