Результаты ВПЧ-диагностики и экспрессии онкобелков Е6/Е7

Îíêîëîãè÷åñêèé æóðíàë, Ò.4, N¹1 (13), 2010
ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ ÂÏ×-ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÈ È ÝÊÑÏÐÅÑÑÈÈ ÎÍÊÎÁÅËÊÎÂ
Å6/Å7 ÂÏ× 16 ÒÈÏÀ ÏÐÈ ÄÎÁÐÎÊÀ×ÅÑÒÂÅÍÍÛÕ È ÏÐÅÄÐÀÊÎÂÛÕ
ÇÀÁÎËÅÂÀÍÈßÕ ØÅÉÊÈ ÌÀÒÊÈ
Ã.Â. Êîñòåâè÷, È.À. Êîñåíêî
ÐÍÏÖ ÎÌÐ èì. Í.Í. Àëåêñàíäðîâà, ã. Ìèíñê
Ключевые слова: профилактический осмотр, ВПЧ, онкобелки Е6/Е7, CIN, рН.
В исследовании приведены результаты ВПЧ-диагностики и экспрессии онкобелков Е6/Е7 ВПЧ 16 типа, оценены данные бактериологического состояния влагалища, уровня рН, степени морфологических изменений эпителия
шейки матки, ассоциированной с ВПЧ-инфекцией, у пациенток трех клинических групп. Установлено, что с целью
диагностики субклинических форм ВПЧ в аспекте профилактического осмотра проведение кольпоскопии целесообразно, что ВПЧ-инфекция шейки матки в большинстве случаев протекает на фоне бактериального вагиноза, а
также высказано предположение, что выявление онкобелков Е6/Е7 может быть использовано в качестве диагностического критерия неопластических процессов шейки матки.
FINDINGS OF HPV DIAGNOSIS AND HPV-16 E6/E7 ONCOPROTEIN EXPRESSION
IN BENIGN AND PRECANCER DISEASE OF UTERINE CERVIX
G.V. Kostevich, I.A. Kosenko
Key words: preventive examination, HPV, E6/E7 oncoproteins, CIN, pH.
The study presents the findings of HPV diagnosis and HPV-16 E6/E7 oncoprotein expression, and evaluation of the
vaginal bacteriological condition, pH level, the extent of pathologic changes in uterine cervix epithelium associated with
HPV infection in patients of three clinical groups. Colposcopy was found to be advisable for diagnosis of subclinical HPV
forms in the framework of preventive examination, cervical HVP infection was established to be taking its course at the
background of bacterial vaginitis; it was also suggested that detecting E6/E7 oncoproteins could de used as a diagnostic
criterion of cervical neoplastic disease.
В
результате проведенных эпидемиологических и молекулярно-биологических исследований учеными разных стран установлено,
что основным этиологическим фактором в возникновении РШМ является вирус папилломы человека (ВПЧ) [1, 2]. В настоящее время известно около
180 типов ВПЧ, более 30 из них могут инфицировать генитальный тракт. С учетом риска развития
злокачественных заболеваний, вирусы подразделяются на ВПЧ высоко- и низкоонкогенного риска.
Наибольшую роль в злокачественной трансформации эпителия шейки матки занимают ВПЧ 16 и 18
типов [3].
Изучение механизмов развития папилломавирусной инфекции показало, что инфекционный
процесс имеет две стадии: стадию репродуктивного размножения вируса и стадию интегративной инфекции, когда ДНК вируса встраивается
в геном инфицированных клеток. Первая стадия
является обратимой, и у многих инфицированных
наступает спонтанная ремиссия. Стадия интегративной инфекции является первым шагом к опухолевому перерождению клетки и часто заканчивается развитием карциномы [4, 2].
Репликация вирусной ДНК и синтез капсидных белков вируса происходит в наиболее дифференцированных слоях эпителия. Вирус обладает
набором механизмов, подчиняющих своим интересам жизнедеятельность инфицированной клетки. Его ДНК кодирует синтез белков Е6 и Е7, которые индуцируют переход дифференцированных
клеток в S-фазу клеточного цикла. На стадии активной репродукции вируса экспрессия генов Е6
и Е7 регулируется продуктом гена Е2, являющимся репрессором транскрипции этих генов. Именно
поэтому, пока вирус находится в эписомальном
состоянии, наблюдаются доброкачественные процессы в инфицированных тканях. Ключевым событием в малигнизации клеток является интеграция вируса в геном клеток эпителия, которая сопровождается делецией гена Е2. В результате чего
в эпителиальных клетках с интегрированной формой ВПЧ развивается сверхэкспрессия генов Е6 и
Е7 [5, 4]. Установлено, что интеграция ДНК ВПЧ в
геном клеток сопровождается активным синтезом
онкобелков вируса, в частности белка Е7. Наличие
белка Е7 в цервикальных пробах рассматривается как свидетельство начавшегося процесса
33
Àêòóàëüíûå ïðîáëåìû îíêîãèíåêîëîãèè
малигнизации эпителиальных клеток, содержащих интегрированную копию генома ВПЧ [6, 2].
Критерием клинически значимой ВПЧ-инфекции, способной развиться в заболевание, является величина вирусной нагрузки. В настоящее
время доказано, что показатель спонтанной элиминации вируса ниже, а риск прогрессии выше в
случаях ВПЧ-инфекции с более высокой вирусной
нагрузкой [3].
ÌÀÒÅÐÈÀËÛ È ÌÅÒÎÄÛ
Цель настоящего исследования — выявить роль
ВПЧ-инфекции в развитии доброкачественных и
предраковых заболеваний шейки матки в рамках
проведения профилактического осмотра, а также
оценить риск развития рецидива CIN III ст. шейки
матки при проведении органосохранного лечения.
Нами разработан и апробирован вариант комплексного профилактического осмотра, направленный на раннюю диагностику доброкачественных и предраковых заболеваний половых органов
у женщин. Он включает простую и расширенную
кольпоскопию, взятие мазков из шейки матки и
аспирата из полости матки для цитологического
исследования, бимануальное и ректовагинальное
обследование, УЗИ органов малого таза.
Материалом настоящего исследования послужили результаты обследования 164 пациенток,
выявленных по результатам кольпоскопического
исследования при проведении профилактического
осмотра женщин Минской области, а также получивших лечение в онкогинекологическом отделении РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова по поводу
CIN III ст.
По клиническим данным пациентки были разделены на три группы:
– первую группу составили 82 клинически
здоровые женщины, у которых при проведении
профилактического осмотра кольпоскопически
впервые обнаружена патология МПЭ шейки матки в виде полей ацетобелого эпителия. Средний
возраст женщин в группе — 31,8 ± 8,9 лет.
– во вторую группу исследования включены
45 первичных пациенток с установленным диагнозом CIN III степени. Средний возраст обследованных — 35,9 ± 8,6 года.
– в третью группу наблюдений включены 37
женщин, получивших ранее (в пределах 6 мес. – 1
год) лечение CIN III ст. в объеме радиоволновой конизации или ампутации шейки матки по Штурмдорфу.
Средний возраст женщин — 36,8 ± 6,7 лет.
Объем обследования включал: простая и
расширенная кольпоскопия, взятие материала из
шейки матки для цитологического и бактериологического исследования, ВПЧ-диагностика и
оценка экспрессии онкобелков Е6/Е7 ВПЧ 16 типа
34
в образцах эпителия шейки матки, измерение рН
влагалищного содержимого. У пациенток 1-й и
2-й групп выполнено гистологическое исследование фрагмента шейки матки, удаленного методом
радиоволновой конизации под контролем кольпоскопии. Качественную и количественную характеристику ВПЧ, а также уровень мРНК онкогенов
E6/E7 ВПЧ 16 типа определяли методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени.
ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ
В табл. 1 представлены результаты ВПЧ-инфицированности пациенток разных клинических
групп. Установлено, что 39,0 % (95 % ДИ 28,4–
50,4 %) практически здоровых женщин, патология
шейки матки у которых выявлена при кольпоскопии, инфицированы ВПЧ, причем 78,1 % из них
(95 % ДИ 60,0–90,7 %) имеют ВПЧ в клинически
значимой концентрации, и у каждой 2й — доминирующим является ВПЧ 16 типа. Во второй группе
75,6 % (95 % ДИ 60,5–87,1 %) пациенток имеют
дисплазию шейки матки тяжелой степени, ассоциированную с ВПЧ, причем клинически значимая
концентрация вируса отмечена в 97,1 % наблюдений (95 % ДИ 84,7–99,9 %); у 100 % (95 % ДИ
89,7–100,0 %) обследованных ведущим является
ВПЧ 16 типа. В группе женщин, пролеченных по
поводу CIN III ст., ВПЧ обнаружен в 70,3 % (95 %
ДИ 55,9–86,2 %) случаев, в том числе у 74,1 ± 8,4 %
из них в клинически значимой концентрации; в
63,0 ± 9,3 % случаев преобладал ВПЧ 16 типа.
В табл. 2 указаны результаты экспрессии онкобелков Е6/Е7 ВПЧ 16 типа и среднее значение
LgЕ7 в исследуемых группах. Оказалось, что экспрессия онкобелков Е6/Е7 ВПЧ 16 типа обнаружена у 66,7 ± 12,2 % ВПЧ-инфицированных пациенток первой группы, что составляет 12,2 % (95 %
ДИ 6,0–21,3 %) всей группы исследования. Это
свидетельствует о том, что каждая 10-я практически здоровая женщина, имеющая кольпоскопические признаки вирусного повреждения эпителия
шейки матки, входит в группу риска по развитию
РШМ. Экспрессия онкобелков, обнаруженная во
второй и третьей группах исследования в 82,4 ±
5,2 % и 81,8 ± 8,2 % случаев соответственно, указывает на то, что основная масса дисплазий является ВПЧ-обусловленной, и у этих пациенток активно идет синтез вирусных белков, обладающих
канцерогенной активностью.
Для оценки уровня онкобелков Е6/Е7 в 1 мл
образца применялся показатель Lg Е7 (табл. 2),
пороговое значение которого для доброкачественных, предраковых и злокачественных процессов
шейки матки в настоящее время не установлено.
Îíêîëîãè÷åñêèé æóðíàë, Ò.4, N¹1 (13), 2010
Òàáëèöà 1
Ðåçóëüòàòû èíôèöèðîâàííîñòè ÂÏ×
Группа
ВПЧ выявлен, %
(количество)
I (82)
39,0 ± 5,4
II (45)
75,6 ± 6,4
III (37)
70,3 ± 6,9
Клин. значим.
концентр, %
78,1 ± 7,1
97,1 ± 2,9
74,1 ± 8,4
ВПЧ в ассоциац., %
Òàáëèöà 2
Ðåçóëüòàòû ýêñïðåññèè îíêîáåëêîâ Å6/Å7 ÂÏ× 16 òèïà
Группы
Экспрессия онкобелков, %
I
66,7 ± 12,2
II
82,4 ± 5,2
III
81,8 ± 8,2
Результаты исследования указывают, что при
доброкачественных изменениях эпителия, ассоциированных с ВПЧ 16 типа, LgЕ7 соответствует
2,31 ± 1,81, при наличии тяжелой дисплазии до лечения — 4,42 ± 1,49, т.е. выше примерно в 2 раза,
а у пролеченных пациенток — 3,52 ± 2,05. Станет
ли измерение концентрации онкобелков Е6/Е7 достоверно информативным методом, покажут дальнейшие исследования, однако полученные нами
результаты обнадеживают.
В табл. 3 представлены результаты бактериологического обследования и уровень рН содержимого влагалища. Из приведенных данных видно,
что половые пути 76,8 % (95 % ДИ 66,2–85,4 %)
клинически здоровых женщин первой группы и
66,7 % (95 % ДИ 51,1–80,0 %) пациенток второй
группы инфицированы условно патогенной флорой. В группе пролеченных женщин этот показатель составил 34,2 ± 7,7 %. У пациенток всех групп
51,6 ± 9,0
35,3 ± 8,2
24,1 ± 7,9
Доминир. тип
ВПЧ 16
48,4 ± 9,0
100 – 2,7
63,0 ± 9,3
Среднее значение Lg Е7, M ± m
2,31 ± 1,81
4,42 ± 1,49
3,52 ± 2,05
отмечено изменение кислотности влагалищного
секрета в сторону ощелачивания (среднее значение PH в группах 6,10 ± 0,06, 6,10 ± 0,08 и 5,90 ±
0,15 соответственно при норме 4–4,5), что свидетельствует о наличии бактериального вагиноза.
Результаты гистологического исследования
фрагментов шейки матки пациенток первой и второй групп указаны в табл. 4. Из представленных
данных видно, что при субклиническом течении
ВПЧ-инфекции преобладают доброкачественные
изменения шейки матки — 84,4 % случаев (95 %
ДИ 67,2–94,7 %); в то же время в 3,7 ± 2,1 % случаев выявлены предраковые изменения эпителия
шейки матки. При наличии CIN III ст. в первичном
биопсийном материале пациенток второй группы
заключительное исследование удаленного конуса
шейки матки после проведенного хирургического
вмешательства позволило выявить наличие инвазивного рака в 2,2 ± 2,2 % случаев.
Òàáëèöà 3
Ðåçóëüòàòû áàêòåðèîëîãè÷åñêîãî èññëåäîâàíèÿ è ðÍ
Группы
Значимого роста нет, %
I
II
III
23,2 ± 4,7
33,3 ± 7,0
65,8 ± 7,7
Ассоциации
микроб. флоры, %
76,8 ± 4,7
66,7 ± 7,0
34,2 ± 7,7
Òàáëèöà 4
Ðåçóëüòàòû ãèñòîëîãè÷åñêîãî èññëåäîâàíèÿ
Хронический
Хронический цервиГруппы
цит с эпидермиз., %
цервицит, %
I
63,4 ± 5,3
21,0 ± 5,2
II
17,8 ± 5,7
15,6 ± 5,4
рН, N 4,0–4,5
6,1 ± 0,5
6,1 ± 0,6
5,9 ± 0,9
CIN I–III ст., %
РШМ, %
3,7 ± 2,1
64,4 ± 7,1
–
2,2 ± 2,2
35
Àêòóàëüíûå ïðîáëåìû îíêîãèíåêîëîãèè
ÂÛÂÎÄÛ
1. В аспекте проведения профилактических
осмотров женского населения с целью ранней
диагностики субликлинических форм ВПЧ-инфекции шейки матки целесообразно применение
кольпоскопии и, в случае выявления патологии,
последующей ВПЧ-диагностики. Это позволяет
своевременно определять степень индивидуального онкологического риска и осуществлять адекватные лечебные мероприятия с целью профилактики развития инвазивного РШМ.
2. Высокий процент инфицированности женщин вирусом папилломы в клинически значимой
концентрации и преобладание ВПЧ 16 типа у пациенток с CIN III ст. до и после органосохранного
лечения, а также сочетание патологии шейки матки с бактериальным вагинозом, указывают на то,
что хирургическое вмешательство не гарантирует
излеченность и не может предотвратить рецидив.
При выборе метода лечения следует учитывать
уровень вирусной нагрузки и проводить коррекцию биоценоза влагалища до и после лечения.
3. Полученные результаты позволяют предположить, что выявление онкобелков Е6/Е7 может
быть использовано в качестве диагностического
критерия неопластических процессов шейкиматки, что даст возможность улучшить диагностику и
36
прогноз течения цервикальной патологии. Однако
для подтверждения этой гипотезы требуются
дальнейшие исследования.
Ñïèñîê èñïîëüçóåìûõ èñòî÷íèêîâ
1. Киселев, В.И. Этиологическая роль вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки: генетические и патогенетические механизмы, возможности
терапии и профилактики / В.И. Киселев, О.И. Киселев //
Гинекология. — 2004. — Т. 6, № 4. — С. 174–180.
2. Wieland, U. Molecular diagnosis of persistent human papilloma virus infections // U. Wieland, H. Pfister //
Intervirology. — 1996. — Vol. 39. — P. 145–157.
3. Moberg, M. Type-specific associations of human
papillomavirus load with risk of developing cervical carcinoma in situ / M. Moberg, I. Gustausson, U. Gyllensten //
Int. J. Cancer. —2004. — Vol. 112, № 5. — Р. 854–859.
4. Глик, Б. Молекулярная биотехнология / Б. Глик, Дж.
Пастернак // Принципы и применение. — М., 2002. —
С. 349–368.
5. Хансон, К.П. Современные представления о канцерогенезе рака шейки матки / К.П. Хансон, Е.Н. Имянитов // Практическая онкология. — 2002. — Т. 3 —
№ 3. — С. 145–154.
6. Киселев, В.И. Взаимосвязь вирусных инфекций,
передаваемых половым путем, и онкологических заболеваний урогенитального тракта / В.И. Киселев, Г.А. Дмитриев, А.А. Кубанова // Вестн. дерматол. — 2000. —
№ 6. — С. 20–23.