006827 Область, к которой относится изобретение

006827
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области выделения РНК, ДНК и белков из биологических образцов тканей.
Предшествующий уровень техники
Определение уровней экспрессии генов в тканях имеет особенно важное значение для точной диагностики заболевания человека и находит все большее применение для назначения нужного курса лечения. Фармакогеномные методы могут приводить к идентификации тех пациентов, которые, по всей вероятности, будут восприимчивыми к лечению данным лекарственным средством, и такие методы могут
способствовать разработке новых терапевтических методик.
Так, например, тимидилатсинтаза (TS) является главным ферментом в биосинтезе ДНК, где она катализирует восстановительное метилирование дезоксиуридинмонофосфата (dUMP) с образованием дезокситимидинмонофосфата (dTMP) и обеспечивает лишь путь de novo синтеза пиримидиновых нуклеотидов в клетке (Johnston et al., 1995). Тимидилатсинтаза является мишенью для химиотерапевтических
лекарственных средств, а чаще всего, для антифолатного агента 5-фторурацила (5-FU). Главным действием 5-FU, как наиболее эффективного и единственного средства для лечения рака толстой кишки, рака
головы и шеи и рака молочной железы, является ингибирование TS-активности, которое приводит к
снижению внутриклеточных уровней тимина, а затем к гибели клеток.
Сообщалось, что в клинических опухолевых образцах, взятых как из первичных опухолей (Johnston
et al., 1995; Lenz et al., 1995), так и из метастазов (Farrugia et al., 1997; Leichmann et al., 1997), наблюдалось значительное варьирование экспрессии TS. Так, например, при раке толстой кишки отношение экспрессии TS в опухолевой ткани к экспрессии TS в нормальной ткани слизистой желудочно-кишечного
тракта составляет в пределах от 2 до 10 (Ardalan & Zang, 1996).
Также известно, что тимидилатсинтаза имеет клинически важное значение для развития опухолевой
резистентности, как было продемонстрировано в результате исследований, которые показали высокую
степень индуцирования белка TS и увеличение уровней фермента TS в опухолевых клетках после их обработки 5-FU (Spears et al., 1982; Swain et al., 1989). Способность опухоли к резкому увеличению экспрессии TS в ответ на действие цитотоксических агентов, таких как 5-FU, может играть определенную
роль в развитии резистентности к фторурацилу. Проведенные ранее исследования показали, что уровни
белка TS непосредственно коррелируют с эффективностью 5-FU-терапии, то есть наблюдается непосредственная корреляция между экспрессией белка и РНК (Jackman et al., 1985), и что экспрессия TS является
мощным прогностическим индикатором при раке толстой кишки и молочной железы (Jackman et al.,
1985; Horikoshi et al., 1992).
Было показано, что при заболевании с прогрессирующим метастазированием высокие уровни мРНК
TS, количественно определяемые с помощью ОТ-ПЦР, а также высокие уровни экспрессии белка TS позволяют предсказать слабый ответ пациента на фторпиримидиновую терапию рака толстой кишки
(Johnston et al., 1995, Farrugia et al., 1997, Leichman et al., 1997), желудка (Lenz et al., 1995, Alexander et al.,
1995), а также рака головы и шеи (Johnston et al., 1997). Значительное перекрывание между пациентамиреспондентами и пациентами, не являющимися респондентами, часто наблюдается у пациентов категории с низкими уровнями TS, но среди пациентов с уровнями TS, превышающими средние значения, преобладают пациенты, не являющиеся респондентами. Прогностическое значение сверхэкспрессии TS может быть еще более усилено, если одновременно учитывать и другие молекулярные характеристики, такие как уровни экспрессии дигидропиримидин-дегидрогеназы (DPD) и тимидин-фосфорилазы (ТР), положительный статус ошибки репликации (RER+) (Kitchens & Berger, 1997) и р53-статус (Lenz et al.,
1997). Исследования, которые проводились до настоящего времени и в которых была оценена экспрессия
TS в опухолях человека, дают основание предположить, что возможность предсказания ответа на лечение и его результата на основе экспрессии TS в опухолях человека позволит в будущем отбирать пациентов, у которых, по всей вероятности, будет наблюдаться благоприятный эффект при TS-направленной
терапии.
Вплоть до настоящего времени количественные исследования экспрессии генов в тканях, включая
экспрессию TS, ограничивались амплификацией РНК из замороженной ткани, проводимой посредством
полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Однако большинство патологических образцов получают не в виде замороженных тканей, а в виде традиционно приготавливаемых фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE) тканей, которые пригодны для проведения гистологических анализов и хранения в архивах. Полуколичественный и опосредованный мониторинг уровней
экспрессии генов в таких фиксированных и залитых образцах может быть проведен с помощью иммуногистохимического окрашивания в целях наблюдения за уровнями экспрессии белка. Поскольку залитые в
парафин образцы имеют широкое применение, то необходимы быстрые и надежные методы выделения
нуклеиновых кислот, а в частности РНК, из указанных образцов.
Существует ряд методов выделения РНК из биологических образцов, однако, ни один из них не является достаточно надежным для выделения РНК из FFPE-образцов. Так, например, Хомчинский
(Chomczynski, патент США № 5346994) описывает метод выделения РНК из тканей на основе жидкофазного разделения с использованием фенола и гуанидинизотиоцианата. Биологический образец гомогени-1-
006827
зируют в водном растворе фенола и гуанидинизотиоцианата, а затем гомогенат смешивают с хлороформом. После центрифугирования гомогенат разделяют на органическую фазу, интерфазу и водную фазу.
Белки секвестируются в органической фазе, ДНК в интерфазе, а РНК в водной фазе. РНК может осаждаться из водной фазы. Этот метод не позволяет осуществлять надежное выделение РНК из фиксированных формалином и залитых в парафин образцов ткани.
В других известных методах выделения РНК обычно используют экстракцию либо солями гуанидина, либо фенолом, как описано, например, Sambrook J. et al., (1989), pp. 7.3.-7.24 и Ausubel F.M. et al.
(1994), pp. 4.0.3-4.4.7. Однако ни один из этих известных методов не дает воспроизводимых количественных результатов при выделении РНК из залитых в парафин образцов ткани.
Способы выделения РНК из залитых в парафин тканей особенно необходимы при исследовании
экспрессии генов в опухолевых тканях. Уровни экспрессии некоторых рецепторов или ферментов могут
указывать на вероятность успеха данного конкретного лечения.
В действительности, количественные исследования экспрессии гена TS были ограничены ОТ-ПЦР
для замороженной ткани, тогда как полуколичественный мониторинг экспрессии белка TS в архивном
патологическом материале, фиксированном на предметных стеклах, является доступным посредством
иммуногистохимического окрашивания. Из-за ограничений в выделении РНК из архивного патологического материала количественные методы измерения уровней экспрессии генов в таких образцах до сих
пор не были осуществимыми.
Краткое описание изобретения
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к надежному способу выделения РНК,
ДНК или белков из образцов биологических тканей. Настоящее изобретение также относится к простым,
эффективным и воспроизводимым способам выделения РНК, ДНК или белков из ткани, залитой в парафин.
Настоящее изобретение относится к способам очистки РНК из биологического образца ткани путем
нагревания данного образца в течение примерно 5-120 мин при температуре от примерно 50 до примерно
100°С в растворе с эффективной концентрацией хаотропного агента. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хаотропным агентом является гуанидиниевое соединение. Затем из указанного раствора выделяют РНК. Так, например, выделение РНК может быть осуществлено посредством
экстракции хлороформом.
В способе настоящего изобретения РНК выделяют из архивного патологического образца. В одном
из вариантов осуществления настоящего изобретения залитый в парафин образец сначала подвергают
депарафинированию. Обычно применяемый способ депарафинирования предусматривает промывку парафинированного образца органическим растворителем, предпочтительно ксилолом. Депарафинированные образцы могут быть подвергнуты повторной гидратации с использованием водного раствора низшего спирта. Подходящими низшими спиртами являются метанол, этанол, пропанолы и бутанолы. В одном
из вариантов осуществления изобретения депарафинированные образцы подвергают повторной гидратации путем последовательной промывки растворами низших спиртов с понижающейся концентрацией. В
другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный образец одновременно подвергают
депарафинированию и повторной гидратации.
Депарафинированные образцы могут быть гомогенизированы посредством механической, ультразвуковой или какой-либо другой гомогенизации. В одном из вариантов осуществления изобретения повторно гидратированные образцы гомогенизируют в растворе, содержащем хаотропный агент, такой как
тиоцианат гуанидиния (также имеющийся в продаже под названием "изотиоцианат гуанидиния").
Полученные гомогенизированные образцы нагревают до температуры в пределах от примерно 50
до примерно 100°С в хаотропном растворе, содержащем эффективное количество хаотропного агента. В
одном из вариантов осуществления изобретения хаотропным агентом является гуанидиниевое соединение. Предпочтительным хаотропным агентом является тиоцианат гуанидиния.
Затем РНК выделяют из раствора, например, посредством экстракции смесью фенол-хлороформ,
ионообменной хроматографии или эксклюзионной хроматографии.
Затем РНК может быть очищена посредством экстракции, электрофореза, хроматографии, преципитации или другими подходящими методами.
РНК, выделенная способами настоящего изобретения, может иметь множество применений в молекулярной биологии, включая обратную транскрипцию с использованием рандомизированных праймеров
для создания кДНК-библиотек.
Очищенная РНК может быть использована для определения уровня экспрессии генов в фиксированном формалином и залитом в парафин образце ткани путем амплификации с помощью полимеразной
цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). С использованием соответствующих ПЦРпраймеров уровень экспрессии любой информационной РНК может быть определен способами настоящего изобретения. Количественный ОТ-ПЦР-метод позволяет сравнивать уровни экспрессии белка в
залитом в парафин образце (иммуногистохимическим методом) с уровнями экспрессии генов (с использованием ОТ-ПЦР) в том же самом образце.
Способы настоящего изобретения могут быть применены в отношении широкого ряда тканей и
опухолей и генов-мишеней, и, таким образом, они могут быть использованы для оценки лечения и в ка-2-
006827
честве средства для диагностики ряда раковых заболеваний, включая рак молочной железы, головы и
шеи, пищевода, толстой кишки и т.п. Особенно предпочтительным геном в способах настоящего изобретения является ген тимидилатсинтазы. Способы настоящего изобретения позволяют проводить воспроизводимое количественное определение экспрессии гена TS в FFPE-тканях, сравнимое с количественным
определением экспрессии этого гена в образцах, полученных из замороженной ткани.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1 показан уровень экспрессии β-актина и TS в различные периоды нагревания. Эти данные
показали, что, без проведения стадии нагревания, выход РНК, экстрагированной из парафина, является
минимальным.
На фиг. 2 показан уровень экспрессии β-актина в нормальной (N) или опухолевой (Т) ткани у пациентов с раком толстой кишки, где этот уровень был определен путем проведения количественной ПЦР
для РНК, экстрагированной при 95°С в течение 0-40 мин. Полученные данные дают основание предположить, что период времени в 30 мин является оптимальным временем нагревания.
На фиг. 3 показано влияние температуры и времени нагревания на выход РНК β-актина и на выделение ДНК. Полученные данные показали, что при более длительном времени нагревания (от 60 до 120
мин) РНК подвергается деградации и при этом наблюдается увеличение уровней примесной ДНК, способной генерировать ДНК-ПЦР-сигнал. Представлены гистограммы, которые иллюстрируют значения,
полученные в экспериментах с тройными повторностями в различные периоды времени и при различных
температурах.
На фиг. 4 показано влияние различных растворов для нагревания на выход выделенной РНК. Эти
данные показывают, что хаотропный агент в растворе, а в данном случае изотиоцианат гуанидиния
(GITC), является главным компонентом раствора для экстракции РНК, в отсутствиe которого выход экстрагированной РНК был бы ниже, по крайней мере, в 10 раз.
На фиг. 5 показано сравнение относительной экспрессии гена TS в залитом в парафин образце (белые столбцы) и в замороженных клеточных осадках (черные столбцы), происходящих от шести клеточных линий. Полученные данные показывают, что анализ экстрагированной из парафина РНК позволяет
надежно определить уровни экспрессии генов в свежезамороженной ткани.
На фиг. 6 показано сравнение уровней экспрессии гена TS в нормальных или опухолевых тканях
толстой кишки и опухолевых тканях пищевода, которые были либо фиксированы формалином и залиты
в парафин, либо заморожены.
На фиг. 7 показаны отношения TS/β-актина, определенные в парафиновых срезах, взятых от пациентов, чьи ответы на 5-FU/LV ранее были ассоциированы с экспрессией гена TS.
На фиг. 8 показаны уровни экспрессии четырех маркерных генов злокачественных опухолей (TS;
тимидинфосфорилазы (ТР); циклооксигеназы-2 (СОХ-2); и васкулярного эндотелиального фактора роста
(VEGF)) в FFPE-образцах первичного рака толстой кишки и метастазов печени, которые давали рецидивы через год у того же самого пациента. Полученные данные показали, что, как и ожидалось, уровни
трех из четырех маркеров злокачественной опухоли были увеличены в опухолевой ткани с метастазами.
Подробное описание изобретения
Способы настоящего изобретения предусматривают выделение РНК из биологических образцов. В
одном из вариантов своего осуществления образцы представляют собой образцы ткани, залитые в парафин, а указанный способ предусматривает депарафинирование залитых образцов, гомогенизацию указанной депарафинированной ткани и нагревание гомогенизированной ткани при температуре в пределах
от примерно 50 до примерно 100°С в течение от примерно 5 до примерно 120 мин в хаотропном растворе, содержащем эффективное количество гуанидиниевого соединения. На этой стадии нагревания происходит увеличение, вплоть до 1000-кратного, количества амплифицированной из образца кДНК по сравнению с образцами, которые не были подвергнуты нагреванию.
Поскольку замороженная опухолевая ткань не является общедоступной, парафиновые блоки получают рутинным способом из опухоли каждого типа после хирургической операции, что позволяет проводить крупномасштабные ретроспективные исследования экспрессии TS и ответа на химиотерапию.
Кроме того, указанный метод может быть применим для опухолей широкого ряда и для геновмишеней неограниченного диапазона. Этот метод может быть использован в будущем для получения
"профилей экспрессии генов" отдельных опухолей, в результате чего уровни экспрессии могут быть определены в образцах, взятых у отдельного пациента, для ряда генов, о которых известно, что они влияют
на клинический результат и ответ на различные химиотерапевтические агенты. Автоматизированная
ПЦР-реакция в режиме реального времени, осуществляемая на FFPE-образце, позволяет обеспечивать
лечение, нацеленное на конкретные опухоли.
Образцы ткани
РНК может быть выделена из любого биологического образца способами настоящего изобретения.
Биологические образцы часто фиксируют фиксатором. Обычно используются альдегидные фиксаторы,
такие как формалин (формальдегид) и глутаральдегид. Образцы ткани могут быть также фиксированы
другими методами фиксации, такими как погружение в спирт (Battifora & Kopinski, J. Histochem. Cytochem.
-3-
006827
(1986) 34:1095). Используемые образцы также заливают в парафин. РНК может быть выделена из любого
залитого в парафин биологического образца ткани способами настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образцы являются фиксированными формалином и залитыми в парафин.
Депарафинирование образцов
Депарафинирование позволяет удалять большой объем парафина с залитого в парафин образца. Известен ряд методов депарафинирования, и любой подходящий метод может быть использован в настоящем изобретении. Предпочтительный способ настоящего изобретения предусматривает промывку органическим растворителем для растворения парафина. Такие растворители дают возможность эффективно
удалять парафин с данного образца ткани, не оказывая при этом негативного влияния на выделение РНК.
Подходящие растворители могут быть выбраны из растворителей, таких как бензол, толуол, этилбензол,
ксилолы и их смеси. Для использования в способах настоящего изобретения предпочтительным растворителем является ксилол. В способах настоящего изобретения растворители, взятые как отдельно, так и в
комбинации, предпочтительно имеют высокую чистоту, обычно составляющую более чем 99%.
Парафин обычно удаляют посредством промывки органическим растворителем при интенсивном
перемешивании, с последующим центрифугированием. Образцы центрифугируют при скорости, достаточной для осаждения ткани в пробирке, обычно от примерно 10000 до примерно 20000 х g. После центрифугирования супернатант органического растворителя отбрасывают. Каждому специалисту в области
гистологии известно, что объем используемого органического растворителя и число промывок зависят от
размера образца и количества удаляемого парафина. Чем больше количество парафина, которое нужно
удалить, тем больше промывок необходимо провести. Обычно образец промывают от примерно 1 до
примерно 10 раз, а предпочтительно от примерно 2 до примерно 4 раз. Обычно объем органического растворителя составляет примерно 500 мкл на 10 мкм образца ткани.
В способе настоящего изобретения могут быть использованы и другие методы депарафинирования,
известные специалистам. Указанные способы включают прямое плавление (Banerjee et al., 1995).
После депарафинирования образцы предпочтительно подвергают повторной гидратации. Предпочтительным способом повторной гидратации является постадийная промывка водными растворами низших спиртов с понижающейся концентрацией. Предпочтительным низшим спиртом для повторной гидратации является этанол. В настоящем изобретении могут быть также использованы и другие спирты,
включая метанол, изопропанол и другие подобные спирты С1-С5-ряда. Альтернативно, образец тщательно смешивают со спиртовыми растворами и центрифугируют. В предпочтительном варианте осуществления изобретения интервал концентраций спирта в воде постепенно снижают от примерно 100 до
примерно 70% примерно за 3-5 стадий с инкрементом убывания, где изменение концентрации раствора в
каждой стадии обычно составляло примерно менее 10% (т.е. последовательность 100%, 95%, 90%, 80%,
70%). В другом варианте осуществления изобретения депарафинирование и повторную гидратацию осуществляют одновременно с использованием такого реагента, как EZ-DEWAX (BioGenex, San Ramon, CA).
Гомогенизация
Депарафинированные, повторно гидратированные образцы могут быть гомогенизированы стандартными механическими, ультразвуковыми или другими подходящими методами. Гомогенизацию тканей предпочтительно осуществляют с использованием механических гомогенизаторов для ткани в соответствии со стандартными процедурами. Существует ряд коммерчески доступных гомогенизаторов, которые являются подходящими для использования в настоящем изобретении, включая гомогенизатор UltraTurrax (IKA-Works, Inc., Wilmington, NC); Tissumizer (Tekmar-Dohrmann, Cincinnati, ОН); и Polytron
(Brinkmann, Westbury, NY).
В одном из вариантов осуществления изобретения образец гомогенизируют в присутствии хаотропного агента. Хаотропные агенты выбирают так, чтобы при эффективном концентрировании РНК
можно было выделить из залитого в парафине образца в количестве, примерно в 10 раз превышающем
количество РНК, выделяемой в отсутствии хаотропного агента. Хаотропными агентами являются гуанидиниевые соединения, мочевина, формамид, иодид калия, тиоцианат калия и аналогичные соединения.
Предпочтительным хаотропным агентом, применяемым в способах настоящего изобретения, является
гуанидиниевое соединение, такое как изотиоцианат гуанидиния (имеющийся в продаже также под названием изотиоцианат гуанидиния) и гидрохлорид гуанидиния. Могут быть использованы многие анионные
аналоги, и, используя соответствующие анионы, каждый специалист может получить множество солей
гуанидиния. Раствор гуанидиния, используемый в настоящем изобретении, имеет концентрацию, в основном, в пределах от примерно 1 до примерно 5 М, а предпочтительно примерно 4 М. Если РНК уже
присутствует в растворе, то раствор гуанидиния может иметь более высокую концентрацию, такую, чтобы конечная концентрация в образце достигала порядка от примерно 1 до примерно 5 М. Предпочтительно также раствор гуанидиния забуферивают до рН от примерно 3 до примерно 6, более предпочтительно примерно 4, подходящим биохимическим буфером, таким как Трис-Cl. Хаотропный раствор может также содержать восстановители, такие как дитиотреитол (DTT) и β-меркаптоэтанол (ВМЕ). Хаотропный раствор может также содержать ингибиторы РНКазы.
-4-
006827
Нагревание
Образцы нагревают в хаотропном растворе при температуре от примерно 60 до примерно 100°С в
течение периода времени от примерно 5 мин до примерно 2 ч. Альтернативно, образцы нагревают в хаотропном растворе при температуре от примерно 50 до примерно 100°С в течение периода времени от
примерно 5 мин до примерно 2 ч. Время нагревания обычно выбирают так, чтобы количество очищенной
РНК, по крайней мере, примерно в 100 раз, а более предпочтительно примерно в 1000 раз, превышало
количество РНК для необработанных образцов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения образец нагревают примерно в течение 20 мин при температуре от примерно 75°С до примерно
100°С. Более предпочтительно образец нагревают примерно в течение 30-60 мин при температуре примерно 95°С.
Выделение РНК
После нагревания РНК может быть выделена из хаотропного раствора любым подходящим методом, который приводит к отделению РНК, по крайней мере, от одного компонента хаотропного раствора.
РНК может быть выделена из хаотропного раствора посредством экстракции органическим растворителем, экстракции хлороформом, экстракции смесью фенола-хлороформа, преципитации этанолом, изопропанолом или любым другим низшим спиртом, с помощью хроматографии, включая ионообменную
хроматографию, эксклюзионную хроматографию, хроматографию на силикагеле и обращенно-фазовую
хроматографию, либо электрофоретическими методами, включая гель-электрофорез в полиакриламидном геле и гель-электрофорез в агарозе, как это известно любому специалисту. РНК выделяют предпочтительно из хаотропного раствора посредством экстракции смесью фенола-хлороформа .
После выделения РНК, РНК может быть, но необязательно, подвергнута дополнительной очистке.
После дополнительной очистки РНК, в основном, не содержит примесной ДНК или белков. Дополнительная очистка может быть осуществлена любыми вышеуказанными способами, пригодными для выделения РНК. РНК предпочтительно очищают путем преципитации с использованием низших спиртов, а в
частности этанола или изопропанола. Преципитацию предпочтительно осуществляют в присутствии носителя, такого как гликоген, который облегчает преципитацию.
Выделение ДНК и белков
Способы настоящего изобретения могут быть также использованы для выделения ДНК или белков
из образца ткани. После смешивания с органическим растворителем, таким как хлороформ, и последующего центрифугирования раствор имеет три фазы: нижнюю органическую фазу, интерфазу и верхнюю
водную фазу. С использованием соответствующего хаотропного агента, а в частности гуанидиниевого
соединения, биологические компоненты образца будут распределяться по трем фазам. Верхняя водная
фаза будет содержать РНК, интерфаза будет содержать ДНК, а органическая фаза будет содержать белки.
При этом следует отметить, что способы настоящего изобретения могут быть использованы для выделения фаз, содержащих ДНК и белок, а также фазы, содержащей РНК. Выход ДНК увеличивался при применении способов настоящего изобретения.
Очищенная РНК
РНК, очищенная способами настоящего изобретения, может быть использована в различных целях
и в методах молекулярной биологии, включая, но не ограничиваясь ими, обратную транскрипцию в
ДНК, продуцирование радиоактивно, флуоресцентно или как-либо иначе меченной ДНК для анализа на
генных "чипах", олигонуклеотидных микроматрицах и т.п.; электрофорез в полиакриламидном или агарозном геле; очистку с помощью хроматографии (например, ионообменной хроматографии, хроматографии на силикагеле, обращенно-фазовой хроматографии или эксклюзионной хроматографии); гибридизацию с нуклеотидными зондами; и фрагментацию механическими, ультразвуковыми или другими средствами.
Примеры
Материалы и методы
Указанные материалы и методы являются общими для нижеследующих примеров.
Приготовление образца.
Характеристики человеческих клеточных линий SK1, Н157, А431, НТ29, НСС298 и НН30 были
описаны раньше. Клетки удаляли из их монослоев путем трипсинизации и осаждения центрифугированием при 3000 об./мин в течение 5 мин. Клеточные осадки либо замораживали при -70°С, либо фиксировали в формалине в течение 24 ч, а затем заливали в парафин.
Репрезентативные срезы опухолевой ткани получали во время хирургической операции, фиксировали формалином и заливали в парафин в соответствии с процедурой, обычно проводимой в большинстве лабораторий клинической патологии.
Выделение РНК.
РНК выделяли из залитой в парафин ткани следующим образом. Один 5 мкм-срез парафинированной ткани помещали в пробирку Эппендорфа и депарафинировали двумя 15-минутными промывками
ксилолом. Эту ткань повторно гидратировали путем последовательных 15-минутных промывок спиртами
разной крепости (100%, 95%, 80% и 70%). Полученный осадок суспендировали в 4М гуанидинизоцианате с 0,5% сакрозином и 20 мМ дитиотреитолом (DTT). Суспензию гомогенизировали, а затем нагревали
-5-
006827
примерно до 50-95°С в течение 0-60 мин; при этом нагревание в момент времени 0 рассматривалось в
качестве контроля для каждого образца. Затем добавляли ацетат натрия (рН 4,0) до концентрации 0,2 М и
раствор экстрагировали смесью фенол/хлороформ и осаждали изопропанолом с 10 мг гликогена. После
центрифугирования (13000 об./мин, 4°С, 15 мин) РНК-осадок 2 раза промывали 1 мл 75% этанола, а затем ресуспендировали в воде, не содержащей РНКазу.
Обратная транскрипция (RT).
После нагревания общую РНК превращали в кДНК с использованием рандомизированных гексамеров. Условия RT были аналогичны условиям, описанным ранее для замороженной ткани (Horikoshi et al.,
1992). Для каждого образца был получен контроль, не содержащий обратной транскриптазы (No-RT).
Количественная ПЦР-оценка экспрессии генов TS и β-актина в режиме реального времени с использованием ПЦР-аппарата Perkin-Elmer Cetus 7700 (Taqman).
Количественную оценку уровней мРНК проводили с помощью ПЦР в режиме реального времени в
соответствии с методом детекции флуоресценции, описанным ранее (Heid et al., Eads et al., 1996). кДНК
получали, как описано выше. Каждую нужную кДНК и эталонную кДНК амплифицировали отдельно с
использованием зонда с 5'-флуоресцентным репортерным красителем (6FAM) и 3'-красителем-"обрыва"
(TAMRA). Полимераза TAQ с 5'-экзoнyклeaзнoй активностью расщепляла зонд и высвобождала репортерную молекулу, флуоресценцию которой детектировали с использованием системы детекции ABI
Prism Sequence Detection System (Taqman). После прохождения порога детекции флуоресценции ПЦРамплификация приводила к флуоресцентному сигналу, пропорциональному количеству генерируемого
ПЦР-продукта. Начальную концентрацию матрицы определяли, исходя из числа циклов, при которых
флуоресцентный сигнал пересекает порог в экспоненциальной фазе ПЦР-реакции. Относительную экспрессию гена определяли, исходя из пороговых циклов нужного гена и эталонного гена. Использование
эталонного гена позволяет избежать необходимости проведения прямой оценки количества РНК, которая
является главным источником ошибок.
Праймер и зонд имеют следующие последовательности:
TS: SEQ ID NO: 1: GGC CTC GGT GTG CCT TT; SEQ ID NO: 2: AAC ATC GCC AGC TAC GCC
CTG C; SEQ ID NO: 3: GAT GTG CGC AAT CAT GTA CGT. β-актин: SEQ ID NO: 4: TGA GCG CGG
СТА CAG CTT; SEQ ID NO: 5: ACC ACC ACG GCC GAG CGG; SEQ ID NO: 6: TCC TTA ATG TCA CGC
ACG ATT Т. Для ПЦР-экспериментов в режиме реального времени, обсуждаемых выше, репортерный
олигонуклеотид (SEQ ID NO: 2 и 5) был помечен 6FAM по 5'-концу и TAMRA по 3'-концу.
Для каждой ПЦР был включен контроль "без обратной транскриптазы" (NRT или No-RT). Эта реакция была проведена в целях коррекции в отношении любой фоновой амплификации, обусловленной
присутствием примеси в виде остаточной геномной ДНК. А поэтому каждое общее значение для TS и βактина вычисляли как величину RT минус величину NRT (RT-NRT).
Статистический анализ.
Для того чтобы определить, являются ли уровни TS в образцах замороженных тканей и в FFPEобразцах одной и той же опухоли значимыми или незначимыми, проводили непараметрическое сравнение с применением критерия, основанного на использовании средних значений.
Пример 1. Общая процедура выделения РНК.
РНК экстрагируют из залитой в парафин ткани в соответствии с нижеследующей общей процедурой.
А. Депарафинирование и гидратация срезов.
(1) Часть среза приблизительно в 10 мкМ помещают в пластиковую центрифужную 1,5-мл пробирку.
(2) Добавляют 600 мкл ксилола и смесь тщательно взбалтывают в течение приблизительно 10 мин
при комнатной температуре (примерно 20-25°С).
(3) Образец центрифугируют на лабораторной центрифуге примерно 7 мин при комнатной температуре и при максимальной скорости (примерно 10-20000 х g).
(4) Стадии 2 и 3 повторяют до тех пор, пока не растворится большая часть парафина. Обычно требуется двух- или трехкратное повторение в зависимости от количества парафина, включенного в данную
часть исходного образца.
(5) Раствор ксилола удаляют интенсивным встряхиванием с низшим спиртом, предпочтительно со
100% этанолом (примерно 600 мкл) приблизительно в течение 3 мин.
(6) Пробирку центрифугируют приблизительно 7 мин, как описано в стадии (3). Супернатант декантируют и отбрасывают. Осадок приобретает белый цвет.
(7) Стадии 5 и 6 повторяют с последовательным использованием более разбавленных растворов
этанола: сначала примерно 95% этанола, а затем примерно 80% и, наконец, примерно 70% этанола.
(8) Образец центрифугируют в течение 7 мин при комнатной температуре, как описано в стадии (3).
Супернатант отбрасывают и осадок оставляют для сушки при комнатной температуре примерно на 5 мин.
В. Выделение РНК с использованием смеси фенол-хлороформ.
(1) Добавляют 400 мкл раствора гуанидинизотиоцианата, включающего 0,5% саркозина и 8 мкл 1 М
дитиотреитола.
-6-
006827
(2) Затем образец гомогенизируют с использованием гомогенизатора для тканей (Ultra-Turrax, IKAWorks, Inc., Wilmington, NC) в течение примерно 2-3 мин при постепенном увеличении скорости от низкой (скорость 1) до высокой (скорость 5).
(3) Затем образец нагревают примерно при 95°С в течение приблизительно 5-20 мин. Перед нагреванием крышку пробирки, содержащей образец, предпочтительно протыкают тонкой иглой. Альтернативно, эта крышка может быть закреплена пластиковым зажимом или лабораторной пленкой.
(4) Затем образец экстрагируют 50 мкл 2 М ацетата натрия при рН 4,0 и 600 мкл свежей смеси фенола/хлороформа/изоамилового спирта (10:1,93:0,036), полученной смешиванием 18 мл фенола и 3,6 мл
раствора изоамилового спирта:хлороформа (1:49). Этот раствор интенсивно встряхивают примерно 10 с,
а затем охлаждают на льду примерно 15 мин.
(5) Раствор центрифугируют в течение примерно 7 мин при максимальной скорости. Верхнюю
(водную) фазу переносят в новую пробирку.
(6) РНК осаждают с использованием примерно 10 мкл гликогена и 400 мкл изопропанола в течение
30 мин при -20°С.
(7) Полученную РНК осаждают центрифугированием в течение примерно 7 мин в лабораторной
центрифуге при максимальной скорости; супернатант декантируют и отбрасывают; и осадок промывают
приблизительно 500 мкл этанола (примерно 70-75%).
(8) Образец снова центрифугируют в течение 7 мин при максимальной скорости. Супернатант декантируют и осадок сушат воздухом. Затем для проведения последующих экспериментов, осадок растворяют в подходящем буфере (например, 50 мкл 5 мМ трис-хлорида, рН 8,0).
Пример 2. Время нагревания.
В данном примере проиллюстрировано влияние времени нагревания на выход РНК.
Как показано на фиг. 1, нагревание хаотропного раствора при 95°С с последующей преципитацией
и обратной транскрипцией значительно повышает эффективность детекции мишеней TS и β-актина. Без
проведения стадии нагревания ни TS, ни β-актин не могли быть детектированы (время 0 мин.). Через 20 мин
при 95°С оба транскрипта были детектируемыми, и последующее увеличение времени нагревания до 60
мин приводило к 3-кратному увеличению чувствительности детекции для TS и к 4,5-кратному увеличению чувствительности детекции для β-актина (NRT=контроль при отсутствии обратной транскриптазы,
RT-NRT=общий относительный уровень экспрессии генов, т.е. значение, полученное с обратной транскриптазой, минус значение, полученное без обратной транскриптазы) .
На фиг. 2 проиллюстрирован уровень экспрессии РНК гена β-актина в нормальной (N) и в опухолевой (Т) ткани. Образцы нагревали при 95°С в течение периодов времени от 0 до 40 мин. Для большинства образцов предпочтительное время нагревания составляет примерно 30 мин.
На фиг. 3 показано, что при нагревании в течение примерно более 60 мин количество экстрагированной РНК начинает уменьшаться, что дает основание предположить о термической деградации РНК,
тогда как количество экстрагированной ДНК начинает возрастать. Это явление является нежелательным,
поскольку в некоторых случаях присутствие ДНК может давать ложный ПЦР-сигнал.
Пример 3. Растворы для нагревания.
В этом примере проиллюстрировано, что нагревание раствора РНК в присутствии хаотропного
агента имеет важное значение для получения высоких выходов РНК. Для этого проводили ОТ-ПЦРэксперимент с осуществлением детекции экспрессии гена β-актина как меры относительных количеств
выделенной РНК в различных растворах.
Клинические FFPE-образцы ткани рака пищевода обрабатывали вышеописанными способами, за
исключением того, что исходный осадок, полученный после депарафинирования, растворяли или суспендировали в 4 М изотиоцианате гуанидиния (GITC), в 4 М изотиоцианате гуанидиния + 100 мкМ β-меркаптоэтанола (GITC + ВМЕ), в 4М изотиоцианате гуанидиния + 20 мкМ дитиотреитола (GITC+DTT), в
буфере Трис-Сl (10 мМ, рН 7,5) или в буфере Трис-Сl + 20 мкМ DTT (Трис/Сl+DTT). Затем образцы нагревали до 95°С в течение 30 мин либо вообще не нагревали (0 мин, 95°С). После этого Трис/Сl-образцы
обрабатывали 4 М изотиоцианатом гуанидиния. Уровни РНК определяли с помощью ОТ-ПЦР и с помощью ПЦР-детекции β-актина в режиме реального времени. Как показано на фиг. 4, присутствие хаотропного агента изотиоцианата гуанидиния при нагревании имеет важное значение для получения высоких
выходов РНК. Присутствие восстановителя, такого как DTT или ВМЕ, не имеет существенного значения
для получения высоких выходов РНК. 4 М раствор изотиоцианата гуанидиния содержит 50 мМ Трис-НСl
(рН 7,5), 25 мМ EDTA и 0,5% саркозина.
Пример 4. Сравнение значений уровней экспрессии генов, определенных в FFPE-ткани и в замороженной ткани, взятых из одного и того же источника.
В данном примере показано, что способы настоящего изобретения позволяют получить уровни экспрессии генов в фиксированных формалином и залитых в парафин образцов, эквивалентные уровням,
полученным для замороженных тканей.
Образцы, взятые от шести клеточных линий, обрабатывали с получением FFPE-образцов и проводили количественную оценку уровней TS в соответствии со способами настоящего изобретения (вклю-7-
006827
чая нагревание при 95°С в течение 30 мин). Полученные относительные величины TS (фиг. 5) сравнивали с величинами, полученными для осадков замороженных клеток в соответствии с известными методами. В замороженных клетках относительные уровни экспрессии TS составляли 3,0-19,5 (среднее=8,5), а в
FFPE-образцах они составляли 3,0-25,0 (среднее=9,0). Статистический анализ различия между двумя
средними значениями давал значение р=0,726, что указывало на то, что не существует значимого различия между величинами TS, полученными для замороженных клеточных осадков в соответствии с ранее
описанными ОТ-ПЦР-методами, и величинами, полученными для FFPE клеточных осадков в соответствии со способами настоящего изобретения.
Уровни экспрессии РНК в образцах опухолевых тканей и нормальных (неопухолевых) тканях также
оказались эквивалентными независимо от того, были ли эти образцы фиксированы формалином и залиты
в парафин, либо они были заморожены. 5 нормальных тканей и 6 опухолевых тканей толстой кишки и 4
ткани опухоли пищевода сравнивали с точки зрения относительной экспрессии гена TS в соответствующих залитых в парафин тканях и замороженных тканях (FT), как описано выше. Результаты показаны на
фиг. 6. Какого-либо значимого различия между уровнями TS, обнаруженными в образцах замороженной
ткани, и величинами TS, обнаруженными в FFPE-образцах той же самой ткани, не наблюдалось. Это было подтверждено для обоих типов тканей толстой кишки и пищевода (среднее для FT-образцов толстой
кишки=3,46; среднее для FFPE-образцов толстой кишки=3,06, р=0,395; среднее для FT-образцов пищевода=13,9; среднее для FFPE-образцов пищевода=15,93, р=0,21).
Пример 5. Сравнение уровней TS в восприимчивых и невосприимчивых опухолевых тканях.
Корреляция уровней TS в замороженной ткани и в соответствующих FFPE-образцах, восприимчивых к 5-FU/лейковорину (LV) при раке толстой кишки IV степени.
Предыдущие исследования, проводимые на основе ОТ-ПЦР-данных, полученных для замороженной ткани, показали, что высокие уровни TS в опухолях (относительная экспрессия генов ≥4,0) являются
показателем слабого ответа на ТS-направленное лечение. Восприимчивые опухоли могут быть охарактеризованы как опухоли, экспрессирующие низкие уровни TS. Определяли отношения TS/β-актин в парафиновых срезах, полученных от 17 пациентов, у которых ответ на 5-FU/LV, как показали ранее проведенные анализы с использованием образцов замороженной ткани, ассоциировался с экспрессией гена TS
(фиг. 7). Было известно, что из 17 пациентов 6 пациентов были восприимчивы к TS-направленному лечению, а 11 пациентов давали слабые ответы на указанное лечение. Было обнаружено, что TS-результаты
для соответствующих залитых в парафин тканей должны предсказывать ответ на данную терапию (для
респондентов средняя величина FT=2,87, средняя величина FFPE=2,37, р=0,641; для нереспондентов
средняя величина FT=7,66, средняя величина FFPE=7,84, р=0,537). Какого-либо значимого различия между уровнями TS, обнаруженными в образцах замороженной ткани, и величинами TS, обнаруженными в
соответствующих FFPE-тканях, не наблюдалось.
Пример 6. Уровни экспрессии генов TS в ткани первичного рака толстой кишки и метастазов печени.
В этом примере проиллюстрирован анализ на экспрессию TS и других генов в первичной опухоли
толстой кишки и рецидивирующих метастазах в печени у того же самого пациента.
На фиг. 8 показаны уровни экспрессии четырех генов: TS; ТР; циклооксигеназы-2 (СОХ-2); и васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) в FFPE-образцах первичного рака толстой кишки и
метастазов в печени (met), взятых от того же самого пациента, у которого через год наблюдался рецидив.
Результаты исследований показали, что, хотя первичная опухоль была восприимчива к 5-FU-терапии
(TS=2,32), однако, метастазы оставались резистентными к лечению (TS-met=11,58). Уровни экспрессии
СОХ-2 и VEGF коррелировали с опубликованными ранее данными, указывающими на то, что эти уровни
экспрессии возрастают при прогрессирующем заболевании и совместно регулируются (СOX-2 для первичной опухоли=1,35; СОХ-2-met=5,4; VEGF для первичной опухоли=5,02; VEGF-met=14,4). РНК выделяли, как описано ранее, из 5 мкм FFPE-среза первичной опухоли рака толстой кишки и из FFPE-среза
метастазов печени. Относительный уровень экспрессии гена TS в восприимчивой первичной опухоли
составлял 2,32, а в метастазах он составлял 11,58 (фиг. 8). Такое 5-кратное увеличение экспрессии TS,
определенное описанными здесь ОТ-ПЦР-методами, указывает на то, что вторичное заболевание не восприимчиво к 5-FU, и дает основание предположить, что подходящей может быть альтернативная терапия, такая как терапия с использованием СРТ-11.
Все цитируемые здесь работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством
ссылки.
Источники
Ardalan, В., and Dang, Z. (1996) Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Cancer Res. 37:A1376.
Ausubel, F.M. et al., "Current Protocols In Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc., vol.1, pp. 2.2.12.4.5(1994).
Bannerjee, S.K., Makdisi, W.F., Weston, A.P., Michell, S.M., and Campbell, D.R. (1995) Biotechniques,
18: 768-773.
Chomczynski et al., "Single-Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-PhenolChloroform Extraction", Analytical Biochemistry, 162:156-159 (1987).
-8-
006827
Eads, С.A., Danenberg, K.D., Kawakami, K., Saltz, L.B., Danenberg, P.V. and Laird, P.W. (1999) CpG
island hypermethylation in humancolorectal tumors is not associated with DNA methyltransferse
overexpression. Cancer Res., 59: 2302-2306.
Farrugia, D., Cunningham, D., Danenberg, P., Danenberg, K., Metzger, R., Mitchell, F., MacVicar, D.,
McCarthy, K., Aherne, G.W., Norman, A., Jackman, A.L. (1997) Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Cancer Res.
38:A4132.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J. and Williams, P.M. (1996) Real-time quantitative PCR, Genome Res.
6:986-994.
Horikoshi, Т., Danenberg, K.D., Stadlbauer, T.H.W., Volkenandt, M., Shea L.L.C., Aigner, K., Gustavsson, В.,
Leichman, L., Frosing, R., Ray, M., Gibson, N.W., Spears, C.P. and Danenberg, P.V. Quantitation of thymidylate
synthase, dihydrofolate reductase, and DT-diaphorase gene expression in human tumors using the polymerase
chain reaction. Cancer Res., 52: 108-116, 1992.
Jackman, A.L., Jones, T.R., Calvert, A.H. Experimental and Clinical Progress in Cancer Chemotherapy
(F.M. Muggia ED.) Martinus Nijhoff, Boston (1985).
Johnston, P.G., Lenz, H.J., Leichman, C.G., Danenberg, K.D., Allegra, C.J., Danenberg, P.V., Leichman,
L. (1995) Cancer Research 55: 1407-1412.
Leichman, C.G., Lenz, H.J., Leichman, L., Danenberg, K., Baranda, J., Groshen, S., Boswell, W., Metzger,
R., Tan, M., Danenberg, P.V. (1997) J. Clinical Oncology, 15(10):3223-9.
Lenz, H.J., Danenberg, K.D., Leichman, C.G., Florentine, В., Johnston, P.G., Groshen, S., Zhou, L.,
Xiong, Y.P., Danenberg, P.V. and Leichman, L.P. (1998) Clinical Cancer Research. 4(5):1227-34.
Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Press, 2nd Ed., pp. 9.14-9.23 (1989).
Spears, С.P., Shahinian, A.H., Moran, R.G., Heidelberger, C., and Corbett, Т.Н. (1982) Cancer Res. 42,
450-456: Keyomarsi, K., and Moran, R.G. (1988) J. Biol. Chem. 263, 14402-14409.
Swain, S.M., Lippman, M.E., Egan, E.F., Drake, J.C., Steinberg, S.M., and Allegra, C.J. (1989) J. Clin.
Oncol. 7, 890-899.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ выделения РНК из образца залитой в парафин биологической ткани, включающий
депарафинирование образца;
нагревание образца в хаотропном растворе, содержащем эффективную концентрацию гуанидиниевого соединения, до температуры в пределах от примерно 50 до примерно 100°С в течение периода времени от примерно 5 до примерно 120 мин; и
выделение указанной РНК из указанного хаотропного раствора с применением способа, выбранного
из группы, включающей экстракцию, электрофорез, хроматографию, преципитацию и их комбинации.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий повторную гидратацию данного образца перед его
нагреванием.
3. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий гомогенизацию указанного образца перед его
нагреванием.
4. Способ по любому из пп.1-3, где указанную РНК выделяют путем экстракции из указанного хаотропного раствора не растворимым в воде органическим растворителем.
5. Способ по п.4, где указанный нерастворимый в воде органический растворитель, в основном, состоит из хлороформа.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий очистку указанной РНК.
7. Способ по п.6, где указанную РНК очищают путем преципитации этанолом.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный период времени составляет от примерно 10 до примерно 60 мин.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный период времени составляет от примерно 30 до примерно 60 мин.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная температура находится в пределах от
примерно 75 до примерно 100°С.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная температура находится в пределах от
примерно 85 до примерно 100°С.
12. Способ по п.1, где указанное гуанидиниевое соединение выбирается из гидрохлорида гуанидиния и изотиоцианата гуанидиния.
13. Способ по п.12, где указанное гуанидиниевое соединение представляет собой изотиоцианат гуанидиния, присутствующий в концентрации от 2 до 5 М.
14. Способ по п.13, где указанный изотиоцианат гуанидиния присутствует в концентрации примерно 4 М.
15. Способ по п.14, где указанный хаотропный раствор имеет рН примерно 3-6.
16. Способ по п.15, где указанный хаотропный раствор имеет рН примерно 4.
17. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный хаотропный раствор дополнительно
содержит восстановитель.
-9-
006827
18. Способ по п.17, где указанный восстановитель выбирается из β-меркаптоэтанола и дитиотреитола.
19. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанную РНК используют для определения
уровня экспрессии гена.
20. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанную РНК дополнительно подвергают
воздействию, выбранному из группы, состоящей из обратной транскрипции, обратной транскрипции с
полимеразной цепной реакцией, электрофореза, хроматографии, гибридизации с нуклеиново-кислотным
зондом и фрагментации.
21. Способ по п.20, где РНК подвергают обратной транскрипции и получаемая таким образом
кДНК является меченой.
22. Способ по п.20, где меченую кДНК используют в генном чипе или микроматричном анализе.
23. Способ количественного измерения экспрессии целевых генов, включающий
выделение РНК способом по любому из предыдущих пунктов
и дополнительно включающий
превращение очищенной РНК в кДНК посредством реакции обратной транскрипции;
осуществление ПЦР-реакции, которой подвергают кДНК, в растворе для проведения полимеразной
цепной реакции, содержащем олигонуклеотидный зонд, подходящий для амплификации, по крайней мере, конкретно определенной последовательности, полимеразу и флуорохром;
определение изменения интенсивности флуоресценции, как результат ПЦР-реакции; и
определение количества нуклеиновой кислоты, имеющей определенную последовательность, присутствующую в образце, на основе указанного изменения интенсивности флуоресценции.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 10 -
006827
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
- 11 -
006827
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 12 -