Протокол работы для наборов FFPE ExtractDNA и FFPE

Протокол работы для наборов
FFPE ExtractDNA и FFPE ExtractDNA Plus
Необходимое оборудование
• Термостаты, 2 шт.
• Бытовой холодильник с холодильной и морозильной камерами
• Микроцентрифуга
• Автоматические дозаторы
Необходимые расходные материалы
(входят в состав сетов кат.## BMS03,BMS04, BMS05, BMS06).
• Стерильные одноразовые хирургические лезвия № 13 для работы со стеклопрепаратами (50 шт входят во все сеты)
• Микроцентрифужные пробирки на 1.5 мл (50 шт в сете # BMS04; 100 шт в сете
# BMS06)
• Микроцентрифужные пробирки на 0.5 мл (50 шт в сетах ## BMS04, BMS06)
(не входят в состав сетов кат.## BMS03, BMS04, BMS05, BMS06)
• Наконечники для дозатора с фильтрами
1. Выделение ДНК
1.1. Выделение ДНК из срезов с парафиновых блоков с фиксированной
формалином тканью
Прочтите внимательно!
Если вы работаете со стеклопрепаратами – см. раздел 1.1.А пункты 1-4.
Если вы работаете с отдельными срезами – см. раздел 1.1.Б пункты 1-4.
После выполнения пункта 4 в любом случае переходите к пункту 5
Общей части протокола.
Стартовый материал
Протокол рассчитан на обработку до 2 срезов, каждый толщиной до 6 мкм и общей
площадью до 2.5 см2 . При увеличении количества срезов необходимо пропорционально увеличить количество раствора для экстракции (из расчета 100 мкл на одну секцию).
www.evrogen.ru
1
стеклопрепараты
1.1.А. Работа со стеклопрепаратами
Перед началом работы убедитесь, что на стеклопрепарате нет покровного стекла
или заключающей среды. Методика удаления покровного стекла зависит от способа фиксации (возможна обработка ксилолом от 2 часов до нескольких суток).
1. Нанесите 20 мкл раствора FFPE ExtractDNA на парафиновые срезы на стеклопрепарате. Равномерно распределите раствор по поверхности среза.
2. Инкубируйте стеклопрепарат 2 минуты при комнатной температуре.
3. Отделите срезы от поверхности стекла. Это рекомендуется сделать с помощью
одноразового хирургического лезвия или стерильного скальпеля.
Для отделения среза от стекла поскребите лезвием по поверхности среза, затем соберите все отделившиеся фрагменты среза в один плотный комок.
4. Поместите 180 мкл раствора FFPE ExtractDNA в микроцентрифужную пробирку объемом 0.5 мл и перенесите туда полученный комок.
I Далее следуйте Общей части протокола (начиная с п. 5).
1.1.Б. Работа с отдельными срезами
срезы
1. Подготовьте гистологические срезы.
2. Поместите 200 мкл раствора FFPE ExtractDNA в чистую пробирку объемом
0.5 мл.
3. Поместите 1-2 среза в пробирку с раствором.
4. Закройте крышку и встряхните.
I Далее следуйте Общей части протокола (начиная с п. 5).
Общая часть протокола
5. Инкубируйте пробирку в термостате при температуре 56°C в течение 30 минут.
6. Перемешайте пробирку аккуратным встряхиванием и поместите её обратно в термостат на 56°C .
7. Инкубируйте пробирку в термостате при температуре 56°C в течение 30 минут.
8. Инкубируйте пробирку в термостате при температуре 90°C в течение 1 часа.
9. Пока пробирка находится на инкубации, заранее (за 15-20 минут) включите второй термостат на температуру 98°C .
10. Инкубируйте пробирку в термостате при температуре 98°C в течение 2 минут.
11. Поместите пробирку в микроцентрифугу. Центрифугируйте при максимальных оборотах в течение 2 минут.
12. Поместите пробирку в холодильник на +4°C –+16°C на 5 минут.
I После охлаждения в холодильнике в пробирке будет виден осадок, над ним – полупрозрачная жидкость, над ней плотное кольцо из парафина.
13. С помощью наконечника объёмом 200 мкл проделайте отверстие в кольце из парафина.
14. С помощью другого наконечника объёмом 200 мкл отберите жидкость, стараясь
не захватить осадок и парафин из кольца, и перенесите её в новую пробирку на
1.5 мл. Объём отобранной жидкости составит около 170 мкл.
2
1.2. Выделение ДНК из буккального эпителия
I Для работы потребуются стерильные ватные палочки или щетки для сбора биологического материала.
1. Произведите взятие пробы согласно правилам отбора биологического материала.
2. Поместите 200 мкл раствора FFPE ExtractDNA в чистую пробирку объемом 0.5 мл.
3. Ножницами срежьте конец ватной палочки или щетки, содержащий биоматериал
и поместите его в пробирку с раствором.
4. Закройте крышку пробирки и перемешайте на вортексе.
5. Инкубируйте пробирку в термостате при температуре 56°C в течение 30 минут.
6. Инкубируйте пробирку в термостате при температуре 98°C в течение 2 минут.
7. Центрифугируйте пробирку при максимальных оборотах 5 минут.
8. Отберите жидкость чистым наконечником и перенесите ее в новую пробирку объемом 1.5 мл. Объем отобранной жидкости 6 200 мкл.
1.3. Выделение ДНК из слюны
1. Произведите взятие слюны согласно правилам отбора биологического материала.
2. Поместите 200 мкл раствора FFPE ExtractDNA в чистую пробирку объемом 0.5 мл.
3. Поместите 50-200 мкл слюны в пробирку с раствором.
4. Закройте крышку пробирки и перемешайте на вортексе.
5. Инкубируйте пробирку в термостате при температуре 56°C в течение 30 минут.
6. Инкубируйте пробирку в термостате при температуре 98°C в течение 2 минут.
7. Центрифугируйте пробирку при максимальных оборотах 5 минут.
8. Отберите жидкость чистым наконечником и перенесите ее в новую пробирку объемом 1.5 мл. Объем отобранной жидкости до 400 мкл.
Полученная жидкость представляет собой раствор ДНК, пригодный для использования в ПЦР и ПЦР-РВ. Компоненты набора не вызывают существенного ингибирования ПЦР при добавлении в реакцию до 60% по объёму.
В случае, если ДНК планируется использовать для рестрикции, лигирования или
для сложных ферментативных реакций, а также в случае обнаружения недостаточной концентрации ДНК в образце и/или существенного ингибирования ПЦР
рекомендуется провести процедуру очистки и концентрирования ДНК (этап 2).
Полученный раствор ДНК может храниться при температуре -20°C или -70°C до
6 месяцев.
www.evrogen.ru
3
2. Очистка и концентрация ДНК
(для набора FFPE ExtractDNA Plus, BM002)
I Добавьте 26 мл 96% этанола во флакон с концентрированным «Промывочным
раствором».
Нанесите пометку о добавлении этанола на крышку флакона.
Все центрифугирования проводятся на максимальной скорости (10000-13000 g).
1. Добавьте к полученному раствору ДНК (раздел 1 п.14) 5 объёмов «Связывающего
раствора». Перемешайте на вортексе.
I При работе со образцами слюны объем жидкости, отобранной на первом этапе, не
должен превышать 400 мкл. Добавьте к полученному раствору 1 мл «Связывающего
раствора». Далее образец обрабатывается согласно общему протоколу очистки.
2. Поместите спин-колонку в собирательную пробирку.
3. Перенесите смесь в колонку (не более 750 мкл) и центрифугируйте 30 сек. Удалите
фильтрат из собирательной пробирки.
I Максимальный объем колонки – 750 мкл. Если объем пробы больше 750 мкл, нужно
разделить на два нанесения, после каждого нанесения колонку центрифугировать и
удалять фильтрат.
4. Добавьте 200 мкл «Промывочного раствора» в колонку и центрифугируйте 30 сек.
5. Повторите пункт 4.
6. Удалите фильтрат из собирательной пробирки и поместите колонку обратно. Центрифугируйте пустую колонку 1 мин, для полного удаления промывочного раствора.
7. Перенесите колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объёмом 1.5 мл.
8. Добавьте 10-50 мкл «Элюирующего раствора» на мембрану колонки и инкубируйте
2-3 мин при комнатной температуре.
I При необходимости объём добавляемого раствора можно увеличить.
9. Центрифугируйте 30 секунд для сбора очищенной ДНК.
Очищенная ДНК пригодна для всех молекулярно-биологических процедур
(ПЦР, секвенирование, рестрикция, лигирование, пробоподготовка к NGS и др.)
Очищенная ДНК хранится при температуре -20°C или -70°C до 1 года.
4