020526 B1 020526 B1 (11) 020526

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
020526
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2014.11.28
(21)
Номер заявки
(51) Int. Cl. A61K 31/502 (2006.01)
A61P 35/00 (2006.01)
A61P 35/02 (2006.01)
201270383
(22)
Дата подачи заявки
2010.09.09
(54)
ПРИМЕНЕНИЕ N-(4-((3-(2-АМИНО-4-ПИРИМИДИНИЛ)-2-ПИРИДИНИЛ)ОКСИ)
ФЕНИЛ)-4-(4-МЕТИЛ-2-ТИЕНИЛ)-1-ФТАЛАЗИНАМИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
РЕЗИСТЕНТНОГО К АНТИМИТОТИЧЕСКОМУ АГЕНТУ РАКА
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Изобретение относится к способам применения соединения N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина или его фармацевтически
приемлемой соли для лечения рака, включающего солидные опухоли, которые стали
резистентными к лечению химиотерапевтическими агентами, включающими антимитотические
агенты, такие как таксаны, и/или другими противораковыми агентами, включающими
ингибирующие Aurora киназу агенты. Изобретение также включает способы лечения рака,
рефрактерного к таким терапиям, путем введения фармацевтической композиции, содержащей
соединение, субъекту, имеющему рак.
020526
B1
(72)
Пейтон Марк, Кендалл Ричард (US)
Соболев А.Ю. (RU)
B1
(56) US-A1-2007185111
Harrington E. A.: "VX-680, a potent and
selective small-molecule inhibitor of the Aurora
kinases, suppresses tumor growth in vivo", Nature
medicine, vol. 10, no. 3 March 2004 (2004-03), pages
262-267, XP002612560, Retrieved from the Internet:
URL:http://www.nature.com/nm/journai /v10/n 3/pdf/
nm1003.pdf [retrieved on 2010-12-02] page 266, lefthand column, paragraph discussion
MOUNTZIOS ET AL.: "Aurora kinases as
targets for cancer therapy", CANCER TREATMENT
REVIEWS, SAUNDERS, US, vol. 34, no. 2,
19 November 2007 (2007-11-19), pages 175-182,
XP022532141, ISSN: 0305-7372 page 178
ANAND S. ET AL.: "AURORA-A
AMPLIFICATION OVERRIDES THE MITOTIC
SPINDLE ASSEMBLY CHECKPOINT, INDUCING
RESISTANCE TO TAXOL", CANCER CELL,
CELL PRESS, US, vol. 3, no. 1, 1
January 2003 (2003-01-01), pages 51-62,
XP009026392, ISSN: 1535-6108, DOI: DOI:10.1016/
S1535-6108(02)00235-0 page 59
BUSH TAMMY L. ET AL.: "Preclinical
characterization of AMG 900, an orally available
small molecule inhibitor of aurora kinases in
phase 1 clinical trials", PROCEEDINGS OF
THE ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN
ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH,
AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER
RESEARCH, US, vol. 51, 1 April 2010 (2010-04-01),
page 1076, XP009142030, ISSN: 0197-016X *
abstract
020526
(31) 61/241,527
(32) 2009.09.11
(33) US
(43) 2013.04.30
(86) PCT/US2010/048247
(87) WO 2011/031842 2011.03.17
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
АМГЕН ИНК. (US)
020526
Родственные заявки
Данная заявка притязает на приоритет по предварительной заявке США 61/241527, поданной 11
сентября 2009 года, описание которой включено здесь полностью посредством отсылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)
окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина для лечения рака, включающего солидные опухоли,
которые стали резистентными к лечению антимитотическими агентами и/или другими химиотерапевтическими агентами.
Сведения о предшествующем уровне техники
Рак является одним из самых широко распространенных заболеваний, поражающих человечество и
ведущей причиной смертности по всему миру. Только в США рак является второй ведущей причиной
смерти после болезней сердца. Рак, как правило, характеризуется разрегулированием нормальных клеточных процессов или нерегулируемой клеточной пролиферацией. Клетки, которые были трансформированы в раковые клетки, имеют тенденцию к пролиферации неконтролируемым и нерегулируемым образом, что приводит в некоторых случаях к метастазам или распространению рака. Разрегулирование
клеточной пролиферации может возникнуть в результате изменения одного или нескольких генов, ответственных за клеточные пути, которые контролируют прогрессию клеточного цикла. Или же разрегулирование может возникнуть в результате изменений ДНК (включая, но без ограничения, мутации, амплификации, реаранжировки, делеции и эпигенетический сайленсинг гена), в одной или нескольких сверочных
точках (checkpoint) клеточного цикла, что позволяет клеткам переходить из одной фазы клеточного цикла в другую непроверенными. С другой стороны, изменения в клеточном механизме сами по себе могут
привести к ошибкам в процессе митоза, которые должным образом не выявлены или восстановлены, и
клетка может проходить через клеточный цикл непроверенной.
Митоз представляет собой процесс, во время которого эукариотическая клетка распределяет свои
дублицированные хромосомы между двумя идентичными дочерними ядрами. После митоза, как правило,
следует цитокинез, в ходе которого происходит деление ядра, цитоплазмы, органелл и клеточных мембран на две дочерние клетки, имеющие примерно равные формы этих клеточных компонентов. Митоз и
цитокинез вместе определяют митотическую (М) фазу клеточного цикла - деление материнской клетки
на две дочерние клетки, генетически идентичные друг другу и их родительской клетке.
Процесс митоза является сложным и строго контролируемым процессом. Последовательность событий делится на отдельные фазы, соответствующие завершению одной совокупности активностей и
началу следующей. Этими стадиями являются профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза. Во
время процесса митоза дуплицированные хромосомы конденсируются и присоединяются к волокнам,
которые растаскивают сестринские хроматиды к противоположным концам клетки. Клетка затем делится
в результате цитокинеза с образованием двух идентичных дочерних клеток. Ошибки в процессе митоза
могут уничтожить клетку посредством апоптоза или вызвать неправильное расхождение хромосом, что
может привести к раку.
Как правило, сверочные точки клеточного цикла (checkpoints) активируются при обнаружении
ошибок в ДНК (например, повреждение ДНК). Если эти ошибки в геноме не могут быть зафиксированы,
то клетка обычно подвергается апоптозу. Однако, если клетка может проходить через свой клеточный
цикл и процесс является непроверенным, то со временем может накапливаться большее количество мутаций. Эти изменения генов могут нарастать и в конечном итоге привести к потомству клетки с предраковыми или раковыми неопластическими свойствами (например, неконтролируемая пролиферация) посредством адаптации.
Антимитотические агенты представляют собой противораковые агенты, которые ингибируют
функцию микротрубочек. Микротрубочки представляют собой полимеры белка, образованные гетеродимерами α- и β-тубулина, которые играют важную роль в формировании веретена митотического аппарата и цитокинезе в конце митоза. Подтвержденным подходом к препятствованию пролиферации раковых клеток являются противораковые агенты, действующие на микротрубочки.
В качестве противораковых агентов было разработано несколько классов антимитотических агентов. Таксаны являются самым известным классом антимитотического агента, который включает паклитаксел (таксол) и доцетаксел (таксотер). Алкалоиды барвинка представляют собой класс дестабилизирующих микротрубочки агентов, включающих винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин. Другие
новые классы включают эпотилоны (иксабепилон). Эти антимитотические агенты предназначены для
предотвращения пролиферации раковых клеток путем стабилизации или дестабилизации микротрубочек.
Это прямое ингибирование микротрубочек приводит к аресту клетки и гибели посредством апоптоза или
митотической катастрофы. Первым открытым соединением из серий таксанов был Паклитаксел. Доцетаксел, структурный аналог паклитаксела, был открыт позднее. Паклитаксел и доцетаксел широко применяются для лечения разных злокачественных новообразований у человека, включающих рак яичников,
рак молочной железы, рак головы и шеи, рак легкого, рак ЖКТ, рак пищевода, рак предстательной железы и СПИД-ассоциированную саркому Капоши. Первичным побочным эффектом таксанов является миелосуппрессия, первичная нейтропения, в то время как другие побочные эффекты включают перифериче-1-
020526
ский отек и нейротоксичность (периферическая нейропатия).
Резистентность к таксанам является осложняющим фактором для успешного лечения рака и, как
правило, связана с повышенной экспрессией гена множественной лекарственной резистентности mdr-1 и
его продукта, Р-гликопротеина (P-gp). Другими документально подтвержденными механизмами вторичной резистентности к таксанам являются мутации тубулина, гиперэкспрессия, амплификация и переключение изотипа. Мутации в α- и β-тубулине ингибируют связывание таксанов с правильным участком на
микротрубочках, что делает лекарственный препарат неэффективным. Кроме того, некоторые резистентные клетки также проявляют повышенное содержание Aurora киназы, фермента, который способствует
завершению митоза.
Алкалоиды барвинка (Vincas, также называемые как растительные алкалоиды) способны связываться с субъединицей микротрубочек β-тубулином, блокируя их способность к полимеризации с αсубъединицей тубулина для формирования полных микротрубочек. Это вызывает арест клеточного цикла в метафазе, что приводит к апоптотической гибели клетки, так как в отсутствие интактного митотического веретена дуплицированные хромосомы не могут выстроиться вдоль метафазной пластинки. Во
время исследования были идентифицированы димерные ассиметричные алкалоиды барвинка: винбластин, винкристин, винорелбин и виндезин, каждый из которых является эффективным для лечения рака,
включающего рак мочевого пузыря и рак яичка, саркому Капоши, нейробластому и болезнь Ходжкина, и
также карциному легкого и рак молочной железы. Основными побочными действиями алкалоидов барвинка являются нейротоксичность и миелосуппрессия у пациентов.
Резистентность к алкалоидам барвинка может быстро возникнуть в экспериментальных моделях.
Противоопухолевые эффекты алкалоидов барвинка могут блокироваться в мультирезистентных клеточных линиях, которые гиперэкспрессируют переносчики, выводящие лекарственное средство, такие как Pgp и MRP1, опосредованные АТФ-связывающим кассетным транспортером (ABC). Другие формы резистентности возникают в результате мутаций в β-тубулине, которые предотвращают связывание ингибиторов с их целью.
Другие химиотерапевтические агенты включают ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан
и топотекан (ингибиторы типа I), а также амсакрин, этопозид, этопозида фосфат и тенопозид (ингибиторы типа II). Ингибиторы топоизомеразы нарушают синтез ДНК и в частности работают путем предотвращения транскрипции и репликации ДНК.
Еще другим классом химиотерапевтических агентов является класс антрациклиновых антибиотиков, включающий даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, эпирубицин и митоксантрон. На сегодняшний день антрациклины применяются для лечения разных видов рака, включающих лимфомы, лейкоз, а также рак матки, яичника, легкого и молочной железы. Антрациклины работают путем формирования свободных радикалов кислорода, которые разрушают ветви ДНК, ингибируя, таким образом, синтез ДНК и функцию. Одним из основных побочных эффектов антрациклинов является повреждение
клетки сердечной мышцы, приводящее к сердечной токсичности.
Резистентность к противораковым агентам, включающим без ограничения химиотерапевтические
агенты и антимитотические агенты, является главным недостатком при лечении рака. Такая резистентность проводит к тому, что пациенты становятся перекрестно-резистентными к действиям многих различных лекарственных препаратов. Таким образом, множественная лекарственная резистентность является проблемой. Кроме того, такая резистентность к противораковой(ым) терапии(ям) неминуемо приводит к гибели пациента. Таким образом, сохраняется проблема развития лекарственной резистентности
для всех противораковых терапий и, следовательно, сохраняется потребность в идентификации терапии
для рака, который более не является восприимчивым или только незначительно поддается лечению,
включающему традиционное лечение химиотерапевтическими агентами, такими как таксаны и алкалоиды барвинка, а также лечению противораковыми агентами, прошедшими клинические испытания с целью получения разрешения уполномоченного органа.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 представляет собой график, показывающий действие AMG 900 и таксола на клеточные линии MES-SA и MES-SA D×5, значения ЕС50 для р-гистона Н3;
Фиг. 2 представляет собой график, показывающий действие AMG 900 и таксола на родительскую
клеточную линию NCI-H460 и таксол-резистентную клеточную линию NCI-H460, значения EC50 для содержания ДНК в клеточном цикле;
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий действие AMG 900 и таксола на клеточную линию MDA-MB-231 и таксол-резистентную клеточную линию MDA-MB-231, значения ЕС50 для содержания ДНК в клеточном цикле;
Фиг. 4 представляет собой график, показывающий ингибирование с помощью AMG 900 роста установленных опухолевых ксенотрансплантатов MES-SA D×5; и
Фиг. 5 представляет собой график, показывающий действие лечения AMG 900 и таксолом на рост
установленных таксол-резистентных ксенотрансплантатов NCI-H460.
Фиг. 6 представляет собой график, показывающий действие AMG 900 на родительскую клеточную
-2-
020526
линию НСТ116, AZD1152-резистентную клеточную линию НСТ116 и паклитаксел-резистентные клеточные линии.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предложено применение соединения N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина (также называемого здесь как "AMG
900" или "соединение") и его фармацевтически приемлемых солей для лечения рака на поздней стадии,
включающего солидные опухоли и раковые клетки, которые являются рефрактерными к стандартному
лечению утвержденными правительством антимитотическими агентами, такими как таксаны, включающие паклитаксел и доцетаксел, и другими химиотерапевтическими агентами, включающими доксорубицин, и другими агентами, вводимыми при клинических испытаниях на лечение рака. AMG 900 имеет
химическую структуру:
В изобретение, кроме того, предложено применение фармацевтической композиции, содержащей
это соединение или его фармацевтически приемлемую соль, для терапевтического, профилактического,
кратковременного и долговременного лечения рака и раковых клеток у пациентов, которые ранее проходили лечение химиотерапевтическими агентами, включающими антимитотические агенты. В одном варианте изобретения предложено применение AMG 900 в производстве лекарственных средств и фармацевтических композиций для способов лечения рака у субъектов, которые ранее проходили лечение антимитотическими агентами, включающими ингибиторы митотического веретена, и антимикротубулиновыми агентами или другими лекарственными средствами, используемыми в химиотерапии рака (также
называемыми здесь как химиотерапевтические агенты), включающими доксорубицин, даунорубицин,
дактиномуцин, колхицин, винбластин, винкристин, эторозид и митоксантрон. В другом варианте в изобретении предложен способ лечения таксан-резистентных типов опухолей, включающих немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы и гормонорезистентный рак предстательной железы у субъекта,
при этом способ предусматривает введение субъекту эффективного количества AMG 900 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения таксан-резистентных опухолей.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Во время клинических испытаний на моделях было обнаружено, что AMG 900, ингибитор Aurora
киназы, обеспечивает удивительное и неожиданное преимущество над современными стандартными раковыми терапевтическими агентами, которые поражают тубулин (такие как паклитаксел, иксабепилон и
алкалоиды барвинка) и другими химиотерапевтическими агентами (такими как доксорубицин), включая
AZD1152. В частности, AMG 900 обеспечивает эффективность ингибирования или замедления прогрессирования или роста опухолей, которые стали кросс-резистентными к антимитотическим агентам, с помощью различных предложенных механизмов, включающих, например, выведение лекарственного средства, опосредованное АТФ-связывающим кассетным транспортером (ABC), амплификацию или модификацию гена тубулина, или структурные изменения в белке α- или β-тубулине. Кроме того, AMG 900 поражает пролиферирующие клетки в G2M-фазе клеточного цикла и, следовательно, с малой вероятностью
будет вызывать периферическую нейропатию, наблюдаемую в случае антимитотиков, которые поражают
микротрубочки.
Определения
Следующие определения будут также способствовать пониманию объема изобретения, описанного
здесь.
Используемые здесь термины "рак" и "раковый" относятся или описывают физиологическое состояние у субъектов, которое, как правило, характеризуется разрегулированным клеточным ростом.
Примеры рака включают без ограничения карциному, лимфому, саркому, бластому и лейкоз. Более конкретными примерами раковых заболевания являются плоскоклеточная карцинома, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, рак ободочной кишки и рак головы и шеи. Поскольку используемый здесь термин "рак" не ограничивается какой-либо конкретной формой заболевания, то полагают, что способы изобретения будут особенно эффективными для лечения рака, который стал резистентным в некоторой степени к лечению противораковыми агентами, включающими без ограничения химиотерапевтические агенты, антимитотические агенты, антрациклины и подобные, а также рака, который рецидивировал после лечения такими противораковыми агентами.
Используемый здесь термин "химиотерапевтический агент" относится к терапии рака путем уничтожения раковых клеток. Этот термин к тому же относится к противоопухолевым препаратам, используемым для лечения рака, или комбинированию этих препаратов в стандартизированный режим лечения.
Примеры химиотерапевтических агентов включают без ограничения алкилирующие агенты, такие как
-3-
020526
цисплатин, карбоплатин, оксаплатин; алкалоиды, включающие алкалоиды барвинка (примеры включают
винкристин, винбластин, винорелбин и виндезин), и таксаны (примеры включают паклитаксел (Таксол) и
доцетаксел); ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан, топотекан, амсакрин, этопозид, этопозида фосфат и тенипозид; и разные противоопухолевые агенты, такие как дактиномицин, доксорубицин,
эпирубицин, блеомицин и другие.
Термин "содержащий" означает неограниченный, включающий указанный(е) компонент(ы), но не
исключающий других элементов.
Используемый здесь термин "мультирезистентный" относится к раковым клеткам, резистентным ко
многим лекарственным препаратам с разными химическими структурами и/или устойчивым к лекарственным препаратам, направленным на разные цели.
Используемый здесь термин "рефрактерный" относится к неподдаваемости, устойчивости или неотвечаемости на лечение, стимулы (терапию) или лекарство, включая резистентность ко многим терапевтическим средствам лечения. Термин "рефрактерный", при использовании здесь в контексте характеристики рака или опухоли, относится к раку или опухоли, которая не отвечает или имеет резистентный или
уменьшенный ответ на лечение одним или несколькими противораковыми агентами. Лечение, как правило, является продолжительным, пролонгированным и/или периодическим в течение периода времени,
что приводит к тому, что рак или опухоль развивают резистентность или становятся рефрактерными к
именно такому лечению.
Используемый здесь термин "субъект" относится к любому млекопитающему, включая человека и
животных, таких как коровы, лошади, собаки и кошки. Таким образом, изобретение может применяться
для пациентов-людей, а также для ветеринарных субъектов и пациентов. В одном варианте изобретения
субъектом является человек.
Выражение "терапевтически эффективный" означает количество соединения (AMG 900), которое
обеспечивает уменьшение размера или тяжести рака или опухоли во время лечения рака традиционными
антимитотическими терапиями при уменьшении или отсутствии вредных побочных эффектов, как правило, связанных с традиционными терапиями рака.
Используемые здесь термины "лечить", "лечение" и "терапия" относятся к терапии, включающей
без ограничения лекарственную терапию, профилактическую терапию и превентивную терапию. Профилактическое лечение в целом состоит в предупреждении начала нарушений вообще или задержки начала
преклинически очевидной стадии нарушений у индивидов.
Термин "фармацевтически приемлемые соли" охватывает соли, обычно используемые для формирования солей щелочных металлов и для образования солей присоединения свободных кислот или свободных оснований. Природа соли не является решающей при условии, что соль является фармацевтически приемлемой. Подходящие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли соединения могут быть приготовлены из неорганической кислоты или из органической кислоты. Примеры таких неорганических кислот включают без ограничения хлористоводородную, бромистоводородную, йодистоводородную, азотную, угольную, серную и фосфорную кислоту. Примеры органических кислот включают
без ограничения алифатические, циклоалифатические, ароматические, арилалифатические, гетероциклические, карбоновые и сульфоновые классы органических кислот, примерами которых являются муравьиная, уксусная, адипиновая, масляная, пропионовая, янтарная, гликолевая, глюконовая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, глюкуроновая, малеиновая, фумаровая, пировиноградная, аспарагиновая, глютаминовая, бензойная, аминобензойная, месиликовая, 4-гидроксибензойная, фенилуксусная,
миндальная, эмбоновая (памовая), метансульфоновая, этансульфоновая, этандисульфоновая, бензолсульфоновая, пантотеновая, 2-гидроксиэтансульфоновая, толуолсульфоновая, сульфаниловая, циклогексиламиносульфоновая, камфарная, камфорсульфоновая, диглюконовая, циклопентанпропионовая, додецилсульфоновая, глюкогептановая, глицерофосфорная, гептановая, гексановая, 2-гидроксиэтансульфоновая, никотиновая, 2-нафталинсульфоновая, щавелевая, пальмитиновая, пектиновая, надсерная, 2фенилпропионовая, пикриновая, пивалиновая, пропионовая, янтарная, винная, тиоциановая, метансульфоновая, ундекановая, стеариновая, альгиновая, β-гидроксимасляная, салициловая, галактаровая и галактуроновая кислота.
Подходящие фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли присоединения основания
соединения включают без ограничения соли металлов, такие как соли, полученные из алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка, или соли, полученные из органических оснований, включающих первичные, вторичные, третичные амины и замещенные амины, включающие циклические амины,
такие как кофеин, аргинин, диэтиламин, N-этилпиперидин, гистидин, глюкамин, изопропиламин, лизин,
морфолин, N-этилморфолин, пиперазин, пиперидин, триэтиламин, триметиламин. Все соли, указанные
здесь, могут быть приготовлены традиционными способами из соответствующего соединения путем реакции, например, соответствующей кислоты или основания с соединением.
AMG 900, N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)оксо)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1фталазинамин, может быть приготовлен способом, аналогичным способу, описанному в публикации РСТ
WO 2007087276, иллюстративные способы от А1 до А2 на стр. 70, но с использованием 1-хлор-4-(4метил-2-тиенил)фталазина в качестве исходного материала, в сочетании с примерами 15 (стр. 50), 25
-4-
020526
(стр. 55) и 30 (стр. 59). Эти способы также описаны в патенте США 7560551, описание которого включено здесь полностью в виде ссылки. В частности, AMG 900 может быть приготовлен так, как описано в
примере 1 ниже.
Пример 1. Синтез N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина (AMG 900).
Стадия 1. 4-(2-хлорпиридин-3-ил)пиримидин-2-амин.
В продутую аргоном колбу с круглым дном емкостью 500 мл, помещенную в изопропаноловую
ванну, медленно добавляли металлический натрий (3.40 г, 148 ммоль) в метанол (180 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре (КТ) в течение примерно 30 мин. В смесь добавляли гидрохлорид
гуанидина (12.0 мл, 182 ммоль) и перемешивали при КТ в течение 30 мин с последующим добавлением
(Е)-1-(2-хлорпиридин-3-ил)-3-(диметиламино)проп-2-ен-1-она (12.0 г, 57.0 ммоль), присоединяли конденсатор с воздушным охлаждением, переносили реакционную смесь в масляную ванну, в которой смесь
нагревали примерно до 50°С в течение 24 ч. Примерно половину метанола выпаривали при пониженном
давлении и твердые вещества фильтровали в вакууме, затем отмывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (NaHCO3) и Н2О, высушивали на воздухе с получением 4-(2-хлорпиридин-3-ил)пиримидин2-амина в виде грязно-белого твердого вещества. MS m/z = 207 [M+1]+.
Вычислено для C9H7ClN4: 206.63.
Стадия 2. 4-(2-(4-Аминофенокси)пиридин-3-ил)пиримидин-2-амин.
В повторно герметизируемую пробирку добавляли 4-аминофенол (1.3 г, 12 ммоль), карбонат цезия
(7.8 г, 24 ммоль) и DMSO (16 мл, 0.75 М). Смесь нагревали до 100°С в течение 5 мин и затем добавляли
4-(2-хлорпиридин-3-ил)пиримидин-2-амин (2.5 г, 12 ммоль), и реакционную смесь нагревали до 130°С в
течение ночи. После завершения реакции по данным LCMS реакционную смесь оставляли охлаждаться
до КТ и разбавляли водой. Полученный преципитат фильтровали и твердую фазу отмывали водой и диэтиловым эфиром. Твердое вещество затем брали в соотношении 9:1 CH2Cl2:МеОН и пропускали через
слой силикагеля с использованием в качестве элюента смесь 9:1 CH2Cl2:МеОН. Растворитель концентрировали в вакууме для получения требуемого продукта, 4-(2-(4-аминофенокси)пиридин-3-ил)пиримидин2-амина. MS m/z = 280 [М+1]+. Вычислено для C15H13N5O: 279.30.
Стадия 3. 1-Хлор-4-(4-метилтиофен-2-ил)фталазин.
1,4-Дихлорфталазин.
(1.40 г, 7.03 ммоль), 4-метилтиофен-2-илборную кислоту (999 мг, 7.03 ммоль) и PdCl2(DPPF) (721
мг, 985 мкмоль) добавляли в герметичную пробирку. Пробирку продували аргоном. Затем добавляли
карбонат натрия (2.0 М в воде) (7.74 мл, 15.5 ммоль) и 1,4-диоксан (35.2 мл, 7.03 ммоль). Пробирку герметично закрывали, перемешивали при КТ в течение 5 мин и помещали в предварительно нагретую масляную ванну при 110°С. Через 1 ч анализ методом LC-MS показал продукт и побочный продукт (двойное
связывание), и исходный материал дихлорфталазин. Реакционную смесь охлаждали до КТ, фильтровали
через слой целита при помощи этилацетата (EtOAc), концентрировали и нагружали на колонку. Продукт
очищали колоночной хроматографией с использованием Hex для удаления верхнего пятна, затем смеси
80:20 гексаны:EtOAc для сбора продукта. Продукт 1-хлор-4-(4-метилтиофен-2-ил)фталазин получали в
виде желтого твердого вещества. Анализ методом LC-MS показал, что продукт содержал примеси в небольшом количестве дихлорфталазина и побочный продукт бис-связывания. MS m/z = 261 [M+l]+. Вычислено для C13H9ClN2S: 260.12.
Стадия 4. N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1фталазинамин.
В 4-(2-(4-аминофенокси)пиридин-3-ил)пиримидин-2-амин и 1-хлор-4-(4-метил-2-тиенил)фталазин
добавляли tBuOH. Полученную смесь нагревали при 100°С в герметичной пробирке в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляли диэтиловым эфиром и насыщенным раствором карбоната натрия и энергично встряхивали. Полученные твердые вещества фильтровали и отмывали водой, диэтиловым эфиром
и сущили на воздухе с получением N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4метил-2-тиенил)-1-фталазинамина в виде грязно-белого твердого вещества. MS m/z = 504 [М+Н]+. Вычислено для С28 H21 N7 О S: 503.58.
-5-
020526
Метод LC-MS
Образцы анализировали на приборе Agilent модели1100 LC-MSD на колонке с обращенной фазой
производства Agilent Technologies, XDB-C8 (3.5 мкм) (4.6×75 мм) при 30°С. Скорость потока была постоянной и изменялась примерно от 0.75 мл/мин до 1.0 мл/мин.
В качестве подвижной фазы использовали смесь растворителя А (Н2О/0.1% НОАс) и растворителя
В (AcCN/0.1% НОАс) с периодом времени 9 мин для градиента от 10 до 90% растворителя В. Затем следовал период в 0.5 мин для возвращения к 10% растворителя В и период в 2.5 мин для повторного уравновешивания (промывки) колонки 10% растворителя В.
Также для синтеза AMG 900 могут применяться другие способы. В данной области известно много
синтетических химических трансформаций, а также методов защитных групп, эффективных для синтеза
AMG 900. Полезная литература, описывающая органические химические превращения, включает, например, R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M.
Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3-е издание, John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); A. Katritzky and A. Pozharski, Handbook of Heterocyclic Chemistry, 2-е издание (2001); M. Bodanszky, A. Bodanszky, The Practice
of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1984); J. Seyden-Penne, Reductions by the Aluminoand Borohydrides in Organic Synthesis, 2-е издание, Wiley-VCH, (1997); and L. Paquette, editor, Encyclopedia
of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995).
AMG 900 тестировали на его способность уменьшать или ингибировать прогрессирование опухоли
в разных клеточных линиях (in-vitro) и многих типах солидных опухолей (in-vivo), некоторых из которых
ранее подвергались лечению и развили резистентность к стандартным антимитотическим агентам, включая таксаны и алкалоиды барвинка, а также к другим химиотерапевтическим агентам. Последующие
примеры и полученные данные иллюстрируют способность AMG 900 лечить рак, включающий рак, резистентный к современным стандартным терапиям, включающим антимитотические агенты, такие как
паклитаксел, и другие лекарственные препараты, используемые в сочетании с химиотерапией, такие как
доксорубицин. Если не указано иное, AMG 900 в форме свободного основания использовали в примерах,
описанных далее.
Пример 2.
Для изучения ингибирования клеточной пролиферации с помощью AMG 900-индуцированной супрессии активности Aurora киназы А и В, антипролиферативное действие AMG 900 оценивали in vitro с
использованием 32 человеческих опухолевых клеточных линий. Как показано в табл. 1 и 2, AMG 900
проявил антипролиферативную активность как в солидных, так и в гематологических опухолевых клеточных линиях. Эта антипролиферативная активность наблюдалась при концентрациях AMG 900 в низком наномолярном диапазоне (значение EC50 от 1 до 5 нМ). Примечательно, что четыре из этих чувствительных к AMG 900 солидных опухолевых клеточных линий (НСТ15, MES-SA D×5, 769P и SNU449)
являются резистентными к паклитакселу и другим химиотерапевтическим агентам. Раковые клетки, резистентные ко многим лекарственным препаратам разных химических структур и/или резистентные к
лекарственным препаратам, направленным на разные цели, называются "мультирезистентными". Одним
основным механизмом множественной лекарственной устойчивости (MDR), используемой раковыми
клетками, является выведение лекарственного препарата, вызванное семейством АТФ-связывающих кассетных транспортеров (ABC), таким как продукт гена mdr-1, P-гликопротеин (P-gp). Например, резистентная к доксорубицину человеческая клеточная линия матки MES-SA D×5 экспрессирует P-gp и является резистентной (30-1200-кратно родительской линии) к ряду химиотерапевтических агентов, включающих даунорубицин, дактиномицин, колхицин, винбластин, винкристин, паклитаксел, этопозид и митоксантрон. Для дальнейшего изучения активности AMG 900 в MDR-экспрессирующих клетках проводили тестирование трех таксол-резистентных опухолевых клеточных линий и сравнили с их соответствующими родительскими клеточными линиями. Как показано на фиг. 1-3 и в табл. 3, AMG 900 сохранил
активность во всех трех указанных резистентных и чувствительных к таксолу опухолевых клеточных
линиях со значениями EC50 < 2 нМ. Таксол показал значительную потерю активности (10-100-кратно) в
P-gp-экспрессирующих опухолевых сублиниях по сравнению с родительскими линиями. В то же время
эти данные указывают на то, что AMG 900 ингибирует фосфорилирование гистона Н3 (проксимальный
субстрат Aurora киназы В) и блокирует деление клеток опухолевых клеточных линий, резистентных к
паклитакселу и другим химиотерапевтическим агентам.
Материалы и способы
Тестируемые материалы.
Тестируемый продукт: AMG 900.
Состав: DMSO.
Источник: Amgen Inc.
Основные реагенты.
-6-
020526
Отмывочные и фиксирующие растворы
Реагенты
-7-
020526
Лабораторное оборудование, поставщики, программное обеспечение
Способы
Активность AMG 900 оценивали in vitro в родительских и резистентных к лекарственным препаратам опухолевых клеточных линиях, полученных из матки, молочной железы и тканей легкого. Конечные
показатели клеточного цикла и р-гистона Н3 определяли методом проточной цитометрии и многопараметрической визуализации клетки, соответственно.
Человеческая клетка и клеточная культура
Человеческие опухолевые клеточные линии были приобретены у компании АТСС (American Type
Culture Collection, Manassas, VA), если не указано иное. Все клетки содержались при 37°С в атмосфере
5% СО2. Извлеченная из опухоли молочной железы клеточная линия CAL51 (АСС 302) была получена от
компании DSMZ (GmbH). Извлеченные из опухоли ободочной кишки клеточные линии HCT-116_JH (генотип р21+/+) и HCT-116_JH (генотип р21 -/-) были получены по лицензии от компании John Hopkins
University Genetics Resources Core Facility.
-8-
020526
Человеческие опухолевые клеточные линии с соответствующей культурной средой
Панель клеточной линии солидной опухоли, обработанной AMG 900: Антипролиферативный анализ (ArrayScan VTi).
Опухолевые клетки засевали в 96-луночный планшет Packard View в 100 мкл соответствующей
полной среды при плотности 3000 или 5000 клеток на лунку в зависимости от кинетики роста клеточной
линии (в широком понимании - медленный vs быстрый). Все разведения выполняли с использованием
рабочей станции Biomek FX. На следующий день клетки обрабатывали AMG 900 (11-точечный диапазон
доз от 0.156 до 0.0003 мкМ) с конечной концентрацией DMSO в среде 0.12%. Через 24 ч среду, содержащую соединение, удаляли и клетки отмывали полной средой. Клетки затем инкубировали в 100 мкл свежей полной среды (без соединения) в течение 48 ч. Через 48 ч клетки фиксировали путем добавления 100
мкл фиксирующего буфера в 100 мкл полной среды. Клетки инкубировали при комнатной температуре в
течение 10 мин. Фиксирующий буфер аспирировали и клетки затем пермеабилизировали в 100 мкл отмывочного буфера в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим добавлением 100 мкл
ДНК-окрашивающего буфера и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
Затем клетки отмывали 100 мкл отмывочного буфера и хранили в 100 мкл 1×PBS при 4°C до проведения
анализа. Клеточные характеристики получали путем сканирования 96-луночных планшетов на системе
-9-
020526
Cellomics "ArrayScan VTi". Количественное определение площади ядра индивидуальной клетки и интенсивности выполняли по окрашиванию флуоресцентным ДНК-красителем Hoechst 33342. Пороговое значение площади ядра было установлено на основе контрольных лунок, обработанных DMSO, для расчета
количества ядер с нормальным размером из ядерного дебриса и полиплоидных клеток. Эта пороговая
величина применялась для подсчета количества нормальных ядер в шести полях изображения на лунку с
использованием увеличения 10×. Кривые доза-концентрация и значения ЕС50 были рассчитаны с использованием четырехпараметрического уравнения.
Панель гематологической клеточной линии, обработанной AMG 900: Многопараметрический анализ содержания ДНК в клеточном цикле (проточная цитометрия).
Опухолевые клетки засевали в 300 мкл глубокий 96-луночный планшет в 150 мкл соответствующей
полной среды при плотности 100000 клеток на лунку. Клетки обрабатывали AMG 900 (10-точечных доз в
диапазоне от 0.156 до 0.0003 мкМ) с конечной концентрацией DMSO в среде 0.2%. За два часа до сбора
клетки импульсно метили с помощью BrdU при конечной концентрации 1:100 в среде. Через 48 ч 100
мкл среды удаляли из каждой лунки с помощью пипеточного дозатора для мультилуночных планшетов.
Затем клетки переносили в ПЦР-пробирки стрипов в 200 мкл среды. Клетки центрифугировали при 2000
об/мин при 18°C в течение 4 мин и супернатант аспирировали. Клетки затем фиксировали в 200 мкл ледяного 90% метанола и хранили при -20°С в течение по меньшей мере 24 ч перед окрашиванием антител
и ДНК. Фиксированные клетки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 4 мин для удаления 90%
метанола. Клетки промывали 200 мкл отмывочного буфера и затем обрабатывали 100 мкл кислотного
буфера при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте. Клетки дважды промывали 200 мкл отмывочного буфера (до установления рН 7.0, подтвержденного индикаторной бумагой). Клетки инкубировали с коктейлем антител анти-BrdU-Alexa 647 (3 мкг/мл) и анти-Каспаза 3-FITC (20 мкл/ячейка) в отмывочном буфере в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте. Окрашенные клетки центрифугировали и промывали 200 мкл отмывочного буфера. Клетки контрокрашивали 200 мкл иодида пропидия (PI)
в течение ночи при 4°C в темноте. Данные получали и анализировали с помощью проточного цитометра
(LSRII). Пороговый интервал применяли согласно содержанию ДНК, BrdU и популяциям, положительным/отрицательным по каспазе-3, на основе контроля DMSO и групп, обработанных лекарственным
средством с низкой/высокой концентрацией. Данные представлены в виде процента содержания SubG1
ДНК, содержания 4N+ ДНК, BrdU и популяций, положительных по расщеплению каспазой-3. Кривые
концентрация-эффект и значения EC50 рассчитывали с использованием четырехпараметрического уравнения.
Клеточные линии MES-SA D×5 и MES-SA, обработанные AMG 900 или паклитакселом (таксолом):
Анализ р-Гистона H3 (ArrayScan VTi).
Клетки MES-SA D×5 и MES-SA наносили при плотности 10000 клеток на ячейку на 96-луночный
планшет в полной среде и культивировали в течение 24 ч. На следующий день клетки обрабатывали
AMG 900 или таксолом в диапазоне 10 значений концентрации (от 1.25 мкМ до 0.0024 мкМ) в течение 24
ч с конечной DMSO концентрацией в среде 0.1%. Клетки отмывали и фиксировали путем добавления 100
мкл 2× формальдегидного фиксирующего буфера в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки
отмывали и пермеабилизировали 100 мкл отмывочного буфера в течение 15 мин. Клетки иммунофлуоресцентно окрашивали антителом к р-гистону Н3 (5 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре
в течение 2 ч. Клетки промывали в 100 мкл отмывочного буфера. Затем клетки инкубировали с антикроличьим козьим антителом, конъюгированным с флюоресцентным красителем А1еха-488 (1.5 мкг/мл) в
отмывочном буфере, дополненном ДНК-красителем Hoechest (1 мкг/мл), и инкубировали при комнатной
температуре в темноте в течение 30 мин. Клетки дважды промывали 100 мкл отмывочного буфера. 96Луночные планшеты анализировали на системе Cellomics "ArrayScan VTi" с использованием BioApplication Algorithm (TargetActivation.V2). Процентное содержание р-гистона H3+ (суммирование 6 полей зрения на лунку с объективом 10×) использовали для получения кривых концентрация-эффект и значений
ЕС50 с помощью четырехпараметрического уравнения.
Родительская клеточная линия NCI-H460 и таксол-резистентная клеточная линия, обработанные
AMG 900 или паклитакселом (таксолом): Анализ содержания ДНК в клеточном цикле (проточная циометрия).
Родительские NCI-H460 и таксол-резистентные NCI-H460 клетки засевали при плотности 500000
клеток на лунку в 6-луночный планшет в 2 мл соответствующей полной среды. На следующий день
клетки обрабатывали AMG 900 или таксолом в диапазоне концентраций с 6 точками с конечной концентрацией DMSO в среде 0.05%. Через 24 ч клетки импульсно метили с помощью BrdU (1:100 разведение)
и собирали. Клетки центрифугировали при 1600 об/мин в течение 4 мин и супернатант аспирировали.
Клетки отмывали в 1×PBS, фиксировали в 900 мкл ледяного 90% метанола и хранили при -20°С. Фиксированные клетки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 4 мин для удаления 90% метанола. Клетки промывали 200 мкл отмывочного буфера и окрашивали с помощью 200 мкл иодида пропидия (PI) в
течение ночи при 4°С в темноте. Данные получали и анализировали с помощью проточного цитометра
(LSRII). Пороговый интервал применяли согласно содержанию +4N (аналогично ≥4N) ДНК, и SubG1- 10 -
020526
положительных популяций на основе обработанных DMSO контролей и групп, обработанных лекарственным средством с низкой/высокой концентрацией. Данные представлены в виде процентного содержания +4N ДНК и SubG1-положительных субпопуляций. Значения ЕС50 для содержания 4N+ (аналогично ≥4N) ДНК или SubG1 в клетке были рассчитаны с использованием четырехпараметрического уравнения.
Родительская клеточная линия MDA-MB-231 (F11)-luc и таксол-резистентные клеточные линии,
обработанные AMG 900 или паклитакселом (таксолом): Анализ содержанию ДНК в клеточном цикле
(проточная цитометрия).
Родительские MDA-MB-231(F11)-luc и таксол-резистентные клетки засевали при плотности 250000
клеток на ячейку в 12-луночный планшет в 1 мл соответствующей среды в двух повторностях. На следующий день клетки обрабатывали AMG 900 или таксолом в диапазоне 10-точечной концентрации с конечной DMSO концентрацией в среде 0.1%. Через 24 ч клетки собирали с помощью 1х трипсин-ЭДТА и
переносили в ПЦР пробирки. Клетки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 4 мин и супернатант
аспирировали. Клетки фиксировали в 200 мкл ледяного 90% метанола и хранили при -20°C по меньшей
мере в течение 24 ч. Фиксированные клетки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 4 мин для
удаления 90% метанола. Клетки промывали отмывочным буфером и окрашивали с помощью 200 мкл
иодида пропидия (PI) в течение 30 мин при 4°С в темноте. Перед получением данных добавляли дополнительно 400 мкл PI. Данные получали и анализировали с помощью проточного цитометра (LSPII). Пороговый интервал применяли согласно содержанию +4N (аналогично ≥4N) ДНК на основе DMSO контролей и групп, обработанных лекарственным средством с низкой/высокой концентрацией. Данные
представлены в виде процентного содержания контроля для популяций, положительных на содержание
+4N ДНК. Значения EC50 для содержания 4N+ ДНК в клетке были рассчитаны с использованием четырехпараметрического уравнения.
Таблица 1. In Vitro AMG 900 ингибирует клеточную пролиферацию многих видов солидных опухолей
*Паклитаксел-резистентные опухолевые клеточные линии (Gyorffy et al., 2006, Harker, G. A. et al.
Multidrug (Pleiotropic) Resistance in Doxorabicin-selected Variants of Human Sarcoma Cell Line MES-SA
Cancer Research, 1985, 45, 4091-4096;
Szakacs, G. et al. Predicting drug sensitivity and resistance Profiling ABC transporter genes in cancer cells,
Cancer Cell, 2004, 6, 129-137;
Szakacs, G. et al Targeting multi-drug resistance in cancer Nat Rev Drug Discovery, 2006, 5, 219-234.
- 11 -
020526
Таблица 2. In Vitro AMG 900 блокирует клеточное деление в некоторых гематологических типах опухолей
Клетки обрабатывали AMG 900 в течение 48 ч (без удаления соединения) Проточная цитометрия основной анализ выполняли с использованием множественных конечных показателей (расщепление каспазой-3, BrdU, SubG1 и содержание +4N ДНК (содержание ≥4N ДНК) Значения ЕС50 получали с использованием конечного показателя содержания +4N ДНК Представленные значения ЕС50 представляют собой одну кривую доза - эффект для 10 точек.
Таблица 3. In Vitro AMG 900 сохраняет активность в опухолевых клеточных линиях, устойчивых
к паклитакселу
Резистентность (r) определена как ≥ 10-кратная потеря активности (значение ЕС50) в сублинии по
сравнению с родительской линией.
* Анализ р-гистона H3 на основе целломикса. Показанные значения ЕС50 представляют собой один
эксперимент по определению доза-эффект для 10 точек.
b
Анализ содержания ДНК методом проточной цитометрии. Значения EC50 получали с помощью соответствующих конечных показателей содержания ДНК (содержание ≥4N ДНК (AMG 900) и Sub G1
(паклитаксел)). Значения EC50 представляют один эксперимент, выполненный в двух повторностях для
10 точек доза-эффект. Клеточные линии MDA-MB-231 содержат трансген, экспрессирующий зеленый
флуоресцентный белок и люциферазу.
с
Анализ содержания ДНК методом проточной цитометрии. Значения ЕС50 получали с помощью соответствующего конечного показателя содержания ДНК (содержание ≥4N ДНК (AMG 900) и Sub G1
(паклитаксел)). Значения EC50 представляют один эксперимент, выполненный в двух повторностях для 6
точек доза-эффект.
1
Сублиния, резистентная ко многим лекарственным препаратам, MES-SA D×5, была образована из
родительской клеточной линии MES-SA путем выращивания клеток в присутствии повышающихся концентраций доксорубицина. Клеточная линия MES-SA D×5 гиперэкспрессировала P-gp (Harker et al, 1985).
2
Паклитаксел-резистентные сублинии MDA-MB-231-Таксол-r и NCI-H460-Таксол-r были получены
из их соответствующей родительской линии путем выращивания клеток в присутствии повышающихся
концентраций паклитаксела. Обе сублинии являются положительными по P-gp на основании метода проточной цитометрии.
Фиг. 1. Действие AMG 900 и таксола на клеточные линии MES-SA и MES-SA D×5, значения EC50
для р-Гистона H3.
Опухолевые клеточные линии матки обрабатывали контролем (DMSO), AMG 900 или паклитакселом (таксолом) в диапазоне доз с 10 точками (от 0.0024 до 1.25 мкМ) в течение 24 ч. Клетки затем фиксировали и окрашивали антителом к р-гистону H3 и контрокрашивали с помощью ДНК-красителя
(Hoechest). Анализ на основе изображений (ArrayScan VTi) выполняли для измерения процентного содержания клеток, положительных по р-гистону H3. Кривые доза - эффект представляют концентрации
AMG 900 или таксола, нанесенные против положительных по р-гистону H3 клеток в виде процента
DMSO-обработанного контроля (РОС). Значения ЕС50 были рассчитаны с помощью четырехпараметрической подобранной модели.
Фиг. 2. Действие AMG 900 и таксола на родительскую клеточную линию NCI-Н460 и таксорезистентную клеточную линию NCI-H460, значения EC50 для содержания ДНК в клеточном цикле.
- 12 -
020526
Клеточные линии опухоли легкого обрабатывали контролем (DMSO), AMG 900 или таксолом в
диапазоне доз с 6 точками в течение 24 ч. Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии выполняли для измерения процентного содержания клеток, положительных по ≥4N ДНК или SubG1 ДНК.
Кривые доза - эффект для AMG 900 представляют концентрацию лекарственного средства, нанесенную
против процентного содержания клеток, положительных по ≥4N ДНК. Кривые доза - эффект для таксола
представляют концентрацию лекарственного средства, нанесенную против процентного содержания клеток, положительных по SubG1 ДНК. Значения ЕС50 были рассчитаны с помощью четырехпараметрической модели подбора.
Фиг. 3. Действие AMG 900 и таксола на клеточную линию MDA-MB-231 и таксол-резистентную
клеточную линию MDA-MB-231, значения EC50 для содержания ДНК в клеточном цикле.
Опухолевые клеточные линии молочной железы обрабатывали контролем (DMSO), AMG 900 или
таксолом в диапазоне доз с 10 точками в течение 24 ч. Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии выполняли для измерения процентного содержания клеток, положительных по ≥4N ДНК или
SubG1 ДНК. Кривые доза - эффект для AMG 900 представляют концентрацию лекарственного средства,
нанесенную против процентного содержания клеток, положительных по ≥4N ДНК. Кривые доза - эффект
для таксола представляют концентрацию лекарственного средства, нанесенную против процентного содержания клеток, положительных по SubG1 ДНК. Значения ЕС50 были рассчитаны с помощью четырехпараметрической модели подбора.
Пример 3.
Для изучения ингибирования клеточной пролиферации с помощью AMG 900-индуцированного подавления активности Aurora киназы, антипролиферативную активность AMG 900 оценивали in vivo во
многих человеческих моделях ксенотрансплантатов, включающих модели рака молочной железы, ободочной кишки, лейкоза, легкого, поджелудочной железы и матки, выращенных у бестимусных мышей.
Мышам вводили орально AMG 900 в дозе 3.75, 7.5 или 15 мг/кг BID (два раза в сутки) в течение 2-х последовательных дней в неделю или 3 мг/кг BID ежедневно на протяжении исследования, начиная с момента установления опухолей Реагенты, растворы, оборудование, формулирование AMG 900, измерение
объема опухоли и расчеты проводили в целом, как описано в примере 4 ниже. Было обнаружено, что
AMG 900 значительно ингибирует рост опухолей во всех протестированных моделях ксенотрансплантатов по сравнению с контрольной группой, которой вводили носитель (табл. 4).
Таблица 4. AMG 900 ингибирует рост многих моделей ксенотрансплантатов
(TGI) ингибирование роста опухоли, *%TGI, выбранный из прерывного или непрерывного режима
введения на основе самого лучшего эффективного ответа (ND) не определен, резистентность (r), определенная как ≥10-кратная потеря активности (значение EC50) по сравнению с восприимчивыми к таксану
опухолевыми клеточными линиями.
Действие AMG 900 тестировали на мультирезистентной клеточной линии MES-SA D×
×5,
выращенной in vivo в виде ксенотрансплантата опухоли
Мышам вводили перорально AMG 900 в дозе 15 мг/кг BID (два раза в сутки) в течение 2-х последовательных дней в неделю или 3.0 мг/кг два раза в сутки на протяжении исследования. Дозирование инициировали после установления опухоли (через 10 дней после имплантации опухоли). Терапия AMG 900
вызвала статистически значимое ингибирование роста опухоли с использованием доз и режимов AMG
900 по сравнению с контрольной группой носителя (фиг. 4; р < 0.0001, апостериорный тест Даннета).
Сравнимое ингибирование роста опухоли было также удивительно достигнуто в 2-х других резистентных к лекарственным средствам моделях (НСТ15 и NCI-Н460-Таксол-r [резистентный]) с использовани- 13 -
020526
ем аналогичных режимов лечения (см. табл. 4).
Фиг. 4. AMG 900 ингибирует рост установленных ксенотрансплантатов опухолей MES-SA D×5.
MES-SA D×5, мультирезистентные клетки (2×106) инъецировали подкожно в правый бок самок бестимусных мышей. Опухоли измеряли дважды в неделю. Лечение начинали на 10 день, когда объем опухоли составил ~100 мм. Мышей дозировали перорально AMG 900 два раза в сутки, прерывисто или непрерывно. Все группы снабжались пищевыми добавками на ежедневной основе на протяжении исследования для поддержания массы тела. Данные представлены как среднее ±SEM для каждой группы (n = 10
на группу), Р-величины соответствуют статистической разнице между группами, обработанными носителем и AMG 900, определенные с помощью RMANOVA с последующим тестом Даннета post-hoc.
Стрелка обозначает начало дозирования.
Пример 4.
Для изучения ингибирования клеточной пролиферации с помощью индуцированного AMG 900 подавления активности Aurora киназы, антиопухолевую активность AMG 900 оценивали in vivo против
таксол-резистентных опухолевых ксенотрансплантатов NCI-H460 у бестимусных мышей. Мышам вводили перорально (РО) AMG 900 BID (два раза в сутки) с интервалом или непрерывно. Мышам внутривенно
(IP) вводили паклитаксел (таксол) 5 дней в неделю. Соединение компании Amgen использовали в качестве положительного контроля в этом исследовании (данные не показаны). Опухоли измеряли дважды в
неделю. Лечение начинали на 12 день после установления опухолей. Все группы снабжались пищевыми
добавками на ежедневной основе на протяжении исследования для поддержания массы тела.
Животные и ткани
Вид/Линия: бестимусные.
Количество/Пол: 125/самки.
Средний вес: 20 - 30 г в день рандомизации.
Тип ткани: NCI-H460 таксол-резистентная.
Источник: Amgen Cancer Pharmacology Cell Bank.
Статус заболевания субъекта: Несущая опухоль мышь
Уход за животными: средства AMALAR.
Тестируемые материалы
Тестируемый продукт: AMG 900.
Производитель: Amgen Inc.
Тестируемый продукт: таксол.
Производитель: Bristol-Myers Squibb.
Основной состав реагентов
Тестируемое соединение: AMG 900.
Исходная концентрация: 1.5, 0.3 мг/мл.
Формулирование: еженедельно, использовать в течение 7 дней.
Носитель: 2% НРМС/1% TW80 рН2.2.
Доза (10 мл/кг при индивидуальной массе тела) - диапазон дозы: 0.20-0.30 мл.
Способ введения: перорально (РО).
Тестируемое соединение: таксол.
Исходная концентрация: 6 мг/мл.
Формулирование: получено от компании Burt's Pharmacy.
Производитель: Bristol-Meyer's Squibb.
Носитель: физиологический раствор.
Доза (10 мл/кг при индивидуальной массе тела) - диапазон дозы: 0.20-0.30 мл.
Способ введение: внутривенно (IP).
Составы
AMG 900 (свободное основание) готовили в виде суспензии с концентрациями 1.5 и 0.3 мг/мл. Объем доз был эквивалентен 10 мл/кг. Таксол (Bristol Meyers Squibb) приобретали от компании Burt's Pharmacy (Newbury Park, СА) и ежедневно разводили базовую концентрацию 6 мг/мл до концентрации рабочего раствора 1.25 мг/мл.
Протокол лечения
- 14 -
020526
Продолжительность периода лечения для AMG 900 составила три недели и две недели для группы
таксола. Опухоли измеряли с помощью цифрового калипера и мышей взвешивали два раза в неделю.
Объемы опухолей рассчитывали следующим образом: Объем опухоли (мм3) = [(W2 XL)/2], где ширина
(W) определена как самая маленькая из 2-х измерений и длина (L) определена как самая большая из 2-х
измерений. Ингибирование опухоли рассчитывали следующим образом: сначала брали [начальный объем опухоли минус конечный объем опухоли] для контрольной и всех лечебных групп; далее брали изменение объема обработанной опухоли, деленное на объем контрольной опухоли, минус один, и затем умножали на 100. В табл. 5 и фиг. 5 ниже представлены объем опухоли и результаты ингибирования роста
опухоли.
Таблица 5. Итоговые данные объема опухоли
Фиг. 5. Действие лечения AMG 900 и таксолом на рост установленных таксол-резистентных ксенотрансплантатов Н460.
Фиг. 5 иллюстрирует действие лечения с помощью AMG 900 и таксола на рост установленных таксол-резистентных опухолей Н460. Клетки (2×106 на животное) подкожно инъецировали в правый бок
самок бестимусных мышей (n = 10 на группу). Опухоли измеряли два раза в неделю. Лечение начинали
через 12 дней после имплантирования опухоли (стрелка), когда объем опухоли составил примерно 170
мм3. Мышей дозировали РО или PI один или два раза в день в течение 3 недель. Данные представлены
как среднее ±SE (стандартное отношение) для каждой группы. *Р значения (не показаны) соответствуют
статистической разнице между группами, обработанными носителем и AMG 900 или таксолом, анализированные при помощи дисперсионного анализа ANOVA с повторными измерениями и критерия Шеффе
в течение времени с помощью программы "STATview". Дни, предусмотренные графиком, приведены в
обозначениях, представляющих дни/неделю. Все группы снабжались пищевыми добавками на протяжении исследования.
Как показано на фиг. 5 выше, лечение несущих опухоль мышей с помощью AMG 900 значительно
ингибировало рост опухоли при непрерывном введении (3 мг/кг BID в течение 7 дней (60% ингибирования, р = 0.0003)) или с интервалами (15 мг/кг BID в течение 2 дней ON/5 дней OFF/неделю (66% ингибирования, р < 0.0001)). Таксол значительно не ингибировал рост опухоли при введении дозы 12.5 мг/кг IP
в течение 5 дней/неделю в течение двух циклов дозирования (20% ингибирования, р = 0.5399) в этом
эксперименте.
Удивительно и неожиданно было обнаружено, что AMG 900 остается активным в опухолевых клеточных линиях, которые резистентны к трем хорошо охарактеризованным ингибиторам Aurora киназы:
AZD1152; VX-680 (также называемый как MK-0457); и РНА-739358 (Данусертиб). Ингибиторы, которые
были использованы для этих экспериментов, представляют собой соединения, описанные и охарактеризованные в литературе. Например, смотри Expert Opinion Investigational Drugs (2009) 18 (4) стр. 379-398;
Expert Opinion Therapeutic Patents, (2009) 19 (3), стр. 321-356. Подробный профиль безопасности, переносимости и рК, включая химическую структуру данусертиба (РНА-739358), в фазе I у пациентов с распространенными или метастатическими солидными опухолями описаны в Steeghs et al, Journal of Clinical
Oncology, 27, 2009.
Данные, представленные ниже, показывают активность AMG 900 в таксол-резистентных клеточных
линиях в сравнении со способностью указанных выше трех хорошо известных ингибиторов Aurora киназы ингибировать фосфорилирование гистона H3 в этих же самых таксол-резистентных клетках.
Пример 5.
Три ингибитора Aurora киназы (AZD1152, MK-0457 и РНА-739358) оценивали вначале экспрессирования опухолевыми клеточными линиями MDR переносчиков, выводящих лекарственное средство, Pgp или BCRP. Неожиданно, AMG 900 ингибировал р-гистон H3 или индуцировал полиплоидию во всех
клеточных линиях, протестированных в отношении статуса P-gp или BCRP, с одинаковыми значениями
IC50 или ЕС50 (от 2 до 3 ммоль/л). В противоположность этому другие ингибиторы Aurora киназы были
менее активными в одной или нескольких клеточных линиях MDR по сравнению с отмеченными чувствительными опухолевыми клеточными линиями, как показано в табл. 6 ниже.
Материалы и методы
Составляющие материалы: молекулярная структура для следующих соединений: паклитаксел и доцетаксел, MLN8054, MK-0457, AZD1152 и РНА-739358 имеется в открытом доступе. Материалы были
получены от коммерческих источников, при наличии, также как таксаны.
- 15 -
020526
Клеточные линии: опухолевые клеточные линии были получены от компании АТСС (American
Type Culture Collection), если не указано иное. Клеточные линии MDA-MB-231-РТХ и NCI-H460-PTX
были образованы путем выращивания клеток в присутствии увеличивающихся концентраций паклитаксела в течение 6 месяцев. AZD1152-резистентная клеточная линия НСТ116 была образована путем выращивания клеток в присутствии AZD1152 при 80 ммоль/л.
Животные: все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с требованиями Национального комитета по содержанию и использованию животных (IACUC) и Министерством сельского
хозяйства США. Бестимусных самок мышей в возрасте от четырех до шести недель (Harlan Sprague Dawley) помещали в стерильные клетки и содержали в стерильных условиях. Лабораторное содержание животных предусматривало чередующиеся циклы темноты и света (по 12 ч каждый) и отвечало стандартам
Ассоциации по оценке и аккредитации условий содержания лабораторных животных (AAALAC). Пища,
вода и пищевые добавки предлагались ad libitum. Все лекарственные средства вводились исходя из индивидуальной массы тела каждой мыши.
Анализы изображения клетки на основе флуоресценции: одновременный многопараметрический
анализ выполняли на ArrayScan VTi HCS Reader (Cellomics). Опухолевые клеточные линии обрабатывали
AMG 900, AZD1152, MK-0457 или РНА-739358 (диапазон концентраций изменялся на основании активности). Клетки готовили для внутриклеточного окрашивания анти-р-гистон H3 Ser10 антителом, как описано ранее (1). Обнаружение проводили с помощью антитела anti-rabbit IgG-alexa-568 и DAPI. Клеточные
уровни р-гистона H3 анализировали с использованием алгоритма Target Activation V2 algorithm (Cellomics) для определения процента положительных клеток. Для анализов изображений кривые концентрация
- эффект и соответствующие значения IC50 и EC50 рассчитывали с использованием процентного содержания пораженных клеток по сравнению с контролем DMSO.
Анализ колониеобразования: опухолевые клетки обрабатывали AMG 900, паклитакселом или
AZD1152 (0.5, 5, 50 нмоль/л) в течение 48 ч, дважды отмывали полной средой, и заново засевали при
плотности 5000 клеток на лунку в свободную от лекарственного средства среду. Клетки выращивали до
тех пор, пока лунки с DMSO контролем не становились конфлюэнтными. Клетки окрашивали красителем кристаллическим фиолетовым (Sigma), отмывали дистиллированной водой и снимали изображение с
использованием цифрового сканера (Hewlett-Packard).
Анализ содержания ≥ 4N ДНК: опухолевые клетки обрабатывали_AMG 900, AZD1152, MK-0457
или РНА-739358 (диапазон концентрации изменялся исходя из активности) в течение 24 ч и готовили к
анализу клеточного цикла (ДНК окрашивание только), как описано ранее (1). Клетки анализировали на
LSRII проточном цитометре с использованием программного обеспечения BD FACS. Кривые концентрация - эффект и соответствующие значения ЕС50 рассчитывали с помощью процентного содержания ≥4N
ДНК в клетках по сравнению с DMSO контролем.
Окрашивание клеточной поверхности на P-gp и BCRP: экспрессию на поверхности клеток P-gp
(ABCB1) и BCRP (ABCG2) определяли путем окрашивания живых клеток на льду в течение 30 мин с
помощью FITC-конъюгированных P-gp (BD Bioscience) или АРС-конъюгированных BCRP (Millipore)
антител. Сходные по изотипу антитела (BD Bioscience) использовали в качестве контролей, а также стойкости краски 7-аминоактиномицина D (BD Biosciences) для исключения мертвых клеток. Клетки анализировали на проточном цитометре LSRII с использованием программного обеспечения BD FACS Diva.
Анализ гена aurora киназы: тотальную РНК и геномную ДНК выделяли из замороженной клеточной
массы (три AZD1152-резистентных клеточных субклона и одна контрольная родительская клетка) стандартными методами экстракции нуклеиновых кислот. Тотальную РНК использовали для синтеза кДНК
(набор "Advantage RT-PCR kit", Clontech). ПЦР-амплификацию непроцессированных транскриптов
aurora-A и -В выполняли с использованием набора "Expand-polymerase-long-template kit" (Roche). Пары
праймеров для ПЦР включали: aurora-A
(GCTTGTTACTTATTACAGCTAGAGGCATCATG и
TCAAGGATTTCTCCCCCTGCACGATTC), aurora-B
(TCTCCTCCCCCTTTCTCTCTAAGGATG и
ACCCGAGTGAATGACAGGGACCATC).
Семь экзонов aurora-C были амплифицированы с помощью такого же набора PCR, как описано выше, из геномной ДНК с использованием семи наборов праймеров на основе 5' и 3' фланкирующих интронов
((AACAGCCATCCAGAGGGTTCAGGAAG и
CCACACACCCAGTCTGTTCTTCATCC),
(AAGGGGAGCATTGGCATCCCTGACTTTC и
GTATTTGGGGAAAATGCTGGGCTCAGAC),
(ACCAGGCAGTGACGGTGGCATCATATG и
TGACAGCCACAAACAGAGCTCCCAC),
(GGTAAGTGTTCCACCTCAGACGGAAATTG и
CATTAAACTGGGTCATTCCTAACTGGTACTCAG),
- 16 -
020526
(CTCAATGAAAGCTGGGGAAGGAGAATTTCC и
AGAGGCATTGATAGTGGAAACCTCACATC), и
(ACAGTGAGACTTACAGACGCATCCTCAAG и
AGGAGAGCTCCCTGAACACACACAAAG)).
ПЦР-продукты ДНК субклонировали в вектор pCR2.1 согласно рекомендуемому производителем
протоколу (Invitrogen). Очищенные плазмиды, содержащие продукты гена aurora-A, -В и -С, подвергали
циклическому дидезокси-секвенированию с использованием фланкирующих векторных праймеров. Реакции секвенирования выполняли на автоматическом генетическом анализаторе 3730×1 DNA Analyzers
(Applied Biosystems) и результаты анализировали с использованием программного обеспечения Sequencher software (Gene Codes Corporation).
В табл. 6 проиллюстрировано проявление AMG 900 одинаковой активности во всех мультирезистентных опухолевых клеточных линиях.
Таблица 6-А
Примечание: происхождением клеточной линии NCI-H460-PTX является легкое; клеточной линией
MDA-MB-231-PTX является молочная железа, клеточной линией MES-SA D×5 является матка, и клетками RPMI-8226 являются клетки множественной миеломы.
Аналогичные эксперименты проводили с другими клеточными линиями, как показано в табл. 6-В
ниже.
Примечание: статус переносчика ABC (* = P-gp+; ** = P-gp и/или BCRP+) ND = не определено.
- 17 -
020526
Пример 6.
Кроме того, AMG 900 оценивали in vivo против клеток НСТ-116, адаптированных к росту в присутствии AZD1152, селективного ингибитора aurora В киназы. Этот эксперимент также проливал свет на
возможные альтернативные механизмы резистентности к ингибиторам aurora киназы. Таким образом,
клетки НСТ116 адаптировали к росту в присутствии AZD1152. Активность AMG 900 оценивали в родительской клеточной линии НСТ116 и AZD1152-резистентной клеточной линии.
Было обнаружено, что AMG 900 индуцирует полиплоидию и ингибирует колониеобразование сублинии НСТ116, адаптированной к росту в присутствии AZD1152. Значения EC50 для AMG 900 для клеточного содержания ≥4N ДНК составили 2 и 5 нмоль/л по сравнению с 34 и 672 нмоль/л для AZD1152,
соответственно (фиг. 6-А). AMG 900 ингибировало колониеобразование в обоих клеточных линиях
НСТ116 при концентрациях ≥5 нмоль/л, в то время как другая сублиния была нечувствительна к
AZD1152 при 50 нмоль/л (фиг. 6-В). Обе клеточные линии НСТ116 были одинаково чувствительными к
паклитакселу и были отрицательными в отношении экспрессии P-gp и BCRP (фиг. 6-С). Примечательно,
что другая сублиния НСТ116 содержит миссенс-мутацию в аллели гена aurora-B (TGG → TTG; W221L),
в то время как мутаций в генах aurora-A и -С не было обнаружено. На основании полученных результатов можно предположить, что AMG 900 сохраняет активность в опухолевых клетках, которые являются
резистентными к AZD1152 и в особенности опухолевых клетках, несущих гетерозиготную мутацию в
aurora-B, которая может быть ответственной за резистентность к AZD1152. Таким образом, неожиданные
положительные результаты указывают на удивительную способность MAG 900 сохранять эффективность при лечении опухолевых клеток, которые стали резистентными к AZD1152.
Фиг. 6. Эффект AMG 900 на родительскую клеточную линию НСТ116, AZD1152-резистентную
HCT116 клеточную линию (фиг. 6-А) и паклитаксел-резистентные клеточные линии (фиг. 6-В).
Способы.
Фиг. 6-А - клеточные линии НСТ116 обрабатывали увеличивающимися концентрациями AMG 900
или AZD1152 в течение 24 ч. Проточную цитометрию использовали для оценки накопления клеток с содержанием ≥4N ДНК, выраженным как процент обработанных DMSO контролей (РОС). Кривые концентрация-эффект и вычисленные значения EC50 были определены на основании двух независимых экспериментов (столбцы, ±SD (стандартное отклонение).
Фиг. 6-В - анализ колониеобразования выполняли с помощью клеточных линий НСТ116 (родительской и AZD1152-резистентной). Клетки обрабатывали DMSO, AMG 900, AZD1152 или паклитакселом в
указанных концентрациях в течение 48 ч и заново засевали в полную среду, не содержащую ингибитор.
После того, как DMSO-обработанные клетки достигали конфлюэнтности, клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым и снимали изображение (лунки в двух повторностях).
Фиг. 6-С - распространенность экспрессии P-gp и BCRP на клеточной поверхности клеточных линий НСТ116 (родительской и AZD1152-резистентной), совместно окрашенных фикоэритрин (РЕ)конъюгированными P-gp и аллофикоцианин (АРС)-конъюгированными BCRP антителами оценивали и
анализировали с помощью проточной цитометрии. Контрольные изотипы использовали для каждой клеточной линии для установления фона флуоресценции. Клеточные линии MES-SA-D×5 и RPMI 8226 использовали в качестве положительных контролей для экспрессии P-gp и BCRP, соответственно.
Животные: самок бестимусных мышей (Harlan Sprague Dawley) в возрасте 5-6 недель получали и
помещали в стерильные клетки. Водой, очищенной обратным осмосом, и обработанной в автоклаве пищей снабжали неограниченно. Все исследования на животных выполняли согласно внутреннему протоколу LACUC и соблюдали все требования AAALAC.
Фармакодинамические анализы (обнаружение фосфо-Гистона H3): мышам с установленными ксенотрансплантатами человеческих опухолей НСТ 116 или Colo 205 перорально вводили однократную дозу контроля (только носитель) или AMG 900 в указанном диапазоне (n = 3 животных на группу). Через 3
или 6 ч собирали опухоль, костный мозг или кожные ткани для фармакодинамической оценки (уровни ргистона H3). Также, собирали плазму для фармакокинетического анализа.
Проточная цитометрия (FCM): опухоли диссоциировали в одноклеточную суспензию и фиксировали в 90% метаноле при -20°C в течение по меньшей мере 24 ч. Клетки затем окрашивали анти-ргистоном H3 (ser-10) и антицитокератин антителами и контрокрашивали иодидом пропидия. Показатели
получали на проточном цитометре LSRII с использованием программного обеспечения FACSDiva. Костный мозг и цитокератин-положительные опухолевые клетки в G2М-фазе клеточного цикла оценивали на
р-гистон H3. Клетки опухоли и костного мозга собирали из обработанных носителем мышей, которые
получали в качестве контролей р-гистон H3. Статистическую значимость определяли с помощью анализа
ANOVA.
Сканирующая лазерная цитометрия (LSC): срезы в трех повторностях из образцов ткани FFPE (кожа и опухоль) окрашивали анти-р-гистон H3 антителом с последующим козьим антителом против кроличьего IgG, конъюгированным с Alexa-633. На срезы наносили раствор Prolong Gold antifade, включая
ДНК-краситель Hoechst33342. Изображения делали на LSC с использованием объектива 40× (при разрешающей способности 0.5 мк). Число р-гистон H3 событий определяли на основе установленного порого- 18 -
020526
вого значения красного флуоресцентного. Подсчитывали только события, которые были больше 20 мкм2.
Контурные события были перенесены в галерею изображений для верификации точности сегментирования. Данные анализировали с использованием SAS V9.3 с прилагаемой регулировкой Даннетта. Все статистические тесты оценивали при альфа = 0.05 уровне значимости.
Тонкоиголъные пунктаты (FNA): опухолевые пунктаты собирали с помощью иглы 25 калибра через
маленький надрез в коже, окружающей опухоль, в предварительно установленном и соответствующем
паттерне (3×), затем вытесняли в 2% параформальдегид. Клетки наносили на предметное стекло микроскопа и окрашивали антителами, специфичными к ЕрСАМ (эпителиальный опухолевый маркер, Alexa
Fluor 488) и рНН3 (маркер митоза, Alexa 647), и контрокрашивали DAPI (содержание ДНК). iCyte LSC
(лазеры 405 нм, 488 нм, 633 нм, РМТ фильтры: 450/40, 530/30, 650/LP) использовали для получения изображений с увеличением 40× и количественного определения содержания ЕрСАМ, рНН3 и ДНК. Целостность популяции устанавливали путем перемещения изображений клеток в галереи. Представлено количество клеток, положительных по ЕрСАМ, рНН3, в G2M. Данные представлены как среднее +/- стандартная ошибка среднего (SEM). Статистическую значимость определяли с использованием ANOVA с
помощью апостериорного (post hoc) анализа методом Бонферрони и Даннета.
Концентрация AMG 900 в плазме (фармакокинетический анализ): образцы плазмы (50 мкл) экстрагировали путем добавления смеси растворителя (90% метанола, 10% воды с 0.01% трифторуксусной кислотой) для изолирования аналита и осаждения белков плазмы. Концентрации AMG 900 в экстрагированных образцах определяли методом LC-MS/MS с использованием обращено-фазовой хроматографии
на аналитической колонке Varian Pursuit PFP (2.0×30 мм, 5 микрон) с помощью 0.1% муравьиной кислоты в воде (подвижная фаза А) и ацетонитрила с 0.1% муравьиной кислотой (подвижная фаза В).
Модели ксенотрансплантатов: мышей инъецировали подкожно 2×106 человеческих опухолевых
клеток ободочной кишки НСТ 116. После установления опухолей (примерно 200 мм3) мышей рандомизировали в экспериментальные лечебные группы (n = 10) и перорально обрабатывали AMG 900 в дозе
1.5, 2.25 или 3 мг/кг ежедневно, либо 3.75, 7.5 или 15 мг/кг с интервалами на протяжении эксперимента.
Мышей снабжали пищевыми добавками на ежедневной основе. Объемы опухолей и массу тела записывали два раза в неделю с помощью калипера и аналитических цифровых весов, соответственно. Данные
по опухоли представлены как средний объем опухоли +/- SEM (среднее стандартное отклонение). Статистическую значимость для ингибирования роста опухоли определяли с помощью повторных экспериментов ANOVA (RMANOVA) с последующим post-hoc анализом Шеффе.
Пример 7.
Кроме того, действие in-vivo AMG 900 на рост опухоли оценивали на панели человеческих ксенотрансплантатов пяти разных типов опухолей (молочная железа, ободочная кишка, легкое, поджелудочная железа и матка), включая модели ксенотрансплантата MDR. Мышам, несущим установленные
опухоли, вводили перорально AMG 900 в дозе 15 мг/кг BID в течение 2 последовательных дней в неделю
в течение 3 недель или при 3 мг/кг BID каждый день в течение 3 недель. Максимальный процент ингибирования роста опухоли (TGI) представлен в табл. 7 ниже для каждой модели ксенотрансплантата. Процент TGI рассчитывали как разность между изменением объемов опухолей, обработанных носителем
контролей и AMG 900 за период исследования. Статистическую значимость ингибирования роста опухоли по сравнению с обработанным носителем контролем определяли с помощью RMANOVA с последующими апостериорными тестами Шиффа или Данетта и обозначали звездочкой (*Р < 0.005, **Р <
0.0005).
AMG 900 проявил значительную противоопухолевую активность во всех 9 моделях ксенотрансплантатов (от 50 до 97% ингибирования роста опухоли (TGI)) по сравнению с обработанной носителем
контрольной группой. Примечательно, что AMG 900 был активным в моделях ксенотрансплантатов
MES-SA-D×5 (84% TGI, P < 0.0001) и NCI-H460-PTX (66% TGI, Р < 0.0001), которые были резистентными к доцетакселу или паклитакселу, введенным в соответствующих максимально переносимых дозах.
Таким образом, AMG 900 ингибирует рост многих человеческих опухолевых ксенотрансплантатов
in vivo, включая мультирезистентные модели и стандартные антимитотические лекарственные агенты. В
частности, данные показывают, что AMG 900 удивительный образом ингибирует активность aurora-B в
опухолях НСТ 116 и подавляет рост множества ксенотрансплантатов, представляющих разные типы
опухолей.
- 19 -
020526
Таблица 7
Ссылки: Payton M., Chung G., Yakowec P., et al. Discovery and evaluation of dual CDK1 and CDK2 inhibitors. Cancer Res, 2006, 66:4299-4308.
Показания
Механизм, посредством которого опухоли развивают устойчивость к ингибиторам Aurora киназы,
различается для разных агентов. В то время как более четкое понимание молекулярных сил, которые
управляют фенотипами рака, будет обеспечивать основу для действия лекарственных средств на молекулярном уровне или терапий, в которых могут использовать идентифицируемые генетические или эпигенетические чувствительности к назначенной терапии, также важно понимать генетическую предрасположенность к резистентности к терапии. Это понимание генетической предрасположенности может являться дополнительным критерием разделения групп пациентов для проспективного исследования. Например, опубликованные наследственные проявления показывают, что ингибитор Aurora киназы,
AZD1152, который в настоящее время проходит клиническую оценку, и потенциальное второе клиническое соединение, VX-680, могут быть относительно неэффективными в опухолевых клетках, которые
гиперэкспрессируют MDR1 или BCRP. Мутации в домене Aurora киназы В, которые возникают во время
отбора ДНК-репарационно-дефектной клеточной линии карциномы ободочной кишки НСТ116, могут
привести к резистентности. Было обнаружено, что эти мутации в каталитическом домене также являются
достаточными для того, чтобы сделать клетки резистентными к AZD1152 и VX-680, что указывает на то,
что устойчивость к этим агентам может возникнуть независимо от MDR. The Pharmacogenomics Journal,
(2009) 9, pgs 90-102.
Настоящее изобретение предлагает соединение AMG 900, ингибитор Aurora киназы, которое обладает способностью лечить рак, который стал рефрактерным к традиционным стандартным химиотерапевтическим агентам, включающим антимитотические средства, такие как таксаны (паклитаксел и доцетаксел), и алкалоиды барвинка. Кроме того, AMG 900 обладает способностью лечить рак, который является резистентным к другим ингибирующим Aurora киназу агентам, включающим, но без ограничения,
AZD 1152, VX-680 и РНА-739358. В целом, такие опухоли развивают резистентность в результате более
раннего и/или пролонгированного лечения противораковыми агентами.
Соответственно, в одном варианте изобретения предложен способ лечения рака у субъекта, который предусматривает введение субъекту эффективного количества соединения, N-(4-((3-(2-амино-4пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина, при этом лечение рака
у субъекта производилось ранее противораковыми агентами. В другом варианте противораковым агентом является химиотерапевтический агент. В другом варианте химиотерапевтическим агентом является
антимитотическое средство или антрациклин. В еще другом варианте химиотерапевтическое средство
выбрано из группы, состоящей из таксола, децетаксела, винкристина, винбластина, виндестина, а также
винорелбина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, эпирубицина и митоксантрона. В еще другом варианте противораковым агентом является AZD1152, РНА-739358, MK-0457 или их комбинация.
Таким образом, AMG 900 может применяться для лечения клеточных пролиферативных нарушений, включающих неконтролируемый клеточный рост и аберрантную регуляцию клеточного цикла, лечение которых производилось ранее стандартными терапиями с помощью таксанов.
- 20 -
020526
Таким образом, AMG 900 является эффективным, но без ограничения, для предупреждения или лечения рака, включающего, например, разные солидные и гематологические опухоли, такие как карцинома, включая без ограничения рак мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почек, печени,
легкого (включая мелкоклеточный рак легкого), пищевода, желчного пузыря, яичника, поджелудочной
железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы, предстательной железы, матки и кожи (включая
плоскоклеточную карциному); гематопоэтические опухоли лимфоидной линии (включая лейкоз, острый
лимфоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому,
лимфому Ходжкина, неходжскинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому и лимфому Буркетта);
гематопоэтические опухоли миелоидной линии (включая острые и хронические миелогенные лейкозы
(AML и CML), миелодиспластический синдром и промиелоцитарный лейкоз); опухоли мезенхимального
происхождения (включая фибросаркому и рабдомиосаркому и другие саркомы, например, мягких тканей
и костей); опухоли центральной и периферической нервной системы (включая астроцитому, нейробластому, глиому и невриному); и другие опухоли (включающие меланому, семиному, тератокарциному,
остеосаркому, пигментную ксеродерму, фиброкератому, фолликулярный рак щитовидной железы и саркому Капоши), при этом такие виды рака рецидивировали или становились рефрактерными. Рак, такой
как рак предстательной железы, рак яичника, рак легкого, рак молочной железы, холангиокарцинома или
другие виды рака, которые стали рефрактерными к противораковой терапии, такой как гормоны, также
можно лечить с помощью AMG 900.
В одном варианте изобретение предлагает способ лечения одного или нескольких видов рака, выбранных из группы, состоящей из рака матки, рака молочной железы, рака легкого, включая немелкоклеточный рак легкого, рака ободочной кишки, рака предстательной железы, рака кожи, рака почки, рака
печени, лейкоза, включая промиелоцитарный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз и Т-клеточный
лейкоз, множественной миеломы, рака яичника и рака костного мозга у субъекта, при этом способ предусматривает введение субъекту эффективного количества AMG 900, при этом ранее производилось лечение рака у субъекта и он стал рефрактерным к одному или нескольким химиотерапевтическим агентам,
выбранным из группы, состоящей из доксорубицина, даунорубицина, дактиномицина, колхицина, винбластина, винкристина, паклитаксела, доцетаксела, этопозида и митоксантрона. В другом варианте изобретения предложен способ лечения одного или нескольких видов рака, выбранных из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, немелкоклеточного рака легкого, головы и шеи, пищевода, ЖКТ, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки
матки, щитовидной железы и предстательной железы, или лимфомы, или лейкоза. AMG 900 также является эффективным для лечения опухолей на поздней стадии, включающих без ограничения опухоли мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, немелкоклеточного рака
легкого, головы и шеи, пищевода, ЖКТ, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и предстательной железы.
Изобретение также предлагает способ лечения солидных опухолей, саркомы (в особенности саркомы Юинга и остеосаркомы), ретинобластомы, рабдомиосаркомы, нейробластомы, гематологических злокачественных заболеваний, включающих лейкоз и лимфому, опухоль-индуцированного плеврита или
перикардиального выпота и злокачественного асцита.
Помимо эффективности в лечении человека соединение также является эффективным для ветеринарного лечения домашних животных, экзотических животных и сельскохозяйственных животных,
включая млекопитающих, грызунов и подобных. Например, с помощью AMG 900 можно аналогично
лечить рак, рефрактерный к стандартному лечению химиотерапиями, у животных, включающих лошадей, собак и кошек.
Составы
AMG 900 может вводиться субъектам, имеющим рак, в виде фармацевтической композиции, содержащей соединение (которое представляет собой активный фармацевтический ингредиент или API
изобретения),
N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1фталазинамин, в сочетании с одним или несколькими нетоксическими, фармацевтически приемлемыми
носителями, разбавителями и/или адъювантами (совместно называемые здесь как "вспомогательные"
материалы). AMG 900 или его фармацевтически приемлемая соль может быть обработана известными в
фармацевтике стандартными способами для получения лекарственных и фармацевтических композиций
для введения пациентам, включающим человека и других млекопитающих.
Фармацевтическую композицию можно вводить субъекту любым подходящим путем, адаптированным к такому способу, и в дозе, эффективной для лечения рефрактерного рака. Композицию или API
можно вводить, например, перорально, мукозально, местно, ректально, пульмонально, например, путем
ингаляции распыления, или парентерально, включая внутриваскулярное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, внутримышечное, внутригрудинное введение и способы инфузии, в виде стандартной лекарственной формы, содержащей традиционные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители.
Для перорального введения фармацевтическая композиция может находиться в форме, например,
таблетки, капсулы, суспензии или жидкости. Фармацевтическую композицию предпочтительно готовят в
- 21 -
020526
форме дискретной единицы, содержащей конкретное количество активного ингредиента. Примерами
таких дискретных единиц являются таблетки или капсулы. Например, они могут содержать количество
активного ингредиента примерно от 1 до 2000 мг и, как правило, примерно от 1 до 500 мг. Подходящие
ежедневные дозы для человека или другого млекопитающего могут изменяться в зависимости от состояния пациента и других факторов, но еще раз могут быть определены обычными способами и практиками.
Количество вводимого API (AMG 900) и режим дозирования для лечения рефрактерного рака зависят от ряда факторов, включая возраст, массу, пол и состояние здоровья субъекта, вид заболевания, тяжесть рака, способ и частоту введения, а также физических и химических свойства AMG 900 или его
конкретной формы, включая конкретную форму соли. Таким образом, режим дозирования может различаться. Может быть подходящей суточная доза от 0.01 до 500 мг/кг, предпочтительно от 0.01 до 50 мг/кг,
более предпочтительно примерно от 0.1 до 30 мг/кг и еще более предпочтительно примерно от 0.1 до 25
мг/кг массы тела. В одном варианте в изобретении предложен способ лечения рака у субъекта, который
предусматривает введение субъекту AMG 900 или его фармацевтически приемлемой соли в эффективной дозе в интервале примерно от 0.5 мг/кг до 25 мг/кг, при этом рак у субъекта является рефрактерным
к лечению антимитотическим агентом. В другом варианте в изобретении предложен способ лечения рака
у субъекта, который предусматривает введение субъекту AMG 900 или его фармацевтически приемлемой соли в эффективной дозе в интервале примерно от 1.0 мг/кг до 20 мг/кг, при этом рак субъекта является рефрактерным к лечению стандартным химиотерапевтическим агентом, включающим антимитотический агент. В еще другом варианте в изобретении предложен способ лечения рака у субъекта, который
предусматривает введение субъекту AMG 900 или его фармацевтически приемлемой соли в эффективном количестве в интервале примерно от 3.0 мг/кг до 15 мг/кг, при этом рак субъекта является рефрактерным к лечению антимитотическим агентом. Суточная доза может быть введена в виде одной-четырех
доз в сутки.
Для терапевтических целей AMG 900 можно объединить с одним или несколькими адъювантами
или "эксипиентами", подходящими для указанного способа введения. При введении на основе разовой
дозы AMG 900 может быть смешан с лактозой, сахарозой, крахмальным порошком, сложными эфирами
целлюлозы и алкановых кислот, целлюлозными алкиловыми сложными эфирами, тальком, стеариновой
кислотой, стеаратом магния, оксидом магния, натриевыми и кальциевыми солями фосфорной и серной
кислот, желатином, аравийской камедью, альгинатом натрия, поливинилпирролидоном, и/или поливиниловым спиртом для получения конечного состава. Например, AMG 900 и адъювант(ы) могут быть таблетированы или инкапсулированы известными и признанными способами для удобного введения. Примерами подходящих составов являются без ограничения пилюли, таблетки, мягкие и твердые гелевые капсулы, пластинки, орально-растворимые формы и составы с замедленным или контролируемым высвобождением. В частности, составы в виде капсул или таблеток могут содержать один или более агентов с
контролируемым высвобождением, таких как гидроксипропилметилцеллюлоза, в виде дисперсии с API.
В случае псориаза и других кожных заболеваний может быть предпочтительным наносить составы
AMG 900 для местного применения на область воздействия от двух до четырех раз в сутки. Составы,
подходящие для местного введения, включают жидкие или полужидкие составы, подходящие для проникновения через кожу (например, линименты, лосьоны, мази, кремы, пасты, суспензии и подобные), а
также капли, подходящие для введения в глаза, уши или нос. Подходящие дозы активного ингредиента
для местного введения составляют от 0.1 мг до 150 мг, вводимые от одного до четырех, предпочтительно
один или два раза в день. Для местных введений API может содержать от 0.001 до 10 мас.%, например,
от 1 до 2 мас.% состава, хотя может содержать до 10 мас.%, но предпочтительно не больше чем 5 мас.%
и более предпочтительно от 0.1 до 1 мас.% состава.
При изготовлении в виде мази AMG 900 может быть использован либо с парафиновой, либо со
смешиваемой с водой мазевой основой. Или же, AMG 900 может быть формулирован в виде крема на
основе эмульсии типа "масло-в-воде". При необходимости водная фаза основы для крема может включать, например, по меньшей мере 30 мас.% многоатомного спирта, такого как пропиленгликоль, бутан1,3-диол, маннит, сорбит, глицерин, полиэтиленгликоль и их смеси. Препараты для местного применения
при желании могут включать соединение, усиливающее абсорбцию или проникновение активного ингредиента через кожу или другие области воздействия. Примеры таких агентов, усиливающих проникновение через кожу, включают DMSO и родственные аналоги.
AMG 900 также может вводиться посредством трансдермального устройства. Местное введение
предпочтительно осуществлять, используя пластырь либо резервуарного и пористо-мембранного типа,
либо твердо-матричного типа. В обоих случаях AMG 900 непрерывно высвобождается из резервуара или
микрокапсулы через мембрану в проницаемый для активного агента адгезив, который находится в контакте с кожей или слизистой оболочкой реципиента. Если AMG 900 абсорбируется через кожу, то реципиенту вводят контролируемое или предварительно определенное количество AMG 900. В случае микрокапсул инкапсулирующий агент может также действовать как мембрана.
Масляная фаза эмульсий может быть составлена из известных ингредиентов известным способом.
Хотя эта фаза может содержать только эмульгатор, она может также содержать смесь по меньшей мере
одного эмульгатора с жиром или маслом, либо и с жиром, и с маслом. Предпочтительно гидрофильный
- 22 -
020526
эмульгатор входит в состав вместе с липофильным эмульгатором, который действует как стабилизатор.
Также предпочтительно включать и масло, и жир. Эмульгатор(ы) вместе со стабилизатором(ами) или без
них образуют так называемый эмульгирующий воск, и этот воск вместе с маслом и жиром составляет так
называемую эмульгирующую мазевую основу, которая образует масляную, дисперсную фазу кремовых
препаратов. Эмульгаторы и стабилизаторы эмульсий, подходящие для использования в препарате, включают, например, Твин 60, Спан 80, цетостеариловый спирт, миристиловый спирт, глицерилмоностеарат,
лаурилсульфат натрия, глицерил дистеарат, по отдельности или с воском, или другими материалами,
хорошо известными в данной области.
Выбор подходящих масел или жиров для состава основан на достижении желаемых косметических
свойств, поскольку растворимость API в большинстве маслах, пригодных для использования в фармацевтических эмульсионных препаратах, крайне низка. Таким образом, крем предпочтительно должен
быть непачкающим, неокрашивающим и смываемым продуктом с подходящей консистенцией, чтобы
избежать вытекания из тюбиков или других контейнеров. Могут быть использованы прямые или разветвленные одно- или двухосновные алкиловые сложные эфиры, такие как диизодипат, изоцетилстеарат,
диэфир пропиленгликоля и кокосовых жирных кислот, изопропилмиристат, децилолеат, изопропилпалмитат, бутилстеарат, 2-этилгексилпалмитат, или смесь сложных эфиров с разветвленной цепью. Они могут быть использованы по отдельности или в комбинации, в зависимости от требуемых свойств. Или же
могут быть использованы липиды с высокой температурой плавления, такие как белый мягкий парафин
и/или вазелиновое масло, или другие минеральные масла.
Кроме того, составы, подходящие для местного введения в глаза, включают глазные капли, где активные ингредиенты растворены или суспендированы в подходящем носителе, особенно в водном растворителе для AMG 900. AMG 900 предпочтительно присутствует в таких составах в концентрации от
0.5 до 20%, предпочтительно от 0.5 до 10% и особенно предпочтительно примерно 1.5 мас.%.
Составы для парентерального введения могут быть в форме водных или неводных изотонических
стерильных инъекционных растворов или суспензий. Эти растворы и суспензии могут быть приготовлены из стерильных порошков или гранул, содержащих один или несколько носителей или разбавителей,
упомянутых для применения в составах для перорального введения, или с использованием других пригодных диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Например, AMG 900
может быть растворен в воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, кукурузном масле, хлопковом масле, арахисовом масле, кунжутном масле, бензиловом спирте, хлориде натрия, траганте и/или различных буферах. Другие адъюванты и способы введения хорошо и широко известны в фармацевтической области. AMG 900 также можно вводить путем инъекции в виде композиции, где в качестве подходящего носителя могут быть использованы, например, физиологический раствор, декстроза или вода,
или циклодекстрин (например, капситол), солюбилизаторы для сорастворителя (например, пропиленгликоль), солюбилизаторы мицелл (например, Твин 80).
Стерильный инъекционный состав может представлять собой стерильный инъекционный раствор
или суспензию в нетоксичном, приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые
могут быть использованы, можно упомянуть воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида
натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно используются
стерильные нелетучие жирные масла. Для этой цели может быть использовано любое нелетучее масло,
включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в приготовлении инъекционных составов
находят применение такие жирные кислоты, как олеиновая кислота.
Для ингаляционного введения фармацевтическая композиция может вводиться в форме аэрозоля
или с помощью ингалятора, включающего сухой порошковый аэрозоль.
Суппозитории для ректального введения лекарственного средства могут быть приготовлены путем
смешивания лекарственного средства с подходящим нераздражающим вспомогательным веществом,
таким как кокосовое масло и полиэтиленгликоли, которое является твердыми при обычной температуре,
но жидким при ректальной температуре и, следовательно, будет расплавляются в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства.
Фармацевтические композиции могут подвергаться обычным фармацевтическим процедурам, таким как стерилизация, и/или могут содержать обычно используемые адъюванты, такие как консерванты,
стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, буферы и подобные. Таблетки и пилюли дополнительно могут содержать энтеросолюбильные покрытия. Такие композиции могут также содержать адъюванты, такие как смачивающие агенты, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы.
Комбинации
Несмотря на то что AMG 900 можно дозировать или вводить в виде единственного активного фармацевтического агента, его также можно применять в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими и/или антимитотическими агентами. При введении в виде комбинации, AMG 900 может
быть формулирован в виде отдельных композиций, вводимых одновременно или последовательно в разные моменты времени, или AMG 900 может быть введен в виде индивидуальной композиции.
Выражение "котерапия" (или "комбинаторная терапия") относится к применению AMG 900 на- 23 -
020526
стоящего изобретения и другого химиотерапевтического агента, и предусматривает введение каждого
агента последовательно в режиме, который будет обеспечивать благоприятное действие лекарственной
комбинации, и, кроме того, предусматривает совместное введение этих агентов главным образом последовательно, например, в виде одной капсулы, содержащей фиксированное соотношение этих активных
агентов, или в виде нескольких отдельных капсул для каждого агента.
В частности, введение AMG 900 можно сочетать с дополнительным химиотерапевтическим агентом, включая антимитотические терапии, известные опытным специалистам для предупреждения или
лечения рака. Изобретение не ограничено в отношении последовательности введения, а именно, AMG
900 может вводиться до, одновременно или после введения известного противоракового или антимитотического агента.
Перечисленное выше является только иллюстрацией изобретения и не предполагает ограничения
изобретения описанными применениями. Варианты и изменения, которые являются простыми для опытного в данной области специалиста, находятся в рамках объема и сущности изобретения, которые определены в прилагаемой формуле. Все указанные ссылки, патенты, заявки и публикации включены здесь
полностью в виде ссылки.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение соединения N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4метил-2-тиенил)-1-фталазинамина или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака у субъекта, при этом рак у субъекта является рефрактерным к лечению противораковым агентом.
2. Применение по п.1, в котором противораковым агентом является химиотерапевтический агент.
3. Применение по п.2, в котором химиотерапевтическим агентом является агент, выбранный из
группы, состоящей из антимитотического агента и антрациклина.
4. Применение по п.2, в котором химиотерапевтическим агентом является агент, выбранный из
группы, состоящей из таксола, доцетаксела, винкристина, винбластина, виндезина, а также винорелбина,
даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, эпирубицина и митоксантрона.
5. Применение по п.1, в котором противораковым агентом является AZD1152, РНА-739358, MK0457 или их комбинация.
6. Применение по любому пп.1-5, в котором рак представляет собой один или несколько из (а) солидных или гематологических опухолей, выбранных из рака мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, мелкоклеточного рака легкого, пищевода, желчного пузыря, яичника, поджелудочной железы, желудка, матки, щитовидной железы, предстательной железы и кожи, (b)
гематопоэтических опухолей лимфоидной линии, выбранных из лейкоза, острого лимфоидного лейкоза,
острого лимфобластного лейкоза, В-клеточной лимфомы, Т-клеточной лимфомы, лимфомы Ходжкина,
неходжскинской лимфомы, волосатоклеточной лимфомы и лимфомы Беркитта, (с) гематопоэтических
опухолей миелоидной линии, выбранных из острого и хронического миелогенного лейкоза, миелодиспластического синдрома и промиелоцитарного лейкоза, (d) опухолей мезенхимального происхождения,
выбранных из фибросаркомы и рабдомиосаркомы, (е) опухолей центральной и периферической нервной
системы, выбранных из астроцитомы, нейробластомы, глиомы и шваномы или (f) меланомы, семиномы,
тератокарциномы, остеосаркомы, пигментной ксеродеромы, кератоакантомы, фолликулярного рака щитовидной железы или саркомы Капоши.
7. Применение по любому пп.1-5, в котором рак представляет собой одну или несколько из солидных опухолей, выбранных из рака мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени,
легкого, немелкоклеточного рака легкого, головы и шеи, пищевода, ЖКТ, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и предстательной железы, или лимфомы, или лейкоза.
8. Применение по любому пп.1-5, в котором рак представляет собой рак предстательной железы,
рак яичников, рак молочной железы, холангиокарциному, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз или их комбинацию.
9. Применение соединения N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4метил-2-тиенил)-1-фталазинамина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления лекарственного средства для лечения рака, рефрактерного к лечению противораковыми агентами.
10. Применение по п.9 для приготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного
из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки, рака почки, рака печени, рака
легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака головы и шеи, рака пищевода, рака ЖКТ, рака яичника,
рака поджелудочной железы, рака желудка, рака матки, рака щитовидной железы, рака предстательной
железы, лимфомы, лейкоза, множественной миеломы или их комбинации, при этом рак является рефрактерным к лечению противораковым агентом.
11. Применение по п.9 для уменьшения размера солидной опухоли у субъекта, при этом лечение
опухоли у субъекта ранее производили химиотерапевтическим агентом, выбранным из группы, состоящей из паклитаксела, доцетаксела, доксорубицина и алкалоида барвинка.
12. Применение по п.9, в котором противораковым агентом является химиотерапевтический агент,
- 24 -
020526
выбранный из группы, состоящей из антимитотического агента и антрациклина.
13. Применение по п.9, в котором противораковым агентом является химиотерапевтический агент,
выбранный из группы, состоящей из таксола, доцетаксела, винкристина, винбластина, виндезина, а также
винорелбина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, эпирубицина и митоксантрона.
14. Применение по п.9, в котором противораковый агент представляет собой AZD1152, РНА739358, MK-0457 или их комбинацию.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 25 -
020526
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
- 26 -
020526
Фиг. 6
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 27 -