Р О С С И Й С К А Я ...
реклама
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 2005 ТРУДЫ ИНСТИТУТА ОБЩЕЙ ФИЗИКИ им. А.М. ПРОХОРОВА Том 61 УДК 535.34+621.373.826 Ю.А. ШУЛАГИН1, Е.В. СТЕПАНОВ, А.Г. ЧУЧАЛИН2, Е.В. БАБАРСКОВ2, А.И. ДЬЯЧЕНКО, Б.Н. ПАВЛОВ3 ЛАЗЕРНЫЙ АНАЛИЗ ЭНДОГЕННОГО СО В ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ 1. Введение Актуальность определения содержания CO в выдыхаемом воздухе, а также разработок аналитических устройств, предназначенных для подобных измерений, обусловлена тем, что моноокись углерода является одним из эндогенных газообразных соединений, играющих значительную роль в жизнедеятельности организма. Особенности процессов ее образования в организме и транспорта от тканей и органов в выдыхаемый воздух в настоящий момент недостаточно хорошо изучены, поэтому разработка методов использования CO в качестве молекулы-биомаркера требует тщательного предварительного исследования. В организме эндогенный CO образуется в результате ферментативно-управляемого катаболизма (разложения) гем-содержащих соединений (рис. 1) [1–3]. Основная его продукция обусловлена гемолизом эритроцитарного гема и миоглобина в ходе эритропоэза, направленного на устранение стареющих клеток крови. Кроме того, некоторая доля эндогенного СО образуется при деградации цитохромов и ряда металлосодержащих ферментов, таких как каталаза, пероксидаза, триптофанпирролаза, гуанилатциклаза, NO-синтаза и других. Также возможно образование относительно малого количества СО негемовой природы за счет перекисного окисления липидов, фотоокисления, а также активности ксенобиотиков и некоторых бактерий [3]. Результаты недавних биохимических исследований показывают, что CO в организме является не только конечным продуктом метаболических превращений упомянутых выше соединений, но и сигнальной молекулой (так называемым вторичным мессенджером), участвующей в механизме преобразования сигналов, регуляции клеточного метаболизма и в передаче информации [4, 5]. Во избежание избыточного накопления CO интенсивно выводится из организма. Для этих целей, помимо диффузии, транспорта в растворенном состоянии и конвективного газообмена, используется специальный механизм обратимого связывания этих молекул гем-содержащими белковыми структурами (гемоглобин, миоглобин, цитоглобин, нейроглобин, цитохром а3), кратковременного буферирования на них и транспорта по градиенту концентраций О2 — от клеток и тканей в легкие [2, 6–9]. Для выведения СО 1 Институт океанологии им. Н.Н. Ширшова РАН Институт пульмонологии МЗ РФ 3 ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН © Коллектив авторов, 2005 2 135 ГЕМ Гем оксигеназа Fe Биливердин NADPH NADPH Не-гемовое СО Экзогенное СО Перекисное окисление липидов O2 Фотоокисление Цитохром с (Р450) Ксенобиотики Бактерии Редуктаза NADPH H2O CO Взаимодействие с другими гемпротеинами (гуанилат циклаза, цитохром АЗ) Диффузия из клетки Биливердин Редуктаза MbCO HbCO NADP Билирубин Выведение с дыханием Рис. 1. Метаболизм СО в организме [3] используется та же цепочка механизмов, с помощью которой осуществляется транспорт кислорода из легких и обеспечение дыхания клеток, только действующая в обратном направлении. В клетках СО может быть связано цитоглобином, нейроглобином [7–9] или цитохромами а3 (в митохондриях клеток). В тканях СО накапливается на миоглобине, а в крови — на гемоглобине. За счет потока кислорода, проникающего с кровью в ткани и клетки, между этими системами буферирования СО происходит постоянный обмен, так что молекулы СО постепенно продвигаются в направлении от клеток к легким. В легких СО диффундирует из крови в воздушное пространство легких и затем за счет вентиляции при дыхании выводится в атмосферу. На заключительном этапе пребывания эндогенного СО в крови, т.е. в альвеолярных капиллярах, темп его выделения в воздушное пространство легких находится в непосредственной зависимости от перфузии и эффективности доставки кислорода к альвеолярной мембране легких [3]. Эта эффективность может меняться за счет вариации как газодинамических, так и диффузионных характеристик используемых дыхательных смесей. Необходимо выделить несколько наиболее важных процессов, в которых эндогенное СО участвует в организме [1, 3–5]. Во-первых, CO является вторичным мессенджером для нейромедиаторов и гормонов, поскольку активизирует работу фермента гуанилатциклазы, участвующей в образовании циклического гуанизинмонофосфата. Последним определяется уровень кальция в клетке, от которого в конечном счете зависит активность протеин-киназ и некоторых биохимических процессов. Кроме того, CO участвует в механизме регуляции тонуса кровеносных сосудов и, возможно, влияет на внутриклеточные механизмы формирования долговременной памяти. Во-вторых, CO разделяет с O2 общую систему транспорта и буферирования, что позволяет использовать его как маркер при исследовании механизмов и самого транспорта кислорода. В-третьих, существуют предположения, что CO выделяется при воспалительных процессах и поэтому может быть использовано как маркер работы антиоксидантной системы. Наконец, вчетвертых, основная функция молекул CO определяется их ролью в регуляции обновления клеток крови, т.е. CO может служить индикатором и маркером катаболизма. 136 Таким образом, для использования эндогенного CO в качестве биомаркера физиологических процессов существенным является то, что интенсивность выделения СО с выдыхаемым воздухом зависит от скорости продукции СО в организме, биохимических параметров среды в клетках и тканях организма и химического состава вдыхаемой газовой среды. Благодаря этому использование высокочувствительного, высокоточного и селективного мониторинга эндогенного CO в выдыхаемом воздухе может быть актуально и перспективно для исследований: • интенсивности метаболических и индуцированных процессов, связанных с образованием CO; • диффузионных и конвективных процессов переноса кислорода в легких; • эффективности процессов переноса кислорода кровью от легких к тканям, включая перфузию и тканевую микроциркуляцию; • интенсивности основного обмена, образования и накопления кислых продуктов в условиях тканевой гипоксии и, возможно, ряда других процессов. Ниже представлены результаты модельного описания основных закономерностей выделения эндогенного CO с выдыхаемым воздухом, а также данные оригинальных экспериментальных исследований этих процессов, полученные в течение последних 10 лет с помощью методов высокочувствительного лазерного анализа. 2. Модель выведения эндогенного CO с выдыхаемым воздухом 2.1. Общие закономерности выделения эндогенного СО При моделировании выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом необходимо принимать во внимание процессы, происходящие в следующих звеньях механизма буферирования и транспорта моноокиси углерода: источники эндогенного СО, внутриклеточные буферные системы (цитохромы, цитоглобины, нейроглобины (Gb)), миоглобин мышечных тканей (Mb), гемоглобин в артериальной и венозной крови (Hb), среда, окружающая эти буферные системы, а также газовая среда в альвеолах легких и во вдыхаемом воздухе. Взаимодействие между этими звеньями происходит за счет процессов дыхания, кровообращения и диффузии газов. Степень заполнения буферных систем является функцией интенсивности продукции СО в организме и характеристик окружающей среды, в частности напряжения СО, О2, СО2, а также кислотно-основного состояния (pH). При постоянстве характеристик внешней среды (концентраций О2, СО2 и СО в выдыхаемом воздухе) и метаболических процессов в организме поддерживаются стационарные потоки СО с одной буферной системы на другую, а также некоторые стационарные уровни заполнения этих буферных систем СО. Вариации внешних условий или интенсивности метаболических процессов влекут за собой изменения стационарных значений характеристик внутренних сред организма и, следовательно, стационарных уровней содержания СО на буферных системах. Последнее будет проявляться в изменении скорости выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом. 2.1.1. Транспорт СО из крови в выдыхаемый воздух Для описания транспорта CO из крови в выдыхаемый воздух рассмотрим малую порцию крови, проходящую в момент времени t легочные капилляры за короткий отрезок времени dt. Количество молекул CO, которые находятся в ней при входе в ка137 пилляр, определяется количеством CO, которое осталось связанным гемоглобином в момент предыдущего прохождения через легкие, т.е. t – T, где T — время одного полного оборота крови, и тем количеством СО, которое было захвачено при последнем прохождении тканевых капилляров, т.е. в момент времени (t – T*). Здесь T* — время движения крови от тканевых капилляров к легким, по величине близкое к T/2. Доля растворенного в венозной крови газообразного СО очень мала, так как в ней около 30 % связей на гемоглобине свободно и поэтому при высоком относительном сродстве СО к гемоглобину (∼ 217 [2, 3]) практически все молекулы СО находятся в связанной форме. Таким образом, содержание CO в этой порции крови можно записать в виде Hb tot tot (1) FHb t − T * dt + ⎡⎣ HbCO ( t − T ) ⎤⎦ art Q& ( t ) dt , V ( ) b tot Hb где F (t ) — суммарный поток эндогенного CO, связываемого гемоглобином в тканевых капиллярах, [HbCO(t)] — относительная концентрация карбоксигемоглобина в крови, Q& (t ) — поток крови в легких, ⟨Hb⟩tot — общее количество гемовых связей на гемоглобине (~ 2.9⋅1022 [3, 6]), Vb — общий объем крови. Cразу после прохождения крови через легкие все находившееся на гемоглобине CO оказывается разделенным на две части. Первая часть, которая состоит из CO, уходящего из легких с артериальной кровью, может быть записана как ⎡⎣HbCO (t )⎤⎦ art Q& (t ) Hb tot Vb (2) dt. Вторая часть CO, вытесненная с гемоглобина за счет конкуренции с кислородом и уходящая через альвеолярную мембрану в альвеолярный воздух, может быть записана с учетом усреднения по дыхательному циклу следующим образом: CO DL ⎡⎣PartCO (t ) − Palv (t )⎤⎦ dt , (3) где DL — коэффициент диффузии альвеолярной мембраны легких для СО (диффузионная способность легких для СО в норме составляет ~ 30 мл/мм рт. ст.⋅мин [10, 11]), CO PartCO (t ) — напряжение СО в артериальной крови, Palv (t ) — парциальное давление СО в альвеолярном воздухе. Приравнивая (1) сумме (2) и (3), получим ( ) tot FHb t − T * dt + ⎡⎣HbCO (t − T )⎤⎦ art Q& (t ) = ⎡⎣HbCO (t − T )⎤⎦ art Q (t ) Hb Vb tot Hb tot Vb dt = CO dt + DL ⎡⎣PartCO (t ) + Palv (t )⎤⎦ dt. Это выражение может быть переписано в виде t ( ) tot CO FHb t − T * dt = DL ⎡⎣PartCO (t ) + Palv (t )⎤⎦ dt + Q& (t ) Hb Vb tot ∫ d ⎡⎣HbCO (t − T )⎤⎦ art dt. (4) t −T В соответствии с теоремой о среднем интегрального исчисления интеграл в (4) можно представить в виде 138 t ∫ d [HbCO]art = (t − t + T ) ⎡⎣HbCO (ξ )⎤⎦′art = T ⎡⎣HbCO (ξ )⎤⎦′art . (5) t −T Реакция замещения молекул СО на карбоксигемоглобине кислородом, происходящая в легких, может быть записана следующим образом: HbCO+O 2 ↔ HbO 2 +CO. (6) На основании этой реакции для относительной доли карбоксигемоглобина в артериальной крови сразу после прохождения легочного капилляра можно записать ⎡⎣HbCO (t )⎤⎦ art = A CO Hb ⎡⎣HbO 2 (t )⎤⎦ art PartCO (t ) , PartO (t ) (7) 2 где [HbO2(t)]art — относительная концентрация оксигемоглобина в артериальной кроCO ви, AHb — относительное сродство СО к гемоглобину, PartO (t ) — напряжение кислорода в артериальной крови. Поскольку гемоглобин в артериальной крови находится в состоянии практически полного насыщения, то в первом приближении выполняется соотношение 2 ⎡⎣HbCO (t )⎤⎦ art + ⎡⎣HbO 2 (t )⎤⎦ art ≈ 1 (при этом влияние прочих лигандов, которые могут быть связаны гемоглобином, считается несущественным при данном рассмотрении). Тогда, подставляя это соотношение в (7), для доли карбоксигемоглобина в артериальной крови получим CO AHb Rart (t ) , ⎡⎣HbCO (t )⎤⎦ art ≈ CO 1 + AHb Rart (t ) (8) где Rart (t ) = PartCO (t ) / PartO (t ). Производная по времени от (8) будет иметь вид 2 CO ⎡⎣HbCO (t )⎤⎦′art = Aart ′ (t ) Rart CO ⎡⎣1 + AHb Rart (t )⎤⎦ 2 (9) . Как будет показано ниже, в норме для некурящего человека напряжение СО в артериальной крови PartCO составляет ~ 2⋅10–3 мм рт. ст., а напряжение кислорода PartO — ~ 100 мм рт. ст. [6], поэтому даже при высоком значении относительного сродства СО к гемоглобину, выполняется соотношение 2 ACO Hb Rart (t ) << 1. При этих условиях соотношение (9) можно упростить ′ (t ) . ⎡⎣HbCO (t )⎤⎦′art ≈ ACO Hb Rart (10) Поскольку для потока крови в легких, общего объема крови и времени полного оборота крови справедливо соотношение Q& (t ) = Vb T (t ) 139 равенство (4) с учетом (5) и (10) сводится к виду Hb tot ( ) CO CO tot * ACO Hb R ′art (t ) + DL ⎡ ⎣Part (t ) − Palv (t )⎤⎦ = FHb t − T . (11) Далее установим соотношение между напряжением СО в артериальной крови CO PartCO (t ) и парциальным давлением СО в альвеолярном воздухе Palv (t ). Если в легких не происходит образования или утилизации СО, то поток СО, выделяемого с выдыхаемым воздухом за счет вентиляции, равен потоку, прошедшему через альвеолярную мембрану, т.е. CO (12) V&(t ) ⎡⎣CavCO (t ) − Catm (t )⎤⎦ = DL ⎡⎣PartCO (t ) − PalvCO (t )⎤⎦ , где V& (t ) — вентиляция легких, CavCO (t ) — средняя концентрация СО в выдыхаемом CO (t ) — концентрация СО в атмосферном воздухе. В первом приближении воздухе, Catm различие между инспираторной и экспираторной вентиляцией легких мало, поэтому его можно не учитывать. При дыхании происходит разбавление альвеолярного воздуха атмосферным, за счет чего усредненное по выдоху парциальное давление эндогенной составляющей endo CO (t ). Коэффициент разбавлеСО, Pavendo CO (t ), ниже, чем в альвеолярном воздухе, Palv ния S(t) зависит от физиологических параметров легких (общий объем легких, мертвое пространство) и режима дыхания (например, глубокое или поверхностное) и может быть представлен в виде S (t ) = endo CO Palv (t ) endo CO av P (t ) = CO CO Palv (t ) − Patm (t ) CO PavCO (t ) − Patm (t ) , (13) CO (t ) — парциальные давления СО в воздухе, усредненном по выдоху, и где PavCO (t ), Patm в атмосферном воздухе соответственно. Как будет показано ниже на основании экспериментальных данных, в норме величина S может принимать значения в диапазоне от 1.5 до 1.8. Таким образом, CO CO Palv (t ) − ⎡⎣1 − S (t )⎤⎦ Patm (t ) PavCO (t ) = . S (t ) CO (t ) с реально измеряемым в эксперименте усредненным за выдох значеСвязь Palv нием концентрации PavCO (t ) будет определяться соотношением CO CavCO (t ) − Catm (t ) = CO PavCO (t ) − Patm (t ) N A NA 1 CO CO (t ) − Patm (t ) ⎤⎦ , = ⎡⎣ Palv PB (t ) Vµ S (t ) PB (t ) Vµ где NA — число Авогадро, Vµ — молярный объем, PB — барометрическое давление. Это позволяет переписать (12) в виде V& (t ) N A CO CO CO ⎡ Palv (T ) − Patm (t ) ⎦⎤ = DL ⎡⎣ PartCO (t ) − Palv (t ) ⎤⎦ . S (t ) P (t ) V ⎣ B µ Отсюда CO Palv (t ) = 140 CO CO PartCO (t ) − Patm (t ) P CO (t ) − Patm (t ) CO CO + Patm (t ) = art + Patm (t ), & & V ( t ) ⎛ ⎞ S (t ) PB (t ) 1 N A V (t ) K (t ) + ⎜ ⎟ S (t ) PB (t ) S (t ) PB (t ) ⎜⎝ V& (t ) DL Vµ ⎟⎠ (14) где K (t ) = S (t ) PB (t ) 1 N A . + V& (t ) DL Vµ С учетом (14) второе слагаемое в левой части (11) приобретает вид CO DL ⎡⎣ PartCO (t ) − Palv (t ) ⎤⎦ = CO CO PartCO (t ) − Patm (t ) N A PartCO (t ) − Patm (t ) N A = . S (t ) PB (t ) 1 N A Vµ K (t ) Vµ + DL Vµ V& (t ) Подставляя это соотношение в (11), получим Hb tot ( ) tot * ′ ACO + Hb R art (t ) = FHb t − T CO Patm (t ) − PartCO (t ) N A . K (t ) Vµ (15) 2.1.2. Источники поступления эндогенного СО на гемоглобин Теперь рассмотрим возможные источники поступления СО на гемоглобин в тканеtot вых капиллярах, т.е. структуру слагаемого FHb (t ). Общая схема потоков эндогенного СО в организме может быть представлена так, как изображено на рис. 2. Суммарный поток эндогенного СО на гемоглобин складывается из потоков с буферных систем, клеGb Mb Endo точных глобинов FHb (t ) и тканевого миоглобина FHb (t ), и потока FHb (t ), который может попадать на гемоглобин, минуя промежуточные буферные системы Tot Gb Mb Endo FHb (t ) = FHb (t ) + FHb (t ) + FHb (t ). (16) В то же время вырабатывающееся в организме эндогенное СО перераспределяется между клеточными глобинами, миоглобином и гемоглобином, поэтому сумма потоков СО на эти буферные системы равна скорости продукции СО организмом E(t), т.е. Endo Endo Endo E (t ) = FGb (t ) + FMb (t ) + FHb (t ). (17) Исходя из условий баланса СО на миоглобине, для скорости изменения количества карбоксимиоглобина ⟨MbCO(t)⟩ можно записать следующее равенство: Endo Gb Mb MbCO(t ) ′ = FMb (t ) + FMb (t ) − FHb (t ). Mb FHbMb endo Mb F Endo Q& /V& O2 FHbendo (18) O2 Hb Gb FMb endo Gb F Gb CO O2 FHbGb Рис. 2. Система буферирования и потоки эндогенного СО в организме 141 Аналогичное соотношение имеет место и для скорости изменения количества клеточных глобинов, связанных СО GbCO(t ) ′ = F Endo (t ) − F Gb (t ) − F Gb (t ). (19) Gb Mb Hb Далее после простых арифметических преобразований из (16)–(19) можно получить равенство tot FHb (t ) = E (t ) − MbCO(t ) ′ − GbCO(t ) ′. (20) Из него следует, что скорость поступления СО на гемоглобин определяется скоростью образования эндогенного СО в организме и динамикой изменения количества СО на миоглобинной и глобинных буферных системах. Первое слагаемое в правой части (20), описывающее скорость образования эндогенного СО, можно, по-видимому, считать достаточно медленно меняющимся во времени, что обусловлено относительной стабильностью естественных скоростей метаболических процессов в организме. Это касается, по крайней мере, части молекул, обусловленной катаболическими процессами (обновление клеток крови, эритроцитов и миоглобина), которая составляет около 95 % продукции СО. Источники эндогенного СО весьма неравномерно распределены по организму. Наиболее интенсивное образование СО идет в селезенке, печени и костном мозге [1,3], т.е. там, где проходят процессы эритропоэза и катаболизма гемоглобина, миоглобина и ферментов-гемопротеинов. Кроме того, СО образуется в клетках головного мозга (гранулярных клетках, клетках Пуркинье мозжечка, гиппокампа, обонятельной луковицы, коре больших полушарий и др.) и в митохондриях клеток, где, по-видимому, существенный вклад в образование СО должны давать процессы метаболизма цитохромов, цитоглобинов, нейроглобинов и ферментов. Локальная неравномерность поступления эндогенного СО на гемоглобин крови, обусловленная неравномерным распределением источников СО по организму, сглаживается за счет усреднения концентрации [HbCO], происходящего в венозных сосудах при перемешивании крови, поступающей из тканей различных органов. Второе слагаемое в (20) отражает вариации во времени количества СО, связанного миоглобином. Они обусловлены динамикой изменения параметров окружающей миоглобин среды, в первую очередь концентрации растворенных кислорода и моноокиси углерода в цитоплазме мышечных клеток. В отличие от гемоглобина, сила связывания лигандов миоглобином не зависит от pH окружающей среды и концентрации в ней СО2 [2, 12]. В момент предельного насыщения миоглобина кислородом, последний вытесняет с миоглобина СО в соответствии с реакцией замещения MbCO + O 2 ↔ MbO 2 + CO. (21) В соответствии с этим соотношением и по аналогии с гемоглобином локальная концентрация карбоксимиоглобина в мышечных клетках может быть записана следующим образом: [ MbO2 (t )]t PtCO (t ) , [ MbCO(t )] t = ACO Mb PtO (t ) 2 где [MbCO(t)]t — локальная концентрация карбоксимиоглобина в тканях, ACO Mb — относительное сродство СО к миоглобину, [MbO2(t)]t — локальная концентрация оксигемоглобина, PtCO (t ), PtO (t ) — локальное напряжение СО и О2 в тканях соответственно. Отметим, что при прочих равных условиях напряжение О2 в тканях будет зависеть, в 2 142 частности, от кислотно-основного состояния среды, напряжения СО2 и содержания бифосфороглицерата (БФГ) [2], т.е. PtO (t ) = f ( pH, CO 2 , БФГ, t ) . 2 Это обусловлено тем, что постоянная диссоциации оксигемоглобина HbO2 ↔ Hb + O2 (22) зависит от этих параметров (эффект Бора), т.е. AOHb2 = [ Hb] P O [ HbO2 ] 2 = ψ ( pH, CO2 , БФГ ) . (23) Аналогично гемоглобину в артериальной крови сразу после прохождения легких, для миоглобина, направляющегося от клеточной мембраны к митохондриям, т.е. в момент наибольшего насыщения кислородом, выполняется равенство [ MbCO(t )]t + [ MbO2 (t )]t ≈ 1, из которого следует, что [ MbCO(t )]t ≈ ACO Mb R t (t ) 1 + ACO Mb R t (t ) , где R t (t ) = PtCO (t ) PtO2 (t ). Из последнего соотношения видно, что объем миоглобинного буфера СО чувствителен к относительному напряжению СО и О2 в мышечных тканях. Возможными причинами таких медленных изменений могут быть вариации парциального давления СО в атмосферном воздухе, изменение содержания О2 и СО2 во вдыхаемом воздухе, изменение интенсивности вентиляции легких, вариации сродства гемоглобина к кислороду вследствие различных локальных изменений химического состава среды в тканях (концентрации БФГ, СО2, рН крови). Причем при ступенчатом изменении во вдыхаемом воздухе концентраций СО или О2 будет наблюдаться динамика, обусловленная процессами двух видов. Во-первых, переходные процессы, связанные с постепенным установлением новых равновесных концентраций этих газов в тканях (например, более высокой концентрации растворенного в крови кислорода вследствие начала дыхания воздушной смесью с увеличенным содержанием О2). Во-вторых, собственно динамика буферной системы СО (гемоглобин, миоглобин и клеточные глобины), связанная с переходом самой буферной системы в новое равновесное состояние, соответствующее новым внешним условиям. Для скорости изменения величины стационарной составляющей концентрации карбоксимиоглобина, будем иметь [MbCO]′t = ACO Mb R ′t (t ) ⎡⎣1 + ACO Mb Rt (t )⎤ ⎦ 2 . Напряжение СО в тканях PtCO (t ) в момент максимального заполнения миоглобинного буфера кислородом точно не известно, но можно ожидать, что в норме для некурящего человека оно может составлять порядка 10–1–10–2 мм рт. ст. Напряжение кислорода PtO (t ) в этот момент заведомо меньше 100 мм рт. ст., которые соответствуют максимальному напряжению кислорода в артериальной крови, и может быть несколь2 143 ко меньше 40 мм рт. ст., соответствующих напряжению кислорода в венозной крови [6, 13, 14]. В любом случае при относительном сродстве миоглобина к СО, составляющем ∼ 40 [3, 12], достаточно надежно выполняется соотношение ACO Mb R t (t ) << 1. Поэтому в норме будем иметь [MbCO(t )]′t ≈ ACO Mb R ′t (t ). Исходя из этого и делая поправку на усреднение по всем тканям, содержащим миоглобин, скорость медленных изменений стационарной составляющей всего миоглобинного буфера СО можно записать в виде MbCO(t ) ′ = Mb tot [ MbCO(t )]′t ≈ Mb tot ′ ACO Mb R t (t ). (24) Аналогичные рассуждения могут быть проведены и для третьего слагаемого в правой части уравнения (20), описывающего роль других клеточных буферов СО. Одним из его компонентов являются цитохромы. Цитохромы a3, находящиеся, как известно, на митохондриальной мембране клеток и составляющие заключительное звено дыхательной цепи в клетках, являются гемопорфиринами. С использованием гема они на короткое время присоединяют молекулы кислорода с тем, чтобы осуществилась передача на них электронов, транспортируемых по дыхательной цепи, и после соединения с протонами одна молекула кислорода превратилась в две молекулы воды. Способность цитохрома а3 присоединять кислород одновременно означает и то, что вместо кислорода на его гем может захватываться эндогенное СО, которое продуцируется в клетке благодаря катаболизму тех же цитохромов, являющихся в большинстве гемопорфиринами (с, аа, в и т.д.), и ферментов. Относительное сродство цитохрома а3 к СО на 2 порядка меньше, чем у гемоглобина, и составляет, по разным источникам, от 1 до 5 [3]. Тем не менее доля цитохромов, связанных с СО, может быть достаточно большой, поскольку в клетках по сравнению с условиями в артериальной крови существенно снижено напряжение кислорода и, напротив, может быть повышено напряжение СО. Как упоминалось, помимо цитохромов в клетках разного типа буфером СО могут также служить недавно обнаруженные цитоглобины и нейроглобины [7–9], похожие по своим свойствам на гемоглобин и миоглобин. Поскольку тонкости их взаимодействия с СО в настоящее время плохо изучены, а химизм окружающей их среды определяется средой клеток, эти буферные системы, включая цитохромы, будут рассматриваться нами далее обобщенно. При поступлении в клетку свежей порции кислорода молекулы СО вытесняются с глобинов аналогично тому, как это происходит с карбоксигемоглобином в легких и карбоксимиоглобином в тканях, и далее за счет диффузии из клетки в кровь переносятся на освобождающийся от кислорода гемоглобин. Так же как и в случае миоглобина, величина этого буфера зависит от значений напряжения кислорода и моноокиси углерода вблизи глобинов в тот момент, когда на них остается минимальное количество СО. Процесс вытеснения СО с глобинов кислородом можно описать обобщенной формулой GbCO + O 2 ↔ GbO 2 + CO, в соответствии с которой доля глобинов, связанных с СО, определяется соотношением [GbCO(t )]c = ACO Gb 144 [GbO2 (t )]c PcCO (t ) PcO (t ) 2 , (25) где [GbCO(t)]c — локальная концентрация связанных с CO глобинов в клетке, ACO — Gb обобщенное относительное сродство СО к глобинам, [GbO2(t)]c — локальная концентрация глобинов, связанных кислородом, PcCO (t ), PcO (t ) — локальные напряжения СО и О2 в клетке соответственно. Аналогично миоглобину и гемоглобину, при вытеснении СО с глобинов кислородом выполняется соотношение 2 [GbCO(t )]c + [GbO2 (t )]c ≈ 1, позволяющее переписать (25) в виде [ GbCO(t )]c ≈ ACO Gb Rc (t ) 1 + ACO Gb Rc (t ) , (26) где Rc (t ) = PcCO (t ) PcO (t ). Тогда для производной от (26) по времени будем иметь 2 [ GbCO(t )]′c = ACO Gb Rc′ (t ) ⎡⎣1 + ACO ⎤ Gb Rc (t ) ⎦ 2 . (27) Величина напряжения кислорода в клетке по литературным данным составляет около 1 мм рт. ст. [13–15], поэтому до значений PcCO (t ) порядка 10–1 мм рт. ст. будет выполняться соотношение ACO Gb Rc (t ) << 1, которое позволяет упростить (27) ′ [ GbCO(t )]′c ≈ ACO Gb R c (t ). Исходя из этого, изменение количества СО на всем глобинном буфере можно записать в виде ′ GbCO(t ) ′ = Gb tot [ GbCO(t ) ]′c ≈ Gb tot ACO (28) Gb R c (t ). Таким образом, используя соотношения (20), (24) и (28), скорость поступления СО на гемоглобин в тканевых капиллярах может быть записана в виде CO FHb (t ) = E (t ) − Mb tot ′ ACO Mb R t (t ) − Gb tot ′ ACO Gb R c (t ). Подставляя это соотношение в (15), получим Hb tot ′ ACO Hb R art (t ) + Mb tot * ′ ACO Mb R t (t − T ) + Gb = E (t − T * ) + tot * ′ ACO Gb R c (t − T ) = CO Patm (t ) − PartCO (t ) N A . K (t ) Vµ (29) 2.1.3. Динамика выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом Вид решения дифференциального уравнения (29) зависит от того, существует ли функциональная взаимосвязь между скоростями изменений относительных концентраций СО и О2 в артериальной крови, тканях и клетках, т.е. между величинами ′ (t ), Rt′(t − T * ) и Rc′(t − T * ). Rart 145 Взаимосвязь переменных существует. Вначале предположим, что такая взаимосвязь существует, и попытаемся определить ее вид. С этой целью представим напряжение СО в тканях как функцию напряжения СО в артериальной крови: PtCO (t ) = PtCO PartCO (t ) . ( ) Тогда для производной функции Rt(t) справедливо равенство ( ⎛ PtCO PartCO (t ) ′ Rt (t ) = ⎜ ⎜ PtmO (t ) ⎝ 2 ) ⎞⎟′ = ⎟ ⎠ PtCO (t ) dPtO (t ) 1 dPtCO (t ) dPartCO (t ) . − 2 dt PtO (t ) dPartCO (t ) dt ⎡⎣ PtO (t ) ⎤⎦ 2 2 (30) 2 Первое слагаемое в правой части этого равенства пропорционально производной напряжения СО в артериальной крови от времени, а второе — скорости изменения напряжения кислорода в тканях. Если не рассматривать особенности переходных процессов, связанных с установлением равновесных концентраций растворенного кислорода в тканях, например, при ступенчатом изменении напряжения кислорода в артериальной крови, то (30) может быть существенно упрощено. В таких квазистационарных условиях справедливы соотношения d PtO (t ) PartO (t ) = const, PtO (t ) = const, = 0. (31) dt 2 2 2 В этом случае (30) может быть преобразовано в следующее равенство: Rt′(t ) = PartO (t ) dPtCO (t ) ⎛ PartCO (t ) ⎞′ PartO (t ) dPtCO (t ) ′ (t ). Rart ⎜ ⎟= PtO (t ) dPartCO (t ) ⎝ PartO (t ) ⎠ PtO (t ) dPartCO (t ) 2 2 2 2 2 (32) Аналогичные соотношения могут быть записаны и для напряжений кислорода и СО в клетках, поэтому получим Rс′(t ) = PartO (t ) dPcCO (t ) ′ (t ). Rart PcO (t ) dPartCO (t ) 2 (33) 2 Теперь рассмотрим свойства функций dPtCO (t )/dPartCO (t ) и dPcCO (t )/dPartCO (t ) , т.е. возможный вид зависимости напряжения СО в тканях и клетках в момент наибольшего насыщения кислородом миоглобина и глобинов соответственно от напряжения СО в артериальной крови. Предположим, что в первом приближении при небольших напряжениях СО в средах организма, которые и соответствуют случаю эндогенного происхождения этого соединения, эти зависимости являются линейными, т.е. имеет вид PtCO = α t PartCO , PcCO = α c PartCO. (34) В этом случае выражения (32) и (33) упрощаются до равенств PartO (t ) ′ (t ), Rart PtO (t ) 2 Rt′(t ) = α t 2 Rc′ (t ) = α c PaOrt (t ) ′ (t ). Rart PcO (t ) 2 2 Причем в условиях медленных изменений внешних условий, т.е. если их характерные времена существенно меньше T*, будут справедливы соотношения Rt′(t − T * ) ≈ α t 146 PartO (t ) PartO (t ) * * ′ ′ ′ (t − T * ). − − ≈ α R ( t T ), R ( t T ) Rart art c c PtO (t ) PcO (t ) 2 2 2 2 Кроме того, если отношение напряжений СО и О2 в артериальной крови и продукция эндогенного СО также изменяются медленнее по сравнению с временем оборота крови, то ′ (t − T * ) ≈ Rart ′ (t ) и E (t − T * ) ≈ E (t ). Rart Подставляя эти соотношения в уравнение (29), получим Hb tot CO ′ (t ) + α t Mb AHb Rart = E (t ) + CO AMb tot CO atm P PartO (t ) ′ (t ) + α c Gb Rart PtO (t ) 2 2 (t ) − P K (t ) CO art ACO tot Gb PartO (t ) ′ (t ) = Rart PcO (t ) 2 2 (t ) N A Vµ или ⎛ PartCO (t ) ⎞′⎛ ⎜ O ⎟ ⎜ Hb ⎝ Part (t ) ⎠ ⎝ 2 tot ACO Hb + α t Mb tot ACO Mb PartO (t ) + α c Gb PmO (t ) 2 2 tot ACO Gb PartO (t ) ⎞ ⎟+ PcO (t ) ⎠ 2 2 ⎛ P CO (t ) ⎞ PartO (t ) N A P CO (t ) N A + ⎜ artO = E (t ) + atm . ⎟ K (t ) Vµ ⎝ Part (t ) ⎠ K (t ) Vµ 2 2 (35) Это выражение представляет собой дифференциальное уравнение типа A(t)y′ + B(t)y = C(t), (36) где y= ⎛ A(t ) = ⎜ Hb ⎝ tot CO + α t Mb AHb tot CO AMb B(t ) = PartO (t ), PartCO (t ) , PartO (t ) 2 PartO2 (t ) + α c Gb PmO2 (t ) C (t ) = E (t ) K (t ) 2 Vµ NA tot CO AGb PartO2 (t ) ⎞ Vµ K (t ), ⎟ PcO2 (t ) ⎠ N A CO + Patm (t ). Общее решение дифференциального уравнения такого типа имеет вид [16] ⎡ ⎤ ⎛ B(t ) ⎞ ⎛ B(t ) ⎞ C (t ) y (t ) = ⎢ dt dt ⎟ + const ⎥ exp ⎜ − dt ⎟ . exp ⎜ A(t ) A(t ) ⎠ ⎝ A(t ) ⎠ ⎝ ⎣ ⎦ ∫ ∫ ∫ (37) Если коэффициенты А, В и С не изменяются во времени, а это имеет место в нашем случае при выполнении условий (31) и постоянстве во времени источника эндогенного СО, т.е. функции E(t), коэффициента диффузии легочной мембраны DL, барического давления, вентиляции легких и уровня СО в атмосфере, то решение уравнения (36) сводится к виду y (t ) = C B + const ⋅ exp ⎡⎣ − ( B A ) t ⎤⎦ . Для стационарного состояния, наблюдаемого при t → ∞, получим PartCO PartO = 2 t =∞ C , B 147 откуда следует, что PartCO (∞) = EK Vµ NA CO + Patm , (38) CO а с учетом соотношения (14) для Palv (t ) будем иметь CO Palv (∞ ) = E Vµ SPB CO + Patm . & NA V Тогда, используя равенства (13) и (14), для усредненной эндогенной составляющей получим CO CO Vµ PB PCO (∞) − Patm PCO (∞) − Patm PB = art =E , Pavendo CO (∞) = alv (39) & S K N A V& V т.е. в стационарном состоянии при постоянных внешних условиях парциальное давление эндогенного СО в выдыхаемом воздухе определяется только темпом его продукции в организме, E, и вентиляцией V&. Специально отметим, что содержание СО и О2 во вдыхаемом воздухе, а также характеристики проницаемости альвеолярной мембраны не влияют на эту величину. Постоянная времени процессов, описываемых рассматриваемым дифференциальным уравнением, определяется выражением ⎛ ⎜ Hb A ⎝ τ= = B ACO + α t Mb tot Hb tot CO AMb PartO2 (t ) + α c Gb PtO2 (t ) tot CO AGb PartO2 (t ) ⎞ Vµ K (t ) ⎟ PcO2 (t ) ⎠ N A O2 art P (t ) CO CO CO ⎛ Hb tot AHb α t Mb tot AMb α c Gb tot AGb =⎜ + + ⎜ PartO (t ) PtO (t ) PcO (t ) ⎝ 2 2 2 ⎞ Vµ K (t ). ⎟ ⎟ NA ⎠ = (40) Отсюда следует, что если существует функциональная взаимосвязь между скоростями изменения относительных концентраций СО и О2 в артериальной крови, тканях и клетках и выполняются соотношения (31) и (35), то динамика наблюдаемых процессов выделения эндогенного СО, обусловленная изменениями параметров внешней среды, будет определяться суммарным вкладом гемоглобинного, миоглобинного и глобинного буферов моноокиси углерода в организме, а также параметрами легочной мембраны. Взаимосвязь параметров отсутствует. Если взаимосвязь между величинами ′ (t ), Rt′(t − T * ) и Rc′(t − T * ) отсутствует, т.е. они являются независимыми функциями Rart от времени, то это позволяет вернуться от уравнения (29) к уравнению (15). В данном CO случае поток эндогенного СО на гемоглобин FHb равен продукции E эндогенного СО. При постоянстве этой величины, решение уравнения (15) будет отличаться от решения (29) лишь постоянной времени. В этом случае для τ будет справедливо равенство τ Hb = Hb tot ACO A Hb Vµ = K (t ). O B Part (t ) N A 2 (41) Таким образом, в отсутствие функциональной взаимосвязи между скоростями изменения относительных концентраций СО и О2 в артериальной крови, тканях и клетках динамика процессов выделения СО с выдыхаемым воздухом, обусловленная изменением параметров вдыхаемой газовой смеси, будет определяться лишь гемоглобинным буфером и диффузионными свойствами легочной мембраны. 148 Рассмотрим, каким образом могут проявляться характеристики других буферных систем при отсутствии рассмотренной выше взаимосвязи. В случае стационарности внешних условий соотношение (39) будет справедливо и для изменяющегося во времени потока эндогенного СО на гемоглобин. Таким образом, если этот поток будет меняться вследствие изменений внутренних параметров организма и вызываемых ими вариаций количества СО, связываемого буферными системами в тканях и клетках, то это отразится на парциальном давлении СО в выдыхаемом воздухе. Проанализируем динамику изменения количества СО на миоглобинном буфере. 2.1.4. Влияние миоглобинного буфера Практический интерес рассмотрения взаимодействия эндогенного СО и О2, проникающего в ткани, с миоглобинным буфером обусловлен тем, что это позволяет объяснить возможную зависимость темпа выделения СО с выдыхаемым воздухом от кислотно-основного состояния (КОС) среды в тканях, а также от интенсивности метаболических процессов, приводящих к образованию СО2 и повышающих кислотность среды. На рис. 3a, поясняющего основные принципы такой взаимосвязи, показаны кривые насыщения гемоглобина при трех различных значениях pH среды: pH = 7.4 соответствует КОС артериальной крови, насыщенной кислородом, а pH = 7.2 и рН = 7.0 соответствуют КОС в тканях при различной метаболической активности. Видно, что при поступлении артериальной крови в ткани с меньшим значением pH (условия большей метаболической активности) там высвободится несколько больше кислорода, чем в менее закисленной среде, что приведет к немного более высокому напряжению кислорода в среде. На рис. 3б показана кривая насыщения миоглобина, параметры которой очень слабо зависят от КОС среды. Видно, что большая порция кислорода, принесенная гемоглобином, вытеснит с миоглобина больше СО, которое далее будет связано гемоглобином и будет транспортировано кровью в легкие. Учитывая конвективный механизм циркуляции миоглобина в цитоплазме клеток, использующийся для транспорта кислорода от клеточной мембраны к митохондрии [17, 18], поток проходящего через миоглобинный буфер СО можно рассмотреть подобно тому, как это было сделано выше для гемоглобина. Это позволяет по аналогии для СО, выходящего из клеток, в которых в качестве транспортной системы кислорода и СО используется миоглобин, записать следующее уравнение баланса Насыщение MbO2 1.0 0.8 pH = 7.4 pH = 7.2 pH = 7.0 0.6 [O2(pH = 7.0)]Rel > > [O2(pH = 7.2)]Rel а 0.4 0.2 0 20 40 60 80 100 pO2, Торр 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Избыточное СО 10 O2(pH = 7.0) 1.0 O2(pH = 7.2) Насыщение HbO2 20 б 30 40 50 pO2, отн. ед. Рис. 3. а — изменение кривых насыщения гемоглобина при снижении кислотно-основного состояния среды до pH = 7.2 и рН = 7.0; б — влияние различных напряжений кислорода в окружающей среде на уровень насыщения миоглобина кислородом и выделение СО. Вертикальные стрелки указывают количество высвобождаемого кислорода [O2]Rel 149 FMb ( t − Tt ) dt + ⎡⎣ MbCO ( t − Tt ) ⎤⎦ q& Mb vt tot dt = ⎡⎣ MbCO ( t ) ⎤⎦ q& Mb vt tot ( ) CO , dt + Dc PtCO − Pven (42) * где FMb(t – T )dt — поток эндогенного СО, продуцируемого в клетке и переносимого миоглобином, q& — скорость циркуляции миоглобина в клетке, vt — циркулирующий объем, Tt — период циркуляции, Dc — коэффициент диффузии клеточной мембраны, CO PtCO — напряжение СО в мышечной клетке вблизи мембраны, Pven — напряжение СО в венозном капилляре. Как и в случае, гемоглобина оно может быть преобразовано к виду ⎛ PtCO ( t ) ⎞′ CO + Dc PtCO ( t ) − Pven = FMb ( t ) . Mb tot ACO (43) Mb ⎜ ⎜ P O ( t ) ⎟⎟ ⎝ t ⎠ 2 ( ) Учитывая, что в венозной крови практически все СО связывается с гемоглобином, можно считать напряжение СО в венозной крови равным нулю. Тогда из (43) получим ⎛ PtCO ( t ) ⎞′ ⎛ PtCO ( t ) ⎞ O CO (44) ⎜⎜ O ⎟⎟ Mb tot AMb + ⎜⎜ O ⎟⎟ Dc Pt ( t ) = FMb ( t ) . P t P t ( ) ( ) t t ⎝ ⎠ ⎝ ⎠ 2 2 2 Таким образом получаем дифференциальное уравнение, аналогичное (35), которое имеет решение типа (36). В этом случае y (t ) = PtCO (t ) , PtO (t ) 2 A(t ) = Mb ACO B(t ) = Dc PtO (t ), C = FMb (t ). Mb , 2 Для стационарного состояния, наблюдаемого при t → ∞, будем иметь PtCO (t ) F (t ) C = = MbO , O2 B Pt (t ) t =∞ Dc Pt 2 (t ) что для напряжения СО в мышечных тканях даст PtCO (t ) = FMb (t ) Dc . Отсюда для потока СО через мембрану мышечной клетки в стационарном состоянии получим достаточно очевидный результат Mb FHb ( t ) = Dc PtCO( t ) = FMb( t ) . Для переходных процессов, определяемых уравнением (44), постоянная времени будет иметь вид Mb ACO A Mb . τ Mb = = (45) B Dc PtO (t ) 2 Как видно, эта постоянная времени пропорциональна величине миоглобинного буфера и относительному сродству миоглобина к СО и обратно пропорциональна напряжению кислорода в тканях и коэффициенту диффузии мембраны мышечных клеток. Можно предположить, что аналогичным образом будет сказываться и влияние глобинных буферов СО, распространенных в клетках других видов, где может проду- 150 цироваться СО. В этом случае напряжение СО в клетках, содержащих глобины, будет определяться соотношением PcCO (t ) = FGb (t ) Dc . При этом для потока СО через клеточную мембрану в стационарном состоянии будет выполняться равенство Gb FHb ( t ) = Dc PcCO( t ) = FGb( t ) . Динамика процессов, обусловленных изменениями параметров среды в клетке, будет определяться характерным временем τ Gb = Gb ACO Gb Dc PcO (t ) 2 . (46) Таким образом, можно ожидать, что при независимом изменении параметров вдыхаемой газовой смеси, среды в тканях и внутриклеточной среды динамика выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом будет описываться суммой трех экспонент, определяемых гемоглобинным, миоглобинным и глобинным буферами СО, т.е. PartCO (t ) = EK ⎛ t ⎞ ⎛ t ⎞ ⎛ t ⎞ CO + Patm + CHb exp ⎜ − ⎟ + CMb exp ⎜ − ⎟ + CGb exp ⎜ − ⎟, NA ⎝ τ Hb ⎠ ⎝ τ Mb ⎠ ⎝ τ Gb ⎠ Vµ (47) где CHb, CMb и CGb — константы, определяющие вклад каждой из буферных систем. Амплитуда эффектов, задаваемая величинами коэффициентов CHb, CMb и CGb будет определяться параметрами, начальными и конечными условиями задачи, т.е. по сути дела характером и интенсивностью изменения условий в среде, окружающей гемоглобин, миоглобин и клеточные глобины. 2.2. Оценка динамических параметров Практический интерес представляет возможность описания переходных процессов, связанных с выделением СО с выдыхаемым воздухом и происходящих при ступенчатом изменении одного или нескольких параметров, например парциального давления О2 или СО в атмосферном воздухе. Рассмотрим случай, когда динамика процесса описывается одной экспонентой с характерным временем, определяемым уравнением (40) или (41). Если значения коэффициентов А, В и С дифференциального уравнения (36) и параметров системы, имеющих место до ступенчатого изменения параметра (t < 0), обозначить индексом 1, а после (t > 0) — индексом 2, то уравнение переходного процесса запишется в виде PartCO (t ) = C2 O Part B2 ( = E2 K 2 2 ) Vµ NA ⎛C C ⎞ + ⎜ 1 − 2 ⎟ PartO 2 ⎝ B1 B2 ⎠ ( ( CO + Patm (P ) ) P ( ) Vµ ⎡ CO − ⎢ E2 K 2 + Patm N ⎣ A ( 2 2 ) + O2 art 2 O2 art 1 ) ⎛ B exp ⎜ − 2 2 ⎝ A2 ⎞ t⎟ = ⎠ Vµ ⎡ ⎤ ⎛ B ⎞ CO exp ⎜ − 2 t ⎟ − + Patm ⎢ E1 K1 ⎥ 1 NA ⎣ ⎦ ⎝ A2 ⎠ ( ⎤ ⎛ B exp ⎜ − 2 ⎥ 2 ⎦ ⎝ A2 ) ⎞ t ⎟. ⎠ Для эндогенной части СО в усредненном по выдоху воздухе получим Pavendo CO (t ) = E2 ( PB )2 V&2 Vµ NA + 151 + ( PB )2 V&2 1 K2 ( ) ( ) ⎧ PartO ⎪ ⎨ O ⎪⎩ Part 2 2 2 1 Vµ Vµ ⎡ ⎤ ⎡ CO CO + Patm + Patm ⎢ E1 K1 ⎥ − ⎢ E2 K 2 1 N N ⎣ ⎦ ⎣ A A ( ) ( ⎤⎫ ⎛ 2 ⎦ ⎪⎭ ⎝ 2 ) ⎥ ⎪⎬ exp ⎜ − BA 2 ⎞ t ⎟. ⎠ (48) Рассмотрим несколько наиболее характерных случаев. 1. Ступенчатое изменение концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе, приводящее к изменению напряжения кислорода в артериальной крови от ( PartO )1 до ( PartO ) 2 . В этом случае для эндогенной составляющей СО в выдыхаемом воздухе из (48) получим ⎛ PartO2 ⎞ Vµ PB Vµ PB 1 ⎛ endo CO CO ⎞ ⎜ 2 ⎟ exp ⎜⎛ − t ⎟⎞ = + + Patm ⎟ − Pav (t ) = E EK 1 ⎜ O & & 2 ⎟ NA V NA V K ⎝ ⎠ ⎜⎝ Part 1 ⎝ τ2 ⎠ ⎠ 2 2 ( ) ( ) ( ) ( ) ⎛ PartO2 = Pavendo CO (∞) + Pavendo CO (∞ ) ⎜ O ⎜ Part 2 ⎝ 2 1 ⎞ ⎛ t − 1⎟ exp ⎜ − ⎟ ⎝ τ2 ⎠ ( ( ⎛ PartO2 ⎞ CO PB 1 ⎜ P + ⎟ atm & V K ⎜ PartO2 ⎠ ⎝ ) ) 2 1 ⎞ ⎛ t − 1⎟ exp ⎜ − ⎟ ⎝ τ2 ⎠ ⎞ ⎟ . (49) ⎠ O . Part2, мм рт. ст. CO Part, ppm Динамика этого процесса изображена на рис. 4 для случая ступенчатого увеличения концентрации О2 во вдыхаемом воздухе, т.е. для ступенчатой гипероксии. Из (49) следует также, что при гипоксии (т.е. при снижении концентрации О2 ниже нормы) в начальный момент 0 50 100 150 200 должно наблюдаться резкое уменьшение парци7 ( PavCO )2 6 ального давления СО в выдыхаемом воздухе. В начале ступенчатого изменения концен5 трации О2 во вдыхаемом воздухе, t = 0, эндо4 CO Pav (t ) генная составляющая СО принимает значение 3 2 1 0 500 400 300 ( PavCO )1 CO Patm Pavendo CO (0) = Pavendo CO (∞) O2 art 2 (P ) 200 100 0 CO + Patm 2 2 ⎤ PB 1 ⎡ ( P ) − 1⎥ . ⎢ & V K ⎣ (P ) ⎦ O2 art 2 O art 1 (50) Используя это соотношение, можно определить значение величины K, характеризующей диффузионно-вентиляторные параметры легких: O2 art 1 (P ) 0 ( PartO ) 2 + ( PartO )1 50 100 150 200 Время, мин Рис. 4. Динамика парциального давления эндогенного СО в выдыхаемом воздухе при ступенчатом изменении концентрации кислорода в дыхательной газовой смеси K= PB V& O2 ⎤ CO ⎡ ( Part ) 2 Patm ⎢ O2 − 1⎥ P ( ) ⎣ art 1 ⎦ endo CO av P (0) − P endo CO av ( P O2 ) (∞) artO 2 ( Part 2 )1 . (51) Однако необходимо учитывать, что в условиях гипероксии, при существенном превышении ( PartO ) 2 над ( PartO )1 , возможно снижение диффузионной способности альвеолярной мембраны, а также вентиляции легких. В этом случае, используя (48), можно найти соотношение, связывающее коэффициенты диффузии при дыхании обычным воздухом DL1 и воздухом, обогащенным кислородом DL2 2 152 2 Таблица 1. Используемые физиологические параметры Параметр Величина в норме V& –1 O2 art 1 (P ) 8 л⋅мин O 100 мм рт. ст. (при Patm = 155 мм рт. ст.) ( PartO2 ) 2 DL K CO Patm O 600 мм рт. ст. (при Patm = 760 мм рт. ст.) 30 мл/мм рт. ст.⋅мин 204 мин⋅мм рт. ст.⋅л–1 0.5 млн–1 = 3.8⋅10–4 мм рт. ст. 2 2 PavCO (∞ ) 1.5 млн–1 = 11.4⋅10–4 мм рт. ст. PavCO (0) ⟨Hb⟩tot ACO Hb 8 млн–1 = 61⋅10–4 мм рт. ст. 2.9⋅1022 217 NA Vµ PB 6.02⋅1023 моль–1 22.4 л 760 мм рт. ст. ( ) ( ) O 1 NA 1 N A Part = DL2 Vµ DL1 Vµ PartO 2 ( ) ( ) 2 2 1 V&1 Pavendo CO (∞) + V&2 Pavendo CO (0) O ⎫ PB ⎧⎪ Part 2 1 endo CO CO endo CO CO ⎪ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ + endo CO ∞ + − + ( ) (0) RP P RP P ⎨ av atm ⎦ atm ⎦ ⎬ . ⎣ av (0) V&2 ⎪ PartO ⎣ Pav ⎪⎭ ⎩ 1 С помощью полученных выше соотношений проведем оценку некоторых величин, которые могут быть измерены экспериментально. При этом будут использованы параметры респираторной системы, приведенные в табл. 1 и заимствованные в [6, 10, 14, 19]. Интенсивность эндогенного источника молекул СО, соответствующая их усредненной концентрации в выдыхаемом воздухе ~ 1 млн–1, составляет & N V& CO N A V E = Pavendo CO A = PavCO (∞ ) − Patm ≈ 2.14 ⋅ 1017 мин −1. Vµ PB Vµ PB 2 2 ( ) При этом оценка скорости образования СО за счет гемолиза эритроцитов (~ 2.9⋅108 молекул гемоглобина в каждом из ~ 25⋅1012 эритроцитов [6]) из учета их полного обновления за ~ 120 дней дает ~ 1.68⋅1017 мин–1, т.е. ~ 76 % от количества, выделяемого с выдыхаемым воздухом. Остальные ~ 20 % могут быть связаны с катаболизмом миоглобина и других гемм-содержащих белков. Пиковое увеличение выделения СО при дыхании чистым кислородом (при этом ( PartO ) 2 = 600 мм рт. ст.) без учета адаптивных реакций организма имеет вид 2 ( ) ( ) ⎡ PartO2 ⎛ CO CO PB 1 ⎞ ⎢ Ppik = ⎜ Pavendo CO (∞) + Patm V& K ⎟⎠ ⎢ PartO2 ⎝ ⎣ 2 1 ⎤ − 1⎥ ≈ 6.0 млн −1. ⎥ ⎦ Вклад гемоглобинного буфера в постоянную времени релаксационного процесса, изображенного на рис. 4, имеет вид 153 Концентрация СО, млн–1 1.8 Pexh 1.6 Pexh 1.4 1.2 Pendo Pendo 1.0 0.8 Patm 0.6 0.4 Patm –50 0 50 100 150 200 250 –50 0 50 100 150 200 250 Время, отн. ед. Рис. 5. Динамика концентрации эндогенной фракции (Рendo) и суммарной концентрации (Рexh) СО при ступенчатом изменении его содержания в атмосфере τ Hb = Hb CO tot Hb O2 art 2 A (P ) Vµ NA K 2 ≈ 106 мин. Для оценки вкладов миоглобинного и цитохромного буферов требуется информация об устанавливающихся при дыхании чистым кислородом напряжениях кислорода в тканях и митохондриях, а также о взаимосвязи напряжений СО в тканях и митохондриях с напряжением СО в артериальной крови (коэффициенты αt и αc в уравнениях (34) и (40). В настоящее время такая информация отсутствует. CO )1 до 2. Ступенчатое изменение концентрации СО во вдыхаемом воздухе от ( Patm CO ( Patm ) 2 . В этом случае из уравнения (48) получим для составляющей СО в выдыхаемом воздухе, обусловленной выделением из организма и в данном случае уже не совпадающей с эндогенно-продуцируемой частью СО ⎛ ⎞ P Vµ PB 1 ⎡ CO CO ⎤ exp ⎜ − t ⎟ = + Pavexh CO (t ) = E B Patm − Patm & & ⎣ ⎦ 1 2 V NA V K ⎝ τ2 ⎠ ( = Pavendo CO (∞) + ) ( PB 1 ⎡ CO Patm V& K ⎣ ( ) ) −(P ) CO atm 2 1 ⎤ exp ⎜⎛ − t ⎦ ⎝ τ2 ⎞ ⎟. ⎠ (52) Динамика этого процесса изображена на рис. 5. Общее парциальное давление СО в выдыхаемом воздухе в момент t = 0 изменится от значения ( CO PavCO = Pavendo CO ( ∞ ) + Patm ) 1 до значения ( CO PavCO ( t ) = Patm 154 ) 2 + Pavendo CO (∞) + PB 1 ⎡ CO CO ⎤. Patm − Patm 1 2⎦ V& K ⎣ ( ) ( ) В норме при условии дыхания атмосферным воздухом с обычным содержанием кислорода, PO2 = 155 мм рт. ст., постоянная времени τ2 установления нового уровня CO ) 2 + Pavendo CO (∞ ), оцениваепарциального давления в выдыхаемом воздухе PavCO (t ) = ( Patm мая лишь с учетом гемоглобинного буфера СО, составит не менее 480 мин (~ 8 час). 3. Периодическое изменение концентрации СО в атмосферном воздухе. Рассмотрим динамику содержания СО в выдыхаемом воздухе при периодическом изменении его концентрации в атмосферном воздухе. Представим парциальное давление СО в атмосферном воздухе в виде суммы постоянной и периодической функций: CO 0 m Patm (t ) = Patm + Patm sin ω t , (53) 0 m — постоянная составляющая содержания СО в атмосфере, а Patm — амплитуда где Patm переменной составляющей, изменяющейся с частотой ω. Если все остальные коэффициенты в уравнении (36) считать неизменными во времени, то его можно переписать в виде Ay ′ + By = C0 + Cm sin ω t , где Vµ 0 m C0 = EK + Patm , Cm = Patm . NA Используя соотношение (37) для общего решения уравнений такого вида, для отношения напряжений СО и О2 в артериальной крови получим PartCO (t ) C0 ⎛ B ⎞ C = + const1 exp ⎜ − t ⎟ + m O2 Part (t ) B ⎝ A ⎠ A A ⎤ ⎡ sin ⎢ω t + arctg(− ω ) ⎥ . B ⎦ ⎣ ( B / A)2 + ω 2 1 Как видно, оно представляет собой сумму стационарного решения, свойства которого были рассмотрены выше, и переменной части, меняющейся с той же частотой ω, что и атмосферная составляющая, но отстающей по фазе. С учетом (13), (14) и (53) для выделяемого из организма СО в выдыхаемом воздухе получим Pavexh CO (t ) = =E CO PartCO (t ) − Patm (t ) PB = K V& ⎧ ⎫ Vµ PB 1 A ⎤ ⎪ ⎡ m PB ⎪ ω ω ω sin t arctg( ) sin t + Patm + − − ⎨ ⎬. ⎢ ⎥ N A V& B KV& ⎪ 1 + (τω )2 ⎣ ⎦ ⎩ ⎭⎪ (54) При сравнительно низких частотах осцилляций уровня СО в атмосферном воздухе, т.е. когда ω << Ω = B/A, второе слагаемое в этом выражении будет близко к нулю, и добавочная часть СО в выдыхаемом воздухе, связанная с выделением этого соединения из организма, будет определяться в основном эндогенной составляющей. Таким образом, система, буферирующая СО в организме, будет успевать отслеживать изменения внешних условий. Суммарное парциальное давление СО в выдыхаемом воздухе в этом случае будет составлять CO PavCO (t ) = Pavexh CO (t ) + Patm (t ) = E Vµ PB 0 m + Patm + Patm sin ω t. N A V& При сравнительно высоких частотах осцилляций уровня СО в атмосферном воздухе, ω >> Ω, выражение (54) сведется к следующему: 155 Pavexh CO (t ) = E Vµ PB m PB − Patm sin ω t , & NA V KV& т.е. в СО, выделяемом с выдыхаемым воздухом, будет присутствовать помимо эндогенной составляющей еще и компонента, осциллирующая в противофазе с атмосферными вариациями и пропорциональная глубине модуляций атмосферной составляющей. Суммарное парциальное давление СО в выдыхаемом воздухе в этом случае будет составлять PavCO (t ) = E Vµ PB PB ⎞ 0 m ⎛ + Patm + Patm ⎜1 − KV& ⎟ sin ω t. N A V& ⎝ ⎠ В обычных условиях, когда физиологические параметры принимают значения, указанные в табл. 1, множитель в скобках составляет ~ 0.5, т.е. глубина модуляции осциллирующей составляющей концентрации СО в выдыхаемом воздухе уменьшается в 2 раза. В случае промежуточных значений ω для PavCO (t ) получим PavCO (t ) = E Vµ PB P ⎞ 1 0 m ⎛ m PB + Patm + Patm 1 − B ⎟ sin ω t + Patm sin [ωt + arctg(−τω )]. ⎜ & & & NA V KV 1 + (τω )2 ⎝ KV ⎠ (55) Осцилляции концентрации СО в атмосферном и выдыхаемом воздухе для трех рассмотренных выше случаев показаны на рис. 6. При их моделировании для расчета использовались следующие значения уровня СО в атмосферном и выдыСодержание СО, млн–1 хаемом воздухе: 2.5 0 m Patm = 0.8 млн–1, Patm = 0.5 млн–1, 2 4 2.0 Pavendo CO = E (Vµ / N A )( PB /V& ) = 1.0 млн–1. 3 В случае суточных вариаций со1.5 Pavendo CO держания СО в атмосфере с периодом 1 ~ 24 часа, являющихся типичными m η Patm 1.0 для городских условий, в норме, т.е при τ ≈ 8 час, получим 0.5 0 2π Patm ω= ≈ 4.36 ⋅10−3 мин −1, 1440 мин 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Время, отн. ед. η = arctg ( −ωτ ) ≈ −1.1 рад. При этом, согласно расчетам с использованием соотношения (50), глубина модуляции уровня СО в выдыхаемом воздухе составит ~ 0.92 млн–1 (см. рис. 6). 4. Ступенчатое изменение параметров среды в организме. Если напряжение О2 в тканях или клетках по каким-либо причинам изменяется ступенчатым образом от значения ( PtO )1 до ( PtO ) 2 , а все остальные параметры системы остаются неизменными, то наблюдаемый переход- Рис. 6. Вариации содержания СО в выдыхаемом воздухе, обусловленные периодическими изменениями концентрации СО в атмосфере (1): при относительно низких (2) и относительно высоких (3) частотах атмосферных осцилляций, а также при суточной цикличности уровня СО в городской атмосфере (4) 2 156 2 ный процесс, связанный с динамикой миоглобинного буфера, будет описываться следующей формулой: ⎛C C ⎞ ⎛ B ⎞ C PtCO (t ) = 2 PtO2 + ⎜ 1 − 2 ⎟ PtO2 exp ⎜ − 2 t ⎟ = 2 2 B2 ⎝ B1 B2 ⎠ ⎝ A2 ⎠ ( ) ( ) ( ) ( ) O2 ⎞ FMb (t ) PB FMb (t ) PB ⎛⎜ Pt 2 ⎟ exp ⎛⎜ − t ⎞⎟ . (56) 1 + − ⎟ τ Mb ⎠ Q& Mb (t ) Q& Mb (t ) ⎜ PtO2 ⎝ 1 ⎝ ⎠ Динамика этого процесса аналогична той, которая показана на рис. 4, но ее характерное время τMb определяется величиной миоглобинного буфера и параметрами среды, реализующимися в тканях. Как упоминалось выше, причиной изменения напряжения СО в тканях, описываемого этой формулой, может стать, например, изменение продукции СО2 или кислотно-основного состояния в тканях, поскольку этими факторами в соответствии с соотношением (23) определяется сродство О2 к гемоглобину. При резком закислении среды напряжение кислорода в тканях повысится, т.е. ( PtO2 ) 2 > ( PtO2 )1 , и, в соответствии с (56), в начальный момент времени (t = 0) будет наблюдаться увеличение выделения CО. Защелачивание среды, напротив, будет приводить к снижению напряжения кислорода в тканях по сравнению с нормой, следствием чего станет уменьшение выделения СО с выдыхаемым воздухом. Ниже будут приведены примеры экспериментального наблюдения подобных процессов. = 3. Лазерные методы анализа СО в выдыхаемом воздухе Коэффициент поглощения, 10–4 см–1 0.5 а 12 18 0.6 С О 12 16 С О 0.4 0.3 13 16 С О 0.2 0.1 0 б H2О 2 CО2 1 0 2100 2110 2120 2130 2140 2150 2160 Волновое число, см–1 Рис. 7. Спектр коэффициента поглощения различных изотопических модификаций СО (а), СО2 и Н2О (б) в выдыхаемом воздухе при нормальном давлении. Концентрация СО — 1 млн–1, СО2 — 3 об. %, Н2О — 3 об. % 157 Для детектирования эндогенного СО в выдыхаемом воздухе был разработан высокочувствительный автоматизированный газоанализатор на основе перестраиваемых диодных лазеров (ПДЛ), позволяющий измерять относительно малые концентрации этого вещества, ~ 0.1 млн–1, с точностью ~ 5 % в режиме долговременного мониторинга. Ранее его конструкция и принципы действия были кратко описаны в [20–24]. 3.1. Спектроскопия СО в среднем ИК-диапазоне Для высокочувствительного лазерного анализа СО были использованы линии поглощения фундаментальной колебательно-вращательной полосы 1–0, расположенной вблизи 4.7 мкм (рис. 7). В силу линейности молекулы моноокиси углерода эта полоса является единственной полосой фундаментального поглощения СО и состоит из отдельных изолированных линий поглощения, удаленных друг от друга на ~ 4 см–1. Наиболее интенсивные линии P- и R-ветвей со значениями J от 5 до 10 расположены в частотных интервалах 2100–2125 см–1 и 2160–2180 см–1 соответственно. Их интенсивности составляют (3–4)⋅10–19 см–1/мол⋅см–2, а коэффициент столкновительного уширения воздухом 0.06–0.08 см–1/атм. Полоса 1–0 СО интерферирует с несколькими слабыми полосами СО2 и Н2О. В данном случае эта интерференция не является существенным фактором, ухудшающим условия детектирования СО в выдыхаемом воздухе, поскольку спектры достаточно разрежены. Наиболее изолированными являются линии R-ветви R(4), R(6), R(7), R(8), R(9) и R(11). В P-ветви наименее чувствительны к СО2 и Н2О линии P(3), P(4), P(5) и P(10). P-ветвь наиболее привлекательна с точки зрения одновременного детектирования в выдыхаемом воздухе СО и СО2, что актуально для исследований в области физиологии дыхания. В силу достаточно регулярного расположения линий СО по спектру актуальной является точная идентификация используемых для анализа линии поглощения. Простой способ решения этой проблемы связан с использованием изотопомеров моноокиси углерода, т.е. молекул 13С16О и 12С18О. Благодаря изотопическому смещению центров полос 12С16О, 13С16О и 12С18О и небольшой разнице их вращательных постоянных спектры этих молекул в совокупности образуют достаточно специфичную и неповторяющуюся картину (см. рис. 7), которую удобно использовать для частотной привязки спектра и идентификации линий. 3.2. Лазерный анализатор СО 7 3 3 4 5 2 4 6 2 158 1 3 Высокочувствительный анализатор СО, схема которого показана на рис. 8, базируется на использовании диффузионного ПДЛ на основе твердого раствора типа PbSSe [25]. Точный подбор химического состава лазера обеспечивает генерацию в диапазоне 2100–2180 см–1 при температуре жидкого азота (~ 78 К). Для накачки используются короткие импульсы тока амплитудой ~ 1–2 А, длительностью до 100 мкс и частотой повторения ~ 100 Гц. Перестройка частоты генерации лазера происходит со скоростями порядка 5⋅104–105 см–1/с. Мощность излучения в моде составляет 0.3–0.5 мВт. Для охлаждения ПДЛ используется заливной оптический криостат с расходом жидкого азота около 1.5 л за сутки. Выбор подходящего режима генерации ПДЛ в данной системе осуществляется только за счет изменения параметров тока накачки. Ста- бильность температуры лазера определяется стабильностью температуры кипения жидкого азота, небольшие медленные вариации которой при изменении внешних условий компенсируются специальным алгоритмом обработки регистрируемых спектров. Выходящее из криостата излучение ПДЛ с помощью двулинзового объектива из CaF2, позволяющего уменьшить потери за счет сферических аберраций, вводится в многоходовую кювету (МХК), съюстированную по схеме Вайта. Объем кюветы составляет ~ 1.2 л при базовой длине кюветы ~ 30 см. При использовании зеркал с аллюминиевым покрытием оптимальный оптический путь в МХК составляет ~ 20 м. После прохождения кюветы лазерное излучение фокусируется на охлаждаемый фотодиод на основе InSb, обладающий быстродействием ~ 20 нс и обнаружительной способностью ~ 1⋅1011 см⋅Гц1/2⋅ср1/2⋅Вт–1. Для регистрации спектров пропускания СО использована электронная система, детально описанная в [26] Сигнал, отн. ед. 140 2 H2O 1 120 4 3 100 80 P(6) P(4) P(3) 12 CO 12CO 12CO 20 30 40 50 60 Время, мкс Рис. 9. Лазерные спектры пропускания выдыхаемого воздуха (1), атмосферного воздуха (2), калибровочной смеси СО:N2 (3), и обогащенной по 13С16О и 12С18О изотопической смеси с азотом (4) при атмосферном давлении. Длина оптического пути в МХК 18.6 м, в калибровочной кювете — 5 см и бази- Рис. 8. Оптическая схема высокочувствительного газоанализатора на основе перестраиваемых диодных лазеров: 1 — ПДЛ в криостате, 2 — ИК-фотоприемники в криостате, 3 — поворотные зеркала, 4 — двулинзовые ИК-объективы, 5 — калибровочная кювета, 6 — реперная кювета, 7 — многоходовая аналитическая кювета рующаяся на быстродействующем (50 нс) 8-разрядном АЦП. При записи огибающей импульса ПДЛ длительностью 40–60 мкс на линию поглощения СО, сканируемую лазером за время ~ 1.5–2 мкс, приходится около 30–40 точек. Исследуемый спектр пропускания (рис. 9), регистрируется с накоплением 128 раз в течение ~ 5 с. Динамический диапазон регистрации амплитуды сигнала расширяется до 4⋅103 за счет аппаратного свипирования сигнала [26]. Для измерения концентрации СО используется прямое детектирование линий поглощения. При автоматической обработке регистрируемого спектра производится определение положения центра аналитической линии, огибающей нуля поглощения, оптического нуля, величины поглощения в максимуме резонанса и ширины линии поглощения на полувысоте. На основании результатов выполнения этих процедур, а также с учетом длины оптического пути в МХК, температуры, атмосферного давления и спектральных параметров используемой аналитической линии поглощения рассчитывается концентрация СО в исследуемой газовой смеси. Применяемые для расчета параметры линии, заимствованные из банка спектральных данных HITRAN-96 [27], задаются на основе идентификации спектра поглощения СО с помощью изотопомеров 13С16О и 12С18О (рис. 9). Основными источниками погрешностей определения концентрации СО в выдыхаемом воздухе с помощью данного анализатора являются: влияние уровня атмосферного СО в открытой части оптической схемы, флуктуации температуры кипения жидкого азота, влияние суперлюминесцентной подставки в излучении ПДЛ, влияние оптических интерференционных помех, влияние дискретности оцифровки спектрального сигнала. 159 • • • • • • Основные аналитические параметры анализатора СО на основе ПДЛ: чувствительность детектирования содержания СО ~ 5 млрд–1, точность детектирования ~ 3 %, селективность детектирования ~ 100 %, время измерения концентрации СО ~ 5 с, время перенапуска МХК (по уровню 0.9) ~ 10 с, время непрерывного мониторинга не ограничено. 3.3. Специфика и методика детектирования СО в выдыхаемом воздухе лярном воздухе 160 АО ВЫКЛ АО ВКЛ В исследованиях содержания СО в выдыхаемом воздухе анализатор мог использоваться в режиме отбора пробы воздуха за один выдох, в режиме долговременного непрерывного мониторинга дыхания и в режиме накопления микропорций воздуха, соответствующих исследуемой фазе выдоха. В первом случае отбор пробы выдыхаемого воздуха проводился в мягкую буферную емкость объемом 1.5–2 л (например, пластиковый мешок, снабженный патрубком с запирающим вентилем), из которой исследуемая газовая смесь медленно откачивалась в МХК анализатора. Время анализа такой пробы составляло 2–3 мин и определялось временем прокачки МХК. При заполнении буферной емкости мог применяться тот или иной дыхательный маневр, например задержка дыхания или гипервентиляция. В случае долговременного мониторинга испытуемый свободно дышал через так называемую клапанную коробку, а носовые ходы перекрывались. Это позволяло контролировать объем и состав вдыхаемого воздуха, используя при необходимости искусственные дыхательные смеси, а также полностью и непрерывно собирать выдыхаемый воздух в Содержание СО, ppm мягкую буферную емкость объемом 3–5 л, снабженную стравливающим клапаном для сброса 1.6 COalv лишнего газа. Усредненная за счет перемешивания в этой буферной емкости воздушная смесь с 1.4 помощью микропомпы прокачивалась через МХК со скоростью от 1 до 10 л в минуту в зависимости 1.2 COav от задач исследования. Этой скоростью определялось время перенапуска МХК и, таким образом, 1.0 постоянная времени анализа (10–100 с). При долговременных измерениях (более нескольких ча0.8 сов) в режиме непрерывного мониторинга стенки МХК подогревались до температуры ~ 37°С, что 0.6 препятствовало конденсации влаги на элементах 0.4 кюветы и поверхности ее зеркал. Это позволяло даже в многосуточных экспериментах обойтись 0.2 без осушителей или очистителей воздуха, исполь0 5 10 15 зование которых могло бы исказить получаемые Время, мин результаты. Рис. 10. Типичная динамика показаВ третьем случае, когда требовалось накопний анализатора CO в выдыхаемом ление микропроб выдыхаемого воздуха, соответвоздухе при использовании свободствующих определенной фазе выдоха, на выходе ного дыхания с помощью клапанной клапанной коробки устанавливалось специалькоробки и альвеолярного отсекателя ное устройство — так называемый альвеолярный (АО). Горизонтальными стрелками показан уровень содержания СО в отсекатель. Он позволял отсечь и собирать наусредненном по выдоху и альвеочальную или конечную часть воздуха в каждом выдохе. Емкость отсекаемой пробы регулировалась и могла составлять от 50 до 100 мл. Собираемый таким образом воздух медленно, со скоростью ~ 5–10 мл/c, прокачивался через МХК. Время наполнения кюветы составляло 3–5 мин. На рис. 10 представлены типичные изменения показаний анализатора при исследовании состава выдыхаемого воздуха с применением альвеолярного отсекателя. Как видно, содержание СО в атмосферном воздухе при проведении измерений составляло ~ 0.3 млн–1. На второй минуте измерений начался отбор в МХК выдыхаемого воздуха из буферной емкости. Усредненное содержание СО в выдыхаемом воздухе составило ~ 1.13 млн–1. Таким образом, часть, обусловленная эндогенным СО, составила ~ 0.83 млн–1 (типичное значение в норме). На пятой минуте был активирован альвеолярный отсекатель (АО) и собирался воздух из конечной, так называемой альвеолярной, фракции выдоха. Как видно, в альвеолярном воздухе содержание СО повышено до ~ 1.52 млн–1 (эндогенная составляющая СО составляет ~ 1.22 млн–1) из-за менее интенсивной вентиляции вдыхаемым воздухом самых дальних отделов легких (альвеол). Таким образом, в данном случае коэффициент разбавления альвеолярного воздуха за счет усреднении по всему объему выдоха составил ~ 1.5. С учетом контролируемой вентиляции, стандартных условий в легких и фонового уровня СО в атмосферном воздухе измеряемая концентрация может быть пересчитана в скорость выделения СО организмом. Для исследований особенностей и закономерностей выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом в различных условиях и при различных состояниях испытуемых описанный анализатор использовался в составе автоматизированного измерительного комплекса, содержащего также анализаторы O2 и СO2, респирометр (датчик дыхательного потока) и пульсоксиметр. 4. Экспериментальные результаты мониторинга СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных В данном разделе дается обзор результатов нескольких циклов исследований, цель которых состояла в изучении основных закономерностей выделения СО с выдыхаемым воздухом с помощью описанных выше методов лазерного газоанализа. Фрагментарно эти данные были уже ранее представлены в целом ряде публикаций [20–24, 28–45]. В ходе этих исследований были впервые получены систематические данные, демонстрирующие специфику и динамику выделения эндогенного СО из организма в различных условиях и позволяющие провести сопоставление с модельным описанием изучаемых процессов. Полученные результаты и практический опыт, накопленный в ходе данных исследований, имеют также и существенное методическое значение, поскольку позволяют составить достаточно полное представление о возможностях развиваемого инструментального подхода в применениях к анализу газообразных биомаркеров в выдыхаемом воздухе. В частности, была проведена оценка основных аналитических параметров метода, таких как чувствительность, селективность и быстродействие детектирования, воспроизводимость и достоверность получаемых данных, устойчивость и надежность системы, возможная продолжительность непрерывного анализа, чувствительность получаемых результатов к изменению внешних факторов. Были опробованы различные способы отбора проб выдыхаемого воздуха, включая анализ в режиме мониторинга и при дистанционном отборе проб, отбор проб в контейнеры, сочетание с дыханием искусственными дыхательными смесями, отбор проб из воздушной среды барокомплексов в экспериментах по гипербарической физиологии, совмещение с аппаратом искусственного дыхания в условиях экстренной терапии. Разработанные методы были испытаны в применении к различным объектам и условиям анализа. В 161 Количество случаев 60 50 40 30 20 10 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Концентрация выделяемого СО, млн–1 Рис. 11. Распределение концентрации эндогенного СО в выдыхаемом воздухе для 365 практически здоровых некурящих испытуемых частности, они были использованы для исследований человека, лабораторных животных и растений. С их помощью изучались закономерности газообмена с дыханием в разных физиологических и патологических состояниях и при применении специальных диагностических приемов и методов (маневры дыхания, физиологические тесты, измененная газовая среда). Была продемонстрирована возможность адаптации методов к условиям клинической диагностики, где важным фактором является неинвазивность анализа. 4.1. Естественные вариации скорости выделения эндогенного СО Исследования эндогенного СО в выдыхаемом воздухе большой группы практически здоровых испытуемых показали, что уровень его содержания варьируется в диапазоне от 0.5 до 1.4 млн–1 и снижается с возрастом. У женщин в среднем наблюдаются более низкие значения, чем у мужчин. При определении уровня эндогенного СО в выдыхаемом воздухе необходимо принимать во внимание, что из-за наличия системы буферирования СО в организме получаемое при измерении значение концентрации зависит от предыстории, т.е. от содержания моноокиси углерода и длительности пребывания испытуемого в среде, предшествующей проведению анализа. На рис. 11 показано распределение значений концентрации СО, выделяемого с выдыхаемым воздухом, которое было получено на основе обследования 365 здоровых некурящих испытуемых, проживающих в московском регионе. В обработку были включены данные, собранные при измерениях в лабораториях, расположенных в различных районах города: в Институте 6.общей физики РАН, ул. Вавилова, в Институте Труды ИОФАН пульмонологии МЗ РФ, 11-я Парковая ул. и в Институте медико-биологических проблем РАН, ст. Планерная, 28-й км Ленинградского шоссе. Видно, что полученное распределение имеет максимум в диапазоне концентраций 0.8–1.0 млн–1, но в то же время не является нормальным. Наблюдается увеличенная доля значений, превышающих 1 млн–1. Такую асимметрию можно связать с повышенным содержанием СО в городском атмосферном воздухе, а также с воздействием пассивного курения, влияние которых будет продемонстрировано ниже. При проведении исследований, направленных на изучение интенсивности выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом, необходимо предпринимать специальные меры, минимизирующие влияние предыстории. Для группы из 15 здоровых испытуемых были проведены систематические измерения содержания СО во вдыхаемом воздухе (FiCO), в выдыхаемом воздухе, усредненном по выдоху (FCO), и в альвеолярной порции выдыхаемого воздуха (FАCO). Исследования проводились в относительно чистом районе на окраине г. Москвы в Институте пульмонологии МЗ РФ. Результаты эксперимента приведены в табл. 2. Полученные значения были использованы для расчета средней по группе концентрации эндогенного СО в усредненном выдыхаемом воздухе (FeCO) и в альвеолярной порции выдыхаемого воздуха (FECO). Отметим, что для этой группы испытуемых значение ко- 162 эффициента S, определяющего отношение содержания эндогенного СО в усредненном выдыхаемом воздухе и в его альвеолярной порции (13), составило ~ 1.68 ± 0.56 млн–1. Нами было обнаружено наличие в норме циркадного (суточного) ритма изменений СО в выдыхаемом воздухе с максимумом в полдень и минимумом в полночь (рис. 12) [23]. Такая периодичность может быть обусловлена незначительными суточными вариациями кислотно-основного состояния в тканях организма [46] или изменением активности специфических метаболических процессов [47]. Снижение темпа выделения СО в ночные часы, которое, как видно из рисунка, может составлять более 30 %, свидетельствует о небольшом защелачивании тканей организма в это время. Механизм этого снижения был пояснен в разд. 2.2 при рассмотрении модели выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом. Наличие циркадного ритма в выделении СО было косвенно подтверждено при круглосуточном мониторинге содержания моноокиси углерода в воздушной среде барокомплекса во время пребывания в нем испытуемых (рис. 13). Представленные на рисунке данные были получены при исследовании 4 испытуемых, находившихся в течение 7 дней в замкнутой среде обитания в нормальных условиях. Низкий и в достаточной мере постоянный уровень СО в окружающей атмосфере поддерживался с помощью систем очистки и регенерации воздуха барокомплекса. Видно, что во второй половине дня равновесная концентрация СО в воздухе поддерживается на уровне ~ 0.6 млн–1. В ночные часы, во время сна испытуемых, она снижается до уровня ~ 0.4 млн–1 и постепенно восстанавливается в утренние и дневные часы, к 16:00. Отметим наличие на графике нескольких моментов резкого незначительного увеличения содержания СО, обусловленных напуском кислорода в барокамеру для компенсации потребления последнего испытуемыми. Таблица 2. Содержание СО в выдыхаемом воздухе 15 здоровых испытуемых Атмосферный воздух FiCO, млн–1 Усредненный выдыхаемый воздух FCO, млн–1 Эндогенное СО в усредненном выдыхаемом воздухе FeCO, млн–1 Альвеолярная порция выдыхаемого воздуха FACO, млн–1 Эндогенное СО в альвеолярной порции выдыхаемого воздуха FECO, млн–1 0.58 ± 0.20 N = 54 1.37 ± 0.27 N = 54 0.79 ± 0.22 N = 31 1.89 ± 0.31 N = 49 1.33 ± 0.30 N = 54 163 Концентрация СО, млн–1 млн–1 Содержание СО в атмосфере, 0.8 1.4 1.0 Рис. 14. Распределение данных по соКонцентрация СО, млн–1 держанию СО в атмосферном воздухе по 0.70 времени суток. Измерения проведены в 0.65пригородной зоне г. Москвы (28-й км 0.60Ленинградского шоссе) 0.8 0.55 0.6 1.2 0.4 0.2 0.6 0 0.4 0.4:00 0.8:00 12:00 00:00 0.2 0 12 24 12 0.50 16:00 20:00 24:00 0.45 Время, чч:мм 0.40 24 12 Время, час Рис. 12. Циркадные (суточные) вариации содержания СО в выдыхаемом воздухе (●) и одновременные изменения уровня СО в атмосфере (○) 0.35 00:00 08:00 16:00 24:00 Время, чч:мм Рис. 13. Суточные вариации содержания СО в атмосфере барокомплекса при многосуточном нахождении в нем 4 испытуемых 4.2. Влияние изменений состава вдыхаемого воздуха С помощью лазерного анализатора нами были исследованы вариации содержания СО в выдыхаемом воздухе, обусловленные изменением газового состава вдыхаемого воздуха, в частности содержания в нем СО, О2 и СО2. 4.2.1. Изменение уровня СО во вдыхаемом воздухе Были исследованы вариации содержания СО во вдыхаемом воздухе, связанные как с изменением уровня загрязнений воздуха в реальной городской атмосфере, так и курением. Из соотношения (39), полученного при моделировании, следует, что в стационарном состоянии эндогенная составляющая СО в выдыхаемом воздухе не зависит от уровня его содержания в атмосферном воздухе. Какая-либо динамика выделения СО может стать заметной лишь при достаточно резких изменениях атмосферной компоненты. Атмосферная составляющая СО может быть достаточно динамичной, особенно в городских условиях. В качестве примера на рис. 14 приведено распределение по времени суток данных измерения содержания СО в атмосферном воздухе, полученных в относительно чистой пригородной зоне Москвы (28-й км Ленинградского шоссе). Отчетливо видно наличие суточной цикличности, которая обусловлена активностью автотранспорта. В ночные часы концентрация СО падает до 0.1–0.2 млн–1, а в дневные — повышается и может доходить в часы наибольшей активности автотранспорта до –1 0.6 6* млн . При наличии вариаций содержания СО во вдыхаемом воздухе переходные процессы в выделении эндогенного СО с выдохом будут описываться уравнением (51) 164 в случае резких ступенчатых вариаций и соотношением (54) в случае периодических вариаций. На рис. 15 представлена типичная динамика концентрации СО в выдыхаемом воздухе, наблюдаемая при относительно резком снижении (а) и нарастании (б) содержания СО в атмосферном воздухе [23]. На рис. 15б видно, что из-за высокой инерционности буферной системы СО в организме общий уровень СО в выдыхаемом воздухе меняется гораздо медленнее, чем концентрация СО в атмосферном воздухе. На рис. 15а СО в выдохе быстрее отслеживает атмосферные изменения. Однако это, вероятнее всего, связано с относительно малой длительностью (3–4 часа) временнóго интервала, в течение которого наблюдалось аномальное повышение уровня СО в атмосферном воздуха. В данном случае оно было связано с увеличенной интенсивностью движения автотранспорта в утренние часы пик. Из этих графиков видно, что в обоих случаях из полученных результатов достаточно трудно судить об истинных значениях эндогенной составляющей СО в выдыхаемом воздухе и ошибка ее определения может превышать 100 %. Величина эндогенной составляющей, как упоминалось выше, обычно близка к 1 млн–1. В приведенных примерах изменение уровня СО в атмосфере было сопоставимо с этим значением и составляло от 0.7 млн–1 до 1.2 млн–1, при этом время характерных изменений составляло 2–3 часа. Эти экспериментальные данные демонстрируют важность соблюдения стационарных внешних условий при исследовании СО в выдыхаемом воздухе. CO, млн–1 3.0 Изменение СО в выдохе a б 2.0 2.5 1.5 2.0 1.5 1.0 СО в атмосфере 1.0 12:00 14:00 СО в атмосфере 16:00 18:00 12:00 14:00 16:00 18:00 20:00 Время, чч:мм Рис. 15. Изменение содержания СО в выдыхаемом воздухе при снижении (а) и увеличении (б) содержания этого вещества во вдыхаемом атмосферном воздухе 165 Содержание СО, млн–1 На рис. 16 представлены данные регуляр1.4 ных двухмесячных измерений СО в выдыхаеа Эндогенное СО 1.3 мом воздухе испытуемого, проживающего в одном из центральных районов г. Москвы [23]. 1.2 Лазерный анализ в данном случае проводился 1.1 один раз в день в рабочие дни недели в лабора1.0 тории ИОФАН, расположенной на улице Вавилова, г. Москва. За счет естественной вентиля0.9 ции воздух в лабораторном помещении был 0.8 подвержен влиянию загрязнений атмосферного 1.6 б воздуха. Измерения проводились в период вреАтмосфера мени, соответствующий наименьшему дневно1.4 му содержанию СО в окружающем воздухе. 1.2 Видно, что концентрация СО во вдыхаемом воздухе (рис. 16б) была достаточно высокой и 1.0 варьировалась в диапазоне от 0.6 до 1.6 млн–1. 0.8 Можно отметить некоторую цикличность из0.6 менений содержания СО в атмосферном возду10.02.97 24.02.97 10.03.97 24.03.97 хе, период которых составляет приблизительно Дата 1 неделю. При этом глубина модуляции состав–1 ляет в среднем ~ 0.6 млн . На рис. 16а показа- Рис. 16. Вариации содержания СО во ны вариации в выдыхаемом воздухе доли мо- вдыхаемом воздухе, обусловленные изноокиси углерода, выделяемой из организма с менением уровня загрязнений атмодыханием. В изменениях этой величины также сферного воздуха (▲), и доли СО, вынаблюдается цикличность с периодом около деляемой с выдыхаемым воздухом (●). Вертикальные линии соответствуют 1 недели и глубиной модуляции ~ 0.3 млн–1. началу недели (понедельник) Видно, что вариации выделяемого СО несколько опережают по фазе (на 1–2 дня) вариации содержания СО в атмосферном воздухе. Поскольку недельный ритм является достаточно медленным по сравнению с постоянной времени τ2 выделения СО из организма (см. разд. 2.2), то он сам по себе не может быть причиной периодичности изменений скорости выделения СО из организма. Регулярные низкие значения уровня выделяемого СО, получаемые в начале недели, можно связать с уменьшением доли экзогенного СО, буферируемого на гемоглобине, в выходные дни, когда обычно снижается уровень загрязнений атмосферного воздуха. Однако нельзя исключить также и наличие недельного цикла в скорости метаболизма гем-содержащих структур в организме. 4.2.2. СО в выдыхаемом воздухе у курильщиков Методами лазерного анализа были исследованы закономерности выделения СО с выдыхаемым воздухом при курении [20–22]. На рис. 17. представлена динамика содержания СО в выдыхаемом воздухе курящего испытуемого, наблюдаемая при приостановлении регулярного курения, периодичность которого составляла ~ 1–1.5 часа). Как видно из графика, сразу после выкуривания очередной сигареты концентрация СО в выдыхаемом воздухе поднимается до ~ 50 млн–1 (три острых пика слева). Затем наблюдается снижение уровня СО, в котором можно выделить несколько характерных участков. Во-первых, участок резкого уменьшения концентрации СО сразу после окончания курения, происходящего с постоянной времени ~ 10–20 c и обусловленного вентиляцией легких. В конце этого процесса концентрация CO снижается до ~ 30 млн– 1 . Во-вторых, участок снижения с постоянной времени ~ 30–40 мин в промежутке между курением сигарет до уровня так называемого смокинг-статуса. Характерное вре166 pm–1 Содержание СО, pмлн мя этого процесса и относительная доля CO, выделяемого на этом этапе, позволяет свя50 зать его с очисткой миоглобинного буфера CO в мышечных тканях. Если человек продолжает курить с постоянной периодично40 стью, то концентрация CO в его выдыхаемом воздухе не опускается ниже уровня смокинг статуса, величина которого зависит 30 от типа сигарет, качества фильтра и частоты курения. В-третьих, участок гораздо более Смокинг-статус медленного снижения концентрации CO 20 вплоть до атмосферного уровня с постоянной времени ~ 500 мин. Согласно оценкам, проведенным в разд. 2.2, это значение с 10 точностью до ошибки измерений совпадает ПДКмр с постоянной времени опустошения гемоАтмосфера 0 глобинного буфера, ~ 8 час. Отметим при 0 200 400 600 800 1000 1200 этом, что нормальный уровень содержания Время, мин CO в выдыхаемом воздухе, ~ 1 млн–1, достигается более чем через 20–25 час. Рис. 17. Динамика содержания СО в выдыхаемом воздухе курильщика в течение Характерный вид кривой элиминации CO и после отказа от курения. ПДКмр — станиз организма курильщика свидетельствует о дарт предельно допустимой концентрации том, что в данном случае процесс описываСО в атмосферном воздухе ется суммой независимых экспонент, т.е. соотношением типа (47). Это может позволить определять параметры различных буферных систем. 4.2.3. Изменение концентрации кислорода — гипероксия У человека и лабораторных животных (крыс) экспериментально была изучена динамика выделения СО с выдыхаемым воздухом при ступенчатом изменении концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе [23, 24, 31, 35, 37, 41]. Исследовались как гипероксические, так и гипоксические состояния. В первом случае уровень содержания О2 во вдыхаемом воздухе повышался до 100 %, а во втором — понижался до 6 % (в экспериментах на крысах). На рис. 18 показана типичная динамика выделения CO с выдыхаемым воздухом при дыхании чистым кислородом у трех испытуемых — практически здоровых молодых мужчин. Стрелкой отмечено начало дыхания гипероксической смесью. Представленные на рисунке данные были получены в различные дни и при разных внешних условиях. Это обусловило отличие уровней содержания CO как в лабораторном воздухе, так и в выдыхаемом воздухе до начала дыхания кислородом. Как видно, сразу после начала дыхания кислородом наблюдается резкое возрастание выделения CO с выдыхаемым воздухом, после которого наблюдается экспоненциальная релаксация. Основные закономерности наблюдаемого процесса описываются соотношением (49). Максимальное значение содержания СО в выдыхаемом воздухе, достигаемое в самом начале дыхания кислородом и определяемое равенством (50), зависит, в частности, от величин эндогенной и атмосферной составляющей СО в выдыхаемом воздухе, а также от коэффициента K, описывающего вентиляторно-диффузионные характеристики газообмена в легких, и вентиляции V&. Таким образом, из релаксационных кривых на рис. 18 могут быть определены как значения коэффициента K, так и постоянная вре- 167 Содержание СО в выдохе мени релаксации τ. Рассчитанные из дан10 ных кривых значения этих величин, а так9 же параметры, использованные при расчете, представлены в табл. 3. Отметим, что 8 полученные значения произведения KV& /PB 7 для данных испытуемых отличались в не6 сколько раз (от 0.85 до 2.35). При этом значения времени релаксации оказались дос5 таточно близкими (от 100 до 110 мин). Их 1 4 абсолютные значения достаточно хорошо 3 совпали с величиной τHb, получаемой из 2 описанной выше модели при условии уче2 3 та лишь гемоглобинного буфера СО. Это 1 свидетельствует о том, что даже при значиО2 100% тельном превышении над нормой содержа0 ния кислорода во вдыхаемом воздухе –20 0 20 40 60 80 100 120 140 функциональная взаимосвязь между скороВремя, мин стями изменений относительных концен- Рис. 18. Динамика выделения СО при ступентраций СО и О2 в артериальной крови, тка- чатом повышении содержания кислорода во нях и клетках, т.е. между величинами вдыхаемом воздухе от нормального (20.9 %) ′ (t ), Rt′(t − T *) и Rc′(t − T *) в соотноше- до 100 % для трех практически здоровых исRart пытуемых. Пунктиром показаны результаты нии (29), является несущественной. Таким модельного расчета по формуле (41) с испольобразом, интеграл под кривыми на рис. 18 зованием экспериментальных значений соможет давать информацию о величине держания СО в выдыхаемом и атмосферном буфера СО на гемоглобине. Полученные воздухе и параметров, указанных в табл. 2, значения для этой величины также пред( PartO ) 2 ( PartO )1 = 5.5 ставлены в табл. 3. Они несколько выше расчетного объема гемоглобинного буфера ~ 159 мкмоль, получаемого для нормального уровня эритроцитов крови (~ 25·1012) в предположении, что в отсутствие СО во вдыхаемом воздухе лишь 0.33 % гемоглобина связано моноокисью углерода. Эти различия могут быть связаны с влиянием атмосферного СО, нормальными отклонениями содержания эритроцитов крови, а также с наличием миоглобинного и цитохромного буферов. На рис. 19 собраны нормированные кривые выделения СО при дыхании чистым кислородом для группы практически здоровых испытуемых, для которых были получены существенные различия времен релаксации τ. Видно, что в норме различия могут достигать нескольких раз. В соответствии с (41) этот разброс может определяться как вариацией содержания гемоглобина в организме, так и различием вентиляторнодиффузионных характеристик (коэффициента K) респираторных систем испытуемых. На рис. 20–24 представлены результаты исследования содержания СО в выдыхаемом воздухе при дыхании воздушными смесями с повышенным содержанием кислорода у крыс [37, 41]. В данных экспериментах исследуемое животное помещалось в цилиндрическую кювету емкостью 1.3 л, в которую с одного из торцов подавалась дыхательная смесь со скоростью 0.48 л/мин. Это значение, приблизительно в 3 раза большее нормального минутного объема дыхания у крыс, было оптимальным для проводимых исследований, так как позволяло достичь компромисса между разбавлением анализируемого состава выдыхаемого крысой воздуха и накоплением СО2 в газовой среде кюветы. Воздух, выходящий через отверстие в противоположном торце кюветы, направлялся в многоходовую кювету лазерного анализатора. Положение 2 168 2 Таблица 3. Параметры процесса релаксации содержания СО в выдыхаемом воздухе при дыхании чистым кислородом (рис. 19) Испытуемый Содержание СО в атмосфере, млн–1 Содержание СО в выдыхаемом воздухе, млн–1 Максимум выделения СО, млн–1 Время релаксации, мин KV& PB Объем буфера СО, мкмоль 1 0.4 1.15 9.5 100 2.35 2 0.65 1.8 6.8 110 1.28 3 1.0 2.4 5.4 100 0.85 334 257 212 крысы внутри кюветы фиксировалось с помощью сетчатого каркаса, что снижало вариации измеряемых значений концентрации СО, обусловленные перемещениями животного и изменением его двигательной активности. На рис. 20 показана динамика выделения СО, получаемая при различном содержании кислорода во вдыхаемом воздухе, 50, 60 и 80 %. Также как и для человека, основные закономерности наблюдаемого в этом случае процесса описываются соотношением (49). Видно, что при дыхании обычным воздухом при используемой скорости вентиляции кюветы концентрация СО в газовой среде кюветы составляет ~ 0.2 млн–1. Это означает, что с учетом разбавления концентрация СО в выдыхаемом крысой воздухе составляет ~ 0.6 млн–1. Как и у человека, у крыс повышение содержания кислорода в газовой среде кюветы приводит к резкому увеличению выделения СО с выдыхаемым воздухом. При этом, в соответствии с соотношением (50), величина достигаемого максимума выделения СО зависит от концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе, которой в свою очередь определяется напряжение О2 в артериальной крови. На рис. 21 представлена зависимость величины суммарного избыточного выделения СО у крыс от содержания О2 во вдыхаемом воздухе. Для определения этой Содержание СО в выдыхаемом воздухе, отн. ед. 1.0 Концентрация СО, млн–1 0.45 0.40 0.35 0.8 τ = 147 мин 0.6 0.30 0.25 О2 80 % 0.20 0.4 τ = 100 мин τ = 52 мин 0.2 0 –30 30 60 0.10 О2 50 % 0.05 О2 100 % 0 О2 60 % 0.15 90 120 150 180 Время, мин Рис. 19. Динамика выделения СО при ступенчатом повышении содержания кислорода во вдыхаемом воздухе от нормального (20.9 %) до 100 % для трех испытуемых с различным содержанием гемоглобина в крови 0 –20 0 20 40 60 Время, мин Рис. 20. Динамика выделения СО в выдыхаемом воздухе у крыс при различном содержании О2 во вдыхаемом воздухе 169 1000 00 220 4 40 6 60 8 80 10 100 12 % Содержание Содержание СОО22,,% Рис. 21. Зависимость средних величин интеРис. 23. Зависимость интегрального выделения средних СО при величин гипероксичегрального выделения СО у крыс, обусловленском тесте у крыс от содержания кислорода ного дыханиемвоздухе гипероксическими смесями с во вдыхаемом повышенным содержанием СО2, от концентрации СО2 N2 25 % N2 20 % N = 10 N = 11 400 200 300 100 200 N = 10 700 400 600 300 500 Выделение ВыделениеСО, СО,нмоль нмоль/мин 9 1600 8 1400 7 1200 6 1000 5 800 4 600 3 2400 N = 10 Выделение СО, нмоль СО, нмоль Избыточное выделение 900 500 800 1200 О2 0 O2 7560% O2 7540 O2 7520 % 30 % 50 O2 1000% 10 –10 Ar 0 % Ar 5 Время, % Ar мин 25 % N2 0 % Рис. 22. Динамика выделения СО с выдыхаеРис. 24. Среднееуинтегральное количество СО, мым воздухом крыс, обусловленная дыхавыделяемое при гипероксическом тесте с иснием чистым кислородом (○) и смесью кислопользованием различных дыхательных смесей СО2 рода и углекислого газа (●) 91 % О2 + 9 % с добавкой Ar величины рассчитывался интеграл под кривыми, подобными изображенным на рис. 20, в интервале времени от начала дыхания обогащенной кислородом смесью до момента, когда концентрация СО снижается до половины от максимального уровня. Отметим близкую к линейной зависимость при низких уровнях гипероксии и снижение величины эффекта при 100 % О2. Последнее, как упоминалось в разд. 2.2, может быть обусловлено эффектами адаптации организма к высоким концентрациям кислорода. На рис. 22 сопоставлены кривые выделения СО с выдыхаемым воздухом у крыс, получаемые при переключении с дыхания воздухом на дыхание чистым кислородом (пустые кружки) и смесью О2 и СО2 с соотношением 91:9 (заполненные кружки) [37, 41]. Как видно, добавление к кислороду двуокиси углерода вызывает более интенсивное выделение эндогенного СО. Этот эффект может быть обусловлен двумя факторами. Во-первых, как известно, избыточное содержание кислорода в крови приводит к вазоконстрикции, т.е. к сужению сосудов [48, 49]. Напротив, повышение напряжения СО2 вызывает эффект вазодилятации (т.е. расширение сосудов). Таким образом, при одновременном воздействии повышенных концентраций О2 и СО2 поток кислорода через тканевые капилляры может быть более интенсивным, чем при вдыхании чистого кислорода. Последнее неизбежно приведет к более интенсивному вытеснению СО с буферных систем, локализующихся в тканях и клетках (миоглобин, ферменты и цитохромы). Во-вторых, как упоминалось выше в разд. 2.3, повышение концентрации СО2 в тканях приводит к сдвигу КОС в кислую сторону, что обусловливает более интенсивное высвобождение в тканях кислорода, транспортируемого гемоглобином. Это, в свою очередь, ведет к более высокой насыщенности тканей кислородом и, как следствие, к более интенсивному высвобождению в тканях СО, удерживаемого миоглобином и другими буферными системами. Динамика этого процесса описывается соотношением (56). На рис. 23 представлена зависимость средних значений суммарного выделения СО в процессе дыхания гипероксической воздушной смесью от содержания в ней СО2. Видно нарастание эффекта дополнительного выделения СО с ростом концентрации СО2. 170 Описанный выше подход позволяет исследовать зависимость эффективности транспорта кислорода в ткани организма от различных факторов, в том числе и от состава газовой смеси, используемой для дыхания. Одной из актуальных задач такого рода является изучение влияния добавок в дыхательную газовую смесь химически инертных –1 (благородных) газов, таких как He, Ar, Kr. На Содержание СО, млн рис. 24 приведены результаты одного из та- 1.2 ких исследований, цель которого состояла в 1.0 сравнении действия на организм крыс гипероксических газовых смесей, отличающихся 0.8 различным содержанием аргона4. В эксперименте была использована группа из 10 крыс 0.6 одного возраста и близкого веса. По схеме, 0.4 описанной выше, для каждой крысы исследовалось выделение СО с дыханием под дей- 0.2 ствием различных гипероксических дыха0 тельных смесей: О2:Ar:N2 = 100:0:0; 0 10 20 30 40 50 О2:Ar:N2 = 75:0:25; О2:Ar:N2 = 75:5:20; Время, мин О2:Ar:N2 = 75:25:0. Для оценки эффективности транспорта кислорода в организме жи- Рис. 25. Динамика концентрации СО в вывотных использовалось общее количество дыхаемом воздухе при дыхании гипоксиСО, выделяемое в течение гипероксического ческой смесью, О2:Не = 1:9. Стрелкой поподъема скорости выделения моноокиси уг- казан интервал действия гипоксии лерода. На рис. 24, где представлены усредненные по группам величины выделения СО для каждой из использованных дыхательных смесей, видно, что замещение в смеси, содержащей 75 % О2, азота на аргон приводит к статистически достоверному увеличению суммарного количества выделяемого СО при гипероксии. Причем такие содержащие аргон смеси вызывают более интенсивное выделение СО, чем чистый кислород. Таким образом, при использовании гипероксических аргон-содержащих дыхательных смесей наблюдается эффект, похожий по своему результату на действие гипероксических смесей с повышенным содержанием СО2, которое было описано выше при обсуждении рис. 22 и 23. Одна из возможных трактовок такого действия аргона заключается в том, что увеличение его содержания в крови приводит к повышению эффективности транспорта и переноса кислорода в тканевые капилляры, которое в свою очередь способствует усилению высвобождения СО, связываемого миоглобином. 4.2.4. Изменение концентрации кислорода — гипоксия На рис. 25 представлена типичная динамика содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе, которая наблюдается у людей при использовании для дыхания гипоксической газовой смеси, содержащей 10 % О2 и 90 % He [31, 32]. Видно, что в данном случае концентрация эндогенного СО в выдыхаемом воздухе в норме при дыхании обычным воздухом составляла около 1 млн–1. В течение первых 10 мин дыхания гипоксической смесью наблюдается монотонное снижение темпа выделения СО с выдыхаемым воздухом. В соответствии с соотношением (50), при применении такой гипоксической смеси следовало бы ожидать более чем двукратного снижения содержания СО в выдыхаемом воздухе, причем оно должно было бы произойти сразу после начала использования этой смеси. Однако, как упоминалось выше, в использованной нами для оценок модели не полностью учитываются процессы установления равновесных кон4 Данные исследования были проведены в рамках гранта МНТЦ, проект 1960. 171 центраций газов в организме при переключении с одной дыхательной смеси на другую. Снижение концентрации СО в выдыхаемом воздухе, наблюдаемое в течение первых 10 мин, в данном случае обусловлено именно постепенным снижением напряжения кислорода как в артериальной крови, так и в тканях, а минимальное значение за это время не достигается. Отметим, что при гипероксии О2 100 % экстремум наблюдается через 3–5 мин (см. рис. 18 и 20). При возврате к дыханию обычным воздухом наблюдается постепенное восстановление нормального уровня СО в выдыхаемом воздухе, причем время восстановления несколько больше (приблизительно в 1.5 раза), чем время спада. Данные временные закономерности могут быть использованы для исследования зависимости эффективности диффузии кислорода в ткани организма, например от состава дыхательной смеси, внешних условий и состояния организма. 4.2.5. Влияние пребывания в условиях гипербарии На рис. 26 представлена динамика восстановления уровня эндогенного CO в выдыхаемом воздухе испытуемых после кратковременного (~ 3 часа) и долговременного (~ 3 суток) пребывания в условиях гипербарии [23, 40, 45]. В первом случае избыточное давление воздуха (N2:O2 = 78:21) составляло ~ 7 атм, а во втором 3 атм. Слева от вертикальной пунктирной линии на графике показаны результаты контрольного измерения концентрации эндогенного СО в выдыхаемом воздухе до пребывания в гипербарической среде. Полученные величины близки к средним значениям, наблюдаемым в норме, ~ 1.1 млн–1. Сразу после выхода из барокамеры концентрации эндогенного СО в выдыхаемом воздухе составляют ~ 0.4 млн–1. Такое снижение объясняется более высокой (по сравнению с атмосферной) концентрацией кислорода во вдыхаемом воздухе при повышенном внешнем давлении. При кратковременном гипербарическом воздействии парциальное давление кислорода составляло ~ 1.60 атм, а при долговременном — ~ 0.8 атм. Соответствующим образом растет и напряжение кислорода в артериальной крови и тканях организма. Это приводит к эффекту, аналогичному тому, который наблюдается при гипероксии и описан выше, т.е. к вытеснению кислородом СО, накапливаемого на буферных системах в организме. При возвращении в условия нормальной атмосферы начинается заполнение опустошенной буферной системы эндогенным СО, что приводит к первоначальному снижению относительно нормы выделения СО с выдыхаемым воздухом. По мере заполнения буферной системы и восстановления равновесной ситуации концентрация эндогенного СО в выдыхаемом воздухе увеличивается до нормального уровня, что и наблюдается в эксперименте. Скорость восстановления определяется объемом системы буферирования, главным образом концентрацией гемоглобина и миоглобина в организме, тем, насколько она была опустошена, т.е. временем и интенсивностью воздействия кислорода, а также скоростью образования эндогенного СО в организме, т.е. разрушения гем-содержащих белковых структур. На рис. 26 отчетливо видно различие времен восстановления, получаемых при кратковременном и долговременном пребывании в условиях гипербарии. Данные закономерности могут быть использованы для исследования адаптационных характеристик испытуемых, принимающих участие в гипербарических исследованиях, а также степени воздействия измененной среды пребывания на организм. 172 Содержание СО в выдохе, млн–1 1.2 1.0 0.8 Норма 4.3. Динамика содержания СО в выдыхаемом воздухе при проведении различных нагрузочных тестов 4.3.1. Физическая нагрузка Влияние физической нагрузки на содержание СО в выдыхаемом воздухе обусловлено вариациями сразу нескольких параметров, оп0.4 ределяющих газообмен, как во время самой 0.2 физической нагрузки, так и в процессе релаксации. При этом наиболее значимыми для вы0 деления СО с выдыхаемым воздухом являются –1 0 1 2 3 4 5 6 7 Время, час такие параметры, как частота и глубина дыхаРис. 26. Динамика восстановления ния (вентиляция), частота сердечных сокращеуровня выделения СО с выдыхаемым ний, потребление кислорода, продукция СО2 и воздухом после кратковременного (○, ●) других метаболических продуктов, например и долговременного пребывания (□, ■) в молочной кислоты, меняющих кислотногипербарической воздушной среде основное состояние среды в тканях. Совокупность этих параметров и их зависимость от мощности и длительности нагрузки определяют достаточно сложную картину выделения СО с дыханием. В ходе нескольких экспериментальных циклов нами были изучены основные закономерности этого процесса [20, 22–24, 31, 32, 35, 38–40, 50]. На рис. 27 и 28 представлены результаты исследования закономерностей выделения CO с дыханием при коротких нагрузках (2 мин) различной мощности от 10 до 225 Вт. Из кривых на рис. 27а, где представлена динамика концентрации СО, видно, что непосредственно во время физической нагрузки наблюдается снижение концентрации СО в выдыхаемом воздухе относительно нормы. Оно связано с усилением вентиляции легких и более интенсивным разбавлением выдыхаемого воздуха атмосферным. Однако, несмотря на то что частота и глубина дыхания нарастают с ростом мощности, наибольшее снижение концентрации, более чем на 30 %, наблюдается при меньшей нагрузке, 100 Вт. Этот эффект объясняется тем, что рост вентиляции и частоты сердечных сокращений с нарастанием мощности приводят также к увеличению потока кислорода к тканям, которое в свою очередь вызывает более интенсивное вытеснение эндогенного СО с гемоглобина и миоглобина. 0.6 173 1.2 175 Вт 1.0 Выделение СО2, л/мин 100 Вт 0.8 Начало ФН pH крови 7.44 100 Вт 175 Вт 7.40 7.36 225 Вт 7.32 0 5 Выделение СО, мкл/мин а 225 Вт 10 15 б 20 Время, мин Рис. 27. Динамика изменений (а) содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе и (б) значений pH капиллярной (артериализованной) крови в ходе физической нагрузки (ФН) различной мощности длительностью 2 мин Потребление О2, л/мин Содержание СО, отн. ед. 1.4 50 CO 175 Вт 40 150 Вт 30 20 125 Вт ФН CO2 1.5 1.0 0.5 1.5 O2 1.0 0.5 0 2 4 6 8 10 12 Время, мин Рис. 28. Динамика выделения СО и углекислого газа, а также потребления кислорода в ходе физической нагрузки (ФН) различной мощности Сразу после окончания физической нагрузки наблюдается рост концентрации СО в выдыхаемом воздухе, причем при высоких уровнях нагрузки, более 100 Вт, содержание СО заметно превышает нормальный уровень. При мощности ~ 225 Вт это превышение в точке максимума составляет более 30 %. Его причиной является совокупность нескольких факторов. Во-первых, происходит постепенная нормализация вентиляции, т.е. уменьшается разбавление выдыхаемого воздуха. Во время этой нормализации наблюдается увеличенное потребление кислорода. Во-вторых, достаточно высокая физическая нагрузка сопровождается не только интенсивным выделением СО2, но и образованием молочной кислоты. Оба эти вещества приводят к закислению среды в мышечных тканях, что, как уже обсуждалось в разд. 2.2, способствует увеличенному высвобождению молекул кислорода гемоглобином в тканях и, таким образом, более интенсивному вытеснению кислородом молекул СО, связанных миоглобином. Как видно на рис. 27, повышенные концентрации СО в выдыхаемом воздухе сохраняются в течение 10–12 мин после окончания нагрузки. Далее, уже в нормальном спокойном состоянии, вновь наблюдается снижение уровня СО в выдыхаемом воздухе, которое на этот раз обусловлено опустошением систем буферирования эндогенного СО в организме во время физической нагрузки и релаксации. Образуемое в это время в организме СО идет на восстановление равновесных концентраций миоглобина и гемоглобина, связанных СО. Отметим, что при кратковременной физической нагрузке низкой мощности эти процессы не наблюдаются, что можно объяснить достаточной сбалансированностью в этих условиях процессов транспорта и потребления О2, а также образования и выделения СО2, что предотвращает накопление СО2 и других кислых продуктов в организме. На рис. 28 проведено сопоставление динамики выделения СО и СО2 и потребления О2 при трех различных мощностях физической нагрузки: 125, 150 и 175 Вт, которое 174 Потребление О2, л Выделение СО, ммоль подтверждает изложенные выше соображения. Данные кривые были получены из концентрационных зависимостей для этих газов с учетом минутного объема вентиляции. Как видно, кривая выделения СО в отличие от кривых для СО2 и О2 имеет несколько максимумов, которые наиболее отчетливо проявляются при средней нагрузке 150 Вт. Сравнение кривых для СО с динамикой потребления ки2.0 б слорода и выделения СО2 позволяет первый 1.5 максимум связать с повышением количества кислорода, доставляемого к тканям. Потреб1.0 ление кислорода достаточно быстро, прибли0.5 зительно через 2–3 мин после окончания физической нагрузки, спадает. Следующие 0 50 100 150 200 250 максимумы выделения СО достаточно хороМощность физической нагрузки, Вт шо коррелируют с вариациями выделения Рис. 29. Зависимость объемов избыточСО2 и поэтому могут быть объяснены динаного выделения СО (а) и избыточного микой КОС среды в тканях. потребления О2 (б) во время (○) и после На рис. 29 представлена зависимость сум(●) физической нагрузки длительностью марного объема избыточного выделения СО 2 мин от ее мощности и избыточного потребления О2 во время и после физической нагрузки от ее мощности. сти. Сравнивая данные на рис. 29а и б, отметим, что для кислорода характерна близость объемов потребления до и после нагрузки. Видна линейная зависимость этих величин от мощности нагрузки, а также запрос организма на кислород при выполнении «нулевой работы». Для СО наблюдается существенная разница объемов выделения в течение короткой нагрузки и сразу после нее. Как видно, выделение СО в течение нагрузки растет линейно с мощностью и стремится к нулю в отсутствие нагрузки. Объем суммарного выделения СО после нагрузки растет нелинейно с мощностью, причем экстраполяция данных в область нулевых выделений показывает, что при мощностях менее 80–90 Вт выделение СО после нагрузки не происходит. Это указывает на различие механизмов избыточного выделения CO во время и после короткой физической нагрузки. На рис. 30 показана зависимость отношения объема избыточного выделения СО к объему избыточного потребления О2 во время и после физической нагрузки от мощности последней, при этом в потреблении О2 не учитывался вклад, связанный с «нулевой работой». Видно, что в пределах точности измерений объем выделения СО во время физической нагрузки прямо пропорционален потреблению О2. После физической нагрузки рост объема выделения СО с мощностью существенно опережает возрастание потребления О2. Это можно трактовать как следствие подключения процессов анаэробного дыхания при возрастающих нагрузках, приводящих, в частности, к увеличению доли СО2 и других метаболических продуктов, которые обусловливают закисление тканей организма. Приведенная выше трактовка получаемых экспериментальных кривых может быть поддержана данными по измерению pH артериализованной крови при физической нагрузке различной мощности, представленными на рис. 27б. Видно, что росту концентрации СО в выдыхаемом воздухе, наблюдаемому после физической нагрузки, соответствует уменьшение pH (закисление) крови, причем чем интенсивнее нагрузка, тем значительнее изменения концентрации СО и pH. Отметим, что при легкой нагрузке (100 Вт) изменения pH практически не наблюдаются. Кроме того, нами было экспериментально продемонстрировано наличие сильной корреляции скорости выделения 7 6 5 4 3 2 1 0 а 175 3.0 Выделение СО, мкмоль/мин 1.8 8 Лактат, ммоль/л 1.5 2.5 2.0 1.5 6 1.2 4 0.9 2 ФН 0 1.0 50 100 150 200 250 Мощность физической нагрузки, Вт 175 Вт 0 5 10 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1 0.6 1.0 2 0.3 0.5 0 0 15 20 Время, мин Потребление О2, л/мин Относительное выделение СО (СО/О2), ммоль/л Рис. 31. Динамика выделения СО (1), потребления О2 (2) и концентрации лактата (●), обусловленная физической нагрузкой (175 Вт, 5 мин) Рис. 30. Зависимость отношения объема избыточного выделения СО к объему избыточного потребления О2 во время (○) и после (●) физической нагрузки длительностью 2 мин от ее мощности CO с выдыхаемым воздухом с уровнем лактата (молочной кислоты) в артериализованной крови (рис. 31) [23, 31, 32]. На рисунке видно, что в момент завершения физической нагрузки (175 Вт, 5 мин) наблюдаются максимальные уровни выделения СО, потребления О2 и концентрации лактата. Далее следует достаточно резкое, в течение 2–3 мин, снижение потребления О2 до уровня, соответствующего потреблению в покое. В то же время снижение уровней СО и лактата происходит гораздо медленнее, в течение ~ 15 мин. Это также позволяет связать интенсивность выделения СО с выдыхаемым воздухом с закислением среды в мышечных тканях различными продуктами метаболических процессов, включая молочную кислоту. Эндогенное СО в выдохе, отн. ед. 1.4 1 мин 1.2 2 мин 1.0 0.8 5 мин 10 мин 0.6 0 5 10 15 20 Время, мин Рис. 32. Вариации содержания СО в выдыхаемом воздухе, вызванные физической нагрузкой мощностью 175 Вт различной длительности (1–10 мин) 176 Были исследованы закономерности выделения СО при физической нагрузке различной длительности 60 (рис. 32–34). На рис. 32 представлена 10 мин динамика концентрации СО в выды40 хаемом воздухе, обусловленная фи2 мин зической нагрузкой мощностью 175 Вт и длительностью от 1 до 20 10 мин. На рис. 33 показаны изме3.0 СО2 нения выделения СО и СО2, а также 2.5 10 мин потребления О2 при нагрузках раз2.0 личной длительности. Для расчета 1.5 5 мин величин выделения и потребления 1.0 этих веществ были использованы 2 мин 0.5 данные об их концентрациях и минутной вентиляции легких. Видно, 2.5 О2 что на концентрационных кривых 2.0 увеличение скорости выделения СО 10 мин с дыханием наиболее ярко проявля1.5 5 мин ется при коротких нагрузках дли1.0 тельностью 1–2 мин. Поскольку, как 2 мин 0.5 следует из рис. 28, максимум выделения СО при коротких нагрузках 0 5 10 15 20 25 Время, мин наблюдается во временнóм интервале между 3-й и 7-й минутой после Рис. 33. Вариации скоростей выделения СО и СО2 и потребления О2, обусловленные физической наначала физической нагрузки, то увегрузкой различной длительности (2–10 мин) мощличенная вентиляция в течение наностью 175 Вт грузок длительностью более 5 мин маскирует этот эффект. При этом учет вентиляции (т.е. использование данных о количестве выделения СО) при длительных нагрузках (см. рис. 33) не позволяет выявить эффект увеличенного выделения СО, наблюдаемый после воздействия короткой нагрузки и обусловливаемый изменением КОС в организме. Это объясняется тем, что при длительной нагрузке во временнóм интервале между 3-й и 6-й мин доминирует эффект, связанный с повышением потока кислорода, поступающего в организм при увеличенной вентиляции и частоте сердечных сокращений (см. рис. 33). Результатом его действия является исчерпание миоглобинного буфера СО еще в течение действия нагрузки. Таким образом, для исследования эффектов повышенного выделения СО, связанных с изменением КОС в тканях организма при физической нагрузке, предпочтительно использовать нагрузки короткой длительности (не более 2 мин) и средней мощности (чуть ниже анаэробного порога). На рис. 34 сопоставлены объемы избыточного потребления О2 и выделения СО, обусловленные физической нагрузкой различной длительности. Как видно, при субмаксимальной мощности, 175 Вт, объем избыточного потребления кислорода растет практически линейно с длительностью нагрузки. В то же время для СО наблюдается постепенное снижение объема суммарного выделения, причем уровень насыщения находится вблизи 25 мкмоль. Такое ограничение может быть связано с конечным объемом буфера СО, который опустошается при физической нагрузке. Как следует из оценки, его величина составляет ~ 10–15 % от объема буфера, опустошаемого при дыхании гипероксическими газовыми смесями (см. табл. 3), и близка к объему миогло5 мин СО Потребление О2, л/мин Выделение СО2, л/мин Выделение СО, мкл/мин 80 177 14 12 10 40 35 30 25 8 20 6 15 4 10 Выделение СО, ммоль 4.3.2. Гипервентиляция 16 Потребление О2, л бинного буфера СО. Это еще раз указывает на вовлечение обмена между миоглобинным и гемоглобинным буферами СО в процесс выделения накопленной моноокиси углерода, который активизируется при изменении кислотно-основного состояния в тканях организма, обусловленном физической нагрузкой. pH крови Содержание СО, отн. ед. 5 2 Гипервентиляция также приводит к дос0 таточно сложной картине выделения эндо8 10 12 0 2 4 6 генного СО с дыханием [23, 24, 35, 38]. В Длительность физической нагрузки, мин этом случае важными факторами, влияющими на уровень СО в выдыхаемом воздухе, Рис. 34. Зависимость объема избыточного являются увеличенное разбавление выды- выделения СО (●) и потребления О2 (○), обухаемого воздуха атмосферным, повышение словленных физической нагрузкой мощностью 175 Вт, от длительности нагрузки концентрации кислорода в альвеолах легких и артериальной крови и более интенсивное выведение СО2 из организма. На рис. 35 представлена динамика концентрации СО в выдыхаемом воздухе, обусловленная гипервентиляцией различной интенсивности (38, 50 и 62 л/мин) и одинаковой длительностью (2 мин). Как и при физической нагрузке, непосредственно во время гипервентиляции наблюдается снижение концентрации СО в выдыхаемом воздухе, связанное с более интенсивным разбавлением выдыхаемого воздуха. После ее 1.1 а окончания наблюдается кратковременное 1.0 нарастание уровня СО. В ряде случаев (не 38 л/мин показано на рис. 35) максимальное значение концентрации СО, достигаемое сразу 0.9 50 л/мин после окончания вентиляции, превышает уровень, наблюдаемый в покое. Это обу0.8 словлено тем, что в этот момент за счет 0.7 более интенсивной вентиляции легких концентрация кислорода в альвеолярном 62 л/мин 0.6 Начало ГВ воздухе и артериальной крови превышает нормальный уровень. Далее наблюдается 0.5 достаточно резкое уменьшение концентраб ции СО в выдыхаемом воздухе. Оно обу62 л/мин 7.6 словлено тем, что за счет гипервентиляции 50 л/мин резко снижается концентрация СО2, растворенного в крови, и требуется некоторое 38 л/мин время, чтобы восстановить нормальный 7.4 уровень за счет продукции СО2 в организ–5 0 5 10 15 20 25 ме. Снижение концентрации СО2 приводит Время, мин к защелачиванию среды в тканях организма Рис. 35. Динамика изменений (а) содержаи менее интенсивной отдаче кислорода ния эндогенного СО в выдыхаемом воздухе гемоглобином в тканевых капиллярах. В и (б) значений pH артериализованной крови результате этого более интенсивно начи- в ходе гипервентиляции (ГВ) различной иннает расходоваться кислород, запасаемый тенсивности (38, 50 и 62 л/мин) длительнона миоглобине, что приводит к образова- стью 2 мин 178 нию дополнительных вакансий на миоглобинном буфере, которые заполняются эндогенным СО. Как следствие, количество СО, переносимого эритроцитами крови в легкие и выделяемого с выдыхаемым воздухом, уменьшается. По мере восстановления нормальной равновесной концентрации СО2 в тканях и крови, восстанавливается и нормальный уровень СО в выдыхаемом воздухе. Как видно на рис. 35, минимальное выделение СО наблюдается через 3–5 мин после окончания гипервентиляции, а релаксация содержания СО к нормальному уровню занимает 15–20 мин. Отметим также, что степень снижения уровня СО в выдыхаемом воздухе, а также характерные времена достижения минимума и возвращения к нормальному уровню зависят от интенсивности гипервентиляции. На рис. 27б приведена динамика рН артериализованной крови, отбираемой в ходе гипервентиляционного теста, которая подтверждает приведенную выше интерпретацию данных по выделению СО. Видно, в частности, что более интенсивная гипервентиляция приводит как к более значительному снижению уровня СО в выдыхаемом воздухе, так и к более существенному сдвигу КОС в щелочную сторону. Сопоставление кривых, представленных на рис. 27 и 35, показывает, что динамические физиологические нагрузки, сопровождающиеся кратковременными и обратимыми изменениями КОС среды в организме, приводят также и к вариациям уровня CO в выдыхаемом воздухе. При этом повышение значений рН (защелачивание) среды вызывает снижение выделения СО, а понижение рН (закисление) приводит к более интенсивному выделению CO. Чем сильнее изменяется КОС, тем значительнее отклонения скорости выделения CO от нормальных значений. Таким образом, эндогенное CO может быть использовано в качестве индикатора слабых физиологических вариаций кислотно-основного состояния в организме, а высокочувствительный лазерный анализ СО в выдыхаемом воздухе может быть применен для неинвазивного мониторинга 5.0 9 а этого жизненно важного параметра. 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 8 7 6 5 4 3 2 4.3.3. Влияние задержки дыхания Концентрация СО2, % Содержание СО, млн–1 Была исследована зависимость концентрации эндогенного СО в выдыхаемом воздухе от времени задержки дыхания [22–24]. В результате этого дыхательного маневра изменяется несколько параметров, которые влияют б 8 4.5 на эффективность выделения СО. Во-первых, 4.0 7 ограничивается доступ в легкие атмосферного 3.5 воздуха, что при непрекращающемся потреб6 лении кислорода организмом приводит к по3.0 5 степенному снижению содержания последне2.5 4 го в легких и артериальной крови. Во-вторых, 3 2.0 происходит накопление СО и СО2 как в газо2 1.5 0 20 40 60 80 100 вой среде легких, так и в крови. Увеличение Время задержки дыхания, с напряжения СО2 в крови в свою очередь выРис. 36. Вариации СО (○) и СО2 (●) в вы- зывает изменение сродства гемоглобина к О2 дыхаемом воздухе при различном времени и СО, а также может иметь и вазидилятаторзадержки дыхания при интервалах между ное (сосудорасширяющее) действие. последовательными измерениями 3 (а) и На рис. 36 приведены результаты измере30 мин (б) ния концентрации СО и СО2 в выдыхаемом воздухе при задержках дыхания, полученные в двух различных сериях измерений. Данные, представленные на рис. 36а, относятся к серии измерений, состоявшей из последовательности дыхательных тестов с постепен179 Концентрация СО, млн–1 но нарастающим временем задержки ды2.5 хания (от 0 до 90 с). На рис. 37 показана временнáя диаграмма концентрации СО, 2.0 получаемая при исследовании одного исУсредненный пытуемого с помощью такого подхода. На выдох 1.5 кривой отчетливо видны: концентрация СО в усредненном выдыхаемом воздухе в 1.0 покое, уровень содержания СО в окружающем воздухе и постепенное нараста0.5 ние максимальных значений концентрации Атмосфера 0 с 2 с 5 с 10 с 15 с 25 с 30 с СО при проведении последовательных 0 12:40 12:50 13:00 13:10 13:20 тестов с различными временами задержки Время, чч:мм дыхания. Как видно, интервал между дыРис. 37. Временнáя диаграмма концентрацихательными тестами в такой серии соонных измерений CO при проведении дыхаставлял 4–5 мин. Результаты, показанные тельных тестов с задержкой дыхания. Вначале на рис. 36б, были получены при увеличедиаграммы — результат детектирования уснии интервала между последовательными редненной концентрации CO в выдыхаемом тестами до 30 мин. При этом время за- воздухе, далее — результат анализа CO в продержки выбиралось случайным образом. бах выдыхаемого воздуха при различных вреКак видно, при достаточно больших менах задержки (30 мин) интервалах между задержками наблюдается монотонное возрастание в выдыхаемом воздухе содержания как СО, так и СО2. В данном случае концентрация анализируемых газов при задержке 90 с увеличивается приблизительно в 3 раза, при этом скорость их накопления в выдыхаемом воздухе падает с увеличением длительности задержки. При коротких интервалах между дыхательными тестами зависимость концентрации СО от времени задержки становится более сложной — наблюдается экстремум при длительности задержек 30– 40 c. При задержках более 60 с концентрация СО в выдыхаемом воздухе начинает падать, т.е. имеет место возвратный поток СО из легких в кровь. В то же время в динамике накопления СО2 не происходит качественных изменений. Такое изменение картины накопления СО в воздухе легких при задержке дыхания может быть связано с тем, что при коротких временах между последовательными дыхательными тестами происходит не только увеличение концентрации СО2 в воздухе легких, но и постепенное накопление СО2 в организме. При задержках более 30 с становится недостаточно 3-минутного интервала между тестами для релаксации организма к нормальному состоянию. Это приводит к постепенному закислению организма, особенно в тканях, в результате которого эффективность высвобождения кислорода с гемоглобина существенно повышается. Поэтому в условиях ограниченного доступа кислорода в легкие при достаточно больших временах задержки в артериальной крови будет оставаться больше гемоглобина, не связанного кислородом. Эти вакансии могут быть заняты СО, что и повлечет обратный отток моноокиси углерода из легких в кровь. Несмотря на повышение отдачи кислорода в тканях в этих условиях, при задержках дыхания не наблюдается вклада миоглобинного буфера CO, который, как отмечалось выше, ответствен за повышение концентрации CO в выдыхаемом воздухе, например при физической нагрузке. Это также можно объяснить постепенным снижением уровня насыщения крови кислородом, происходящем при длительной задержке дыхания. Отметим, что скорость нарастания концентрации CO на начальном участке зависимости, показанной на рис. 36б, т.е. при задержках дыхания до 20 с, когда не столь существенны изменения химизма крови, определяется диффузионной способностью 180 Содержание СО, млн–1 2.6 2.4 Лежа 2.2 2.0 1.8 1.6 Сидя 1.4 1.2 5 0 10 15 20 25 30 35 Время задержки дыхания, c Рис. 38. Зависимость содержания CO в выдыхаемом воздухе от времени задержки дыхания при проведении тестов сидя и лежа легких. Это позволяет использовать дыхательный тест, основанный на анализе CO при задержках дыхания, для определения диффузионной способности легких и диагностики некоторых патологий [44, 51, 52]. Кроме того, концентрация CO в выдыхаемом воздухе при задержках дыхания оказывается чувствительна к кровенаполнению легких и физиологически активному объему легких. Это отчетливо видно на рис. 38, где представлены результаты, полученные при различных положениях тела испытуемого — сидя и лежа. Как следует из этого рисунка, в положении лежа наблюдаются на ~ 15 % более высокие концентрации CO, что может быть связано с увеличением кровенаполнения легких и уменьшением их объема в этом положении. 4.4. Влияние некоторых фармпрепаратов на динамику выделения СО с выдыхаемым воздухом Благодаря взаимодействию миоглобинного и гемоглобинного буферов СО в организме, прием фармацевтических препаратов, которые оказывают влияние на эффективность доставки кислорода в ткани, может также приводить к изменению концентрации СО в выдыхаемом воздухе. На рис. 39 представлена динамика содержания СО в выдыхаемом воздухе, обусловленная пероральным приемом нитроглицерина [31, 32]. В частности, видно, что через несколько минут после приема нитроглицерина наблюдается повышение скорости выделения СО. Концентрация СО в выдыхаемом воздухе практически скачкообразно поднимается от нормального значения ~ 1.6 млн–1 до 1.85 млн–1. Содержание СО, ppm 0.6 Содержание СО, млн–1 1.9 Нитроглицерин 0.5 1.8 Подкожная инъекция ЛПС 0.4 1.7 0.3 1.6 0.2 0.1 1.5 0 1.4 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время, мин Рис. 39. Выделение СО после приема нитроглицерина у человека –20 0 20 40 60 Время, мин Рис. 40. Выделение CO при введении липополисахарида у крыс 181 Резкий подъем сменяется медленной релаксацией, происходящей в течение ~ 20 мин. Такая динамика может быть связана с расширением тканевых капилляров и улучшением кровообращения в них, происходящем при приеме нитроглицерина. Последнее приводит к увеличению потока кислорода в расширенных капиллярах и более интенсивному выносу из них накопленного СО. На рис. 40 показано последствие подкожной инъекции липополисахарида (ЛПС) у крысы (400 мкг на 0.5 мл водного раствора) [31, 32]. Как известно, это вещество вызывает острую воспалительную реакцию и оксидативный стресс. Видно, что до введения ЛПС уровень эндогенного CO в выдыхаемом воздухе крысы составлял ~ 0.3 млн–1. Сразу после инъекции наблюдается практически двукратное увеличение содержания CO в выдыхаемом воздухе, а после 20-минутной релаксации устанавливается более низкий постоянный уровень содержания СО, ~ 0.15 млн–1. Последнее свидетельствует о том, что инъекция ЛПС вызывает резкое опустошение гемоглобинного буфера CO. 4.5. Применение лазерной методики детектирования эндогенного CO для клинической диагностики заболеваний 182 Гепатит СН Мук БА ИФФ Анемия ХОБЛ Контроль Разработанный лазерный анализатор и методы детектирования эндогенного CO в выдыхаемом воздухе были опробованы в применении к задачам диагностики ряда заболеваний. Предварительно, с учетом особенностей клинической диагностики и ранее полученных данных по динамике эндогенного CO в выдыхаемом воздухе, были сформулированы методические требования, стандартизирующие условия проведения таких тестов (протокол исследований). В таких исследованиях должны учитываться: параметры внешней среды; циркадные (суточные ритмы) изменения Среднее значение эндогенного CO скорости выделения эндогенного CO; предыстория в выдохе, млн–1 обследуемого субъекта, особенно важная для ку2.5 рильщиков и амбулаторных обследуемых; диета и принимаемые лекарственные препараты; возраст и пол обследуемых. Выполнение этих условий по2.0 зволяет повысить достоверность получаемых результатов и обеспечить их однозначность и воз1.5 можность последующего сравнения. Нами были обследованы группы больных, страдающих различными заболеваниями респираторной 1.0 системы, кардиоваскулярной системы, заболеваниями печени и системы крови. Экспериментально для ряда заболеваний продемонстрировано наличие 0.5 статистически достоверных отклонений концентрации СО в выдыхаемом воздухе от значений, на0 блюдающихся в норме (рис. 41) [23, 24, 42, 44]. Как видно, усредненные по группам испытуемых данЗаболевания ные указывают на уменьшение выделения СО при хроническом обструктивном бронхите (ХОБЛ), Рис. 41. Усредненные по группам фиброзах легких, анемии и бронхиальной астме значения концентрации СО в вы(БА). Получаемые при этих заболеваниях средние дыхаемом воздухе при различных заболеваниях: контроль, хроничеконцентрации на 20–40 % меньше среднего значе- ская обструктивная болезнь легких ния, наблюдаемого в группе контроля. Такое (ХОБЛ), фиброз (ИФФ), анемия, уменьшение концентрационных данных может бронхиальная астма (БА), муковисбыть обусловлено как нарушением проницаемости цидоз (Мук), сердечная недосталегочной мембраны, так и увеличением вентиля- точность (СН), гепатит б 1.0 0.6 0.5 0.8 0.4 0.6 0.3 0.4 0.2 0.2 0.1 0 Контр. Пневм. Контр. Пневм. Выделение СО, мкмоль/мин Концентрация СО в выдохе, млн–1 а 0 Рис. 42. Усредненные значения концентрации CO в выдыхаемом воздухе (а) и скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом (б) для группы контроля и группы пациентов, страдающих идеопатической интерстициальной пневмонией ции легких. При сердечной недостаточности достоверные изменения не были зафиксированы. Существенное (в несколько раз) увеличение выделения СО над нормой наблюдается при поражениях печени, что обусловлено усиленным метаболизмом билирубина и связанным с ним разрушением гем-содержащих структур [1, 3, 6]. Для того чтобы уточнить причину снижения концентрации СО при заболеваниях респираторной системы, в одной из экспериментальных серий концентрация СО в выдыхаемом воздухе измерялась одновременно с объемом минутной вентиляции легких и было проведено сравнение получаемых данных [53]. Нами была обследована группа из 12 некурящих пациентов, страдающих идеопатической интерстициальной пневмонией, средний возраст 42 ± 12 года, среди них 10 — женщины. Сравнение проводилось с группой из 20 некурящих испытуемых, средний возраст 37 ± 7 лет, 9 — Выделение СО, мкмоль/мин женщины. Результаты исследования приведены на рис. 42, где представлены концен0.4 трационные данные (а) и результаты расчета скорости выделения СО (б). Для средней 0.3 концентрации СО в выдыхаемом воздухе в группе больных и контрольной группе были 0.2 получены значения 0.57 ± 0.13 млн–1 и 0.83 ± ± 0.21 млн–1 соответственно, а для скорости выделения СО — 0.24 ± 0.06 ммоль/мин и 0.1 0.44 ± 0.13 ммоль/мин соответственно. Таким образом, при учете минутной вентиляции различие результатов между группами еще 0 20 40 60 80 более увеличивается, с 45 % до 82 %. Это, DL CO, % от должной величины наряду с отсутствием корреляции данных по Рис. 43. Скорость выделения СО с выдыСО с результатами диагностики маркеров хаемым воздухом в зависимости от диффувоспаления, может свидетельствовать о назионной способности легочной мембраны рушении функции респираторной системы, для СО в группе больных, страдающих в частности об уменьшении диффузионной идеопатической интерстициальной пневмонией способности легочной мембраны. В пользу 183 Содержание СО, мг/м3 a 0.9 0.8 0.6 0.7 0.4 0.6 0.5 14:00 б 0.8 Уровень СО в атмосфере 0.2 Уровень СО в атмосфере 16:00 18:00 20:00 22:00 0 Напуск атм. воздуха 19:20 20:00 Время, чч:мм Рис. 44. Динамика изменения содержания СО в микрокосме растений: а — нарастание СО в микрокосме 3-суточных проростков пшеницы, обработанных ИК-излучением, б — поглощение СО атмосферного воздуха сформировавшимся растением (Crataegi Vulgarus) этого предположения свидетельствует сопоставление скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом у обследованной группы пациентов с коэффициентом диффузии легочной мембраны DL для СО. Данные этого сравнения для одиннадцати испытуемых представлены на рис. 43, где прослеживается высокая степень корреляции этих параметров, R = 0.81 ± 0.04. Полученные в первых клинических исследованиях результаты свидетельствуют о перспективности использования данного аналитического подхода для целей неинвазивной диагностики подобных заболеваний, а также для повышения эффективности применяемых способов их терапии. 4.6. Лазерный анализ CO в исследованиях по физиологии растений Уникальные аналитические возможности, предоставляемые при использовании ПДЛ, позволяют проводить высокочувствительные измерения газового состава в исследованиях по физиологии растений. Актуальность таких исследований обусловлена, в частности, необходимостью изучения особенностей жизнедеятельности живых организмов в замкнутых искусственных экологических системах, например на космических или подводных обитаемых станциях. Лазерный анализатор был применен нами для изучения CO в микрокосме некоторых видов растений [54]. В экспериментах in vitro было впервые продемонстрировано, что на ранних стадиях развития растений наблюдается образование CO (рис. 44а) [54]. Данный результат подтверждает результаты полевых исследований по мониторингу CO в открытой атмосфере, проведенных С.Н. Котельниковым, в которых наблюдалось повышение уровня CO в атмосфере Кара-Дагского заповедника в периоды вегетативного развития растений (весна и осень) [55]. Также впервые было экспериментально показано, что сформировавшиеся растения могут интенсивно поглощать CO (рис. 44б) [54]. Таким образом, была продемонстрирована возможная важная роль растений в очищении загрязненной городской атмосферы от CO техногенного происхождения. 5. Заключение Нами были разработаны методы и лазерная система для высокочувствительного спектрального анализа эндогенного СО в выдыхаемом воздухе человека и лаборатор184 ных животных. Используемый подход базируется на применении диффузионных ПДЛ среднего ИК-диапазона на основе соединения PbSSe. Это позволяет регистрировать CO в выдыхаемом воздухе с чувствительностью ~ 5 млрд–1 и быстродействием ~ 5 c в режиме, близком к детектированию в реальном времени, при использовании прямой регистрации линий поглощения. Основные параметры СО анализатора: спектральная рабочая область ~ 4.7 мкм, мощность излучения < 0.5 мВт, рабочие температуры ПДЛ ~ 78 K, спектральное разрешение < 5⋅10–4 см–1, чувствительность к оптической плотности < 10–3, длина оптического пути в МХК ~ 18 м, объем аналитической кюветы ~ 1 л, диапазон анализируемых концентраций CO от 5 до 3⋅104 млрд–1, временнóе разрешение регистрации спектров пропускания 50 нс, полное время регистрации спектра пропускания исследуемой среды ~ 5 c. Для анализа СО была использована прямая регистрация спектров поглощения, при этом обеспечивалась близкая к 100 % селективность измерений к содержанию в выдыхаемом воздухе Н2О и СО2. Лазерный анализ СО в выдыхаемом воздухе позволяет исследовать выделение этого газообразного вещества при проведении различных фундаментальных физиологических и медицинских исследований, изучать закономерности и взаимосвязи процессов, отвечающих за продукцию, транспорт, буферирование и выделение СО в организме. Использование фракционирования воздуха, выделяемого в течение одного выдоха, позволяет разделять части, соответствующие начальной и конечной фазам выдоха. Возможен долговременный непрерывный мониторинг содержания СО в выдыхаемом воздухе или других исследуемых газовых средах. С помощью разработанной лазерной системы были проведены измерения уровня эндогенного СО в выдыхаемом воздухе в больших группах испытуемых, как практически здоровых, так и с бронхолегочной патологией. Лазерный анализ был применен нами для мониторинга относительно быстрых изменений скорости выделения СО при проведении различных функциональных тестов (физической нагрузки различной мощности и длительности, гипервентиляции различной глубины, задержки дыхания с различными патернами, гипербарии), при изменении состава вдыхаемого воздуха (гипероксии, гипоксии, гиперкапнии, изменении уровня антропогенных загрязнений атмосферного воздуха), при воздействии фармацевтических препаратов. Была продемонстрирована возможность исследований закономерности выделения эндогенного СО лабораторными животными (крысы, мыши) и растениями. Проведенный цикл исследований выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом позволил установить, что помимо скорости образования СО в организме основными факторами, обусловливающими интенсивность этого процесса, являются: вариации концентрации СО в атмосферном воздухе; парциальное давление кислорода в альвеолах легких и артериальной крови; напряжение растворенного кислорода в тканях и межклеточной жидкости; рН среды в крови, клетках и тканях организма (содержание СO2, лактата и других кислых продуктов). Полученные экспериментальные данные позволили разработать математическую модель, описывающую основные закономерности выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом, в частности динамику выделения СО при изменении содержания О2 и СО во вдыхаемом воздухе, а также при изменении химических параметров среды в организме. Полученные в рамках данного исследования экспериментальные результаты и разработанная модель показывают, что использование высокочувствительного, высокоточного и селективного лазерного мониторинга эндогенного СО в выдыхаемом воздухе может быть актуально и перспективно для исследования интенсивности метаболических и индуцированных процессов, связанных с образованием СО; изучения диффузионных и конвективных процессов переноса кислорода в легких; инструмен185 тального исследования эффективности процессов переноса кислорода кровью от легких к тканям, включая перфузию и тканевую микроциркуляцию; определения интенсивности основного обмена, образования и накопления кислых продуктов в условиях тканевой гипоксии и, возможно, ряда других процессов. Успешная клиническая апробация разработанных методов и приборов указывает на возможность и перспективность использования лазерного анализа СО в выдыхаемом воздухе для целей диагностики заболеваний и контроля эффективности терапии. Авторы выражают свою благодарность Ю.Г. Селиванову и Е.Г. Чижевскому за предоставленные для данной работы образцы перестраиваемых диодных лазеров, А.И. Кузнецову и П.В. Зырянову за разработку электронной системы управления и регистрации для лазерного анализатора. ABSTRACT The data of the experimental studies of endogenous CO excretion with exhalation obtained with tunable diode lasers are summarized. The laser-based analytical system and other analytical methods applied for the complex high sensitive and high selective studies of gas exchange with exhalation for man and laboratory animals are described. The laser based analysis of endogenous CO in exhalation was demonstrated to be useful in applications to different studies in normal physiology and in diagnostics of some pathology where a data on endogenous CO production, transportation, storage and release could be significant. Possibilities of the new approach were experimentally demonstrated in different diagnostic applications. It was applied for the analysis of endogenous CO content in the air averaged over respiration and in the alveolar fraction of exhalation. Laser based monitoring of relatively fast variations of endogenous CO in breath was fruitful in various functional tests like physical load of different power and duration, hyperventilation of different intensity, breath holding of different pattern and in hyperbaric tests. It was also applied for studies of endogenous CO dynamics caused by variations of chemical content of an inhaled gas mixture (hyperoxia, hypoxia, elevated CO content in atmospheric air and cigarette smoking) as well as by drugs uptake. The experimental data was compared with a model description of the endogenous CO release with exhalation. Previous results of clinical application of this technique are also discussed and demonstrate a possibility for future application of the laser based approach to diagnostics of some diseases as well as to a control of their therapy. ЛИТЕРАТУРА 1. Тиунов А.А., Кустов В.В. Продукты метаболизма при радиационном поражении. М.: Атомиздат, 1980. 104 с. 2. Страйер Л. Биохимия. В 3-х томах. М.: Мир, 1985. 3. Vreman H.J., Mahoney, Stevenson D.K. Carbon monoxide and carboxyhemoglobin // Adv. Pediatrics. 1995. Vol. 42. P. 303–334. 4. Марков Х.М. Окись азота и окись углерода — новый класс сигнальных молекул // Успехи физиологических наук. 1996. Т. 27, № 4. С. 30–41. 5. Gazit V., Rozenberg B., Katz Y. Nitric oxide and carbon monoxide—a new generation of neuronal messengers // Harefuah. 1996. Vol. 130, N 12. Р. 854–858. 6. Физиология человека / Под. ред. Р. Шмидта, Г. Тевса. В 3-х томах. М.: Мир, 1996. 7. Burmester Т., Welch В., Reinhardt S., Hankeln T. A vertebrate globin expressed in the brain // Nature. 2000. Vol. 407. P. 520–523. 8. Geuens E., Brouns I., Flamez D., Dewilde S., Timmermans J.P., Moens L. A globin in the nucleus! // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, N 33. P. 30417–30420. 186 9. Hamdanet D., Kigert L., Dewilde S., at al. The redox state of the cell regulates the ligand binding affinity of human neuroglobin and cytoglobin // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, N 61. P. 61713– 61721. 10. Foster R.E. Exchange of gases between alveolar air and pulmonary capillary blood: pulmonary diffusing capacity // Physiol. Rev. 1957. Vol. 37. Р. 391. 11. Coburn R.F., Brakemore W., Forster R. Endogenous carbon monoxide production in man // J. Clin. Invest. 1963. Vol. 42, N 7. P. 1172–1178. 12. Верболович П.А. Миоглобин и его роль в физиологии и патологии животных и человека. М.: МЕДГИЗ, 1961. 213 c. 13. Коваленко Е.А., Черняков И.Н. Кислород тканей при экстремальных факторах полета // Проблемы космической биологии. Т. 21. М.: Наука, 1972. 14. Коваленко Е.А. О теории динамики газов в организме // Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. М.: Наука, 1973. С. 192–212. 15. Gnaiger E., Lassnig B., Kuznetsov A., Rieger G., Margreiter R. Mitochondrial oxygen affinity, respiratory flux control and excess capacity of cytochrome c oxidase // J. Exp. Biol. 1998. N 201. P. 1129–1139. 16. Прудников А.П., Брычков Ю.А., Маричев О.И. Интегралы и ряды. М.: Наука, 1981. 798 c. 17. Wittenberg B.A., Wittenberg J.B. Transport of oxygen in muscle // Ann. Rev. Physiol. 1989. Vol. 51. P. 857–878. 18. Wittenberg J.B., Wittenberg B.A. Review myoglobin function reassessed // J. Exp. Biol. 2003. Vol. 206. P. 2011–2020. 19. Физиология дыхания. Отв. ред. И.С. Бреслав, Г.Г. Исаев. СПб.: Наука, 1994. 680 c. 20. Кузнецов А.И., Логачев А.П., Степанов Е.В. Анализ выдыхаемого человеком воздуха методами диодной лазерной спектроскопии // Изв. АН СССР. Сер. физ. 1990. T. 54, № 10. C. 1909–1914. 21. Stepanov E.V., Zasavitskii I.I., Moskalenko K.L., Nadezhdinskii A.I. Application of tunable diode lasers for human expiration diagnostics // Proc. Symp, on TDLAMGP, Freiburg, FRG. 17–18, October 1991 // Ed. by R. Grisar, H. Bottner, M. Tacke, G. Restelli. Dordrecht–Boston–London: Kluwer Academic Publ., 1992. P. 353–370. 22. Stepanov E.V., Moskalenko K.L. Gas analysis of human exhalation by tunable diode laser spectroscopy // Opt. Eng. 1993. Vol. 32, N 2. P. 361–367. 23. Stepanov E.V., Zyrianov P.V., Miliaev V.A., Shulagin Y.A., Diachenko A.I. Endogenous CO monitoring in exhalation with tunable diode lasers: Applications to clynical and biomedical diagnostics // Proc. SPIE. 1999. Vol. 3829. P. 77–87. 24. Степанов Е.В., Миляев В.А. Применение перестраиваемых диодных лазеров для высокочувствительного анализа газообразных биомаркеров в выдыхаемом воздухе // Квантовая электрон. 2002. T. 32, № 11. C. 987–992. 25. Шотов А.П. Физические исследования узкозонных полупроводников и разработка инфракрасных перестраиваемых диодных лазеров // Вестник АН СССР. 1986. № 6. C. 3–9. 26. Зырянов П.В., Кузнецов А.И., Степанов Е.В., Глушко А.Н. Автоматизированная система управления для диодной лазерной спектроскопии и многокомпонентного спектрального анализа // Наст. сборник. С. 79–106. 27. Rothman L.S., Rinsland C.P., Goldman A., Massie S.T., Edwards D.P., Flaud J.-M., Perrin A., Camy-Peyret C., Dana V., Mandin J.-Y., Schroeder J., McCann A., Gamache R.R., Wattson R.B., Yoshino K., Chance K.V., Jucks K.W., Brown L.B., Nemtchinov V., Varanasi P. The HITRAN Molecular Spectroscopic Database and HAWKS (HITRAN Atmospheric Workstation): 1996 edition // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer. 1998. Vol. 60, N 5. P. 665–710. 28. Логачев А.П., Степанов Е.В. Анализ выдыхаемого человеком воздуха методами диодной лазерной спектроскопии // Тез. 9-го Симп. по молекулярной спектроскопии высокого разрешения. Якутск, 1989. C. 37. 29. Логачев А.П., Степанов Е.В. Анализ выдыхаемого человеком воздуха методами диодной лазерной спектроскопии // Тез. Межд. конф. «Лазеры и медицина». Ташкент, 1989. C. 62–63. 30. Степанов Е.В., Москаленко К.Л., Кузнецов А.И. Диодные лазеры в анализе микропримесей выдыхаемого воздуха // В сб. Совета по спектроскопии АН СССР «Диодная лазерная спектроскопия». Москва, 1990. C. 190–215. 187 31. Stepanov E.V., Kouznetsov A.I., Zyrianov P.V., Skrupskii V.A., Shulagin Yu.A., Galagan M.E. Detection of small trace molecules in human and animals exhalation by tunable diode lasers for applications in biochemistry and medical diagnostics // Conf. Biomedical Optics, Europe, Lille. Sept. 1994. Proc. SPIE «Medical Sensors II and Fiber Optic Sensors». 1994. Vol. 2331. P. 173–183. 32. Stepanov E.V., Kouznetsov A.I. Applications of tunable diode laser spectroscopy for detection exhaled endogenous gases: CO, NH3, CH4, N2O, СO2 // Proc. SPIE «Biomedical Sensing, Imaging, and Tracking Technologies I». BiOS’96. 27 Jan.–2 Feb., 1996. San Jose, 1996. Vol. 2676. P. 272– 282. 33. Степанов Е.В., Миляев В.А. Лазерные методы детектирования газообразных биомаркеров в выдохе человека и животных для биомедицинской диагностики // Труды 11-й Межд. конф. по авиакосмической медицине и биологии. Москва, июнь 1998. T. 2. C. 225–227. 34. Степанов Е.В., Миляев В.А., Селиванов Ю.Г. Лазерная ортомолекулярная медицинская диагностика // УФН. 2000. T. 170, № 4. C. 458–462. 35. Stepanov E.V., Kouznetsov A.I., Shulagin Yu.A., Skrupskii V.A. Endogenous CO dynamics monitoring in breath by tunable diode lasers // Proc. SPIE «Laser Diodes and Applications II». 1996. Vol. 2682. P. 247–256. 36. Moskalenko K.L., Stepanov E.V. Tunable diode laser spectroscopy for carbon oxides (CO and СO2) detection in exhaled air // Proc. SPIE. 1991. Vol. 1811. P. 395–407. 37. Скрупский В.А., Степанов Е.В., Шулагин Ю.А. Мониторинг выделения эндогенной окиси углерода с выдыхаемым воздухом у крыс при гипероксии // Журнал авиакосмической и экологической медицины. 1995. № 1. C. 49–53. 38. Kouznetsov A.I., Stepanov E.V., Zyrianov P.V., Shulagin Y.A., Diachenko A.I., Gurfinkel Y.I. Monitoring of rapid blood pH variations by CO detection in breath with tunable diode laser // Proc. SPIE. 1997. Vol. 2976. P. 88–95. 39. Дьяченко А.И., Павлов Б.Н., Степанов Е.В., Шулагин Ю.А. Выделение эндогенной моноокиси углерода с дыханием при дозированной физической нагрузке и гипервентиляции // Труды 11-ой Межд. конф. по авиакосмической медицине и биологии. Москва, июнь 1998. T. 1. C. 254-256. 40. Степанов Е.В., Дьяченко А.И., Павлов Б.Н., Шулагин Ю.А. Применение лазерного анализа эндогенной моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе для мониторинга метаболизма при физической нагрузке в условиях гипербарии // Труды 11-ой Межд. конф. по авиакосмической медицине и биологии. Москва, июнь 1998. T. 2. C. 223–225. 41. Шулагин Ю.А., Скрупский В.А., Степанов Е.В. Выведениие эндогенной моноокиси углерода из организма при сочетанном воздействии гипероксии и гиперкапнии // Труды 11-ой Межд. конф. по авиакосмической медицине и биологии. Москва, июнь 1998. T. 2. C. 341–343. 42. Вознесенский Н.А., Степанов Е.В., Дулин К.С., Сахарова Г.М., Соодаева С.К., Шулагин Ю.А., Чучалин А.Г., Ягмуров Б.Х. Оксид азота и моноксид углерода при патологиях легких // Сб. трудов Всероссийского научного общества пульмонологов «Актуальные проблемы пульмонологии» / Под ред. А.Г. Чучалина. Москва, 2000. C. 738–746. 43. Степанов Е.В., Миляев В.А. Применение перестраиваемых диодных лазеров для высокочувствительного анализа газообразных биомаркеров в выдыхаемом воздухе // Квантовая электрон. 2002. T. 32, № 11. C. 987–992. 44. Babarskov E., Shulagin Yu., Stepanov E., Cherniack A., Aisanov Z., Chuchalin A.G. Applicability of exhaled CO measurement for calculation of CO transfer parameters in healthy volunteers // Proc. 12th Europ. Respiratopy Society Annual Congress. Stockholm, Sweden, 2002 // Europ. Respiratory J. 2002. Vol. 20, Suppl. 38. P. 154S. 45. Pavlov B.N., Grigorev A.L., Smolin V.V., Komordin I.P., Sokolov G.M., Ramazanov R.R., Spirkov P.V., Soldatov P.E., Buravkova L.B., Diachenko A.I., Shulagin Yu.A., Stepanov E.V. Hyperoxic, normoxic and hypoxic oxygen-argon gaseous mixture influence on humans under different barometric pressures and respiration time // Undersea and Hyperbaric Medicine. 1997. Vol. 24 (Suppl.). P. 56(18). 46. Окунева Г.Н., Шевелева Л.Т., Миргородская В.А., Вялов Е.А. Суточные ритмы кислотно-щелочного равновесия газового состава крови и внешнего дыхания у здоровых лиц // Теоретические и прикладные аспекты анализа временной организации биосистем. М.: Наука, 1976. C. 131–137. 188 47. Mercke C., Carallin-Stahl E., Lund B. Diurnal variations in endogenous production of carbon monoxide // Acta Med. Scan. 1975. Vol. 198. P. 161–164. 48. Lambertsen C.J. The compressed gas atmosphere. Oxigen toxicity. Physiological effects // Fundamentals of Hyperbaric Medicine. Washington, 1966. P. 3–29. 49. Кисляков Ю.Я., Бреслав И.С. Дыхание, динамика газов и работоспособность при гипербарии. Л.: Наука, 1988. С. 86–116 50. Stepanov E.V., Shulagin Yu.A., Babarskov E.V., Chuchalin A.G. Increased release of endogenous carbon monoxide caused by physical load // Europ. Res. J. 2003. Vol. 22, Suppl. 45. P. 1823. 51. Shulagin Yu.A., Stepanov E.V., Diachenko A.I., Pavlov B.N., Babarskov E.V., Buravkova L.P. Endogenous carbon monoxide monitoring as a noninvasive technique of tissue gas exchange estimation of pulmonary transfer factor and oxide-base balance in high pressure environment // 8th Int. Meeting on High Pressure Biology. Moscow, Russia. June 2–6, 2003. P. 57. 52. Babarskov E.V., Shulagin Yu.A., Stepanov E.V., Cherniak V., Aisanov Z.R. Exhaled CO measurement for detection of lung diffusion disturbances // Eur. Res. J. 2003. Vol. 22, Suppl. 45. P. 1819. 53. Avdeev S.N., Shulagin Yu.A., Avdeeva O.E., Stepanov E.V., Cherniak A.V., Chuchalin A.G. Exhaled carbon monoxide is decreased in interstitial lung diseases (ILD) // Eur. Res. J. 2001. Vol. 18, Suppl. 33. P. 195S. 54. Stepanov E.V., Zyrianov P.V., Khusnutdinov A.N., Kouznetsov A.I., Ponurovskii Ya.Ya. Multicomponent gas analyzers based on tunable diode lasers // Proc. SPIE. 1996. Vol. 2834. P. 270–280. 55. Kotelnikov S., Galaktionov V., Karpinchik K., Stepanov E.V. Diode laser-based spectroscopy in atmospheric monitoring in Karadag National Park // Proc. SPIE. 1993. Vol. 1874. P. 209–212. 189
