На правах рукописи ИЛАТОВСКАЯ Мария Евгеньевна Участие
реклама
На правах рукописи ИЛАТОВСКАЯ Мария Евгеньевна Участие эндотелина-1 в развитии реноваскулярной гипертензии у крыс с интактными семенниками и у гонадэктомированных половозрелых самцов 03.03.01 – физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (заведующий кафедрой – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский). Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Медведева Наталия Александровна доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Мальков Павел Георгиевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова Кошелев Владимир Борисович доктор биологических наук, главный научный Завалишина Лариса сотрудник ФГБУ «Российский центр судебно- Эдуардовна медицинской экспертизы Минздрава России» Ведущая организация: ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН Защита состоится 2 декабря 2013 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1. С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова. Автореферат разослан 2 ноября 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Б.А. Умарова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Изучение механизмов патогенеза артериальной гипертонии является актуальной проблемой как для физиологии и патофизиологии сердечнососудистой системы, так и для клинических исследований. Формирование повышенного артериального давления представляет собой многофакторный процесс, однако принято считать, что в подавляющем числе случаев гипертензия обусловливается и связана с почечной патологией. Согласно современным представлениям, эндотелиальная выстилка сосудов представляет собой эндокринный орган, изменение секреторного фенотипа которого является одним из звеньев многих заболеваний сердечнососудистой системы. Одним из синтезируемых эндотелием веществ является эндогенный пептид эндотелин-1 (ЭТ-1) – мощный вазоконстрикторный, провоспалительный и профибротический фактор. Большие количества ЭТ-1 синтезируют и почки [Wilkes B.M. и др., 1991], где этот пептид, действуя паракринно, может индуцировать фиброзно-склеротические процессы. Dhaun N. и соавторы [2009] показали, что уровень экскреции ЭТ-1 увеличивается пропорционально тяжести почечной недостаточности. В связи с этим возрос интерес к ингибиторам системы эндотелина, в том числе, ингибиторам эндотелинпревращающего фермента, как к ренопротективным и гипотензивным препаратам [Kuruppu S., Rajapakse N.W., Smith A.I., 2013]. С другой стороны, почечный синтез ЭТ-1 в медуллярном слое может иметь адаптивное значение, поскольку стимулирует диуретические и натриуретические реакции [Kohan D.E. и др., 2011]. Одно из первых предположений о физиологической значимости почечного ЭТ-1 было высказано, когда обнаружили сниженный уровень экскреции пептида при эссенциальной гипертензии, особенно у пациентов с солезависимыми формами заболевания [Hoffman A. и др., 1994]. Применение блокаторов рецепторов эндотелина в остром эксперименте на наркотизированных крысах [Vassileva I., Mountain C., Pollock D., 2003] подтвердило натриуретические эффекты ЭТ-1, 3 опосредованные синтезом оксидом азота. А эксперименты на мышах с избирательно нокаутированным геном предшественника ЭТ-1 в собирательной трубке почек позволили высказать предположение о стимулирующем действии этого пептида на диурез, причем выведенная линия мышей имела повышенное артериальное давление [Ge Y. и др., 2005; Strait K., Stricklett P., Kohan D., 2007]. В связи с неудачными клиническими испытаниями ряда блокаторов эндотелиновых рецепторов, в том числе, связанными с возникновением отеков и анемии при их использовании [Kirkby N.S. и др., 2008], актуальной задачей является более глубокое изучение осморегулирующей и диуретической роли ЭТ-1 при патологиях почек, приводящих к повышению артериального давления. Кроме того, экспериментальные данные свидетельствуют, что система ЭТ-1 в почках имеет половые особенности как на уровне рецепторов, так и на уровне синтеза ЭТ-1. Показано, что системный и почечный синтез ЭТ1 может увеличиваться под влиянием тестостерона [Polderman K. и др., 1993; Yanes L., Sartori-Valinotti J., Reckelhoff J., 2008]. В связи с этим, актуальной задачей является изучение влияния мужского полового гормона тестостерона на участие ЭТ-1 в регуляции почечной функции в норме и при патологии, приводящей к увеличению системного артериального давления. В качестве модели реноваскулярной гипертонии, индуцированной снижением объемрегулирующей функции почки, в экспериментах на животных используют модель “одна почка, один зажим” [Liard J.-F. и др., 1974]. С учетом предполагаемых диуретических функций ЭТ-1 в почках, данная модель является адекватной и была использована в настоящей работе. Цели и задачи исследования В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось изучение роли ЭТ-1 в развитии реноваскулярной гипертензии (модель “одна почка, один зажим”) с помощью хронического применения ингибитора синтеза ЭТ-1 в экспериментах на крысах с интактными и удаленными семенниками. 4 Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить влияние хронического применения ингибитора эндотелинпревращающего фермента (ЭПФ) на динамику артериального давления при развитии гипертензии у крыс с интактными или удаленными семенниками. 2. Проанализировать изменения системной концентрации ЭТ-1 в крови и экскреции ЭТ-1 с мочой при развитии гипертензии у крыс с интактными или удаленными семенниками и влияние хронического применения ингибитора ЭПФ на эти параметры. 3. Изучить гистологические (гистоархитектоники клубочкового изменения аппарата почки ткани и почки эндотелин- индуцированного фиброза) у крыс с интактными или удаленными семенниками при применении ингибитора ЭПФ на фоне развития гипертензии. 4. Изучить механизмы влияния хронического применения ингибитора ЭПФ на показатели осморегуляции (осмоляльность и ионный состав крови, осмоляльность мочи, суточные объемы потребления воды и мочевыделения) у крыс с интактными или удаленными семенниками с гипертензией. Научная новизна работы В представленной диссертационной работе впервые в хроническом эксперименте на крысах эндогенного почечного была показана эндотелина-1, антигипертензивная на модели функция объем-зависимой реноваскулярной гипертонии. У животных с интактными семенниками и у кастрированных крыс с почечной гипертензией было показано значительное увеличение экскреции эндотелина-1, что свидетельствует об увеличении его синтеза. Применение ингибитора ЭПФ приводило к уменьшению экскреции ЭТ-1 и потенциации артериальной гипертонии у животных с интактными семенниками, а у кастрированных животных эффекта выявлено не было, что говорит о наличии взаимосвязи между уровнем содержания тестостерона и почечным синтезом эндотелина-1. В исследовании на бодрствующих крысах было проведено сравнение комплекса осморегуляторных эффектов применения 5 ингибитора эндотелинпревращающего фермента у половозрелых и кастрированных самцов крыс на фоне гипертензии. Было показано, что ингибитор ЭПФ у гипертензивных крыс с интактными семенниками вызывает увеличение осмоляльности крови. У кастрированных крыс ингибитор ЭПФ не приводил к изменениям осморегуляции. Полученные результаты расширяют представления об эффектах ингибиторов эндотелинпревращающего фермента и свидетельствуют об отличиях механизмов участия эндотелина-1 при развитии реноваскулярной гипертензии у половозрелых самцов крыс в зависимости от наличия или отсутствия семенников. Теоретическая и практическая значимость работы В работе было показано, что хроническое применение ингибитора ЭПФ способно селективно снижать содержание ЭТ-1 в плазме крови или его экскрецию с мочой, которая является общепринятым показателем синтеза ЭТ-1 в почках. Степень активации системы эндотелина, наличие или отсутствие семенников, развитие реноваскулярной гипертензии приводило к изменению селективности действия ингибитора. Это свойство использованного в работе ингибитора может иметь перспективы при терапии и изучении патогенеза заболеваний, сопровождаемых увеличением синтеза ЭТ-1 в почках. Гонадэктомия половозрелых самцов крыс, представляющая собой модель возрастного снижения продукции тестостерона, позволила выявить влияние тестостерона на систему почечного эндотелина. Отсутствие эффекта ингибитора ЭПФ на почечный синтез ЭТ-1 может свидетельствовать об изменении ферментативного пути синтеза этого регулятора у самцов на фоне гонадэктомии. Это может иметь значение при изучении и разработке фармакологических препаратов для снижения синтеза ЭТ-1 у пожилых мужчин. Положения, выносимые на защиту: 1. Применение ингибитора ЭПФ на фоне развития реноваскулярной гипертензии оказывало различное воздействие на почечную экскрецию ЭТ-1 у половозрелых крыс в зависимости от наличия или отсутствия семенников. 6 2. Прогипертензивное действие ингибитора ЭПФ у самцов с реноваскулярной гипертензией и интактными семенниками возникало вследствие снижения почечного синтеза ЭТ-1, о чем говорит уменьшение экскреции ЭТ-1 с мочой. 3. Хроническое применение ингибитора ЭПФ, приводящее к уменьшению синтеза ЭТ-1 в почке, вызывало дисбаланс осморегуляции у гипертензивных крыс интактными семенниками, что могло лежать в основе его прогипертензивного действия. Апробация результатов исследования Основные положения диссертации были представлены на конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов», посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.П. Ашмарина (Россия, Москва, 2010), на XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Россия, Калуга, 2010); 21st European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Prevention (Italy, Milan, 2011); 23rd European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Prevention (Italy, Milan, 2013); ERA-EDTA (European Renal Association European Dialysis and Transplant Association) 50th Congress (Turkey, Istanbul, 2013); на XXII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Россия, Волгоград, 2013); в виде устных сообщений на XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых ЛОМОНОСОВ-2012 (Россия, Москва, 2012) и на VIII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, Россия, 2012). Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи - в отечественных научных журналах, рекомендуемых ВАК, и 8 тезисов докладов – в сборниках материалов отечественных и международных конференций. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 154 страницах и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, результаты, обсуждение, выводы, 7 список цитируемой литературы (содержит 232 источника, в том числе 8 опубликовано в отечественных изданиях). Работа иллюстрирована 46 рисунками и содержит 35 таблиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Все исследования были проведены в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным. Моделирование реноваскулярной гипертензии «одна почка, один зажим» и деление животных на экспериментальные группы В исследование брали половозрелых самцов стока Wistar массой 200-250 г, часть из которых подвергали кастрации, а вторую часть делили на 4 группы. Крысам из групп Гипер и Гипер-РР проводили операцию по удалению правой почки и наложению зажима на артерию левой, у животных из групп ЛО и ЛОРР ту же операцию проводили без удаления почки и наложения зажима. Крысам из групп Гипер-РР и ЛО-РР в течение 4-х недель после операции индивидуально в питьевую воду в дозе 2,3 мг/кг в сутки добавляли ингибитор ЭПФ – вещество РР36, синтезированное в Институте Биомедицинской химии РАН им. Ореховича Поздневым В.Ф., которое было показано эффективным в отношении снижения концентрации ЭТ-1 в плазме крови [Симонова А.И. и др., 2008; Rufanova V.A. и др., 2009]. Аналогичным образом делили по группам кастрированных животных, операцию по моделированию гипертензии проводили на 18-21 день после кастрации у групп к-Гипер и к-Гипер-РР, и ложную операцию – у групп к-ЛО и к-ЛО-РР. Оценка динамики и степени развития гипертензии Перед экспериментом и после операции еженедельно у каждой крысы измеряли системное систолическое давление в хвостовой артерии с помощью плетизмографического метода [Malkoff J., 2005; Feng M., 2008]. Регистрацию и обработку результатов проводили в программе LGraph2. Для оценки 8 выраженности гипертрофии левого отдела сердца в конце эксперимента измеряли абсолютный вес левого желудочка. Оценка осморегулирующей и выделительной функции почек За несколько суток до операции и в конце эксперимента (через 4 недели после операции), крыс помещали в метаболические камеры со свободным доступом к воде и проводили сбор мочи в течение 24 часов. На следующий день собирали кровь для анализа содержания креатинина, мочевины – показателей выделительной функции почек [Кутырина И.М., 2000; Рябов С.И., Наточин Ю.В., 1997], измерения проводили на биохимических анализаторах Architect 4000 (Abbott) и А25 (Biosystems, Испания) используя оригинальные наборы реактивов. Для оценки осморегуляции, оценивали осмоляльность мочи и крови (при помощи криоскопического осмометра OSMOMAT 030 (Gonotec, Германия)), содержание ионов натрия и калия (при помощи ионоселективных электродов), суточные объемы потребления воды и экскреции мочи. Осмометрию и ионометрию проводили на базе лаборатории Эндокринологичекого научного центра Минздрава России. Осмотический клиренс (ОК) и клиренс осмотически свободной воды (КСВ), показатели осморегулирующей функции почек [Наточин Ю.В., 2009; Shoker A.S., 1994], рассчитывали по формулам: ОК UOsm V POsm и КСВ V ОК , где V – объем суточного мочеотделения, UOsm – осмоляльность суточной мочи, POsm – осмоляльность плазмы или сыворотки крови (в случае кастрированных крыс). Объемы экскреции мочи и потребления воды, а также ОК и КСВ относили к весу животного, поскольку к окончанию эксперимента мы наблюдали увеличение различий между группами по массе тела крыс. Гистологическое исследование Поскольку эндотелин-1 оказывает профибротические эффекты в тканях, для изучения степени развития склерозно-фибротических процессов в корковом веществе почек проводили гистологическое исследование (работа выполнена в 9 лаборатории патоморфологии и цитологии ГБУЗ КДЦ №6 Департамента здравоохранения г. Москвы, заведующий – доктор мед. наук Мальков П.Г.). Визуальную оценку гистоархитектоники клубочков, в том числе гломерулосклероза, проводили на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином в соответствии с общепринятыми признаками (клеточность мезангия, площадь мезангия, прорисовка капиллярных петель клубочка, состояние капилляров и мочевого пространства) [Серов В.В., Варшавский В.А., Иванов А.А., 2000]. Для относительной оценки выраженности интерстициальных склерозно-фибротических изменений проводили подсчет относительного количества полей зрения с выраженными соединительнотканными волокнами. Для этого на препаратах, окрашенных трихромом по Массону, на увеличении x20 считали количество полей зрения с тубулоинтерстициальным фиброзом (из 5ти находящихся рядом) в 7-10 отдельных участках коркового слоя почки. Анализ содержания эндотелина-1 в крови и его мочевой экскреции Определение содержания ЭТ-1 проводили с помощью набора для иммуноферментного анализа (Biomedica, Австрия) в образцах свежей мочи и плазмы крови (содержащей ЭДТА, 1 мг/мл), собранных в конце эксперимента. Образцы плазмы, сыворотки и мочи хранили при -20 оС. Методы статистической обработки данных Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи программы Statistica 8.0 (Statsoft). Данные подвергали проверке на нормальность распределения с помощью тестов Колмогорова-Смирнова и Лиллифорса (Lilliefors test), а также проводили проверку на наличие выбросов. Затем сравнивали значения между группами, при этом в соответствии с полученным распределением величины, выбирали параметрический (ANOVA, c использованием апостериорной оценки (post hoc) по методу Фишера) или непараметрический метод (критерий Крускалла-Уоллиса). Различия считали статистически значимыми при p<0,05. В тексте, на графиках и в таблицах значения нормально распределенных величин приведены в виде «среднее ± 10 стандартная ошибка среднего». При оценке корреляций между величинами, для нормально распределенных величин использовали корреляцию Пирсона, а для других величин – корреляцию Спирмена. Вычисленный коэффициент корреляции сравнивали с критическим значением коэффициента корреляции в соответствии с объемом выборки n (количество степеней свободы = n-2) и выбранным уровнем значимости p<0,05. Корреляцию считали статистически значимой, если вычисленный коэффициент корреляции был больше критического значения. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Влияние хронического эндотелинпревращающего применения фермента РР36 ингибитора на развитие реноваскулярной гипертензии у крыс с интактными семенниками Основным показателем развития системной артериальной гипертензии был выбран уровень системного систолического артериального давления, измеренный непрямым (плетизмографическим) методом в хвостовой артерии крыс. Системное систолическое артериальное давление измеряли еженедельно начиная с 5-7 дня после операции в течение 4-х недель. Увеличение систолического давления по сравнению с исходным уровнем в группе Гипер-РР через 2 и 3 недели после операции было статистически значимо выше, чем в группе Гипер на 13,6 мм рт. ст., что составило 28,6% от величины подъема систолического давления в группе Гипер (табл. 1). Через 3 недели после операции также наблюдалоcь статистически значимое увеличение роста систолического давления на 14,3% в группе Гипер-РР по сравнению с группой Гипер (p<0,05). Однако через 4 недели после операции увеличение систолического давления по сравнению с исходным в группе Гипер-РР было таким же, как в группе Гипер. Одним из общепринятых показателей степени развития системной гипертензии является гипертрофия левого желудочка сердца. В нашей работе показано, что реноваскулярная гипертензия привела к гипертрофии левого желудочка в группах Гипер и Гипер-РР на 22 и 25% (по сравнению с 11 соответствующим контролем), причем наблюдалась тенденция к увеличению гипертрофии в группе Гипер-РР по сравнению с группой Гипер на 40% (p=0,11), что видимо, говорит о более высоком развитии гипертензии на фоне применения РР36. Кроме того, мы проводили еженедельный мониторинг веса крыс, который не показал статистически значимых отличий, однако на 3-ей неделе эксперимента выявил тенденцию к увеличению среднего веса животных на 14 г в группе Гипер-РР по сравнению с группой Гипер (р=0,1), что могло свидетельствовать о задержке жидкости в организме этих животных. Таблица 1 Оценка степени развития гипертензии у крыс с интактными семенниками Группа, число животных ЛО n=13 Увеличение сист. артер. давления, мм рт.ст. через нед. 6,0±2,5 1 через нед. 2 через нед. 3 через нед. Абс. вес л. ж. 4 сердца, г 6,8±2,4 8,9±2,8 8,4±2,5 0,45±0,01 14,4±2,7 13,9±2,6 15,5±2,8 0,47±0,01 Гипер 34,7±4,5 47,7±4,2 57,8±4,5 68,1±6,0 n= 20 ** ** ** ** Гипер-PP 37,4±2,6 61,3±2,7 66,1±5,6 67,6±3,9 n=18 ** **## **# ** ** - p<0,005 – Гипер vs ЛО или Гипер-РР vs ЛО-РР, 0,55±0,02 ** 0,59±0,02 ** ЛО-РР n=16 9,6±2,8 # - p<0,05, ## - p<0,005 – Гипер-РР vs Гипер 1.1 Изучение эффективности действия ингибитора эндотелинпревращающего фермента РР36 Для оценки эффективности применения РР36 и влияния гипертензии на уровень ЭТ-1, были выбраны содержание ЭТ-1 в плазме крови и суточная экскреция ЭТ-1 с мочой, измеренные через 4 недели после операции. Хроническое применение РР36 привело к снижению уровня ЭТ-1 в плазме крови на 28% (43,4±4,5 vs 60,2±6,1 фмоль/мл, p<0,05), однако данный эффект был слабо выражен у крыс с гипертензией (снижение на 21%, 45,5±6,6 vs 12 57,9±6,2 фмоль/мл) по сравнению с эффектом у ложнооперированных животных (снижение на 34%, 41,6±7,1 vs 63,2±13 фмоль/мл, р=0,07). В работе показано, что гипертензия не оказывала влияния на величину концентрации ЭТ-1 в крови, однако приводила к статистически значимому увеличению суточной экскреции ЭТ-1 на 74% (p<0,05). Кроме того, нам удалось выявить, что хроническое применение РР36 предотвращало увеличение суточной экскреции ЭТ-1 на фоне гипертензии (Гипер-РР - 515±103 vs ГиперРР - 898±111 фмоль в сутки/кг, p<0,05). Данные результаты привели к гипотезе об участии почечных механизмов в изучаемой патологии. Поэтому на следующем этапе работы изучали влияние реноваскулярной гипертензии и применения ингибитора ЭПФ РР36 на почечную экскреторную, осмо- и ионорегулирующую функцию, а также провели гистологическое исследование почек. 1.2 Изучение выделительной функции почек, водно-осмотического баланса и гистологическое исследование проявлений гипертензии в ткани почек Выделительную функцию почек определяли по содержанию креатинина и мочевины в сыворотке крови. Средняя концентрация креатинина в сыворотке в группе Гипер через 4 недели после операции повышалась на 21%, а в группе Гипер-РР – на 35% по сравнению с исходным уровнем. Средняя концентрация мочевины в сыворотке в группе Гипер после операции повышалась на 36%, а в группе Гипер-РР – на 43%. Потребление РР36 статистически значимо не влияло на данные показатели. Кроме того, в качестве показателя скорости клубочковой фильтрации мы изучили клиренс эндогенного креатинина. Выяснили, что через 4 недели после операции у крыс с гипертензией, в отличие от ложнооперированных, не наблюдалось увеличения клиренса креатинина, связанного с ростом массы тела. Это позволяет предположить ухудшение почечной функции у крыс с гипертензией. 13 Оценка гистоархитектоники почечных клубочков выявила развитие признаков гломерулосклероза через 4 недели после индукции гипертензии. Было выявлено увеличение клеточности клубочков, предположительно, за счет пролиферации мезангиальных клеток, увеличение площади мезангия и увеличение диаметра клубочков, появление спаек листков капсулы Боумена, в мочевом пространстве присутствовали эритроциты с признаками гемолиза. Применение РР36 несколько снижало данные проявления. Эндотелин-1 является профибротическим и провоспалительным фактором [Clozel M., Salloukh H., 2005], поэтому мы также провели оценку развития склерознофибротического ремоделирования интерстиция коркового вещества почки (рис.1). Рис. 1. Оценка выраженности интерстициальных склерозно- фибротических изменений * - p<0,05 – Гипер vs ЛО, # - p<0,05 – Гипер-РР vs Гипер Развитие гипертензии привело к увеличению относительного количества соединительной ткани вокруг почечных канальцев на 23% по сравнению с ложнооперированным контролем, в то время как в группе Гипер-РР относительное количество соединительной ткани было снижено на 19% по сравнению с группой Гипер (рис. 1). Выявленные положительные изменения на гистологическом уровне могут иметь прогностическую силу, однако через 4 недели после операции они не 14 проявлялись на уровне выведения продуктов белкового обмена. Вероятно, это также может говорить о компенсаторной природе гистологических проявлений у гипертоников. Вклад работы почки в регуляцию артериального давления определяется не столько экскрецией продуктов обмена, сколько выделением осмотически активных веществ, поэтому был проведен анализ влияния РР36 и гипертензии на осмо- и ионорегулирующую функцию почки. Мы выяснили, что через 4 недели после операции осмоляльность плазмы крови при приеме РР36 увеличилась у крыс с гипертензией по сравнению с группой контрольных гипертоников на 10 мОсм/кг (р<0,05) (табл. 2), что сопровождалось тенденцией к увеличению концентрации натрия (145,9±1,4 vs 142,6±1,7 ммоль/л). При этом суточное потребление воды в метаболических камерах было также снижено на 45% у этих животных (р<0,05). Экскреция мочи в группе Гипер-РР имела тенденцию снижаться на 36% по сравнению с группой Гипер (р=0,06), что сопровождалось повышенной осмоляльностью мочи (в 1,7 раза). При этом показатель эффективности выведения осмотически активных веществ (осмотический клиренс) не отличался между группами (рис. 2), что вероятно говорит об отсутствии значительных изменений в экскреции натрия. Таблица 2 Оценка осморегулирующей функции почки в метаболических камерах Осм. плазмы, Осм. мочи, Экскреция Потребление Осм/кг воды Осм/кг воды мочи, мл/кг в воды, мл/кг в сутки сутки Группы ЛО ЛО-РР 0,297±0,004 0,297±0,003 0,564±0,130 0,497±0,090 75±12 67±9 75±15 68±9 Гипер 0,294±0,004 0,460±0,064 93±14 94±16 0,304±0,003 0,799±0,200 59±13 52±16 # # Гипер-РР # # - p<0,05 – Гипер-РР vs Гипер 15 Рис. 2. Изучение величин осмотического клиренса и клиренса осмотически свободной воды через 4 недели после операции и хронического действия РР36 у крыс различных групп. Вторая составляющая диуреза, выведение осмотически свободной воды, снижалась в группе Гипер-РР, отражая более активную работу почек по реабсорбции воды (рис. 2). 1.3 Изучение системной продукции оксида азота и его взаимосвязи с экскрецией ЭТ-1 Важное значение в поддержании системной и особенно почечной гемодинамики, а также реабсорбции натрия в почечных канальцах имеет оксид азота. Поэтому мы изучили, сопровождалось ли развитие гипертензии и прием РР36 снижением экскреции метаболитов NO. Через 4 недели после операции было обнаружено статистически значимое уменьшение суточной экскреции метаболитов NO в группе Гипер на 45%, а в группе Гипер-РР на 49% по сравнению с исходными значениями. Кроме того, применение РР36 статистически значимо снизило среднюю суточную экскрецию метаболитов оксида азота на 34,5%. Изучение взаимосвязи между суточной экскрецией ЭТ-1 и метаболитов NO показало статистически значимую корреляцию этих величин у крыс до операции (r=0,428, n=23, p<0,05) и после операции в группе Гипер 16 (r=0,74, n=8, p<0,05), однако при применении РР36 у ложнооперированных крыс была выявлена обратная корреляция (r= -0,685, n=7, p<0,1). У крыс группы Гипер-РР корреляции между данными величинами выявлено не было. Поэтому можно заключить, что действие РР36, по-видимому, не было напрямую связано с реакциями, опосредуемыми оксидом азота. Таким образом, комплекс эффектов, полученный у крыс группы ГиперРР, может быть результатом сдвига чувствительности осморецепторов гипоталамуса, который привел к снижению потребления воды. Причиной этого могла быть более активная гипергидратация при развитии гипертензии у этих крыс, к чему, учитывая диуретическую роль эндотелина-1, мог привести сниженный синтез ЭТ-1 в почках при применении РР36. Это также вероятно послужило причиной более высокого давления у крыс Гипер-РР, зарегистрированного нами через 2-3 недели после операции. Для того, чтобы прояснить возможное участие тестостерона в полученных эффектах, мы провели аналогичную серию экспериментов на кастрированных самцах крыс. 2 Влияние хронического эндотелинпревращающего применения фермента РР36 ингибитора на развитие реноваскулярной гипертензии у кастрированных самцов крыс При изучении влияния РР36 на развитие гипертензии у кастрированных крыс был отмечен эффект РР36 на ускорение роста системного давления, поскольку через 1 неделю после операции величина роста давления у крыс с гипертензией была выше на фоне приема РР36 (табл. 3). Однако при последующих измерениях отличий в величине подъема давления между группами к-Гипер и к-Гипер-РР обнаружено не было. Интересно, что на 1 неделе эксперимента в группе к-Гипер-РР также был обнаружено задержка в наборе веса по сравнению с группой к-Гипер (5±6 vs 2±6 г, p<0,05), поэтому возможно, более высокое давление не было связано с задержкой жидкости на 1 17 неделе. Абсолютный вес левого желудочка через 4 недели после операции также не различался между группами крыс с гипертензией. Таким образом, РР36 не влиял на степень развития гипертензии у кастрированных крыс. Таблица 3 Оценка степени развития системной гипертензии у кастрированных самцов крыс Подъем сист. артер. давления, мм рт.ст. через 1 нед. через нед. 2,6±2,2 0,6±2,7 2,9±3,1 -2,5±2,1 0,430±0,022 к-ЛО-РР n=6 7,1±2,7 5,4±4,1 7,7±3,8 2,7±4,9 0,390±0,030 Группа к-ЛО n=7 2 через нед. 3 через нед. Абс. вес л. 4 ж. сердца, г 34,5±7,1 43,2±4,8 59,4±8,1 58,1±8,3 0,564±0,020 && *&& *&& *&& && к-Гипер-PP 45,9±4,2 49,4±5,0 50,5±3,4 51,4±4,9 0,568±0,029 n=7 # && && && && && * - p<0,05 – по сравнению с величиной за 1 неделю, && - p<0,005 – к-Гипер vs к-Гипер n=8 к-ЛО, или к-Гипер-РР vs к-ЛО-РР, # - p<0,05 – к-Гипер-РР vs к-Гипер 2.1 Изучение экскреции ЭТ-1 и метаболитов NO через 4 недели применения ингибитора эндотелинпревращающего фермента РР36 на фоне гипертензии В экспериментах на самцах с интактными семенниками было показано, что основной эффект гипертензии в отношении синтеза ЭТ-1 – увеличение его экскреции с мочой, поэтому в экспериментах на кастрированных крысах мы также изучали скорость экскреции ЭТ-1 с мочой. Как и у самцов с интактными семенниками, гипертензия приводила к увеличению экскреции ЭТ-1 с мочой в 2 раза. Однако применение РР36 не оказывало статистически значимого влияния на объем экскреции ЭТ-1 ни у ложнооперированных (380,0±96,7 vs 439,7±96,6 фмоль/кг*сутки), ни у гипертензивных крыс (685,1±104,6 vs 884,5±223,4 фмоль/кг*сутки). 18 В предыдущей серии экспериментов мы выяснили, что развитие гипертензии у крыс с интактными семенниками приводит к снижению суточной экскреции метаболитов NO, и хроническое применение РР36 на фоне гипертензии потенцирует этот эффект. Развитие гипертензии у кастрированных самцов не влияло на выведение продуктов метаболизма NO, и РР36 также не вызывал статистически значимых эффектов на этот параметр. Однако существовала тенденция ложнооперированных к крыс, снижению экскреции принимавших РР36 метаболитов (7,8±1,8 vs NO у 10,9±1,1 мкмоль/сутки*кг). Изучение корреляции между суточной экскрецией ЭТ-1 и метаболитов NO показало наличие взаимосвязи, сходной с полученной нами у животных с интактными семенниками, причем это наблюдалось как без применения РР36, так и после его хронического применения. 2.2 Изучение выделительной функции почек, водно-осмотического баланса и гистологическое исследование проявлений гипертензии в ткани почек В экспериментах на кастрированых самцах, гипертензия приводила к снижению выделения продуктов катаболизма белков, аналогичному полученным на крысах с интактными семенниками. В группе к-Гипер концентрация креатинина в сыворотке увеличилась на 24%, а мочевины на 22% по сравнению с предоперационными величинами. В группе к-Гипер-РР содержание креатинина увеличилось на 25%, а мочевины на 17% по сравнению с исходными значениями. Хронический прием РР36 не влиял на данные показатели почечной функции. Клиренс креатинина у крыс групп к-Гипер и кГипер-РР по сравнению с соответствующими ложнооперированными группами снижался на 21 и 20%, однако по сравнению с предоперационными значениями, клиренс креатинина у этих крыс увеличивался, поэтому возможно, гипертензия у кастрированных крыс приводила к меньшим изменениям выделительной функции почек. 19 Оценка гистоархитектоники почечных клубочков выявила развитие признаков гломерулосклероза через 4 недели после индукции гипертензии. Было выявлено увеличение клеточности клубочков, предположительно, за счет пролиферации мезангиальных клеток, увеличение площади мезангия и увеличение диаметра клубочков, появление спаек листков капсулы Боумена, в мочевом пространстве присутствовали эритроциты с признаками гемолиза. Применение РР36 практически не влияло на развитие этих признаков. В отличие от серии на крысах с интактными семенниками, оценка туболоинтерстициальных склеротических изменений полуколичественным методом не выявила статистически значимых различий между группами, вероятно, за счет большего относительного количества соединительной ткани вокруг почечных канальцев, чем у животных с интактными семенниками. При оценке осморегулирующей функции мы выявили увеличение осмоляльности сыворотки ложнооперированным крови в группе к-Гипер по контролем, что сопровождалось сравнению с тенденцией к увеличению концентрации калия (табл. 4). Таблица 4 Оценка осморегулирующей функции почки Концентрация ионов в Осм. Осм. мочи, плазме сыворотки, Осм/кг Осм/кг Натрий Калий Группы (ммоль/л) (ммоль/л) к-ЛО n=7 143,6±0,6 5,25±0,11 0,310±0,005 0,60±0,18 к-ЛО-РР n=7 к-Гипер n=8 144,3±0,6 5,47±0,19 0,318±0,004 0,65±0,14 143,9±0,7 5,68±0,17 0,322±0,002 0,54±0,08 * к-Гипер-РР 143,1±0,6 5,64±0,14 n=9 * - p<0,05 – к-Гипер vs к-ЛО 20 0,319±0,005 0,55±0,07 Было показано, что величины осмотического клиренса и клиренса осмотически свободной воды, величины потребления воды и экскреции мочи не отличались между группами кастрированных животных. Таким образом, на динамику артериального давления, гистологические проявления патологии, изменения показателей осморегуляции, ингибитор ЭПФ РР36 оказывал разное воздействие при развитии гипертензии у крыс с интактными или удаленными семенниками. Хроническое применение РР36 в течение 4 недель на 43% снижало экскрецию ЭТ-1 с мочой у гипертензивных крыс с интактными семенниками, но не у кастрированных животныхгипертоников. Мы предполагаем, что данный ингибитор может обладать определенной селективностью действия, в зависимости от функционального состояния животного. Заключая вышеизложенное, можно сказать, что роль эндотелина-1 в развитии гипертензии «одна почка, один зажим» (1П1З) связана с поддержанием водно-электролитного баланса и выделительной функции почки. Основным компонентом, определяющим гипертензивный эффект применения ингибитора ЭПФ в данной модели, по-видимому, является увеличение реабсорбции воды в собирательных трубках почки вследствие дефицита ЭТ-1, а также возможно, задержка натрия. Таким образом, эндотелин-1 имеет определенное протективное влияние на развитие гипертензии 1П1З. Использованная нами модель гипертензии позволила выявить гипотензивный компонент действия эндотелина-1, что ранее в хронических физиологических опытах удавалось показать только на нокаутных моделях. Кроме того, показано, что ингибитор ЭПФ у гипертензивных крыс с интактными семенниками вызывает увеличение осмоляльности крови, что может быть одним из факторов потенциирующих гипертонию. Полученные результаты расширяют представления об эффектах ингибиторов эндотелинпревращающего фермента и свидетельствуют об отличиях механизмов участия эндотелина-1 при развитии реноваскулярной гипертензии у половозрелых самцов крыс в зависимости от наличия или отсутствия семенников. 21 ВЫВОДЫ: 1. При развитии гипертензии содержание ЭТ-1 в крови не изменялось, но происходило увеличение экскреции ЭТ-1 с мочой вне зависимости от наличия или отсутствия семенников. Ингибитор ЭПФ селективно снижал экскрецию ЭТ-1 с мочой только у гипертензивных самцов с интактными семенниками. 2. У гипертензивных крыс с интактными семенниками применение ингибитора ЭПФ сопровождалось увеличением степени развития гипертензии, а у кастрированных крыс этот эффект был выражен лишь на ранних сроках развития патологии. 3. Развитие интерстициальных гипертензивных крыс с фиброзно-склеротических интактными семенниками изменений снижалось у при применении ингибитора ЭПФ на 19%. Эффект сопровождался менее выраженным развитием гломерулосклероза. 4. Прогипертензивное действие ингибитора ЭПФ сопровождалось увеличением осмоляльности плазмы крови, мочи и снижением суточного потребления воды. Применение ингибитора ЭПФ у гипертензивных кастрированных самцов не приводило к аналогичным изменениям осморегуляции. 5. Рост уровня экскреции эндотелина-1, свидетельствующий об увеличении синтеза ЭТ-1 в почках при развитии гипертензии у крыс с интактными семенниками, оказывает антигипертензивное воздействие, связанное с поддержанием осморегулирующей функции. Вклад ЭТ-1 в регуляцию артериального давления у половозрелых кастрированных крыс менее выражен. 22 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. М.Е.Илатовская, В.Ф.Позднев, Н.А.Медведева, А.В.Ильин. Ингибитор синтеза эндотелина-1 потенциирует развитие реноваскулярной гипертензии у интактных, но не кастрированных самцов крыс // Материалы XXII съезда физиологического общества им. И. П. Павлова (Россия, Волгоград, 2013) 2. M. Ilatovskaya, V. Pozdnev, A. Iliyn, Endothelin-converting enzyme inhibitor reduces endothelin-1 excretion and aggravates hypertension in adult but not gonadectomised male rats with renovascular hypertension // European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Prevention (Milan, 2013), Journal of Hypertension, Volume 31, e-Supplement A, e400 3. Ilatovskaya M.E., Andreev-Andrievsky A.A., Pozdnev V.F., Iliyn A.V. and Medvedeva N.A. Endothelin-converting ensyme inhibitor decreases free water clearance and accelerates renovascular hypertension in adult but not gonadectomised male rats // ERA-EDTA 50th Congress (Turkey, Istanbul, 2013), Nephrology Dialysis Transplantation 28 (Supplement 1): i329. 4. Илатовская М.Е., Юдахина Е.Д., Позднев В.Ф., Медведева Н.А. Анализ эффектов хронического применения ингибитора эндотелинпревращающего фермента на модели реноваскулярной гипертонии в экспериментах на крысах // Материалы VIII Всероссийская конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», СПБ.-Турусел, 2012, с.97. 5. Илатовская М.Е., Позднев В.Ф., Андреев-Андриевский А.А., Медведева Н.А. Блокада синтеза эндотелина-1 усиливает степень развития реноваскулярной гипертензии в экспериментах на крысах // Российской физиологический журнал им.И.М.Сеченова, 2012, Т.98, №7, С.836-844 6. Илатовская М.Е. Анализ участия эндотелина-1 в развитии объемзависимой реноваскулярной гипертензии у крыс // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2012» / 23 Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, К.К. Андреев, М.В. Чистякова. [Электронный ресурс] — М.: МАКС Пресс, 2012, с.252. 7. М.Е. Илатовская, С.И. Софронова , В.Ф. Позднев, Н.А. Медведева. Влияние блокатора синтеза эндотелина-1 на развитие реноваскулярной гипертензии у крыс (модель «одна почка, один зажим») // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2011. - №4. с.23-28. 8. Софронова С.И., Илатовская М.Е., Тарасова О.С., Позднев В.Ф., Медведева Н.А. Исследование эффектов эндотелина на реактивность артерий легкого и почки у крыс путем хронической блокады эндотелинпревращающего фермента // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2011. - №4. - с.29-34. 9. Илатовская М.Е., Софронова С.И., Позднев В.Ф., Медведева Н.А. Влияние блокатора синтеза эндотелина-1 на развитие вазоренальной гипертензии у крыс (модель «одна почка, один зажим») // Материалы конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов», посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.П. Ашмарина. 10.Ilatovskaya M.E., Pozdnev V.F., Medvedeva N.A. Endothelin-converting enzyme inhibitor promotes renovascular hypertension development in rats (1 kidney, 1 clip Goldblatt model). // 21st European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Prevention, Milan, 2011, Journal of Hypertension, V. 29, e465. 11.Илатовская М.Е., Артемьева М.М., Позднев В.Ф., Медведева Н.А. Влияние хронического применения ингибитора эндотелинпревращающего фермента на реактивность изолированных почечных артерий крыс линии Wistar // Тезисы докладов, XXI съезд физиологического общества имени И.П.Павлова, (Москва, 2010 г.), c. 248 24 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ: 1П1З – операция по методу «одна почка, один зажим» NO – оксид азота Абс. вес л. ж. сердца – абсолютный вес левого желудочка сердца Гипер; Гипер-РР – группы крыс с интактными семенниками и гипертензией, получавшие или не получавшие хронически ингибитор ЭПФ РР36 к-Гипер; к-Гипер-РР – группы кастрированных крыс с гипертензией, получавшие или не получавшие хронически ингибитор ЭПФ РР36 к-ЛО; к-ЛО-РР – группы кастрированных ложнооперированных крыс, получавшие или не получавшие хронически ингибитор ЭПФ РР36 (ложнооперированный контроль) КСВ – клиренс осмотически свободной воды ЛО; ЛО-РР – группы ложнооперированных крыс с интактными семенниками, получавшие или не получавшие хронически ингибитор ЭПФ РР36 (ложнооперированный контроль) нед. – неделя ОК – осмотический клиренс Осм. – осмоляльность Увеличение сист. артер. давления – увеличение систолического артериального давления ЭПФ – эндотелинпревращающий фермент ЭТ-1 – эндотелин-1 25
