УДК 577.112 ФЕРМЕНТЫ-АНТИОКСИДАНТЫ: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА И РОЛЬ В РЕГУЛИРОВАНИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Л.Т. Рязанцева Изложены представления о структурно-функциональных свойствах основных ферментов антиоксидантной системы: супероксиддисмутазы и каталазы. Анализируются кинетические параметры процессов структурнофункциональных модификаций указанных белков Ключевые слова: антиоксиданты, супероксиддисмутаза, каталаза, кинетические параметры Существование живых организмов на Земле (кроме небольшого числа бактерий – облигатных анаэробов) невозможно без кислорода, являющегося неотъемлемым компонентом метаболических процессов. Однако при включении кислорода в процессы жизнедеятельности организма образуются активированные производные молекулярного кислорода – активные формы кислорода (АФК). АФК инициируют реакции свободнорадикального окисления (в том числе перекисное окисление липидов), приводящие к химической модификации и разрушению биомолекул. В тканях благодаря наличию сложных ферментативных комплексов со специфическими электронтранспортными простетическими и коферментными группировками процесс восстановления кислорода протекает по многоступенчатому механизму, что сводит к минимуму возможность образования высокореакционных промежуточных соединений кислорода. Ферментативные антиоксиданты (АО) характеризуются высокой специфичностью действия, а также клеточной и органной локализации, использованием в качестве катализаторов некоторых металов (Cu, Zn, Mn, Fe) (рисунок). Уровень внутриклеточных ферментативных АО находится под генетическим контролем. У животных в условиях гипоксии и гипероксии, усиливающих образование активных форм кислорода, повышается уровень внутриклеточных ферментов АО системы, что связано с механизмами поддержания устойчивости организма к окислительному стрессу (рисунок). Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.11, СОД) - фермент, катализирующий реакцию дисмутации супероксидных анион-радикалов с Рязанцева Лариса Тихоновна – ВГТУ, канд. биол. наук, доцент, тел. (4732) 521939 образованием пероксида водорода и триплетного кислорода: . . O2 + O2 + 2Н+ → Н2О2 + О2 СОД принадлежит к наиболее интенсивно изучаемым белкам, так как она является ключевым ферментом, непосредственно обеспечивающим обрыв цепей кислородзависимых свободнорадикальных реакций в клетках аэробных организмов [1]. К настоящему времени получены три типа СОД человека, для функционирования которых необходимо наличие марганца, меди и цинка. Медь-цинковая форма (Сu,Zn-СОД) содержится в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий, Mn-СОД локализована в митохондриях. Экстрацеллюлярная высокомолекулярная форма СОД, содержащая медь, рассматривается как третий тип фермента - эСОД. Молекула Сu,Zn-СОД состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 16,3 Да, связь между которыми осуществляет дисульфидный мостик. По другим данным, субъединицы объединены через ионы металлов, причем места связывания металлов неидентичны. Химическими методами, методами атомной абсорбционной спектроскопии и ЭПР показано присутствие в молекуле фермента по два иона меди и цинка. Установлено, что ионы меди (Cu2+)в молекуле СОД играют важную роль при катализе реакции дисмутации, тогда как цинк имеет отношение к сохранению определенной конформации белка, необходимой для формирования реактивного медьсвязывающего участка. Ион меди в молекуле СОД окружен тремя прочно связанными с ним и одним слабым лигандами, которые являются имидазольными группами гистидиновых остатков [2]. Пятое место занимает вода, которая может быть заменена на другие лиганды; расстояние Cu2+-О составляет примерно 0,2 нм. NADPH(пентозный цикл) NADP Объект фагоцитоза О2 О2 +Н2О Н2 О2 Каталаза МПО Сl– Оксидазы D-аминокислот ОН· О2 –· Меn+ О2 СОД NADPH оксидаза Фагоцитирующие лейкоциты (нейтрофилы) Плазма Ткани Активация Fe+2 → Fe+3 Пероксидация фосфолипазы А2 сывороточных ЦП Пероксидаза Глюкоза, липидов Деполимеризация мочевая ПОЛ ПОЛ биополимеров кислота Н2 О2 (ловушка OH· Арахидоновая Ме(n-1)-хелаты радикалов) СОД кислота –· О2 Циклоокси- Липооксигенация генация Н2 О2 Меn+ -хелаты –· (Трансферрин, церулоплазмин, О2 –· хелатные соединения Cu++ и Fe+++ ) –· О2 О2 Простагландины, тромСОД боксаны Эритроциты –· Каталаза – ОСl ОН· 1 O2 –· О2 СОД Н2 О2 → НbFе+2 Меn+-катализ Глутатион-пероксидаза ПОЛ Н2 О2 +О2 О2 → НbFе+3 OH· Гемихром Тельца Гейнца ПОЛ Каталаза Гидроксиперокси- эйкотетрадазы еновая кислота, лейкотриЛизис ены мембран Пути превращения активизированных метаболитов кислорода в тканях Ионы меди и цинка связаны через азот имидазольного кольца гистидина, причем цинк может оттягивать на себя пару электронов в ходе одной из стадий ферментативного процесса. В настоящее время существуют 2 модели функционирования СОД. 1. На основании исследования спектров ЭПР фермента было разработано представление о двухтактном механизме действия СОД (“пинг-понг”) [3], заключающемся в последовательном восстановлении и реокислении меди в активном центре фермента: . E-Cu2+ + O2 → E-Cu+ + O2, . O 2 + 2H+ → E-Cu2+ + H2O2. E-Cu + + 2. Б. С. Маринов с соавторами предложили многоцентровую модель функционирования СОД [4], сочетающую экспериментальные наблюдения и результаты квантовомеханических расчетов. Согласно этой модели, . одна молекула субстрата ( O2 ) связывается с ионом меди в активном центре фермента, а вторая - взаимодействует с участком на периферии молекулы белка. Неспаренный электрон из активного центра передается по белку к пе- . риферийному O2 , в результате чего в актив- ном центре образуется молекула кислорода, а на внешней поверхности фермента - пероксид водорода. Функциональные свойства СОД из эритроцитов человека всесторонне изучены [5]. Для нее характерен широкий температурный оптимум, фермент стабилен при нагревании в течение 40 мин в температурном интервале 20 ÷ 70 °С. Фермент также устойчив к колебаниям значений рН в широком диапазоне, он сохраняет свою активность в интервале рН 5,5 11,5, причем в области рН 8,0 - 9,5 ферментативная активность СОД достигает максимального значения и практически не изменяется. При концентрации супероксидного анион-радикала 10-10 моль/л фермент в 105 раз ус- . коряет спонтанную реакцию дисмутации O2 (k ≈ 2. 109 М-1.с-1). У человека ген, кодирующий синтез СОД, локализован в хромосоме 21; выявлены случаи генетически детерминированного как снижения, так и повышения содержания СОД (у людей с трисомией по хромосоме 21). Интересно отметить, что в обоих случаях изменения концентрации фермента являются причиной развития патологических процессов: в первом - вследствие недостаточности защиты от активных форм кислорода, во втором - в результате усиления цитотоксического дейст- . вия Н2О2, образующегося при дисмутации O2 . Рассмотренная Cu, Zn-СОД является внутриклеточным энзимом и в межклеточных жидкостях (плазма крови, лимфа, синовиальная жидкость) быстро, в течение 5-10 мин, разрушается. В 1982 г Marklund впервые выделил СОД из плазмы крови человека [6]. По своим свойствам этот фермент отличается от извест- ных типов СОД и рассматривается как новый (третий) тип супероксиддисмутазы - экстрацеллюлярная СОД (эСОД). Высокомолекулярная форма СОД представляет собой тетрамерный Cu,Zn-содержащий гликопротеин с молекулярной массой около 120-150 кДа [7]. В таблице представлен сравнительный анализ свойств СОД эритроцитов и плазмы, откуда следует, что СОД плазмы представляет собой новый тип супероксиддисмутазы. Таблица Сравнительный анализ свойств супероксиддисмутазы плазмы и эритроцитов человека Свойства Молекулярная масса, кДа Содержание меди, ммоль/мг белка Максимум поглощения в видимой области, нм Влияние 2,5.10-5 моль/л ацетонциангидрина Влияние 0,47 моль/л NaF Влияние азида натрия ЭПР-спектры Супероксиддисмутаза эритроцитов 32,0; 33,6 9,0.10-6 Супероксиддисмутаза плазмы крови 120; 147 3,14.10-5 675-680 470, 525, 560 Полностью ингибирует Ингибирует 1мМ - активирует, 10 мМ - ингибирует g1 = 2,68; g2 = 2,96; g = 3,24 (“тип 1 Сu”) Не влияет Активирует Не влияет Хроматографическое разделение фермента позволило выделить три его фракции: А, В и С, отличающихся различным сродством к гепарину. Фракции А и В фермента, обладающие слабым сродством к гепарину, присутствуют преимущественно в плазме; фракция С (с высоким сродством к гепарину) находится, в основном, в сосудистой стенке. Выявлено динамическое равновесие между содержанием фракции С в плазме и в эндотелии сосудов. Причем, супероксиддисмутаза С хорошо связывается с гепаринсульфатом гликокаликса эндотелиоцитов, но не с лейкоцитами и эритроцитами. При определенных условиях (длительное хранение при t=4-5 °С, тепловое воздействие в диапазоне от 20 до 40 °С, действие HOCl) наблюдается диссоциация молекулы на отдельные субъединицы, затем следует агрегация и образование лабильных комплексов, что сопровождается изменением биологической активности СОД. Вероятно, такого рода структурные изменения фермента можно рассматривать как механизм адаптации организма к изменению окружающей среды. Каталаза (Н2О2:Н2О2-оксидоредуктаза; КФ 1.11.1.6) - фермент, относящийся к классу оксидоредуктаз, катализирует гетеролитиче- Нет ЭПР-сигнала (тип 3 Сu) ское расщепление О-О-связи в Н2О2 и, таким образом, является синергистом супероксиддисмутазы в клетке [8]: Н2О2 + Н2О2 → О2 + Н2О Каталаза всегда присутствует в системах, где осуществляется транспорт электронов с участием цитохромов, т.е. там, где образуется токсичный для клетки пероксид водорода. Она локализована преимущественно в пероксисомах клеток, где ее концентрация достигает 10-6 моль, и в цитоплазме. У человека высокое содержание каталазы обнаружено в эритроцитах, а также в печени и почках; концентрация ее в мозге и щитовидной железе мала. Молекула каталазы представляет собой тетрамер с молекулярной массой 250 кДа, состоящий из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых содержит протопорфирин IX с хелатированным атомом железа [9]. Железо в активном центре фермента находится в трехвалентном состоянии; четыре места в координационной сфере геминового железа заняты порфириновым циклом, пятое - имидазольным остатком гистидина, а у шестого происходит реакция каталитического разложения пероксида водорода. Процесс разложения Н2О2 каталазой может быть представлен следующей схемой: Е-Fe3+ + H2O2 [Е-Fe3+ ...ООН] H [Е-Fe5+ O2- ] + H2O2 [Е-Fe3+ ...ООН]; Н [Е-Fe5+ O2- ] + H2O; Комплекс I Е-Fe3+ + O2 + H2O; Комплекс I Нуклеофильный атом азота имидазольной группы гистидина оттягивает на себя протон, активируя молекулу Н2О2, которая замещает ОН-группу у атома железа. Последняя протонируется гистидином и образуется молекула воды. Пероксосоединение разлагается с образованием второй молекулы воды, одновременно присоединяя депротонированную гистидином молекулу Н2О2. При этом происходит гетеролитическое расщепление О-Освязи в пероксиде водорода: Для регенерации исходной структуры активного центра достаточно обратимой ионизации имидазола, что является быстрым процессом в области рН 6-8. Кроме характерной функции каталазы высокоэффективного катализа разложения пероксида водорода на воду и кислород (k=107 моль-1.с-1), фермент проявляет умеренную пероксидазную активность, т.е. катализирует реакции окисления пероксидом водорода различных доноров электронов (k=103 моль-1с-1). В заключении хотелось бы отметить, что в условиях оксидантного стресса или усиленного образования форм кислорода (как, например, в результате фагоцитоза) может происходить нарушение функционирования ферментов антиоксидантной системы и, как следствие, возникновение и накопление окислительных повреждений, что сопровождает ряд физиологических и патофизиологических феноменов - таких, как воспаление, реперфузное поражение тканей, старение, канцерогенез [10]. В этой связи необходим поиск путей регулирования антиоксидантного статуса в биологической системе. Литература 1. Hough M.A., Strange R.W., Hasnain S.S. Conformational variability of the Cu site in one subunit of bovine Cu,Zn superoxide dismutase: the importance of mobility in the Glu 119-Leu 142 loor regionb for catalytic function // J. Mol. Biol. 2000. V. 204 (2). P. 231-141. 2. Tainer J.A, Hallewell R.A., Roberts V.A. et al. Probing enzyme-substrate recognition and catalytic mechanism in Cu,Zn-superoxide dismutase // Oxygen Radicals in Biol. and Med.: Proc. IV Int. Congr., La Jolla, 1987. London, 1988. P. 635-640. 3. Kajihara J., Enomoto M., Katoh K. Relation between ESR-detectabl Cu (II) and superoxide dismutase activity // J. Biochem. 1988. V. 104. № 5. P. 855-857. 4. Гуляева Н.В., Обидин А.Б., Маринов Б.С. Механизм функционирования СОД: многоцентровая модель // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1989. № 6. С. 890898. 5. Башарина О.В. Анализ фото- и термоиндуцированных структурно-функциональных изменений супероксиддисмутазы и каталазы: Дис. ... канд. биол. наук. Воронеж, 1995. 140 с. 6. Marklund S.L., Karlsson K. Antioxidants in therapy and preventive medicine. N.Y.: Plenum press, 1990. P. 1. 7. Marklund S.L. Location and regulation of extracellular-superoxide dismutase synthesis // Free Rad. Biol. a. Med. 1990. V. 9. Suppl. 1. P. 127. 8. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Вашанов Г.А., Наквасина М.А., Путинцева О.В. Олигомерные белки: структурно-функциональные модификации и роль субъединичных контактов. - Воронеж, 1997. 264 с. 9. Соломон Х., Снайдер С.Х., Дейвид С., Бредт Д.С. Биологическая роль окиси азота // В мире науки. 1992. № 7. С. 16-26. 10. Рязанцева Л.Т. Особенности функционирования нейтрофилов крови человека в условиях лазерного облучения: Дис. ... канд. биол. наук. Воронеж, 2002. 155 с. Воронежский государственный технический университет ENZYMES-ANTIOXIDANTS: STRUCTURALLY FUNCTIONAL PROPERTIES AND A ROLE IN REGULATION OF METABOLIC PROCESSES L.T. Ryazantseva Concepts about structurally functional properties of the basic enzymes antioxidant system are stated: superoxide-dismutase and catalase. Kinetic parameters of processes of structurally functional modifications of the specified proteins are analyzed Key words: antioxidants, superoxide-dismutase, catalase, kinetical parameters