морфологические особенности микроспорогенеза у

ISSN 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научноисследовательского института масличных культур. Вып. 2 (144-145), 2010
_________________________________________________
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
МИКРОСПОРОГЕНЕЗА У ФЕРТИЛЬНОГО И
СТЕРИЛЬНОГО – ЦМС РЕТ1 АНАЛОГОВ
ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА
А.В. Усатов1, доктор биологических наук
Г.Ф. Федоренко2 , доктор биологических наук
М.А. Тихонова1, кандидат сельскохозяйственных наук
В.А. Гаврилова3, доктор биологических наук
Н. В. Маркин1, кандидат биологических наук
1
Научно-исследовательский институт биологии Южного
федерального университета
Россия, 344090, Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1
тел. (863) 243-33-94, e-mail: usatova@mail.ru
2
Южный научный центр РАН,
Россия, 344006, Ростов-на-Дону, Чехова 41.
3
ГНУ ГНЦ РФ ВИР им. Н.И. Вавилова
19000, Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42.
Ключевые слова: цитоплазматическая мужская
стерильность (ЦМС), микроспорогенез, тапетум, инбредные
линии, Helianthus
УДК 575.153: 576.31
Введение. Цитоплазматическая мужская
стерильность (ЦМС) у растений многообразна
по своему фенотипическому выражению и, как
правило, возникает либо спонтанно, либо в результате совмещения ядерных геномов одних и
цитоплазмонов других видов. В коммерческом
производстве подсолнечника наиболее распространена ЦМС типа РЕТ1, которая была получена в результате объединения цитоплазмона
Helianthus petiolaris с ядерным геномом Helianthus annuus.
Исследования нарушения микроспорогенеза
у форм с различными типами ЦМС достаточно
актуальны, так как их результаты могут стать
основой для выявления причин и механизмов
дегенерации или стерильности пыльцы, что
имеет не только общебиологическое значение,
но и большой практический интерес.
Ранее рядом авторов, проводившим исследования с помощью световой и электронной
микроскопии, были отмечены особенности
микроспорогенеза у нескольких линий подсолнечника с ЦМС типа РЕТ1. Например, Х.Т.
Хорнером у линии HA 232 [1], В.К. Симоненко
у линий АС-2009, АC-2007, K-077-S [2, 3, 4],
Дж.Х. Лаво у линии HA 89 [5] и К.Дж. Смартом у линии RPA842B [6] описаны особенности
морфологии
клеток
пыльников,
характерные при абортивном развитии микроспор у форм с ЦМС типа РЕТ1, по сравнению с
фертильными аналогами. Однако ЦМС растений представляет собой феномен ядерноплазменного взаимодействия, в котором участвуют как гены органелл (митохондрий), так и
ядра. Поэтому, несмотря на один тип мутации
в митохондриальной ДНК, индуцирующей
ЦМС РЕТ1, процесс микроспорогенеза в зависимости от ядерного окружения имеет свои
особенности у линий с одинаковым цитоплазмоном, но разными ядерными генотипами. В
связи с этим целью работы является определение морфологических особенностей микроспорогенеза, возникающих в результате действия
различных ядерных геномов, у инбредных линий подсолнечника с ЦМС РЕТ1 согласно данным литературы и результатам собственных
исследований.
Материалы и методы. Материалом исследования служили фертильный и стерильный
(ЦМС PET1) аналоги линии ВИР 109 (селекции
Кубанской опытной станции Всероссийского
института растениеводства). С помощью световой и электронной микроскопии изучали
пыльники растений на разных стадиях развития: начальных (стадия спорогенных клеток и
микроспороцитов) и более поздних (стадия
формирования пыльцевых зерен у фертильной
и полного абортирования пыльцы у стерильной
форм). Фиксацию пыльников и подготовку срезов для световой и электронной микроскопии
проводили согласно методике [7]. Срезы анализировали в электронном микроскопе Tecnai
12 (Phillips, Голландия) и светооптическом
микроскопе Axioskop Zeiss (Германия).
Результаты и обсуждение. Результаты сравнительного анализа светооптической микроскопии свидетельствуют, что на ранних этапах
развития пыльники ЦМС и фертильных форм
линии ВИР 109 не отличаются друг от друга.
Они состоят из четырех микроспорангиев
(гнезд) с четырехслойными стенками. У них
закладывается археспорий и выделяется тапетальный слой, имеющий клеточное строение (рис.
1а, 1б).
Эндоплазматический ретикулюм (ЭПР) в
тапетальных клетках представлен в виде узких
протяженных канальцев, поверхность которых
усеяна рибосомами и полисомами (рис. 1е).
и пластиды (рис. 1д). Однако в отличие от описаний фертильных форм, сделанных В.К. Симоненко [3], в нашем случае пластиды не окружены
концентрически расположенными каналами ЭПР.
Спорогенные клетки, локализованные в
центре гнезда пыльника, соединены между собой и с тапетумом плазмодесмами (рис. 2а).
Ядра в этих клетках крупные, с отчетливо различимыми ядрышками и небольшим количеством электронно-плотного хроматина (рис. 2б).
Рисунок 1 – Строение гнезд пыльников и
ультраструктура клеток тапетума
фертильного и ЦМС РЕТ1 подсолнечника на ранней стадии развития:
а) гнездо пыльника фертильной формы; б) гнездо
пыльника стерильной формы; в) и г) фрагмент клетки тапетума фертильной формы; д) клетка тапетума
стерильной формы; е) участок цитоплазмы клетки
тапетума стерильной формы.
ЭП – эпидермис; ЭН – эндотеций; ПС – промежуточный слой клеток; Т – тапетум; С – спорогенные
клетки; Я – ядро; Яд – ядрышко; М – митохондрия;
П – пластида; ЭПР – эндоплазматический ретикулюм; АГ – аппарат Гольджи.
Хорошо видны концентрически расположенные каналы ЭПР (рис. 1в, 2а). Клетки содержат крупные ядра с хорошо заметными
ядрышками (рис. 1в, 1д). В цитоплазме клеток
тапетума располагается большое количество
свободных рибосом, многочисленные митохондрии с плотным матриксом и хорошо развитыми
кристами (рис. 1г, 1д), аппарат Гольджи (рис. 1г)
Рисунок 2 – Ультраструктура спорогенных клеток
фертильного и ЦМС РЕТ1 подсолнечника на ранней стадии развития:
а) участок цитоплазмы спорогенной клетки фертильной формы; б) спорогенные клетки фертильной
формы; в) митохондрии в спорогенной клетке стерильной формы.
Я – ядро; Яд – ядрышко; М – митохондрия; П –
пластида; ЭПР – эндоплазматический ретикулюм;
Пл – плазмадесма.
Цитоплазма содержит множество пластид с
крахмальными
зернами и митохондрий с
большим количеством крист у фертильного
аналога ВИР 109 (рис. 2а), в отличие от данных
Дж.Х. Лаво [5], который при изучении фертильной линии НА 89 обнаружил в спорогенных клетках митохондрии с небольшим
количеством крист. У стерильной формы ВИР
109 количество крист в митохондриях, наоборот, небольшое (рис. 2в). Митохондрии локализованы вблизи ядерной мембраны, что
согласуются с наблюдениями В.К. Симоненко
[3]. ЭПР представлен более узкими, чем в клетках тапетума, уплощенными каналами (рис. 3а).
Мембраны ЭПР и цитоплазма микроспороцитов
содержат меньшее количество рибосом, чем тапетум. Аппарат Гольджи не обнаружен.
Микроспоры у фертильных растений формируются в результате двух мейотических делений спороцита и располагаются в тетрадах в
виде тетраэдра. После выхода из тетрады микроспора приобретает сферическую форму,
начинает увеличиваться в размерах, ее оболочка достраивается и утолщается (рис. 3а).
Каждая микроспора (пыльцевое зерно) содержит ядро, окруженное плотной цитоплазмой с множеством мелких вакуолей (рис. 3б).
Подобную вакуолизацию цитоплазмы микроспор наблюдали Х.Т. Хорнер [1] и Дж.Х. Лаво
[5]. Многочисленные митохондрии локализованы вблизи ядра (рис. 5б). Эту особенность
отмечал и Дж.Х. Лаво [5]. Наружный слой экзины (эктэкзина) имеет шипы и содержит следующие компоненты: тектум, столбики-бакули
и подножный слой. Внутренняя часть экзины
(эндэкзина) состоит из многих отложений и
тяжей, параллельных поверхности протопласта. Между эктэкзиной и эндэкзиной можно
наблюдать пространство, которое Х.Т. Хорнер
[1] определил как spacer layer (рис. 3б).
На данной стадии развития пыльника тапетальные клетки увеличиваются в размерах радиально, по направлению к центру гнезда
пыльника. Стенки клеток тапетума лизируются
(рис. 3г). Наблюдается пикноз ядер, они приобретают форму «тающих ядер» [2]. В клетках
видна обширная сеть ЭПР, плеоморфные митохондрии (рис. 3в) и гантелевидные пластиды (рис.
3г). Тапетальный плазмодий проникает между
клетками спорогенного комплекса, но сохраняет
контакты с пристенным слоем клеток (рис. 3а).
По мере роста микроспор вещество тапетального периплазмодия расходуется на питание пыльцевых зерен и формирование экзины,
и к концу развития в гнездах зрелых пыльников находятся лишь трехъядерные пыльцевые
зерна с характерными удлиненными спермия-
ми и шипиками на поверхности экзины [4].
Рисунок 3 – Строение зрелого пыльника и
ультраструктура пальцевого зерна
и клеток тапетума фертильного
подсолнечника:
а) срез зрелого пыльника; б) фрагмент пыльцевого
зерна; в) плеоморфные митохондрии в клетке тапетума; г) фрагмент клетки тапетума.
Т – тапетум; Пз – пыльцевые зерна, Я – ядро; М –
митохондрии; В – вакуоли; ЭПР - эндоплазматический ретикулюм; П – пластида; Эн – эндэкзина; Эк
– эктэкзина; Тк – тектум; Б – бакули; ПС – подстилающий слой; S - spacer layer.
Х.Т. Хорнер [1] разделил процесс микроспорогенеза у фертильной линии на 11 стадий
и указал, что первые признаки аномального
развития пыльцы у линии НА 232 с ЦМС РЕТ1
возникают на четвертой стадии (ранних тетрад
микроспор), когда клетки тапетума начинают
разрастаться и сжимать микроспоры. В.К. Симоненко [3] отмечал, что первые аномалии
развития в пыльниках ЦМС растений изученных им линий – расширенные каналы эндоплазматического ретикулума в цитоплазме
тапетальных клеток – были видны уже на стадии поздних микроспороцитов. По наблюдениям Дж.Х. Лаво [5], первыми аномалиями
микроспорогенеза у ЦМС линии НА 89 являются нарушения структуры мембранных органелл (эндоплазматический ретикулум, мембрана ядра, диктиосомы) материнской клетки
спор. К.Дж. Смарт с сотр. [6] установили, что
на стадии пахитены (стадия 3 по Х.Т. Хорнеру
[1]) аномалии обнаруживаются в развитии
мембранных органелл мейоцитов стерильной
линии RPA842B, тапетум демонстрирует аномальное развитие и полностью дегенерирует на
стадии тетрад микроспор.
Первые аномалии развития в пыльниках
растений ЦМС РЕТ1 аналога линии ВИР 109
можно наблюдать на стадии поздних микроспороцитов и диад в многоядерных тапетальных клетках, цитоплазма которых содержит
расширенные каналы ЭПР (их профили видны
на срезах в виде замкнутых цистерн, усеянных
рибосомам) (рис. 4б) и аппарат Гольджи (рис.
4в). В тапетуме не наблюдается концентрически расположенных каналов ЭПР, однако в
микроспороцитах пыльников ЦМС растений
они присутствуют (рис. 5г). На этой стадии радиальные стенки оболочки клеток тапетума
растворяются, и на их месте формируется новая тонкая оболочка, ограничивающая будущий пристенный тапетальный периплазмодий
от микроспороцитов, а затем и тетрад (рис. 4а).
Сразу после завершения мейотического деления, в процессе формирования тетрады микроспор, тапетум линии ВИР 109 А РЕТ1
начинает разрастаться. Внутренняя структура
его клеток повреждена: митохондрии со светлым матриксом лишены крист (рис. 4г), что согласуется с наблюдениями Х.Т. Хорнера и
Дж.Х. Лаво [1, 5], но противоречит результатам
В.К. Симоненко [3], который на данной стадии
развития в клетках тапетума наблюдал митохондрии с мощно развитой системой крист.
Шероховатый ЭПР фрагментирован (рис. 4г).
Пластиды округлые, с плотной стромой и редкими ламеллами (рис. 4г).
Кроме того, для тапетума ЦМС РЕТ1 формы
ВИР 109 характерно аномальное развитие
ядер. В отличие от фертильного аналога, у которого клетки тапетума содержат по два крупных ядра, постепенно лизирующиеся, по мере
превращения клеточного тапетума в периплазмодий, количество и объем ядер в клетках тапетума стерильной линии увеличиваются. Ядра
сильно хроматизированы, и количество частиц
плотного гетерохроматина на срезах чрезвычайно велико. Форма ядер амебоидная, со многими выростами и инвагинациями (рис. 4д).
Однако оболочка, в отличие от наблюдений
В.К. Симоненко [3], не фрагментирована. В
дальнейшем в цитоплазме тапетума происходит резкое расширение каналов гладкого ЭПР и
образование крупных лакун и вакуолей (рис. 4е).
У микроспороцитов ЦМС растений ВИР 109
на стадии тетрад отдельные участки цитоплазмы изолируются каналами ЭПР. Затем вся
цитоплазма клетки тетрады вакуолизируется.
Пластиды имеют вытянутую форму и не содержат крахмальных зерен (рис. 5б). Митохондрии набухшие, со светлым матриксом и
малочисленными кристами (рис. 5в).
Рисунок 4 – Ультраструктура клеток тапетума
ЦМС РЕТ1 подсолнечника на
стадии диад и тетрад микроспор:
а) тетрады микроспор и тапетальные клетки; б)
расширенные каналы ЭПР в тапетальной клетке на
стадии диад; в) АГ в тапетальной клетке на стадии
диад; г) участок цитоплазмы тапетальной клетки на
стадии тетрад; д) многоядерная клетка тапетума.
Т – тапетум; ТМ – тетрады микроспор; Я – ядро;
ЭПР – эндоплазматический ретикулюм; М – митохондрия; П – пластида; АГ – аппарат Гольджи.
В клетках тетрад микроспор ВИР 109 с
ЦМС типа РЕТ1 на поверхности ядерной оболочки не наблюдается четкого расположения
митохондрий, как это имеет место в тетрадах
микроспор фертильного аналога. Их цитоплазма содержит многочисленные диктиосомы, что
наблюдал и Дж.Х. Лаво [5] (рис. 5а).
При дальнейшем развитии микроспороциты
сжимаются агрессивно разросшимся тапетумом
и образуют своеобразную плотную массу.
Клетки ее постепенно облитерируются и
окончательно дегенерируют, а затем разруша-
ется и все остальное содержимое гнезда пыльника. Клетки промежуточного слоя, уплощенные на предыдущих стадиях развития
пыльника, сильно вакуолизируются, пузыревидно вздуваются, их ранее плотная цитоплазма просветляется, располагаясь пристенно.
Этот промежуточный слой сохраняется до полной дегенерации тапетума и микроспороцитов
стерильного подсолнечника.
округлая, а не овальная, оболочка гипертрофированных ядер тапетума не фрагментирована,
ядерная оболочка микроспороцитов не образует инвагинаций и выростов. Кроме того, на более поздней стадии микроспорогенеза (стадия
тетрад) клетки тапетума растений ВИР 109 в
отличие от других исследованных линий с
ЦМС типа РЕТ1 содержат диктиосомы, а митохондрии тапетума полностью лишены крист.
Очевидно, эти особенности клеточной ультраструктуры могут свидетельствовать о влиянии
ядерных генов на протекания абортивного микроспорогенеза у ЦМС-форм подсолнечника.
Исследование выполнено при финансовой
поддержке Министерства образования науки и
РФ (грант «Развитие научного потенциала
высшей школы (2009-2010)» № 2.1.1/4947).
Список литературы
Рисунок 5 – Ультраструктура микроспороцитов
ЦМС РЕТ1 подсолнечника на
стадии тетрад:
а) АГ в цитоплазме микроспороцита; б) фрагмент
клетки микроспороцита; в) набухшие митохондрии
в цитоплазме микроспороцита; г) концентрические
каналы ЭПР в цитоплазме микрспороцита.
Таким образом, в целом структурные изменения клеток и органелл, выявленные нами
при абортивном микроспорогенезе у стерильных растений линии ВИР 109, сходны с таковыми, описанными в литературе и для других
линий с данным типом ЦМС. А именно, четко
проявляется спорофитный характер действия
ЦМС факторов, выражающийся, прежде всего,
в абортивном развитии тапетальной ткани, ее
гипертрофии уже на стадии спорогенных клеток, что приводит к постепенной дегенерации
последних. Кроме того, наблюдаются изменения в структуре органелл клеток тапетума и
микроспороцитов (нарушение структуры митохондрий и пластид, расширение каналов
ЭПР, вакуолизация цитоплазмы, появление
амебоидных ядер) стерильной формы относительно фертильной. Однако у ЦМС формы типа РЕТ1 линии ВИР 109 нами выявлен и ряд
отличий от стерильных растений других линий, приведенных в литературе [3, 5]. Вопервых, на ранней стадии развития пыльников
(стадия микроспороцитов) не происходит
чрезмерного отложения спорополленина в
клетках тапетума, форма тапетальных пластид
1. Horner, H.T. A comparative light- and electron-microscopic study of microsporogenesis in
male-fertile and cytoplasmic male-sterile sunflower (Helianthus annuus) / H.T. Horner // Amer. J.
Bot. – 1977. – Vol. 64. – P. 747-759.
2. Симоненко, В.К. Цитоэмбриологические
причины мужской стерильности подсолнечника /
В.К. Симоненко // Науч.-техн. бюл. Всесоюз. селек.-генетич.. – Одесса, 1975. – Вып. 24. – С. 24-30.
3. Симоненко, В.К. Особенности развития
пыльника и микроспор у фертильных форм и
ЦМС-линии подсолнечника / В.К. Симоненко //
Репродуктивный процесс и урожайность полевых культур: сборник научн. труд. ВСГИ. –
1981. – С. 83-90.
4. Симоненко, В.К. Цитологическое проявление различных типов мужской стерильности
у подсолнечника / В.К. Симоненко, Е.В. Карпович // Науч.-техн. бюл. Всесоюзного селекционно-генетического института. – Одесса,
1978. – Вып. 31. – С. 32-38.
5. Laveau, J.H. Microsporogenesis abortion in cytoplasmic male sterile plants from H. petiolaris or H.
petiolaris fallax crossed by sunflower (Helianthus
annus) / J. H. Laveau, C. Schneider, A. Berville //
Annals of Botany. – 1989. – Vol. 64. – P. 137-148.
6. Smart, C.J. Cell-specific regulation of gene expression in mitochondria during anther development
in sunflower / C.J. Smart, F. Moneger, C.J. Leaver //
The Plant Cell. – 1994. – Vol. 6. – P. 811-825.
7. Усатов, А.В. Особенности клеточной
структуры листьев культурного и дикорастущего подсолнечника Helianthus annuus L. / А.
В. Усатов, Г. М. Федоренко, Е. В. Машкина, В.
А. Тарасова, Н. В. Маркин // Масличные культуры.
Научно-технический
бюллетень
ВНИИМК. – 2009. – Вып. 2 (141). – С. 35-40.