[577.127.4:612.014.31]:616-092.9 экспрессия металлотионеина

УДК [577.127.4:612.014.31]:616-092.9
ЭКСПРЕССИЯ МЕТАЛЛОТИОНЕИНА-3 В ТКАНЯХ МОЗГА КРЫС С РАЗЛИЧНЫМ
ОРИЕНТИРОВОЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИМ ПОВЕДЕНИЕМ ПРИ
ХРОНИЧЕСКОМ СТРЕССЕ
Чубуков Ж.А.
УО «Гомельский государственный медицинский университет»
г.Гомель, Республика Беларусь
Введение
В настоящее время известно, что металлотионеин-3 (МТ-3) вовлечён в патогенез
заболеваний головного мозга и выполняет в норме и при патологических состояниях
регуляторные и протекторные функции, участвует в механизмах повреждения тканей
головного мозга [1]. При этом экспрессия данного гена при хроническом стрессе является
малоизученной. Так, исследователи из автономного университета Барселоны указывают, что
при хроническом стрессе наблюдаетcя тенденция к снижению экспрессии МТ-3 или
экспрессия его не изменяется [2,3]. В то же время, другими исследователями отмечается, что
экспрессия МТ-3 в ответ на повреждение или окислительный стресс – увеличивается [4,5].
При этом все авторы отмечают, что экспрессия МТ-3 находится во взаимосвязи с
концентрацией допамина, который во многом определяет ориентировочно-исследовательское
поведение крыс. Сведений же о взаимосвязи ориентировочно-исследовательского поведения
крыс с экспрессией МТ-3 при хроническом стрессе в доступной для изучения литературе
выявлено не было.
Цель: изучить экспрессию МТ-3 в тканях головного мозга крыс с различными типами
ориентировочно-исследовательского поведения.
Материалы и методы
У 50 половозрелых самцов беспородных белых крыс проведено моделирование
хронического стресса по методу J. Ortiz (1996) [6]. Сформирована контрольная группа
животных из 50 половозрелых самцов белых беспородных крыс, не подвергавшихся
стрессорному воздействию.
Для каждой крысы проведен 6-тиминутный тест ориентировочно-исследовательского
поведения «открытое поле» с видеофиксацией. В ходе расшифровки видеоматериалов теста
подсчитывали: количество амбуляций, выходов в центр установки, отрывов лап от пола, опор
на стенку установки, обследованных отверстий установки, коротких и длинных грумингов,
актов дефекации, замираний длительностью более 5 секунд. После проведения теста все
крысы были декапитированы, образцы тканей мозга сохранены в стерильных криопробирках
при температуре -76°С.
Из образцов тканей головного мозга экспериментальных животных выделена общая
РНК с использованием наборов «GeneJet RNA Purification Kit (Thermo Scientific, USA)» и
очищена нуклеазами от компонентов ДНК. Проведена обратная транскрипция выделенной
РНК в кДНК с использованием наборов «Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo
Scientific, USA)». На амплификаторе RotorGene 3000 выполнена амплификация кДНК с
использованием наборов «Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Scientific,
USA)». В образцах тканей головного мозга крыс проведено определение экспрессии генов
МТ-3
и
18s
(housekeeping)
методом
ПЦР
в
реальном
времени.
Сведения
о
последовательности олигонуклеотидов представлены в таблице 1.
Таблица 1. Олигонуклеотидные последовательности праймеров МТ-3 и 18s
Ген
18s
MT-3
Статья-источник
Piller et al. / BMC Research Notes 2013,
6:266
Velazquez et al. / J. Neurosci., March 15,
1999, 19(6):2288–2300
Полученные
данные
сведены
в
Последовательность (5' → 3')
GGCTCATTAAATCAGTTATGGTTCCT
GTTGGTTTTGATCTGATAAATGCACG
ATGGACCCTGAGACCTGCCCCTGT
TCACTGGCAGCAGCTGCATTTCTCG
таблицы
и
обработаны
статистически
с
использованием пакета прикладного программного обеспечения «Statsoft Statistica v.10.0»
(США). Выявление подгрупп по количественным показателям проводили с использованем
кластерного анализа методом К-средних. Анализ различий в двух независимых группах по
количественным показателям проводили с использованием критерия Манна-Уитни (U, Z).
Анализ взаимосвязи проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции
Спирмена (rs). Показатели описательной статистики приведены в виде медианы и квартилей –
Me(Q25%;Q75%). Нулевую гипотезу отклоняли при уровне статистической значимости р<0,05
[7]
Результаты и обсуждение
При проведении анализа различий у низкоактивных крыс выявлены статистически
значимые различия (U=138,0;Z=-2,062;p=0,039) по экспрессии гена МТ-3 в тканях головного
мозга. В группе низкоактивных животных, перенесших хронический стресс, экспрессия МТ3 была в 2,36 раза выше, чем у низкоактивных крыс контрольной группы. При проведении
корреляционного анализа у низкоактивных животных были выявлены тенденции к наличию
средней силы взаимосвязей экспрессии МТ-3 с количеством коротких грумингов
(rs=0,283;p=0,066) и амбуляций (rs=0,255;p=0,098).
Результаты расчтётов кластерного анализа и данные описательной статистики о
подгруппах высокоактивных и низкоактивных животных представлены в таблице 2.
Таблица 2. Ориентировочно-исследовательское поведение крыс с различной двигательной
активностью в опытной и контрольной группах
Стресс
Показатель
Контроль
Высокая
активность
Низкая
активность
Высокая
активность
Низкая
активность
Количество замираний
0(0;1)*
1(0;4)*
1(0;2)
0(0;2)
Количество амбуляций
399(373;477)*
270(222;294)* 226(190;246)
50(39;87)
Количество опор на стенку
28(22;35)*
21(14;27)*
22(16;27)
7(5;11)
Количество отрывов лап от пола
12(8;16)*
9(4;16)*
4(3;8)
1(1;5)
Количество обследованных
отверстий
30(26;34)*
19(15;23*)
15(13;18)
4(3;5)
4,5(3;6)*
4(3;6)*
3(1;5)
1(0;2)
Количество длительных
грумингов
3(3;5)
5(4;6)
5(3;7)
5(4;6)
Количество актов дефекации
0(0;0)*
0(0;1)
2(0;3)
1(0;2)
Количество коротких грумингов
Количество выходов в центр
5(3;7)*
1(0;2)*
1(1;2)
0(0;0)
установки
* - различия статистически значимы относительно соответствующей подгруппы
активности в группе контроля (р<0,05)
В подгруппах животных, перенесших хронический стресс, наблюдали статистически
значимое увеличение показателей как горизонтальной, так и вертикальной двигательной
активности. Более высокое значение количества амбуляций в опытной группе может
свидетельствовать о повышенной эмоциональности крыс. В пользу повышения тревожности
у животных, перенесших хронический стресс, свидетельствуют повышение значений
показателей количества отрывов лап от пола и опор на стенку установки, а также факт
статистически значимого увеличения количества коротких грумингов.
Заключение
Экспрессия МТ-3 в тканях головного мозга при хроническом стрессе у крыс с
различными
типами
ориентировочно-исследовательского
поведения
отличается.
У
низкоактивных животных, перенесших хронический стресс, наблюдается статистически
значимое повышение экспрессии МТ-3, которое взаимосвязано с эмоциональностью
(количество
амбуляций)
и
тревожностью
(количество
коротких
грумингов).
У
высокоактивных крыс отсутствуют как статистически значимое изменение экспрессии МТ-3,
так и взаимосвязи с показателями ориентировочно-исследовательского поведения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. West, A.K. Metallothionein in the central nervous system: roles in protection, regeneration
and cognition / A.K. West [et al.] // Neurotoxicology. - 2008. - №29(3). - Р.488-502
2. Belloso, E. Effect of stress on mouse and rat brain metallothionein I and III mRNA levels /
E.Belloso [et al.] // Neuroendocrinology. – 1994. - №64(6). - Р.430-439
3. Hidalgo, J. Brain metallothionein in stress / J. Hidalgo [et al] // Biol Signals. – 1996. №3(4). - Р.192-210
4. Carrasco, J. Role of metallothionein-3 following central nervous system damage / J.
Carrasco [et.al] // Neurobiol Dis. – 2003. - №13(1). - Р.22-36
5. Lee, S.J. Roles of zinc and metallothionein-3 in oxidative stress-induced lyzosomal
dysfunction, cell death, and autophagy in neurons and astrocytes / S.J. Lee, Koh J.Y. // Mol
Brain. - 2010. - №3(1). - Р.3-30
6. Ortiz, J. Effect of stress in the mesolimbic dopamine system / J. Ortiz [et al.] //
Neuropsychopharmacology. – 1996. – Vol. 14, №6 – P. 443–452.
7. Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета
прикладных программ STATISTICA / О. Ю. Реброва. – М.: МедиаСфера, 2003. – 312 с.