Спектральный анализ в определении состояния белков плазмы

Дюбко Т.С. 1, Козин Ю.И. 2, Соколик О.А. 3, Бондаренко О.Б. 4,
Калниня И.Э. 5
СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ В ОПРЕДЕЛЕНИИ СОСТОЯНИЯ БЕЛКОВ
ПЛАЗМЫ КРОВИ И ДИНАМИКИ ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ
ЗАЩИТЫ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ОЗОНОТЕРАПИЕЙ
1Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины;
2Харьковский национальный медицинский университет;
3ГНУ НТК "Институт монокристаллов НАН Украины";
4Институт радиофизики и электроники им. А.Я. Усикова НАН Украины;
Харьков, Украина
Университет Даугавпилса,
Даугавпилс, Латвия
tdyubko@mail.ru
Введение. Несмотря на значительные успехи, достигнутые при использовании
озона для терапевтических целей, механизмы его действия на молекулярном и
организменном уровнях остаются до настоящего времени изученными
недостаточно.
20
Целью работы явилось изучение состояния белков плазмы крови и динамики
общей антиоксидантной защиты при лечении озонотерапией с привлечением
современных методов спектрального анализа [1-3]: флуоресцентной
спектроскопии основного состояния, конфокальной флуоресцентной
микроскопии, хемилюминесценции, спектрофотометрии, дополненных
электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ). Ряд модельных
экспериментов выполняли на озонированных in vitro изолированных белках, а
также клетках и плазме крови человека и животных.
Материал и методы исследования. В исследованиях использовали кровь
пациентов с урогенитальными инфекциями (n = 26), получавших курс
озонотерапии в Харьковском региональном противоболевом центре. Контролем
служила группа клинически здоровых добровольцев (n = 7), получавших
аналогичные процедуры. Озонирование крови осуществляли введением в
кровяное русло пациентов озонированного физиологического раствора (ОФР)
или озонированной аутокрови (процедура БАГТ). Озонирование in vitro
производили, смешивая биологические жидкости с ОФР в объемном
соотношении 1:1. ОФР получали с помощью медицинского озонатора «Озон
УМ-80», сертифицированного МОЗ Украины Использовали концентрации
озона
от 2,0 до 17 мг/л в зависимости от задач эксперимента, патологии и
индивидуальной чувствительности пациента. Определение bадренореактивности организма белых крыс линии Wistar (n = 15) проводили на
эритроцитах с использованием набора бета-АРМ-АГАТ (Москва). Уровень
гемолиза эритроцитов, содержание общего белка и альбумина в образцах
определяли спектрофотометрически. Для определения содержания альбумина в
плазме использовали набор «Альбумин-Агат» с бромкрезоловым зеленым.
Общую антиоксидантную активность (ОАО) плазмы оценивали методом
хемилюминесценции с применением фенилового эфира N–
метилакридинийкарбониевой кислоты, любезно предоставленного А.Д.Рошалем
(НИИ химии при ХНУ им. В.Н. Каразина, Харьков). Показателем ОАО плазмы
служила парциальная константа скорости тушения хемилюминесценции (KCL)
[1, 2]. Также использовали флуоресцентные зонды (ФЗ) К-35, К7-1045, С-13-4,
синтезированные в Отделе органических люминофоров и красителей ГНУ НТК
"Институт монокристаллов НАН Украины" (Харьков) и зонд АВМ, любезно
предоставленный И. Калниня (Университет Даугавпилса). Флуоресценцию
измеряли на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian). Спектры поглощения
регистрировали на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer). Результаты
обрабатывали статистически с помощью пакета “Statgraf”.
Результаты. Установлено, что введение озона в организм приводит к
изменению спектра белков сыворотки крови. При этом, внутривенное введение
озонированной аутокрови оказывает более выраженный стимулирующий
эффект на выработку сывороточных белков, чем ОФР. По данным собственной
флуоресценции и ФЗ, действие озона in vitro приводит к изменению
конформационного состояния белков плазмы. Степень изменения структурного
состояния белков зависит от концентрации озона в растворе и от исходного
состояния белка. Необратимые нарушения структуры белков,
сопровождающиеся разрушением ароматических колец, наблюдаются при
содержании озона в среде более 0,6 г/м3. У пациентов с урогенитальной
инфекцией показатель KCL был снижен в сравнении с контрольной группой. Вне
зависимости от вида процедуры (ОФР или БАГТ) влияние озона на ОАО
плазмы
крови имеет сходство. После первой процедуры озонирования наблюдалось
наибольшее снижение KCL, которая возрастала по мере увеличения количества
проведенных процедур. Кроме того, параметр KCL зависел от пола, возраста
пациентов, а также от тяжести течения заболевания. По данным собственной
флуоресценции и ФЗ, озонирование in vitro вызывало однонаправленное
изменение изменение конформационного состояния изолированных альбуминов
и белков плазмы человека и животных (бык, лошадь), выражающееся в
снижении интенсивности флуоресценции и уменьшении связывания ФЗ. При
этом, у пациентов после проведения ОФР или БАГТ наблюдалось как
уменьшение, так и, в ряде случаев, увеличение отмеченных показателей,
связанное с индивидуальными характеристиками крови. На крысах показано,
что применение препарата Д5, созданного на основе стимулятора АСД-2,
защищает симпато-адреналовую систему организма от оксидативного стресса,
вызванного введением больших доз озона.
Обсуждение и выводы. Полученные результаты позволяют прийти к выводу,
что на первых процедурах введенные в организм озониды и продукты
окисления
биомолекул используются для восстановления антиоксидантной защиты
пораженных органов и тканей, а к концу курса озонотерапии (10-12 процедура),
когда органная антиоксидантная защита восстановлена, происходит рост
показателей общей АОА. Изменение белкового спектра плазмы под влиянием
озонирования может рассматриваться в качестве одного из механизмов
терапевтического воздействия озона на организм. Причиной обнаруженной
неодинаковой устойчивости альбумина к действию озона может быть различная
степень нагруженности молекул альбумина токсическими лигандами. В целом
проведенные исследования свидетельствуют о широких возможностях
применения малых доз озона для активизации биологических функций как на
уровне изолированных белков или клеток, так и на уровне организма.
Перспективным на наш взгляд является применение препарата Д5 для
коррекции адаптационных возможностей организма, подвергнутого действию
озона.
Литература
1. Козин Ю.И., Дюбко Т.С., Соколик О.А., Кшимински К.
Хемилюминесцентный мониторинг антиоксидантной активности плазмы крови
больных с атипичной урогенитальной инфекцией // Харківська хірургічна
школа.– 2007.– № 3(26).– С. 41-47.
2. Dyubko T., Kozin Yu., Roshal A., Sokolik O., Zinchenko V., Krzyminski K. Usage
of Chemiluminescence Methods for Researches of Ozonotherapy Influence on Total
Antioxidant Activity of Blood Plasma of Patients with a Urogenital Infection
Contamination // 10th Conference on Methods and Applications of Fluorescence (9-12
sept. 2007): Book of abstracts.– Salzburg, 2007.– P. 308.