Вестник Башкирского университета.2006.№3 49 раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА УДК 581:635.21:632.7 ББК 28.5:42.15:44.6 ПОДАВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ЛИЧИНОК КОЛОРАДСКОГО ЖУКА РАСТИТЕЛЬНЫМИ БЕЛКАМИ Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И., Умаров И.А. Из личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata, выделены гидролитические ферменты, протеиназы и α-амилаза. Изучена протеолитическая активность на разных субстратах и взаимодействие с белками – ингибиторами гидролаз из растений различных видов. Приводятся данные о содержании ингибиторов протеиназ в вегетативных органах картофеля Solanum tuberosum. Показана связь между устойчивостью растений к вредителям и содержанием в них белков – ингибиторов протеиназ. Колорадский жук является основным вредителем посадок картофеля во многих странах. Для регуляции его численности используются в основном, химические средства защиты, которые обладают побочным вредным эффектом воздействия на природные экосистемы [1]. В связи с этим, является актуальным исследования теоретических и практических аспектов взаимоотношений растений и насекомых - для разработки новых, экологически безопасных способов защиты растений от вредителей. В комплексе свойств, определяющих степень агрессивности и вирулентности фитопатогенов и вредителей, существенная роль принадлежит их гидролитическим ферментам, при помощи которых вредные организмы, перерабатывая ткани растения хозяина, обеспечивают себе условия для роста и дальнейшего развития [2]. Другой стороной этих взаимодействий являются особенности кормового растения, выражающиеся в различных факторах, препятствующих действию гидролаз на растительные ткани. Среди них особое значение имеют белки-ингибиторы, которые присутствуют в семенах и вегетативных органах растений многих семейств: пасленовых, злаковых, бобовых и др.[3]. Эти молекулы способны инактивировать гидролазы чужеродных организмов, что является одним из факторов устойчивости растений. Несмотря на то, что исследования взаимодействия ферментов насекомых и природных ингибиторов ведутся уже долгое время, роль ингибиторов как факторов иммунитета остается невыясненной. Очевидно, что для получения целостных представлений о физиологической роли этих молекул необходимы исследования как самих растительных ингибиторов, так и ферментов насекомых, на которые направлено их действие [4]. Целью нашей работы было изучение действия белков-ингибиторов из вегетативных органов растений на активность протеиназ и α- амилаз личинок колорадского жука. МЕТОДИКА Объектами служили личинки колорадского жука (далее ЛКЖ) размером 6-8 мм; клубни, ростки до 1см, листья и стебли, сортов картофеля Романо, Удача, Невский, Луговской, Снегирь, листья и плоды растений различных видов. Гидролитические ферменты выделяли из ЛКЖ, ингибиторы гидролаз – из растительных тканей, в качестве экстрагента использовали дистиллированную воду, подробное описание методики выделения приведено в публикациях [2;5]. В экстрактах ЛКЖ определяли протеолитическую, амилазную активность методам агарозных пластин [6] для определения активности протеиназ, гидролизующих N,α-бензоил-DL-аргинин-4нитроанилид (БАПНА) использовали метод Эрлангера [7]. Содержание белка определяли по методу Бредфорд [8]. Статистическую обработку проводили в программе Excel. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Известно, что в тканях личинок колорадского жука функционирует комплекс гидролитических ферментов [9], в связи с этим нами исследовалась способность протеиназ колорадского жука к гидролизу различных субстратов. Выделенные ферменты оказались способными гидролизовать различные белки (казеин, гемоглобин, желатин, яичный белок). За единицу активности (ПЕ) принимали такое количество фермента, которое гидролизовало 1 мм2 субстрата. Высокую активность эти протеиназы проявляли к желатину, гемоглобину, яичному белку. Как видно, активность протеиназ ЛКЖ по отношению к различным субстратам определяется сопоставимо с уровнем активности высокоочищенных коммерческих препаратов ферментов. Так, активность ЛКЖ по отношению к желатине составляет 32 % от активности проназы E (протеиназы актиномицетов) в концентрации 1 мг/мл (рис.1). Интересно отметить, что мукопротеид яичного белка, подавляющий активность трипсина [10], не ингибировал протеолитическую активность ЛКЖ. раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА 50 П роназа Е 45 0 Т рипс ин 40 0 Э кс тракт Л К Ж 35 0 Sмм2 30 0 25 0 20 0 15 0 10 0 50 0 ж елатин казеин гем оглобин яич ны й белок Рис.1. Гидролиз белков протеолитическими ферментами Кроме различных белков, протеиназы ЛКЖ активно гидролизовали синтетический субстрат БАПНА. Эти факты свидетельствуют о том что, в протеолитическом комплексе личинок содержатся протеиназы различных типов. Из литературных источников известно, что у растений ингибиторы протеиназ локализуются в основном в семенах и других запасающих органах [3;11], в связи с этим нас интересовала активность ингибиторов протеиназ ЛКЖ и проназы Е из вегетативных органов картофеля, разных сортов. Использовали субстрат БАПНА, за 1 единицу (Е) активности фермента принимали такое его количество, которое в стандартных условиях, образует 1µМ п-нитроанилид за 1 мин. За единицу ингибиторной активности (ИЕ) принимали такое количество ингибитора, которое на 100% подавляет активность 1 единицы фермента. Как показали наши эксперименты (табл.1,2) вегетативные органы содержат белки – ингибиторы, подавляющие активность БАПНА- гидролизующих протеиназ. Наибольшей удельной активностью белков ингибиторов БАПНА-аз ЛКЖ обладали стебли, возможно это один из факторов их устойчивости, наименьшей листья картофеля, как известно, самая уязвимая часть при поражении вредителем. Белки картофеля неодинаково влияют на активность проназы Е и протеиназы колорадского жука. Как видно из табл. 2 вегетативные органы разных сортов картофеля незначительно отличаются активностью ингибиторов проназы, наибольшей удельной активностью обладают ростки, наименьшей – стебли картофеля Таблица 1 Активность ингибиторов БАПНА-азы ЛКЖ из вегетативных органах картофеля Ингибиторы БАПНА-азы ЛКЖ клубни ростки листья стебли Сорт ИЕ/г мИЕ/мг ИЕ/г мИЕ/мг ИЕ/г мИЕ/мг ИЕ/г мИЕ/мг массы белка массы белка массы белка массы белка Романо 0,22±0,02 0,9±0,06 0,3±0,011 3,3±0,2 0,32±0,01 1,1±0,07 0,41±0,02 4,3±0,31 Удача 0,2±0,03 0,8±0,03 0,33±0,013 3,9±0,31 0,56±0,04 1,9±0,1 0,42±0,02 2,6±0,12 Снегирь 0,3±0,02 1,5±0,12 0,29±0,02 2,4±0,15 0,27±0,02 1,2±0,09 0,56±0,04 4,13±0,36 Луговской 0,33±0,05 1,56±0,11 0,28±0,015 2,5±0,08 0,3±0,011 2,4±0,14 Невский 0,28±0,02 1,09±0,09 0,27±0,018 2,3±0,03 0,37±0,025 1,4±0,11 0,56±0,041 4,13±0,25 - данные отсутствуют Таблица 2 Активность ингибиторов проназы Е из вегетативных органах картофеля Ингибиторы проназы Е клубни ростки листья стебли Сорт ИЕ/г массы мИЕ/мг ИЕ/г массы мИЕ/мг ИЕ/г мИЕ/мг ИЕ/г массы мИЕ/мг белка белка массы белка белка Романо 1,2±0,1 5,01±0,41 0,8±0,01 8,9±0,7 0,84±0,04 2,9±0,2 0,08±0,002 0,8±0,07 Удача 1,04±0,09 4,0±0,37 0,44±0,01 5,14±0,42 0,73±0,06 2,5±0,15 0,4±0,02 2,3±0,15 Снегирь 1,06±0,05 5,3±0,34 0,9±0,03 7,3±0,63 0,8±0,05 3,6±0,28 0,3±0,015 2,2±0,01 Луговской 1,05±0,07 5,01±0,28 0,9±0,03 7,8±0,52 0,7±0,05 2,5±0,16 0,08±0,002 0,6±0,04 Невский 1,05±0,1 4,05±0,36 0,9±0,025 7,2±0,29 0,64±0,03 2,4±0,14 0 0 Следует отметить, что белки из разных частей картофеля неодинаково подавляют активность проназы и протеиназы ЛКЖ. Еще более наглядно эта закономерность проявляется при анализе средних значений данных по активности ингибиторов протеиназ из пяти сортов картофеля. На рис.2 представлены средние значения активности ингибиторов протеиназ: ЛКЖ и проназы Е из клубней, ростков, листьев и стеблей. Из рис.2 видно, что, к примеру стебли картофеля при наибольшей активности ингибиторов протеиназ ЛКЖ (сравнительно с другими органами картофеля), характеризуются наименьшей активностью ингибиторов проназы Е. Вестник Башкирского университета.2006.№3 51 ингибиторы проназы 8 ингибиторы протеиназы ЛКЖ 7 мИЕ/мг белка 6 5 4 3 2 1 0 клубни ростки листья стебли Рис.2. Активность ингибиторов проназы Е и ингибиторов протеиназы ЛКЖ из картофеля. Паслёновые Данные различия - свидетельство высокоспецифичного взаимодействия белка с ферментом, и как следствие растения и насекомого. Интересные закономерности обнаруживаются при сравнительном анализе активности белков ингибиторов протеиназ, из различных частей растений (табл.3)., разных видов. Таблица 3 Активность белков – ингибиторов протеиназ из различных растений Ингибиторы проназы Е Ингибиторы протеиназы ЛКЖ Содержание Объект Часть растения ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка белка, мкг/мл Одуванчик (Taraxacum sp.) листья 1,5±0,21 8,8±0,35 0,36±0,02 2,1±0,14 170 листья 0 0 0,31±0,018 6,2±0,34 50 Тополь (Populus nigra L.) Морковь листья 0,85±0,06 4,0±0,28 * * 215 (Daucus carota) корнеплод 0 0 * * 165 ингибитор трипсина из * * * * 1000 сои (ком. препарат) Томат листья 1,2±0,09 4,6±0,36 0,54±0,03 2,1±0,17 260 (Solanum плоды 0 0 * * 90 lycopersicum) Баклажан листья 1,4±0,12 6,1±0,45 0,22±0,011 0,96±0,05 230 (Solanum melongena) листья 0,36±0,01 1,6±0,09 0 0 230 Физалис (Physalis sp.) Картофель листья 0,74±0,05 2,8±0,18 0,3±0,019 1,12±0,07 290 (Solanum tuberosum) ростки 0,8±0,03 7,3±0,51 0,3±0,015 2,9±0,22 100 стебли 0,74±0,03 2,8±0,12 0,45±0,03 3,5±0,24 130 клубни 1,08±0,09 4,7±0,41 0,27±0,02 1,2±0,09 220 цветы 0,8±0,03 4,7±0,39 0,28±0,02 1,65±0,06 170 Примечание: *- полное подавление активности ферментов (активность БАПНА-азы ЛКЖ составила - 45,8 мЕ/мл; активность проназы Е – 190 мЕ/мл. Растения из семейства пасленовых, известные как неустойчивые культуры к колорадскому жуку, обладают высоким содержанием белков ингибиторов проназы, и напротив, сниженной, по сравнению с растениями других семейств активностью ингибиторов к протеиназе ЛКЖ. Белки из плодов томата и корнеплодов моркови подавляют активность протеиназы жука, однако активность ингибиторов проназы в них не выявлена. По-видимому, низкая активность ингибиторов микроорганизмов в них обясняет низкую устойчивость к болезням, вызванными бактериями и патогенными грибами. Таким образом, ингибиторы протеолитических ферментов, наряду с другими растительными веществами играют существенную роль в устойчивости растения к насекомым вредителям. Однако активность природных ингибиторов ферментов не стабильна. Она колеблется в онтогенезе и зависит от условий внешней среды [2]. В табл.4 приведены данные, полученные методом агарозных пластин, по активности гидролаз ЛКЖ (контроль). Здесь же показано как ингибиторы из вегетативных органов картофеля, разных сортов, добавленные к экстракту ЛКЖ, в соотношении 1:1, действуют на активность ферментов. раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА 52 За единицу активности ингибитора (ИЕ) принимали такое количество, которое подавляет 1 единицу активности фермента. Наши исследования показывают, что в клубнях и стеблях присутствует активность ингибиторов желатиназы ЛКЖ, в листьях такой активности не обнаружили. Неочищенный экстракт личинок обладал также, способностью к гидролизу крахмала, т.е. проявлял амилазную активность. Белки из клубней и стеблей способны незначительно подавлять активность α-амилазы ЛКЖ. В листьях ингибирующей активности к амилазе не фиксировали (табл.4). Таблица 4 Активность ингибиторов желатиназы (Иж) и ингибиторов амилазы (Иа) личинок колорадского жука в различных сортах картофеля Сорт картофеля клубни, ИЕ стебли, ИЕ листья, ИЕ Иж Иа Иж Иа Иж Иа Невский 18,1 50,2 16,7 15,1 0 0 Удача Луговской Рамона 18,1 34,5 34,5 40 40 34,3 18 12 18 28,3 14,8 18,2 0 0 0 0 0 0 Снегирь 26,5 34,3 20,2 21,8 0 0 желатиназа ,ПЕ амилаза, АЕ 113,04 78,5 В итоге проведенных исследований мы можем сделать следующие выводы: Протеолитические ферменты личинок колорадского жука, обладают широкой субстратной специфичностью. Взаимодействие с белками – ингибиторами из разных частей растений различных видов приводит к частичному или полному подавлению их активности. Растения из семейства пасленовых обладают сниженной, по сравнению с растениями из других семейств, активностью белков-ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука. ЛИТЕРАТУРА Методические рекомендации по индикации и мониторингу процессов адаптации колорадского жука к генетически модифицированным сортам картофеля// Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Сухорученко Г.И., Фасулати С.Р. и др. издательство ВИЗР, ВНИИБЗР. Санкт-Петербург, 47 с. 2. Применение методов биохимии в исследованиях по защите растений (Методические указания) п/р К.В.Новожилова, С.Л.Тютерева, издательство ВИЗР, Ленинград, 1976 с.61-62 3. Мосолов ВВ, Валуева ТА. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений//Прикладная биохимия и микробиология.-2005.-Т.41 №3.-с.261-282 4. Фомичева Ю.А. Пищеварительные α-амилазы и протеиназы насекомых как элемент специфичного взаимодействия в системе растение – насекомое –фитофаг: Автореф. канд.дис. Санкт – Петербург,1992. 15 с. 5. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А. Выделение и свойства протеолитических ферментов личинок Leptinotarsa decemplineata// Тез. докладов второго международного симпозиума Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете. Казань. 2006. С.228-229 6. Шпирная И.А.,Шевченко Н.Д. Определение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов методом гелевых пластин// Тез. докладов второго международного симпозиума Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете. Казань. 2006. С.230-231 7. Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys.- 1961.- V. 95, N 2.- P. 271-278. 8. Bradford M.M. A rapide and sensetive method for the quantitasion of microgramm quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V.172, N 1. - P. 248 - 254. 9. Конарев Ал.В. Ингибиторы протеиназ и устойчивость картофеля к колорадскому жуку//Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.М. Наука, 2000.- С.35-40 10. Велобова Е. Н. Переваривание белков. Киев: гродынец,1993, 29 с. 11. Ибрагимов Р.И. Содержание ингибиторов протеиназ в семенах сельскохозяйственных культур // Качество продукции растениеводства и приемы его повышения.- Уфа: Баш. гос. агр. ун-т. - 1998.С. 146-149. 1. Поступила в редакцию 14.09.06 г.