КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ IN VITRO В

ЗЕМЛЕДЕЛИЕ И РАСТЕНИЕВОДСТВО
УДК 581.3:631.52:634.2
КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ IN VITRO
В ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ ВИШНИ
Т.В. ПЛАКСИНА, кандидат сельскохозяйственных
наук, старший научный сотрудник
Д.С. КУЛЬХАНОВА, аспирант
Е.Ю. МАТЬКОВА, аспирант
НИИ садоводства Сибири им. М.А. Лисавенко Россельхозакадемии
E-mail: tplaksina@mail.ru
Резюме. Гибридный фонд вишни на Алтае пополнен новыми
оригинальными генотипами, в том числе сложного генетического происхождения и плоидности, не имеющими аналогов
в европейской части страны и за рубежом. Эти формы при
скрещиваниях часто дают невсхожие семена, что снижает эффективность селекции. Применение метода эмбриокультуры
in vitro, как вспомогательного для практической селекции, позволяет не только сохранить, но и размножить ценный гибридный материал. Исследования проводили с целью получения
экспериментальных данных о влиянии регуляторов роста на
развитие изолированных зародышей вишни в условиях in
vitro на этапах введения и микроразмножения для сохранения
оригинальных гибридных генотипов. На этапе введения изолированных зародышей в культуру in vitro оптимальны невысокие концентрации регуляторов роста – 6-бензиламинопурин
(БАП) 2,5 мкМ в сочетании с индолилмасляной кислотой
(ИМК) 0,1 мкМ и гиббереловой кислотой (ГК) 1,0 мкМ. На питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) с таким соотношением
регуляторов происходила не только стимуля роста самого
зародыша, но и формирование дополнительных побегов (2,8±
1,2 шт./раст.). В зависимости от комбинации скрещивания доля
тронувшихся в рост зародышей от числа введенных в культуру in
vitro составила от 12,5 до 63,6 %. На этапе микроразмножения
применение комбинированных питательных сред МС по гормональному составу (БАП 2,5 мкМ + ИМК 0,1 мкМ + ГК 1,0 мкМ)
позволяет повысить коэффициент размножения регенерантов
большинства гибридов в изученных комбинациях скрещивания в среднем в 1,5 раза. Микропобеги, достигшие 1,5…2 см
высоты, укореняли на питательной среде МС, разбавленной
вдвое по минеральному составу и сахарозе, без мезо-инозита
с добавлением 5,0 мкМ ИМК и 0,5 мкМ НУК. Через 3 недели
растения с корнями высаживали в субстрат и адаптировали к
условиям ex vitro в вегетационной комнате. Адаптированные
растения (не менее 10 шт. каждой комбинации скрещивания)
передавали для оценки в полевых условиях.
Ключевые слова: вишня, эмбриокультура, гибриды, зародыши,
питательные среды, регуляторы роста, микроразмножение.
Вишня – одна из самых распространенных косточковых культур в садоводстве на юге Западной Сибири,
в том числе на Алтае. К сожалению, в последние десятилетия урожайность и площади, занимаемые этой
культурой в промышленном садоводстве Алтайского
края, значительно сократились.
На сегодняшний день имеющийся сортимент уже не
соответствует потребностям рынка. В нем отсутствуют
сорта, сочетающие высокую урожайность, зимостойкость и устойчивость к болезням с хорошим качеством
плодов. Кроме того, среди них нет сортов раннего
срока созревания.
Улучшение сортимента ведется непрерывно методами классической селекции с привлечением доноров
ценных признаков. На создание сорта вишни таким
путем уходит от 15 до 25 лет.
Для повышения эффективности селекционной работы
широко используются различные методические подходы
и приемы, к числу которых относится метод культуры зародышей in vitro. Он эффективен при решении проблем
генетической несовместимости исходных форм и преодоления стерильности гибридов в случае использования
Достижения науки и техники АПК, №7-2013
в селекционном процессе отдаленной гибридизации.
Этот метод позволяет получать сеянцы на искусственных
питательных средах из семян, которые в обычных условиях не дают полноценных всходов [1…4].
Метод культуры зародышей in vitro перспективен
для расширения генетического разнообразия культуры и ускорения селекционного процесса в целом. В
селекции косточковых культур эмбриокультура in vitro
позволила преодолеть половую само- и перекрестную
несовместимость при межвидовых и межродовых скрещиваниях, повысить выход гибридных растений в скрещиваниях с участием отдаленных форм при селекции
на целый ряд признаков (раннеспелость, устойчивость
к заболеваниям и неблагоприятным фактором среды,
морозостойкость, самоплодность, засухоустойчивость,
низкорослость). В частности, такие исследования проведены в Беларуси. Получены гибридные зародыши и
регенеранты от скрещивания раносозревающих сортов
Cerasus для селекции на суперраннеспелость [5…7]. В
РФ также выращены ценные растения от ряда стерильных и слабофертильных гибридов сливы, вишни войлочной, вишни обыкновенной, яблони, груши, айвы [2, 8, 9].
Гибридные формы персика, абрикоса и алычи получены
с использованием культуры изолированных зародышей
в Никитском ботаническом саду Украина [10].
В НИИСС им. М.А. Лисавенко селекция вишни
ведется в комплексной программе с участием селекционеров, биотехнологов и цитологов, что позволяет
значительно повысить ее результативность. Гибридный
фонд вишни на Алтае пополнен новыми оригинальными
генотипами, в том числе гибридами сложного генетического происхождения и плоидности, не имеющими
аналогов в европейской части страны и за рубежом.
При скрещиваниях они часто дают невсхожие семена,
что снижает эффективность селекции. Мы предприняли
попытку применить накопленный опыт культивирования изолированных зародышей плодовых растений в
практической селекции вишни.
Целью работы было получить экспериментальные
данные о влиянии регуляторов роста на развитие изолированных зародышей вишни в условиях in vitro на
этапах введения и микроразмножения для сохранения
оригинальных гибридных генотипов.
Условия, материалы и методы. Исследования
проводили в 2011-2012 гг. Их объектами послужили
изолированные зародыши, полученные из семян растений, созданных путем отдаленной гибридизации
разных по числу хромосом отборных форм вишни
(табл. 1).
Таблица 1. Исходный материал для введения
в культуру in vitro гибридных зародышей вишни,
гибридизации 2011 г.
Всего Число жизнеПроисхождение семьи
семян, способных зашт. родышей, шт.
5-98-277 (×6) × ВЧ 89-95-48
(×6)
22
5
Селиверстовская (×4)×ВЧ
4-83-44 (×4)
11
7
Селиверстовская (×4)×ВЧ 1097-286 (×4)
14
5
12-4-18(×3), свободное опыление
7
1
17
ЗЕМЛЕДЕЛИЕ И РАСТЕНИЕВОДСТВО
Основной метод исследований – культура зародышей in vitro [10, 11]. Статистическую обработку
материала проводили по общепринятым методам с
использованием пакета прикладных программ Office
Excel 2007. На рисунках приведены средние арифметические величины и доверительный интервал.
Успех эмбриокультуры in vitro, прежде всего, зависит от начальной стадии развития изолированного
зародыша, степени его дифференциации при изоляции. Из зародышей, изолированных на ранних
стадиях развития (до 30 дн. после опыления), редко
удается получить проростки. В нашем эксперименте
зародыши извлекали из семени через 50…55 дн. после опыления. Как правило, в это время, большинство
из них дифференцированы на почечку, зародышевый
корешок и семядоли.
Для стимуляции развития изолированных зародышей на питательной среде МС использовали БАП в
концентрации от 2,0 до 4,5 мкМ, а также комбинации
БАП с ауксинами: ИМК от 0,1 до 0,5 мкМ либо нафтилуксусной кислотой (НУК) от 0,1до 2,0 мкМ и ГК от 0,1
до 4,5 мкМ.
На следующем этапе гибридные проростки пересаживали на среды микроразмножения для получения клона
от каждого гибридного семени. Кроме питательных сред
с БАП использовали комбинированные среды с добавлением ИМК от 0,1 до 0,5 мкМ и ГК – от 0,5 до 1,0 мкМ.
Результаты и обсуждение. При извлечении из
семени отдельные зародыши были полностью сформированы, у других наблюдали аномальное развитие
семядолей, либо нормально развитые семядоли с недоразвитым зародышем.
Известно, что в процессе роста и развития зародыша
в нем происходит изменение содержания цитокининов,
ауксинов и гиббереллинов. Все эти вещества тесно взаимодействуют между собой. По мере созревания семян
и плодов у вишни наблюдается снижение концентрации
гиббереллинов и замена их абсцизовой кислотой [13].
В наших исследованиях оптимальными для стимуляции развития изолированных зародышей оказались
невысокие концентрации регуляторов роста – 2,5 мкМ
БАП в сочетании с 0,1 мкМ ИМК и 1,0 мкМ ГК. На питательной среде с таким их соотношением происходил не
только рост самого зародыша, но и формирование дополнительных побегов (2,8±1,2 шт. на один зародыш). В
зависимости от комбинации скрещивания доля тронувшихся в рост зародышей от числа введенных в культуру
in vitro составила от 12,5 до 63,6 %. Большинство из них
нормально развивались и имели стебель с листьями
(72 %), у отдельных наблюдали аномальное развитие.
Например, 16,6 % зародышей образовали только листья
без стебля, а 11 % – только увеличились в объёме.
Такие отклонения мы связываем с генетической отдаленностью триплоидов, тетраплоидов и гексаплоидов,
использованных в гибридизации, что приводит к различным нарушениям в формировании гибридных зародышей.
К подобным выводам пришли отечественные ученые при
скрещивании диплоидных сортов сливы с тетраплоидным
терном и гексаплоидными сливами, а также при культивировании гибридных зародышей, полученных от отдаленных скрещиваний косточковых плодовых культур [2, 14].
На средах микроразмножения цитокинины, помимо
стимуляции клеточного деления и роста, инициируют
дифференциацию клеток, гистогенез и побегообразование. Их используют в культуре тканей для снятия апикального доминирования и стимуляции развития пазушных и адвентивных почек. В наших опытах на питательной
18
Рис. 1. Коэффициент размножения отдаленных гибридов
вишни на среде с разным содержанием БАП после третьего
пассажа: 1 – БАП 2,0 мкМ; 2 – БАП 4,0 мкМ; 3 – БАП 4,5 мкМ;
4 – БАП 5,0 мкМ; – Селиверстовская × ВЧ 286; – 277 (6х)
× ВЧ (6х); – №12-4-7 (3х); – Селиверстовская × ВЧ 44.
среде, где был использован только БАП, наиболее выраженное влияние на количество пазушных и адвентивных
побегов отмечено в вариантах с концентрацией 4…4,5
мкМ. Дальнейшее ее увеличение приводило не только
к снижению коэффициента размножения, но и к витрификации регенерантов (рис. 1). Применение питательных сред комбинированных по гормональному составу
(БАП 2,5 мкМ + ИМК 0,1 мкМ + ГК 1,0 мкМ) позволило
повысить коэффициент размножения у регенерантов
большинства комбинаций скрещивания при снижении
концентрации БАП почти в 2 раза. Исключением были
регенеранты комбинации скрещивания 12-4-7 (3X), для
которых оптимальным оказался вариант БАП 4,5 мкМ +
ИМК 0,2 мкМ + ГК 0,5мкМ (рис. 2).
Микропобеги, достигшие 1,5…2 см высоты, укореняли на питательной среде МС, разбавленной вдвое по
минеральному составу и сахарозе, без мезо-инозита
с добавлением 5,0 мкМ ИМК и 0,5 мкМ НУК. Через
3 недели растения с корнями высаживали в субстрат
и адаптировали к условиям ex vitro в вегетационной
комнате. Адаптированные растения (не менее 10 шт.
каждой комбинации скрещивания) были переданы
селекционерам для посадки в поле, что позволит провести быструю оценку гибрида по широкому спектру
показателей устойчивости.
Рис. 2. Влияние комбинированных по гормональному
составу питательных сред на коэффициент размножения отдаленных гибридов вишни после третьего пассажа: 1 – БАП
2,0 мкМ + ИМК 0,5 мкМ; 2 – БАП 2,5 мкМ + ИМК 0,1 мкМ + ГК
1,0 мкМ; 3 – БАП 4,5 мкМ + ИМК 0,2 мкМ + ГК 0,5мкМ; – Селиверстовская × ВЧ 286; – 277 (6х) х ВЧ (6х); – №12-4-7
(3х); – Селиверстовская × ВЧ 44.
Достижения науки и техники АПК, №7-2013
ЗЕМЛЕДЕЛИЕ И РАСТЕНИЕВОДСТВО
Гибридные растения каждой комбинации скрещивания продолжают поддерживаться в культуре in vitro и
при необходимости могут быть размножены в нужном
количестве, что позволит ускорить передачу нового
сорта потребителю.
Выводы. На этапе введения изолированных зародышей в культуру in vitro оптимальны невысокие
концентрации регуляторов роста – 2,5 мкМ БАП в
сочетании с 0,1 мкМ ИМК и 1,0 мкМ ГК. Примене-
ние питательных сред комбинированных по гормональному составу (БАП 2,5 мкМ + ИМК 0,1 мкМ +
ГК 1,0 мкМ) на этапе микрогразмножения дает возможность повысить коэффициент размножения регенерантов большинства изученных комбинаций скрещивания
в среднем в 1,5 раза.
Таким образом, метод эмбриокультуры in vitro позволяет не только сохранить, но и размножить ценный
гибридный материал в первый год гибридизации.
Литература.
1. Здруйковская-Рихтер А.И. Получение сортов плодовых растений in vitro методом культуры изолированных зародышей
// Доклады АН СССР. – 1985. – Т. 283, №1. – С. 246-249.
2. Курсаков Г.А. Отдаленная гибридизация плодовых растений – М.: Агропромиздат, 1986. – 112 с.
3. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура изолированных зародышей и генеративных органов как метод селекции плодовых
растений // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений: науч. тр. – М.: Колос, 1979. – С. 57-70.
4. Высоцкий В.А. Биотехнологические приёмы в современном садоводстве // Плодоводство и ягодоводство России:
Сб. науч. работ. – М., 2011. – С. 3-10.
5. Малюкевич М.П., Кухарчик Н.В., Чиковани М.С. Перспективы эмбриокультуры при гибридизации косточковых. Использование в селекции. // Изв. АН БССР. Сер. Биол. наук. – 1990. – Т.6. – С. 67-70.
6. Кухарчик Н.В., Кастрицкая М.С., Пугач Р.М. Методика культивирования изолированных зародышей вишни и сливы //
Плодоводство: науч. тр. – Самохваловичи, 2006. – Т. 18, ч.2. – С. 157-162.
7. Кухарчик Н.В. Культура зародышей in vitro в селекции Cerasus на раннеспелость // Плодоводство: науч. тр. – Самохваловичи, 1994. – Т. 9, ч.1. – С. 56-63.
8. Курсаков Г.А. Применение изолированной культуры зародышей и тканей при отдаленной гибридизации плодовых растений // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. – М.: Колос, 1979. – С. 25-34.
9. Расторгуев С.Л. Метод эмбриокультуры в селекционной работе с аллополиплоидами // Садоводство и виноградарство. – 2006. – №2. – С. 13-15.
10. Лесникова Н.П., Смыкова А.В., Горина В.М. Культура зародышей и получение гибридных форм персика, абрикоса,
алычи // Сб. науч. тр. Государственного Никитского ботанического сада. – 1997. – Т.119. – С. 46-63.
11. Высоцкий В.А., Плотникова Г.А. Методические указания по выращиванию сеянцев вишни из зародышей изолированных
на ранних стадиях развития – М., 1988. – 14 с.
12. Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и
декоративными культурами / под ред. Е.Н. Джигадло. – Орел: ГНУ ВНИИСПК, 2005. – 51 с.
13. Гусев А.А. Гистологическая и экологическая оценка всхожести семян вишни: автореф. дис. …канд. с-х наук. – Мичуринск, 2006. – 23 с.
14. Кравцов П.В. Опыт применения культуры изолированных зародышей в селекции плодовых растений // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. – М.: Наука, 1970. – С. 41-45.
THE CULTURE OF ISOLATED EMBRYOS IN BREEDING OF CHERRY
T.V. Plaksina, D.S. Kulhanova, E.Y. Matkova
Summary. Hybrid fund of cherry at Altai is extended by new original genotypes, including hybrids of complex genetic origin and ploidy,
which have no analogs in European part of our country as well as abroad. These forms often give non-germinating seeds at crossings,
following to lower breeding efficiency. The aim of our work is to study cultivation peculiarities of ripen and non-ripen embryo of remote
cherry hybrids in vitro. It is proved, that at the stage of introduction of isolated embryo, not-high concentrations of growth regulators –
2.5μM 6-benzylaminopurine (BAP) in combination of 0.1 μM indole-3-butyric acid (IBA) and 1.0 μM gibberellic acid (GA3) are optimal. In
nutritional medium of the Murashige-Skoog (MS) with such ratio of growth regulators, the growth of not only embryo was stimulated, but
formation of additional shoots (2.8 + 1.2 pieces/embryo) have taken place as well. Depending on crossing combination, the ratio of growing
embryo from quantity of introduced in culture in vitro ranges from 12.5 up to 63.6 %. At the stage of micropropagation the application of
combined in hormonal composition nutritional media of the MS, BAP 2.5 μM + IBA 0.1 μM + GA3 1.0 μM makes possible to raise propagation
coefficient of regenerated plants of the studied crossing combinations on the average in 1.5 times. Shoots with length of 1.2-2.0 cm were
transferred to rooting media. The composition of the rooting medium was 1/2 MS without myo-inositol, 15gl-1sucrose, 6 gl-1 agar, IBA 5.0
μM and l-naphthleneacetic acid (NAA) 0.5 μM. All rooted plants within 3 weeks were transferred for acclimatization to vegetation room.
Key words: cherry, embryo culture, hybrid, embryos, nutrient medium, growth regulators, micropropagation.
ВНИМАНИЮ СОИСКАТЕЛЕЙ УЧЕНЫХ СТЕПЕНЕЙ
И ДРУГИХ ЗАИНТЕРЕСОВАННЫХ ЛИЦ!
Редакция журнала «Достижения науки и техники АПК» издает монографии
и другую книжную продукцию с редактированием и всеми выходными данными.
Цены договорные.
Заявки отправлять по адресу: 101000, г. Москва, Моспочтамт, а/я 166.
Тел.: (495) 557-13-01, (916) 241-63-43. E-mail: agroapk@mail.ru
Достижения науки и техники АПК, №7-2013
19