ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ «МОСКОВСКИЙ ОБЛАСТНОЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
реклама
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ «МОСКОВСКИЙ ОБЛАСТНОЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ КЛИНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ. М.Ф. ВЛАДИМИРСКОГО» На правах рукописи Дедова Мария Георгиевна МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ КАРТИНА СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ СРЕДНЕЙ И СТАРШЕЙ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП 14.01.30 - геронтология и гериатрия 14.01.03 - болезни уха, горла и носа Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.м.н., профессор С.Н. Шатохина д.м.н. В.И. Самбулов Москва – 2014 г. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ МСКТ – мультиспиральная компьютерная томография МРТ- магнитно-резонансная томография УЗИ – ультразвуковое исследование АБГ - ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина МГ - альфа-2-макроглобулин МТ1-ММР - матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 ИЛ - интерлейкин ЛФ - лактоферрин ТК- тест-карта ДД -Дегенеративно-дистрофический АР- активный рост 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………….......4 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ДИАГНОСТИКЕ И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМАХ РАКА ГОРТАНИ (обзор литературы) ………………..………………………..……...9 1.1. Распространенность рака гортани, возрастной состав и клиникоанатомические особенности……………………………………………………...9 1.2. Современные представления о канцерогенезе и патогенетических механизмах развития рака гортани ……………………………….....................11 1.3. Возможности диагностики рака гортани ……………………..........15 1.4 Значение анализа структур неклеточных тканей человека в диагностике патологических состояний и оценке эффективности лечения ……………………………………………………………………….....................24 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………………………………………..29 2.1. Общая характеристика больных раком гортани …………………………………………………………………………………….29 2.2. Материал для исследования………………………........................... 33 2.3 Методы исследования...........................................................................34 2.4 Статистические методы………............................................................38 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО У БОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ НА ЭТАПЕ ОБСЛЕДОВАНИЯ……………………...................39 3.1 Морфологические маркеры злокачественного роста в сыворотке крови больных раком гортани в зависимости от стадии заболевания ………………………………………………………………………….................39 3 3.2 Морфологический маркер дегенеративно-дистрофического процесса в сыворотке крови больных раком гортани………………………………...........41 ГЛАВА 4. ДИНАМИКА МАРКЕРОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО РОСТА И ДЕГЕНЕРАТИВНО-ДИСТРОФИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА У БОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП НА ЭТАПАХ ЛЕЧЕНИЯ И АМБУЛАТОРНОГО НАБЛЮДЕНИЯ ..............48 4.1. Динамика маркеров злокачественного роста и дегенеративнодистрофического процесса у больных раком гортани разных возрастных групп на этапах хирургического лечения ………………….............…….........49 4.2. Динамика маркеров злокачественного роста и дегенеративнодистрофического процесса у больных раком гортани разных возрастных групп на этапах комбинированного лечения ……….........................................51 4.3. Динамика маркеров злокачественного роста и дегенеративнодистрофического процесса у больных раком гортани разных возрастных групп на этапах лучевой терапии …………………………………...................57 4.4. Морфологический маркер прогрессии рака гортани…………………………………………………………………………....68 ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………...73 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………..…81 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………..83 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………...……..84 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ МСКТ – мультиспиральная компьютерная томография МРТ- магнитно-резонансная томография УЗИ – ультразвуковое исследование АБГ - ассоциированный с беременностью альфа-2-гликопротеин МГ - альфа-2-макроглобулин МТ1-ММР – матриксная металлопротеиназа мембранного типа 1 ИЛ - интерлейкин ЛФ - лактоферрин ТК - тест-карта ДД - дегенеративно-дистрофический ЗР - злокачественный рост ВПР - высокодифференцированный плоскоклеточный рак НПР - низкодифференцированный плоскоклеточный рак УПР - умереннодифференцированный плоскоклеточный рак МСК- морфологическое исследование сыворотки крови 5 Введение В настоящее время во всех странах мира отмечается устойчивый рост онкологической заболеваемости. Одной из причин такой тенденции является постарение населения. Среди злокачественных опухолей Лор-органов первое место по частоте занимает рак гортани - злокачественное новообразование эпителиального происхождения, поражающее различные отделы гортани, способное к экзофитному или инфильтративному росту, дающее регионарные и отдаленные метастазы в процессе развития [90, 113, 47]. Заболеванию более подвержены мужчины ( до 96% случаев) в возрасте от 50 до 70 лет [89, 29, 53]. В общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди мужского населения рак гортани составляет 2,6%, в последние годы отмечается тенденция к неуклонному росту числа больных с этой патологией. Так, по данным Минздрава России, абсолютное число впервые в жизни установленного диагноза рака гортани у мужчин в 2007 г. составило 6138, а в 2012г. – 6346 [44]. Причем, при первичном обращении у 60-70% диагностируется местнораспространенные формы заболевания и только в 30-40% - ограниченные опухолевые поражения [73]. По данным Министерства здравоохранения Московской области заболеваемость раком гортани в 2009 году составила 4,7 на 100 000 человек населения, против 4,4 – в 2007 г. [117]. Анализ современной научной литературы в области диагностики, клиники и лечения больных со злокачественными новообразованиями гортани показывает, что сохраняется целый ряд проблем, связанных, прежде всего, с ранней диагностикой и эффективным лечением указанной патологии. В настоящее время диагностика новообразований гортани включает сбор жалоб, анамнеза, проведение непрямой и прямой ларингоскопии, фиброларингоскопии, лучевые методы исследования гортани 6 рентгенография, томография, КТ, МРТ [14, 15, 39, 54, 67]. Решающее значение при установлении диагноза имеет гистологическое исследование. Несмотря на имеющийся широкий спектр диагностических возможностей в арсенале врача, выявление злокачественного роста на раннем этапе остается актуальной проблемой и на сегодняшний день. Ошибка в диагностике приводит к длительному (от двух неадекватному ведению больных предраком до восьми месяцев) (хронический ларингит, пахидермия, лейкоплакия и др.) и ранним раком гортани, проведению у них неадекватного лечения (противовоспалительного, физиотерапевтического) до развития в большинстве случаев классической клинической картины злокачественного новообразования [132]. Необходимо учитывать, что у 3035% больных заболевание протекает бессимптомно, и, следовательно, выявление у данной категории больных процессов, относящихся к облигатному предраку, позволяют отнести их в группу повышенного онкологического риска для дальнейшего динамического контроля [90]. В ряде случаев, при явной клинической картине опухолевого поражения, не удается получить гистологического подтверждения диагноза, что удлиняет период обследования и приводит к более позднему сроку начала лечения [131]. Успех лечения онкологических больных разных возрастных групп напрямую зависит от сроков выявления опухоли. Особого внимания заслуживает проблема выбора наиболее оптимального метода лечения рака гортани у пациентов старшего возраста. Сопутствующая соматическая патология зачастую ограничивает возможности и утяжеляет прогноз лечения, особенно при распространенных формах заболевания, требующих проведения обширных хирургических операций. Однако борьба со злокачественной опухолью не завершается после проведенного лечения, и перед специалистами встает следующая задача - мониторинг рака гортани в процессе лечения и после его завершения с целью наиболее раннего выявления рецидива заболевания, либо продолженного роста опухоли [124]. 7 Все вышеизложенное обосновывает актуальность поиска новых методов диагностики рака гортани, позволяющих на ранних стадиях заболевания выявлять признаки злокачественного роста, оценивать эффективность терапии и прогнозировать генерализацию онкологического процесса. Цель активности исследования: злокачественного разработать процесса по диагностические морфологической критерии картине сыворотки крови и оценить их значение в выборе оптимального способа лечения для больных раком гортани среднего и старшего возраста. Задачи исследования: У больных раком гортани среднего и старшего возраста: - исследовать анизотропные морфотипы сыворотки крови и оценить их значимость в определении активности злокачественного процесса; - изучить динамику активности злокачественного процесса на этапах обследования, хирургического лечения, лучевой терапии и амбулаторного наблюдения по морфологической картине сыворотки крови; - установить зависимость эффективности хирургического и лучевого лечения от исходного состояния злокачественного процесса (активный рост, дегенеративно-дистрофический процесс); - сопоставить клинические и морфологические признаки прогрессии злокачественного роста. Научная новизна исследования: Впервые у больных раком гортани: - для диагностики и контроля эффективности лечения использована новая диагностическая технология – морфология биологических жидкостей «Литос-система»; - выявлены диагностические критерии активности злокачественности процесса на этапе обследования, а именно – фаза активного роста и дегенеративно-дистрофического состояния; 8 - определены объективные критерии для выбора способа лечения у больных среднего и старшего возраста (хирургический, лучевая терапия); - разработан «Способ диагностики генерализации злокачественного новообразования» (Приоритетная справка на изобретение №2013108715 от 27.02.2013). Практическая значимость Морфологическое исследование сыворотки крови больных раком гортани на этапе обследования позволяет определить активность опухолевого процесса, что может служить одним из объективных критериев выбора вида лечения. Использование данного исследования в ходе лечения и после его завершения позволяет контролировать эффективность лечения и выявлять ранние признаки генерализации процесса. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Морфологическое исследование сыворотки крови больных раком гортани позволяет определить активность злокачественного процесса у больных разных возрастных групп, что может служить одним из объективных критериев выбора наиболее эффективного способа лечения; 2. Наличие в составе морфотипов сыворотки крови больных раком гортани «волнистого» микросферолита является ранним признаком прогрессии злокачественного роста. Внедрение в практику Результаты исследования внедрены и применяются в работе оториноларингологических отделений: ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, МБУЗ «Дзержинская городская клиническая больница», МБУЗ «Видновская районная клиническая больница», МБУЗ «Домодедовская центральная городская больница». Апробация работы Основные положения и результаты работы доложены и обсуждены на XI Российском конгрессе оториноларингологов «Наука и практика в оториноларингологии» (Москва 2012 г.); Петербургском форуме 9 оториноларингологов России (Санкт-Петербург, 2013 г.); I Междисциплинарном конгрессе по заболеваниям органов головы и шеи Медицина XXI века - междисциплинарный подход к патологии органов головы и шеи. Опухоли головы и шеи. Москва, 29 мая 2013 г.; Заседании Московского областного общества оториноларингологов. Москва, 7 февраля 2013 г. Публикации По теме диссертации опубликовано одиннадцать печатных работ, из них три в изданиях, рекомендуемых ВАК. Подана заявка на патент РФ (регистрационный номер 2013108715, дата подачи заявки 27.02.2013). Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, включающий 232 источника (149 - отечественных и 83 - зарубежных). Работа иллюстрирована 26 рисунками, содержит 13 таблиц. 10 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ДИАГНОСТИКЕ И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМАХ РАКА ГОРТАНИ (обзор литературы) В последние годы отмечается рост заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований. По прогнозам ВОЗ к 2030 г. ожидается трехкратное увеличение данных показателей. Наряду с экологичискими экономическими и другими факторами важное место в формировании такой тенденции занимает постарение населения. Рак гортани занимает первое место среди злокачественных опухолей лор-органов. На его долю приходится до 60% всех злокачественных опухолей головы и шеи. Наиболее высокая заболеваемость отмечается среди мужчин в возрасте от 60 до 70 лет [24,44,131, 136]. 1.1. Распространенность рака гортани, возрастной состав и клинико-анатомические особенности. Рак гортани составляет 2,6%, в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди мужского населения. В России абсолютное число впервые в жизни установленного диагноза у мужчин в 2012г. возросло до 6346 случаев по сравнению с 6138 в 2007г. [44]. В Московской области в 2007 году заболеваемость раком гортани составила 4,4 случая на 100 000 населения, а в 2009 возросла до 4,7 [117]. Проблема рака гортани актуальна и во всем мире. Первое место по заболеваемости раком гортани занимают Таиланд, Польша. Высокая заболеваемость отмечается в Италии, Испании, Франции. Более благополучная ситуация в Норвегии, Швеции, Японии, где заболеваемость составляет менее 2 человек на 100 000 населения [130,135]. 11 Заболеванию более подвержены мужчины - 96% в возрасте от 50 до 70 лет [29,44,89,53]. Известно, что 98% заболевших раком гортани имеют многолетний стаж курения [163,182]. В настоящее время наблюдается тенденция к увеличению заболеваемости раком гортани у женщин и омоложению рака. Повидимому, сказывается распространение табакокурения среди данных категорий населения. Среди детского населения рак гортани встречается крайне редко, обычно развивается на фоне длительно протекающего папилломатоза гортани. Известно, что рак гортани редко развивается в здоровом органе. Чаще ему предшествуют пролиферативные хронические тканевые атрофически-дегенеративные изменения, а также и некоторые доброкачественные опухоли [26,159]. Так, хронический гиперпластический ларингит, по данным разных источников, встречается в популяции от 30 до 65%, при этом малигнизация происходит у 3 - 35% больных в сроки от 6 месяцев до 7 лет. Частота встречаемости лейкоплакии гортани составляет 15,7-20,5% случаев, при этом озлокачествление происходит в 8 - 35% от 9 мес. до 9 лет. На фоне пахидермии рак развивается в 16,6% случаев в сроки от 1 года до 4 лет. Озлокачествление папиллом гортани при длительности заболевания от 2 лет до 12 колеблется от 8 до 28% [45, 146, 205]. Среди злокачественных новообразований гортани в 95-98% развивается плоскоклеточный рак. Неэпителиальные опухоли составляют 5% (хондросаркомы, фибросаркомы, лимфосаркоы, злокачественные шванномы и меланомы) [14, 29, 90]. В зависимости от формы роста различают экзофитные, встречающиеся в 19,7% случаев, эндофитные - 21.1% и наиболее распространенные смешанные формы рака гортани - 59,2% [53]. Клиническое локализацией течение (надскладковый, опухолевого складковый, процесса определяется подскладковый отделы 12 гортани), что обусловлено различием слизистой оболочки, подслизистого слоя, лимфообращения и другими особенностями. Наиболее благоприятно, с медленным темпом роста и сравнительно редким метастазированием (от пяти до 12%) протекает рак складочного отдела гортани, что обусловлено малым количеством лимфатических кровообращением голосовых складок. узлов и слабо развитым Наиболее злокачественно, с высокой частотой метастазирования, процесс протекает при поражении вестибулярного отдела, чему способствует развитая лимфатическая сеть. Рак подскладочного отдела, в виду отсутствия вовлечения в процесс голосовых складок, распознается поздно [90]. Чаще поражается надскладочный отдел гортани 50-70%, складочный - 30-40% и, реже всего, подскладочный отдел - у 3-5% больных [46,90,224]. Метастазирование в отдаленные органы при раке гортани происходит редко (1-9%), в основном, лимфогенным путем, чаще у молодых. Органами мишенями являются легкие, реже - средостение, плевра, печень [29, 89, 90,130]. 1.2. Современные представления о канцерогенезе и патогенетических механизмах развития рака гортани. В 70-е годы 20 века в составе высокоонкогенных вирусов были открыты особые последовательности нуклеотидов, получивших название - онкогены. Оказалось, что роль опухолеродных вирусов заключается в способности вносить выделенные гены в генетический аппарат нормальных клеток. В дальнейшем и в геноме позвоночных были выявлены двойники вирусных онкогенов. Последующие молекулярные исследования показали, что вирусные онкогены происходят от нормальных клеточных генов протоонкогенов. Позже были выделены десятки протоонкогенов, не имеющих вирусных аналогов. Открытие онкогенов позволило установить принципиальное сходство и однотипность спонтанного, химического, радиационного и вирусного канцерогенезов [37]. 13 Протоонкогены всегда присутствуют в любой нормальной клетке. В эмбриональный период они обеспечивают условия для интенсивного размножения и нормального развития организма, в постэмбриональном периоде большая их часть оказывается в репрессированном состоянии, остальные обеспечивают лишь периодическое обновление клеток [115]. Белковые продукты протоонкогенов – онкобелки, являются основным пусковым компонентом в цепи событий, приводящих к клеточной пролиферации. В нормальных клетках протоонкогены контролируются генамисупрессорами (антионкогенами), являющимися частью системы репарации структуры ДНК. Функция системы репарации заключается в распознавании и восстановлении мутированных и измененных участков ДНК. Если же, по каким-то причинам, репарационно-восстановительная система не справляется и повреждения ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется программа апоптоза. Явление апоптоза открыл в 1972 году J. Kerr (от греч apoptosis- опадание), определив его как запрограммированную гибель клетки. Таким способом осуществляется удаление клеток, чье выживание нежелательно: чужеродных, дефектных клеток с поломками в генетическом аппарате. Посредством апоптоза происходит замена «отработанных» клеток, что обеспечивает поддержание генетического гомеостаза. Программа апоптоза регулируется геном-супрессором р53, который кодирует выработку онкобелка р53.При повреждении в структуре ДНК, ген р53 активируется восстанавливается и блокирует поврежденный клеточный участок цикл, ДНК, в либо результате запускается апоптозный каскад. При мутации-инактивации гена р53, повышается количество белка мутированного типа - mt p53, при этом не происходит запуска апоптоза, а клетки с поврежденными ДНК сохраняются. Обнаружение мутированного mt p53 является неблагоприятным признаком, такие опухоли отличаются устойчивостью к лучевой терапии. 14 Другой группой протоонкобелков, участвующих в регулировании апоптоза являются белки группы bax. Часть белков этого семейства является индукторами апоптоза, а часть ингибиторами. Соотношение количества различных форм онкобелков группы bax и р53 определяет судьбу клетки жизнь или смерть [20]. Пусковым механизмом канцерогенеза является активация онкогенов и инактивация антионкогенов в результате мутаций, которые происходят под действием самых различных канцерогенных факторов - вирусных, химических, физических, физико-химических и др. Экспрессия онкогенов в опухолевых клетках на стадии предрака, как правило, опережает наступление морфологической атипии клеток [160]. Для возникновения злокачественной опухоли необходимо наличие мутаций как минимум в 4-5 генах. Тогда как доброкачественные могут развиться при мутации в 1-2 генах [221]. В настоящее время доказана многостадийность канцерогенеза. Принято выделять 3 фазы: инициация, промоция и прогрессия. Нарушения генотипа клетки происходят уже в первую фазу, вследствие чего она переходит к предрасположенному к трансформации состоянию. В фазу промоции под действием промотера (канцерогены, гормоны, поваренная соль, некоторые лекарственные вещества) происходит превращение инициированных клеток в опухолевые с последующим отбором клона жизнеспособных опухолевых клеток. Эта фаза до определенного момента обратима. При прекращении действия промотера возможна регрессия опухоли. Первые две стадии являются доклиническими, и только фаза прогрессии проявляется в формировании опухоли. Для перехода неопластического процесса в фазу прогрессии необходимо несколько повторных мутаций (происходящих при инициации) и /или активации генов-модуляторов. При прогрессии опухоли происходит гиперэкспрессия специфических онкогенов, утрата и изменение многих ферментативных систем клетки, изменение количества и локализации 15 регуляторных белков, клеточных рецепторов, происходит упрощение антигенных свойств опухоли [20]. Согласно теории прогрессии опухолей, которая была разработана L. Floulds в 1969 г. на основе экспериментальной онкологии происходит постоянный стадийный прогрессирующий рост опухоли, повышение ее злокачественности и метастазирование за счет необратимого качественного изменения одного или нескольких свойств неоплазии [48, 65]. В жизни опухоли условно выделяют стадию инвазии, которая в свою очередь проходит три фазы и стадию метастазирования. В первую фазу инвазии опухоли происходит снижение концентрации адгезивных молекул, повышается отрицательный заряд клеток за счет снижения количества ионов кальция на их поверхности. Все это приводит к ослаблению контактов между клетками, с другой стороны - усиливается экспрессия молекул, обеспечивающих рецепторов, мобильность служащих для опухолевых прикрепления клеток клеток и интегриновых к компонентам экстрацеллюлярного матрикса - коллагенам, фибронектину, ламинилу. Во второй фазе инвазии происходит деградация экстрацеллюлярного матрикса протеолитическими ферментами, секретируемыми опухолевыми клетками. Так освобождается путь для инвазии. В третью фазу инвазии происходит передвижение опухолевых клеток в зону деградации при помощи продуктов деградации - фибронектина и ламинила. Затем весь процесс повторяется. Стадия метастазирования - заключительная стадия морфогенеза опухоли, она также сопровождается определенными гено- и фенотипическими перестройками опухоли, направленными на обеспечение распространения опухолевых клеток из первичной опухоли в другие органы [48]. Значительная часть клеток злокачественной опухоли может исключаться из пролиферативного пула и находиться в фазе покоя. Причиной снижения темпов роста опухоли может быть и гибель клеток 16 вследствие апоптоза и некроза, из-за воздействия иммунологических факторов и недостаточного кровоснабжения. Доля некротизированных клеток растет по мере увеличения размеров опухоли [91]. Дальнейшее развитие опухоли сопровождается метаболическими нарушениями в организме. В их основе лежат нарушения, обусловленные непрямым воздействием процессов, иммунных новообразования: конфликтов дисбалансом «опухоль-организм», обменных эктопическим образованием гормоноподобных полипептидов, которые в норме не продуцируются. Эти симптомы связаны с появлением опухоли и исчезают после ее удаления. Анализируя литературные данные о канцерогенезе можно сделать вывод, что имеющиеся диагностические методы позволяют выявлять онкологический процесс только на заключительной - необратимой стадии канцерогенеза, при уже имеющейся клеточной атипии. Молекулярные изменения в клетке на стадии предрака, составляющие при раке гортани от нескольких месяцев до нескольких лет, остаются недоступными для современных диагностических методов [90]. На сегодняшний день сложно прогнозировать течение онкологического заболевания и осуществлять контроль эффективности лечения. Остается актуальной проблема поиска методов, позволяющих определить активность опухолевого процесса, что может служить объективным критерием для определения тактики лечения. В связи с этим, в своих исследованиях по диагностике, оценке эффективности терапии больных раком гортани, мы использовали новую диагностическую неклеточных тканей организма технологию – морфологию - Литос-систему, которая позволяет наблюдать патологический процесс на любой стадии развития на уровне молекулярных взаимодействий. 1.3. Возможности диагностики рака гортани. Диагностика новообразований гортани включает сбор жалоб, анамнеза заболевания, проведение непрямой, а, в ряде случаев, прямой ларингоскопии, 17 фиброларингоскопии, стробоскопии. Для определения локализации и распространения опухоли, наиболее полную информация предоставляют лучевые методы исследования (рентгенография, томография, КТ, МРТ). В последние десятилетия активно развивается метод эндоскопической флуоресцентной диагностики. Решающее значение, при установлении диагноза, имеет гистологическое исследование. Для выявления метастазирования в регионарные лимфатические узлы и другие органы применяется УЗИ, радионуклидная диагностика [39, 180]. В сомнительных случаях проводится гарпунная чрескожная биопсия лимфатического узла под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием [19, 207]. Несмотря на имеющийся широкий спектр диагностических возможностей в арсенале врача, процент диагностических ошибок на догоспитальном этапе остается высоким, составляя 30-35%, а выявление злокачественных новообразований на раннем этапе остается актуальной проблемой и на сегодняшний день [129]. Наиболее распространенный метод осмотра гортани – непрямая ларингоскопия не всегда позволяет полноценно визуализировать все отделы. Гортанная поверхность надгортанника, комиссура, подскладковый отдел зачастую бывают плохо обозримы при зеркальном осмотре. Диагностические ошибки в этом случае могут достигать до 50%. Фиброларингоскопия заболеваний гортани, труднообозримые при значительно позволяя непрямой повышает досконально диагностику осмотреть ларингоскопии. Однако, отделы, если хронические процессы в гортани имеют четкую эндоскопическую картину, то участки злокачественной трансформации слизистой оболочки на фоне хронического заболевания практически невозможно дифференцировать визуально [129, 83]. Применение флуоресцентной эндоскопии расширило возможности диагностики злокачественных новообразований гортани. Метод основан на 18 избирательном накоплении флюоресценции эндогенных и экзогенных фотосенсибилизаторов в опухолевых тканях при возбуждении их светом в диапазоне 380-460 нм [132,147]. В последние годы при эндоскопии используется метод осмотра в узкоспектральном пучке. Суть метода состоит в контрастировании капиллярного рисунка слизистой оболочки при освещении ее световым пучком с узким спектром и длиной волны 415+ - 15 нм [129, 104]. Проведение микроларингоскопии, самостоятельно или в сочетании с пробой с толуидиновым синим, позволяет выявлять предраковые изменения в гортани. Раковые клетки отличаются большим количеством РНК и ДНК, а толуидиновый синий имеет тропность к аминокислотам. В результате, при обработке слизистой оболочки гортани толуидиновым синим, происходит окрашивание раковых клеток в фиолетовый цвет. С этих участков проводится прицельная биопсия [53]. Однако в виду высокой стоимости исследования, далеко не все оториноларингологические отделения, а тем более поликлинические Лор-кабинеты оснащены соответствующим оборудованием, что на данном этапе ограничивает использование этих методов. Ультразвуковое исследование позволяет визуализировать гортанные структуры, оценить инвазию злокачественного процесса в хрящи гортани, преднадгортанниковое и подскладковое пространство, в корень языка, щитовидную железу и лимфатические узлы шеи. Особенно значима его роль при эндофитной и смешанной формах рака. Чувствительность в этих случаях составляет 92,7% и 91,4%. Но при малых размерах опухоли, экзофитной форме роста, остром угле щитовидного хряща и окостенении его, возможности данного метода ограничены. Кроме того, остается не решенным вопрос об эффективности метода в дифференциальной диагностике рака гортани и гиперпластических процессов [80, 123]. Ведущим методом в рентгенодиагностике гортани, в настоящее время, является мультиспиральное компьютерно-томографическое 19 исследование (МСКТ), позволяющее получить изображение костных и мягкотканных структур, оценить распространенность процесса, состояние окружающих мягких тканей. П.В. Васильев и А.Л. Юдин (2007) в своих исследованиях определили дифференциальную критерии, диагностику позволяющие воспалительных и проводить опухолевых изменений. Авторы показали, что при проведении МСКТ с внутривенным контрастированием, у больных хроническим гиперпластическим ларингитом отсутствуют гиперваскулярные участки в гортани с инфильтрацией подлежащих тканей, характерные для злокачественного процесса. По данным литературы, чувствительность МСКТ составляет 100%, специфичность 93,5%, а точность 95% [15, 16, 173]. Также в диагностике рака гортани с успехом используется магнитно-резонансная томография (МРТ). По данным ряда авторов, МРТ обладает более высокой чувствительностью, чем МСКТ при поражении хрящей [67, 157, 158]. Отдельной проблемой является верифицированном диагнозе рака выявление метастазов при гортани. Применяемые методы УЗИ, МСКТ, МРТ малоинформативны при микрометастазах, когда имеются лишь скопления опухолевых лимфатического узла. В клеток при решении неизмененной данной структуре проблемы хорошо зарекомендовал себя метод выявления сторожевого узла с использованием непрямой лимфосцинтиграфии [137]. Заключительным цитологическое и этапом в гистологическое постановке исследование диагноза [19]. является Но, если верификация процесса при инвазивном росте не составляет трудностей, то дифференциальная диагностика дисплазии и карциномы in situ нередко вызывает сложности [29]. Гистологический диагноз рака гортани удается установить в 80% случаев. В остальных случаях диагноз поставить затруднительно, биопсийного что обусловлено материала. Это трудностями зависит от при получении гистологической формы, 20 локализации процесса, степени дифференцировки опухоли и качества приготовления препарата [90]. В последние годы онкоморфология пополнилась новыми знаниями. Внедрение иммуногистохимического метода значительно повысило уровень диагностики онкологических заболеваний в целом. Метод позволяет не только проводить диагностику опухоли, но и определить прогноз заболевания и чувствительность клеток к химиолучевой терапии [25, 203, 151, 156]. Все приведенные выше методы позволяют выявлять уже сформированное новообразование. Минимальная масса опухоли, которая может быть визуализирована, составляет примерно 1 г (109 клеток или 30 последовательных удвоений исходной онкологической клетки). Совместимой с жизнью является опухоль массой не более 1 кг, что составляет 1012 клеток. Следовательно, визуализировать опухоль возможно 109 и 1012 клеток, что составляет всего 10 циклов в периоде между удвоения. Таким образом, опухоль на протяжении 1/4 части жизненного цикла остается недоступной для перечисленных методов диагностики [18]. Согласно современным представлениям формирование опухоли происходит только в о канцерогенезе, третью стадию - стадию прогрессии. Первые две стадии: инициация и промоция, являются доклиническими, а, следовательно, не диагностированными, хотя процесс трансформации клеток в опухолевые уже запущен, но еще является обратимым [84, 20]. Одним из направлений поиска диагностических методов, которые позволили бы выявлять онкологический процесс еще до формирования визуально наблюдаемого новообразования, стало исследование биологических жидкостей с целью выявления компонентов, указывающих на присутствие в организме пациента злокачественного процесса. Такими компонентам являются продукты измененного метаболизма опухолевых клеток (онкомаркеры). К маркерам злокачественного роста относят 21 вещества различной природы. В их число входит более 200 соединений. Часть из них специфичны только для одного вида опухоли, другие являются неспецифичными, т.е. встречаются при различных опухолях, либо продуцируются при заболеваниях неопухолевой природы [140, 21]. Все онкомаркеры можно подразделить на следующие классы: ассоциированные с опухолью антигены или антитела к ним, продукты распада опухолей белковой природы, гормоны, ферменты, продукты азотистого обмена (креатинин, гидроксипролин, полиамины), нуклеиновые кислоты (свободная ДНК), специфические белки плазмы крови (ферритин, церуллоплазмин, бета-2-микроглобулин). Концентрация онкомаркеров коррелирует с массой опухоли, ее пролиферативной активностью, а в некоторых случаях – со степенью злокачественности новообразования [60, 154, 165, 227]. Определение опухолевых маркеров позволяет диагностировать опухоль в организме на ранних стадиях, а исследование в динамике дает возможность мониторировать течение заболевания, помогая в выборе тактики лечения. Так, при эффективном лечении отмечается снижения уровня маркера, а нарастание опухолевого маркера свидетельствует о развития заболевания или метастазировании, позволяя обнаружить метастазы за 4-6 месяцев до их клинического проявления. Однако до сих пор нет ни одного опухолевого маркера, обладающего 100%-й диагностической чувствительностью и 100%-й специфичностью по отношению к какому-либо одному органу. Повышение концентрации онкомаркеров могут наблюдаться и при доброкачественных заболеваниях. В раннем послеоперационном периоде и при проведении специфической терапии отмечается повышение концентрации онкомаркеров, что обусловлено некрозом ткани опухоли и высвобождением из нее онкомаркеров в кровяное русло. Повысить эффективность диагностики можно путем использования комбинации разных опухолевых маркеров [65, 189, 170, 198]. 22 Применительно к раку гортани установлено повышение концентрации ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (АБГ) в 88% случаев. Определение же АБГ и альфа-2-макроглобулина (МГ) в крови позволяет месяцев обнаружить до 90% рецидивов за несколько подтверждения диагноза другими традиционными методами [77]. В.Д. Осипов (2006) в своей работе выявил повышение АБГ при предраке и раке, при этом уровень МГ, напротив, снижался. Эффективное лечение приводило к нормализации концентрации обоих белков. В качестве молекулярных маркеров высокого риска прогрессии и рецидивирования рака гортани, предлагают использовать изменение уровня экспрессии гена контактина (CTTN), картированного на 11 хромосоме, феномен потери гетерозиготности генов-регуляторов клеточного цикла и онкосупрессоров, делеция которых может инициировать процесс малигнизации [150, 176, 211, 230]. Наиболее перспективным в решении проблемы прогнозирования течения рака, по данным одних авторов, является уровень экспрессии матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 (МТ1-ММР). Другие авторы предлагают использовать в качестве фактора прогноза общей выживаемости больных раком гортани уровень экспрессии гена NF-kB, генов ингибиторов циклинзависимых киназ и циклинов А и Е [153, 193, 212]. В последнее время придается большое значение роли цитокинов в патогенезе опухолевой прогрессии - интерлейкинам, интерферонам, факторам роста и т.д. Интерлейкины (один из подклассов цитокинов) включаются во все этапы системного и местного иммунного ответа. При развитии злокачественного процесса имеется угроза нарушения любого из этих этапов. Центральное место в перечне причин развития опухоли принадлежит дисбалансу в системе цитокинов. Одну из ключевых ролей в онкогенезе имеют провоспалительные цитокины - интерлейкин 1 и 6 (ИЛ-1, ИЛ-6). ИЛ-1 и ИЛ-6 часто 23 продуцируются опухолевыми клетками меланомы, плоскоклеточной карциномы с различной локализацией и др. [9,78]. А.В.Махов (2003), изучая острофазовые регуляторные белки - МГ, лактоферрин (ЛФ), а также ИЛ1 и ИЛ6, отметил снижение концентрации МГ сыворотки крови при предраке и повышение при раке гортани по сравнению со здоровыми людьми, причем с нарастанием процесса выявлена тенденция к повышению МГ до тех пор, пока идет рост опухоли. В стадии замедления роста опухоли количество МГ приходит к норме. Это объясняется тем, что при росте опухоли происходит не только образование новых опухолевых клеток, но и их разрушение, что сопровождается повышением протеаз и выбросом их в кровеносное русло. Этим же объясняется и нормальные значения МГ у ряда больных с развернутой картиной рака (1/5 всех исследований). Снижение уровня МГ при предраке объясняется его участием в образовании комплексов с различными биологическими факторами, продуцирующимися в течение воспалительной реакции. Автор делает предположение, что здесь проходит граница воспалительной реакции и процесса малигнизации. После окончания курса лечения рака гортани (комбинированное) в течение 18 месяцев концентрации МГ оставались повышенными. По данным тех же исследователей повышение концентрации лактоферрина (ЛФ) в сыворотке крови больных предраком и раком гортани не позволяет дифференцировать эти процессы. С другой стороны, у части больных раком гортани регистрировались нормальные значения ЛФ, что являлось плохим прогностическим признаком, а при высоких показателях ЛФ отмечено более гладкое течение послеоперационного периода, особенно при 3 стадии рака гортани. Содержание ИЛ 1 в крови при предраке повышается, что объясняется авторами достаточной реактивностью организма, а при раке гортани снижается за счет несостоятельного ответа иммунной системы на развивающуюся опухоль. Напротив, содержание ИЛ 6 в крови при предраке 24 понижается, видимо за счет участия его в образовании комплексов с МГ, а при раке - повышается, т.к. добавляется доза этого интерлейкина, продуцируемая самими клетками опухоли [74]. Приведенные литературные данные свидетельствуют о том, что ни один из применяемых в настоящее время молекулярных маркеров злокачественного роста при раке гортани не является идеальным. Существующие методы диагностики не позволяют определить, в какой фазе жизни находится опухоль в момент исследования (рост, стабилизация, деградация), когда происходит начало метастазирования, т.е. когда метастаз представлен лишь группой клеток. И, наконец, широкому применению молекулярно-генетических методик препятствует их высокая стоимость [38]. Несмотря на появление большого количества новых диагностики рака гортани, анализ результатов методов лечения и показателей смертности от рака гортани, проводимые в США и нашей стране, не выявил улучшения ситуации по данной проблеме [44, 134, 218]. Так, более 60% новообразований гортани выявляются в III - IV стадиях, только в 23,9% диагностируется I стадия процесса (чаще это поражение складкового отдела), а рак in situ выявляется в 2,3- 6% случаев [130, 131, 214]. Следствием поздней диагностики рака гортани является высокая смертность больных в течение первого года после установления диагноза – 33% [57]. Вместе с тем, ведущую роль в успехе лечения и реабилитации больных, играет ранняя диагностика опухолевого процесса [47, 175, 172]. Если при начальных стадиях возможно проведение консервативного лечения либо органосохраняющих операций, то дальнейшее развитие процесса требует проведения комбинированного лечения, включающего хирургическое вмешательство в большем объеме, приводящее к инвалидизации больного [81]. Еще более важное значение ранняя диагностика имеет старшего возраста, так как у больных сопутствующая комплексная соматическая патология ограничивает возможности противоопухолевого лечения. Так, при I-II стадиях рака гортани у 80-86 % больных удается достичь 25 положительного эффекта при лучевой терапии, 5-летняя выживаемость среди этой группы составляет 88-97%, а частота рецидива - 18%. При Т3N0M0 после комбинированного лечения 5-летняя выживаемость достигает 60%, при Т4 - 34,0% [122, 127, 152]. Другой актуальной проблемой является мониторинг рака гортани в процессе лечения и после его завершения. В этом направлении также активно ведутся поиски новых возможностей [124]. Анализируя все вышеизложенное можно заключить, что на сегодняшний день актуальность проблемы дальнейших исследований в области диагностики и прогнозировании течения рака гортани не вызывает сомнений. 1.4. Значение анализа структур неклеточных тканей человека в диагностике патологических состояний и оценке эффективности лечения. Явление кристаллизации жидкостей достаточно давно изучается учеными разных отраслей науки. В 1804 г. ученик М.В. Ломоносова Т.Е. Ловиц впервые описал два способа анализа химических веществ по их кристаллографическим признакам: «метод микрокристаллических реакций» и метод «выветренных солей» [109]. Но только в 40-50 годы прошлого столетия стали рассматриваться возможности получения диагностической информации из кристаллизатов биологических жидкостей. Первым в диагностических целях был использован метод тезиграфии. Суть тезиграфии состоял в том, что при добавлении в биологическую жидкость кристаллообразующего вещества – дигидрата хлорида меди (CuCl2х2Н20) происходят изменения в нормальном образовании кристаллов. Изменения кристаллов дигидрата хлорида меди оценивали макро- и микроскопически. Впервые голландский ученый Daems в 1965 году обнаружил различия в форме кристаллов дигидрата хлорида меди при добавлении к ней гемолизированой крови здоровых людей и больных с гипертрофией и карциномой простаты. В 1969 г. была опубликована работа М.П. Кузина и А.В. Галкина, применивших этот метод для сортового 26 различия плодов [41]. В дальнейшем стали изучаться возможности применения кристаллографии в медицине для диагностики различных заболеваний, о чем свидетельствует ряд публикаций [85, 126, 138]. И.Л. Теодор и группа исследователей модифицировали тезиграфический метод, предложив метод кристаллических налетов: биопсийный материал погружался в физиологический раствор на 0-15 мин, к полученному смыву добавляли дигидрат хлорида меди, пропускали через тонкопористый бензольный фильтр, высушивали в термостате, получая при этом «кристаллический налет» [126]. В последующем стали исследовать кристаллограммы биологических жидкостей без добавления кристаллообразующих веществ - нативная кристаллография (107, 7, 33). Л.В. Савина и соавторы предложили кристаллооптический способ [107]. Авторы исследовали сыворотку крови в проходящем или поляризационном свете, высушенную под покровным стеклом в термостате в условиях вакуума. Полученные «модельными композитами» кристаллограммы сравнивали с (кристаллограммы, приготовленные из сыворотки здоровых людей, обогащенных растворами щавелевой, мочевой кислот, глицина, холестерина и др.). Параллельно исследовали сыворотку тех же больных на содержание щавелевой и мочевой кислоты, креатинина, холестерина, глицина, кальция стандартными лабораторными методами. Таким образом были выявлены типовые микровключения при различных нарушениях метаболизма. В литературе встречается целый ряд публикаций, изучению процессов, биологической жидкости происходящих [101]. при Однако посвященных дегидратации данные работы капли имеют описательный характер и не нашли клинического применения. С 1986 г. С.Н. Шатохиной стали проводиться исследования структур биологических жидкостей без добавления какого-либо кристаллообразующего вещества. Отправной точкой данной работы 27 явилась закономерность, наблюдаемая в природе при кристаллизации магмы вулканического происхождения, при которой имеют место три стадии образования твердого вещества (при взаимодействии металлов и органических примесей): первая – идеоморфная (идеальный кристалл); вторая – стадия борьбы; третья – аморфная стадия. Увидеть эти три стадии в виде морфологических структур С.Н. Шатохиной удалось при дегидратации сыворотки крови, разведенной физиологическим раствором хлорида натрия. Дальнейшие исследования, проводимые С.Н. Шатохиной совместно с академиком РАМН, проф. В.Н. Шабалиным позволили изучить процессы, происходящие в капле биожидкости при дегидратации с позиций синергетики – науки, изучающей процессы самоорганизации сложных систем [141, 142]. Авторами впервые было объяснено формирование зон при дегидратации капли биологических жидкостей, определены стандартные условия дегидратации, даны названия методам - метод клиновидной и метод краевой дегидратации, высушенной капле – фация (от греч. фация – форма), показано значение аутоволновых взаимодействий, происходящих в процессе дегидратации биологических жидкостей в норме и при различной патологии. Методом клиновидной и краевой дегидратации С.Н. Шатохиной и В.Н. Шабалиным изучены структуры морфотипов более 50 000 образцов различных видов биожидкости: сыворотки крови, мочи, слюны, цереброспинальной жидкости, влаги передней камеры глаза, слезы, желудочного сока, желчи, синовиальной жидкости и др.[144]. Ими и их учениками был разработан целый ряд методов диагностики различных патологических состояний, нашедших большое практическое применение в различных обоснования областях медицины. механизмов Если дегидратации по поводу в капле теоретического биожидкости продолжаются активные споры не только между медиками, но и физиками, то факт специфических изменений фаций биожидкостей при различных патологических состояниях признается всеми исследователями [125,149]. 28 Метод краевой дегидратации биологических жидкостей, позволяющий в течение длительного времени переводить структуру жидкокристаллического вещества в кристаллическую, позволил наблюдать в поляризованном свете морфотипы, сформированные структурами белковых и липидных молекул. Это и есть те структуры, которые являются важнейшими составляющими клеток организма – мембраны, ДНК и других ультраструктур, т.к. известно, что биологическая жидкость представляет собой лиотропный жидкий кристалл - структурно упорядоченные растворы различных биологических молекул, в том числе липидов. Липиды являются амфифильными молекулами, т.е. молекулами, имеющими растворимую и нерастворимую в воде части. Нерастворимая часть ориентирует молекулу липида в воде и придает раствору двулучепреломляющие оптические свойства (свойство, характерное только для кристаллов). Существование жидких кристаллов – веществ, одновременно обладающих свойствами жидкости и кристалла, было установлено еще в 1888 г. австрийским ученым-ботаником Ф. Рейнитцером. В последующем было выделено термотропных, 2 класса обладающих жидких кристаллов: анизотропией однокомпонентных (двулучепреломление свойство, характерное для кристаллов) и лиотропных - – жидкостей, состоящих из двух или более компонентов, являющихся неоднородными [32]. Любые мгновенно изменения в процессе проявляются в изменении жизнедеятельности характера организма упорядоченности лиотропных жидких кристаллов. При переходе биожидкости в твердую фазу эти изменения становятся доступными для визуального наблюдения. На сегодняшний день оба метода морфологического исследования биологических жидкостей сформировано в качестве новой диагностической технологии – морфологии биологических жидкостей Литос-система, имеет официальное разрешение для практического использования, налажен выпуск специальных наборов для постановки ее методов [142]. В настоящее время 29 создан НИИ морфологии неклеточных тканей живых систем, а анализ структур неклеточных тканей организма (биологических жидкостей) широко используется специалистами различных отраслей медицины в диагностике заболеваний и контроле эффективности проводимого лечения [5, 31, 97, 110, 128]. Технология «Литос-система» стала изучаться и в диагностике онкологических заболеваний. На сегодняшний день имеются публикации, в которых анализируются возможности морфологического исследования сыворотки крови в диагностике и оценке степени риска злокачественного роста [143]. Изучение вопросов диагностики, оценки эффективности лечения больных раком гортани с помощью новой диагностической технологии ранее не проводилось. С учетом роста заболеваемости данной патологией нам представилось перспективным дегидратации сыворотки крови оценить возможности больных раком гортани метода краевой в диагностике, контроле эффективности проводимого лечения и амбулаторном наблюдении онкологических больных после лечения в разных возрастных группах. 30 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Настоящая работа проводилась на базе ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (директор – член-корр. РАМН, профессор Г.А. Оноприенко) 2.1. Общая характеристика больных раком гортани В ЛОР-отделении МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, в период с февраля 2011 г. по март 2013 г., проведено обследование и лечение 70 больных раком гортани. Основную часть больных составляли мужчины значительно реже рак гортани диагностировался у (n=66, 94%), женщин (n=4, 6%). Возраст пациентов варьировал от 44 лет до 81 года. В зависимости от возраста больные были распределены на две группы: - I группу - составили 32 пациента (46%) в возрасте от 44 до 59 лет, - II группу - 38 человек (54%), старше 60 лет. Критериями исключения больных из проводимого исследования являлись наличие у них доброкачественной или злокачественной опухоли любой другой локализации. Длительность заболевания (от появления первых клинических признаков патологии гортани до поступления в ЛОР-отделение МОНИКИ им М.Ф. Владимирского) менее шести месяцев отмечена у 24 человек (34%), от шести месяцев до одного года - у 28 больных (40%) , более одного года – у 18 (26%). По стадиям заболевания пациенты распределились следующим образом (табл. 1). 31 Таблица 1. Распределение больных по стадиям онкологического процесса Стадии рака гортани Количество больных I Т1N0М0 4 (6%) II Т2N0М0 15 (21%) III Т3N0М0; Т3N1М0 37 (53%) IV Т3N2М0; Т4N0М0; Т4N1М0; 14 (20%) Т4N2М0 Всего больных 70 (100%) Наиболее чаще (в 73%) рак гортани был диагностирован на III, IV стадиях. Такая картина поздней диагностики рака гортани соответствует данным мировой статистики. При анализе распределения больных раком гортани по стадиям заболевания в зависимости от возраста выявлено, что в обеих возрастных группах более чем в 60% случаев имеет место поздняя диагностика (табл. 2). Таблица 2. Распределение больных раком гортани по стадиям заболевания в зависимости от возраста Число больных (%) в возрастных группах Стадии заболевания I группа (n=32, 100%) II группа (n=38,100%) 1 ст. 0 4 (10%) 2 ст. 6 (19%) 9 (24%) 3 ст. 18 (56%) 19 (50%) 4 ст. 8 (25%) 6 (16%) Среди обследуемых нами больных поражение надскладкового отдела чаще отмечено у пациентов среднего возраста (22%), что не имело 32 статистического значения (р=0,19) Более чем в 40% случаев в обеих возрастных группах опухоль занимала более одного отдела гортани (табл. 3). Таблица 3. Распределение больных раком гортани по локализации опухоли Локализации опухоли Число больных (%)в возрастных группах Надскладочный отдел I группа (n=32, 100%) 7 (22%) II группа (n=38,100%) 4 (10%) Складочный отдел 10(31%) 17 (45%) Подскладочный отдел 0 1(3%) Опухоль занимает более одного отдела 15 (47%) 16 (42%) При анализе наличия метастазов в зависимости от локализации было выявлено, что метастазы чаще наблюдались у пациентов среднего возраста, что обусловлено большей частотой надскладковой локализации (табл.4). Таблица 4. Наличие метастазов в лимфоузлы шеи в зависимости от локализации опухоли гортани в возрастных группах Локализации опухоли Надскладочный отдел I группа (n=32, 100%) Всего Из них с больных метастазами 7 (100%) 3 (43%) II группа (n=38,100%) Всего Из них с больных метастазами 4 (100%) 1 (25%) Складочный отдел 10 (100%) 0 17 (100%) 0 0 0 1 (100%) 0 15 (100%) 3(20%) 16(100%) 3(19%) 32 (100%) 6 (19%) 38 (100%) 4 (10%) Подскладочный отдел Опухоль занимает более одного отдела Всего больных При сопоставлении распространенности опухоли и ее локализации было выявлено, что среди больных с I и II стадиями рака гортани в обеих возрастных группах преобладало поражение складочного отдела, при III и IV 33 стадиях, увеличивалась частота поражения опухолью надскладочного отдела гортани (табл. 5). Таблица 5. Локализация рака гортани в зависимости от стадии Стадии рака гортани Локализации I ст. II ст. III ст. IV ст. опухоли 44-59 60-81 44-59 60-81 44-59 60-81 44-59 60-81 лет год лет год лет год лет год Надскладочный 4 2 3 2 отдел (22%) (37%) (33%) (10%) Складочный 4 5 8 5 5 отдел (100%) (83%) (89%) (28%) (26%) Подскладочный 0 0 0 0 0 1 0 0 отдел (5%) Более одного 1 1 9 11 5 4 отдела (17%) (11%) (50%) (59%) (63) (67%) Всего больных 0 4 6 9 18 19 8 6 По результатам гистологического исследования биопсийного материала в группе больных среднего возраста чаще диагностирован умеренно-дифференцированный рак, в старшей возрастной группе отмечено преобладание высокодифференцированных форм плоскоклеточного рака (р=0,0034) (табл. 6). Таблица 6. Степень дифференциации плоскоклеточного рака гортани в зависимости от возраста Степень диф-ии плоскоклеточного рака ВПР УПР ВПР и УПР НПР Количество больных в возрастных группах(%) I группа (n=32,100%) II группа (n=38, 100%) 9 (28%) 24 (63%) 16 (50%) 13 (34%) 2(6%) 1(3%) 5 (16%) 0 Наиболее частой сопутствующей патологией среди пациентов обеих возрастных групп были отмечены заболевания сердечно-сосудистой 34 системы, однако количество пациентов с данной патологией в старшей возрастной группе значительно превышало число пациентов с теми же заболеваниями в средней возрастной группе (р<0,0001) (табл. 7). Таблица 7. Сопутствующие заболевания Количество больных в возрастных группах I группа (n=32,100%) II группа (n=38,100%) ИБС ГБ СД 2 типа БА ХОБЛ МКБ 8 (25%) 15 (49)% 2 (6%) 1 (3%) 2(6%) 30 (79%) 35 (92%) 8 (21%) 2 (5%) 5 (13) 2 (5%) Динамическое наблюдение за течением заболевания проведено у 61 пациента сроком от 6 месяцев до двух лет. В зависимости от вида проводимого лечения наблюдаемые пациенты были разделены на 3 группы: 1 группа - 17 больных (восемь человек средней, девять - старшей возрастных групп) поступивших в ЛОР-отделение для хирургического лечения по поводу продолженного роста после проведения лучевой терапии по радикальной программе. 2 группа - 13 человек (шесть человек средней, семь - старшей возрастных групп), которым проводилась комбинированное лечение с послеоперационной лучевой терапией; 3 группа - 31 человек (15 человек средней, 16 - старшей возрастных групп), получивший лучевую терапию. 2.2. Материал для исследования В настоящей работе материалом для исследования служили: - биоптаты опухолевой ткани для гистологического исследования; - мазки отпечатки опухолевой ткани для цитологического исследования; - сыворотка, полученная из крови локтевой вены. 35 2.3. Методы исследования Всем пациентам проводилось следующее обследование: 1. Общие клинические методы: сбор жалоб, анамнеза, осмотр ЛОРорганов. 2. Лабораторные исследования: клинический анализ крови, клинический анализ мочи, исследование времени свертывания крови и длительности кровотечения, определение группы крови и резус фактора, биохимический анализ крови, определение антител к вирусам гепатита В и С, ВИЧ и сифилиса. 3. Дополнительные методы: лучевые исследования гортани и органов грудной клетки (рентгенография, томография, КТ, МРТ). Для выявления метастазирования в регионарные лимфатические узлы и другие органы проводилось УЗИ шеи и органов брюшной полости. Заключительным этапом в установке диагноза являлось проведение биопсии новообразования. 4. Специальные видеофиксацией, методы исследования: морфологическое фиброларингоскопия исследование сыворотки крови с с помощью метода краевой дегидратации биологических жидкостей (раздел технологии «Литос-система»). Метод краевой дегидратации биологических жидкостей. Морфологическое исследование сыворотки крови с помощью краевой дегидратации проводилось в аналитических ячейках квадратных окон ТК4 диагностического набора «Литос-система» (рис. 1). Техника проведения исследования заключалась в следующем: - забор крови у пациента проводится строго натощак. После венопункции локтевой вены кровь собирается самотеком через иглу в сухую чистую центрифужную пробирку, в объеме не менее 2 мл; - сыворотку крови получают путем центрифугирования крови при 3000 об\мин в течение 10 минут; 36 - на каждого пациента заполнялось две тест-карты (10 аналитических ячеек). В каждую аналитическую ячейку наносили по 0,02 мл сыворотки крови в виде капель полуавтоматической пипеткой-дозатором и накрывали их покровными стеклами; - заполненные тест-карты выдерживали в течение пяти-семи суток, при температуре 20 - 25°С и относительной влажности 55 - 60%; - исследование морфотипов сыворотки крови проводили при микроскопии в поляризованном свете при увеличении х50 - х100 - х200 х400 - х630 с помощью поляризационного микроскопа DM2500 фирмы «Leica». Рис. 1. Тест-карта 4 (ТК4) диагностического набора «Литос-система» для исследования дегидратированных структур сыворотки крови 37 а б в г д е ж з Рис. 2. Анизотропные морфотипы сыворотки крови при физиологическом и различных видах патологического процесса в организме: а, в, г, д, е, з – х200; б, ж –х 400. Объяснения в тексте 38 Морфологическое исследование сыворотки крови, полученной из локтевой вены, проводили при поступлении в стационар, после каждого этапа лечения (при лучевой терапии после каждого курса: до 46 Гр; до 70 Гр, при выполнении хирургической операции - в до и послеоперационном периоде). Далее исследования продолжались при амбулаторном наблюдении за пациентами ежемесячно на протяжении двух лет. Исследование состава анизотропных морфотипов проводилось по классификации С.Н. Шатохиной, В.Н. Шабалина [144]. Анизотропные морфотипы нормы: - базисные сферолиты, являются основными структурами сыворотки крови здоровых людей, представляют собой крупный монохромный сферолит с четким ровным контуром, без дефектов и каких-либо включений в структуре(рис. 2а); - морфотипы адаптационных состояний, выявляются в сыворотке крови здоровых людей, наряду с базисными сферолитами, могут быть представлены либо незавершенными крупными монохромными сферолитами в виде веера или дендрита, либо напротив сферолитами с вторичным ростом по периферии (рис. 2б,в). Присутствие таких структур в сыворотке крови указывает на процессы адаптации организма к условиям внутренней среды и являются вариантом нормы. Морфотипы патологии: - маркер деструкции, является неспецифическим, выявляется в сыворотке крови больных с различными хроническими воспалительными заболеваниями; представлен крупными слабоанизотропными сферолитами ячеистой структуры, утратившими правильную форму, с неровными изъеденными краями (рис. 2г); - маркер хронической патологии, представлены мелкими монохромными сферолитами, имеющими зернистую структуру, при этом они располагаются отдельно от крупных сферолитов, также встречаются в сыворотке крови людей с вялотекущей хронической патологией 39 - маркер злокачественного роста представляет собой комбинацию макро- и микросферолита, при этом зернистый микросферолит находится в центре макросферолита (рис. 2 д,е) - маркер риска злокачественного роста представлен комбинацией макро- и микросферолита, однако зернистый микросферолит располагается в краевой зоне макросферолита (рис. 2ж); - маркер дегенеративно-дистофического процесса также представляет собой комбинацию макро- и микросферолита, однако макросферолит имеет резко сниженную степень анизотропии и ячеистую структуру. Зернистый микросферолит, при этом, имеет вид светящегося «глазка» (рис. 2, з). Новая технология разрешена к клиническому использованию в составе комплекса новых технологий «Морфологический анализ биологических жидкостей Литос-система» (Разрешение ФС № 2009/155 от 15.06.09 г.). 2.4. Статистические методы Статистическую обработку данных проводили при помощи программы Statistica for windows v.8.0. Для сравнения групп обследуемых строили сетку 2х2. Для статистического анализа применялся метод Х-квадрат с поправкой Ейца на непрерывность и точный критерий Фишера для малых выборок. Для концевых точек (0 и 100 %) применялся t критерий Стьюдента с поправкой на концевые точки. Вычислялся относительный риск (RR) и отношение шансов (OR) и соответствующий 95% доверительные интервалы. Для выявления зависимости эффективности лечения от исходного состояния опухолевой ткани (активный рост или дегенеративно-дистрофическое состояние) применялся корреляционный анализ Пирсена (r). 40 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ НА ЭТАПЕ ОБСЛЕДОВАНИЯ Исследование сыворотки крови методом краевой дегидратации проводилось на базе лаборатории морфологии биологических жидкостей Филиала РНИМУ им. Н.И. Пирогова «НКЦ геронтологии» (зав. лабораторией – д.м.н., профессор С.Н. Шатохина). У всех больных с диагнозом плоскоклеточного рака гортани, подтвержденным гистологическим и цитологическим исследованиями, изучен состав анизотропных морфотипов сыворотки крови методом краевой дегидратации. Основными из них являлись два морфологических маркера: маркер злокачественного роста и маркер дегенеративно-дистрофического процесса [144]. 3.1. Морфологические маркеры злокачественного роста в сыворотке крови больных раком гортани в зависимости от стадии заболевания. Маркер злокачественного роста представляет собой комбинацию макро- и микросферолита, (см. главу 2) однако, по мере прогрессирования опухоли данный маркер претерпевает изменения. На рис. 3а-в показан маркер злокачественного роста, определяющийся в сыворотке крови больных раком гортани на I-II стадиях. Маркѐр представляет собой патологическую агрегацию базисного сферолита (БС) и микросферолита с зернистой структурой (м). Такая агрегация (БС+м) имеет одинаковую степень анизотропии (свечения). На рис. 4а-г представлен маркер злокачественного роста III-IV стадий [144]. Он также является патологической агрегацией БС+м, с одинаковой степенью анизотропии, однако отличается тем, что сферолита присутствуют лишь его фрагменты, вместо базисного в то время как микросферолит с зернистой структурой представлен в сохранном виде. 41 Особенности двух указанных патологических агрегаций четко видны при сравнении с базисным сферолитом нормы (рис. 3г), который определяется в сыворотке крови здоровых людей. а б в г Рис. 3. Анизотропные морфотипы сыворотки крови: а-в - маркер злокачественного роста I-II стадии (патологическая агрегация базисного сферолита и зернистого микросферолита с одинаковой степенью анизотропии); г - базисный сферолит здорового человека (для сравнения), ув. 200. Микроскопия в поляризованном свете 42 Рис. 4. Анизотропные морфотипы сыворотки крови: маркер злокачественного роста III-IV стадии (патологическая агрегация из фрагментов базисного сферолита и зернистого микросферолита с одинаковой степенью анизотропии). Ув. 200. Микроскопия в поляризованном свете 3.2. Морфологический маркер дегенеративно-дистрофического процесса в сыворотке крови больных раком гортани. На рис. 5 представлен маркер дегенеративно-дистрофического процесса, который также характеризуется патологической агрегацией БС+м, однако отличие этой агрегации от маркера злокачественного роста состоит сниженной степени анизотропии базисного сферолита. в резко Зернистый 43 микросферолит при этом имеет вид светящегося «глазка», а базисный приобретает ячеистую структуру. а б г в Рис. 5. Анизотропные морфотипы сыворотки крови: а-в - маркер дегенеративно-дистрофического процесса (патологическая агрегация базисного сферолита с низкой степенью анизотропии и зернистого микросферолита с выраженным анизотропным свечением), ув. 200; г – микросферолит с зернистой структурой, ув. 600. Микроскопия в поляризованном свете Одновременно с указанными патологическими маркерами в сыворотке крови больных раком гортани, выявлялись отдельно лежащие микросферолиты с зернистой структурой (рис. 5г) и деструктивные морфотипы - слабо анизотропные сферолиты неправильной формы с неровными краями и ячеистой структурой (рис. 6). 44 Рис. 6. Деструктивные анизотропные морфотипы сыворотки крови. Ув. 200. Микроскопия в поляризованном свете В сыворотке крови некоторых больных определялся маркер усиленной пролиферации – текстура в виде каскада параллельных линий (рис. 7). Этот маркер выявляется у людей с наличием репаративных процессов, доброкачественной гиперплазии и других состояниях. 45 Рис. 7. Маркер усиленной пролиферации – анизотропные текстуры сыворотки крови в виде каскада параллельных линий. Ув. 100. Микроскопия в поляризованном свете Количественный состав морфотипов сыворотки крови у больных раком гортани разных возрастных групп до начала лечения имел отличительные особенности (таблица 8). 46 Таблица 8. Состав морфотипов сыворотки крови 70 больных раком гортани при поступлении в стационар Виды морфотипов Число больных в возрастных группах 40-59 лет n=32(100 %) 60-81 год n=38(100 %) Физиологические (см. главу 2) Сферолит, дендрит, 22 (69%) 16 (42%) веерные Патологические Микросферолиты 9 (28%) 15 (39%) 24 (75%) 20 (53%) 31 (100%) 38 (100%) Деструктивные 10 (31%) 17 (45%) Маркер усиленной пролиферации (текстура в виде параллельных линий) 4 (12%) 4 (10%) зернистые Маркер злокачественного роста Маркер дегенеративнодистрофического процесса У всех больных раком гортани при поступлении в стационар определялся маркер дегенеративно-дистрофического процесса. На фоне этого процесса у 75% больных среднего возраста и 53% больных старшего возраста выявлялся маркер злокачественного роста, что свидетельствовало об активности у этих больных злокачественного процесса. Помимо указанных морфотипов, в сыворотке крови части больных в обеих возрастных группах были выявлены морфотипы нормы и неспецифического воспалительного процесса. Анализ возможных причин такого количественного распределения - «дегенерация и злокачественный рост» у больных раком гортани среднего и старшего возраста, а также данные литературных источников, позволили выделить нам несколько причин, объясняющих этот факт. 47 Во-первых, у больных раком гортани возникновению злокачественного новообразования предшествуют хронические атрофически-дегенеративные и пролиферативные тканевые изменения. При этом, как установлено рядом исследователей, до клинической манифестации опухоли проходит многолетний период. Во-вторых, любой процесс, включая и онкологический, протекает волнообразно, т.е. имеет стадии активности и регрессии. На современном этапе знаний в области онкологии известно, что стадия инвазии опухоли протекает в три фазы: в первой происходит ослабление контактов между клетками и экспрессия молекул, обеспечивающих мобильность опухолевых клеток и интегриновых рецепторов, служащих для прикрепления клеток к компонентам экстрацеллюлярного матрикса - коллагенам, фибронектину, ламинилу. Во второй экстрацеллюлярного фазе матрикса инвазии происходит протеолитическими деградация ферментами, секретируемыми опухолевыми клетками. Следовательно, путь для инвазии опухолевых клеток освобождается за счет деструктивного процесса в экстрацеллюлярном матриксе. В третью фазу происходит перемещение опухолевых клеток в зону деградации матрикса. Затем все стадии инвазии повторяются вновь и вновь, в той же последовательности. Таким образом, в процессе освоения окружающего пространства опухолевыми клетками происходят циклично повторяющиеся периоды деградации здоровых тканей с последующей активацией роста злокачественного новообразования. В-третьих, по мере роста и увеличения размеров опухоли, в ней нарастают деструктивные процессы за счет недостаточного поступления питательных веществ и кислорода. У пациентов старшего возраста преобладание морфотипов дегенеративно-дистрофического процесса обусловлено не только присутствием опухоли, но и инволютивными изменениями органов и тканей, обусловленных возрастной ишемией в результате атеросклеротических изменений. Кроме того, активность 48 опухолевого роста находится в обратной зависимости от состояния иммунной системы, которая также имеет свою фазность. Следует подчеркнуть, что диагностическая технология «Литоссистема» интегрально отражает все события, происходящие в биологических жидкостях организма на молекулярном уровне, то есть учитывает морфологические особенности всех молекулярных структур, выработанных опухолевыми клетками и продуктов их распада. Таким образом, технология предоставляет информацию непосредственно о самом патологическом процессе на период обследования. В этом и состоит главное отличие морфологического анализа неклеточных тканей от клеточных технологий, регистрирующих устойчивые патологические изменения в тканях, в то время как множество патогенетических процессов, чередующихся по силе, длительности и тяжести воздействия, которые привели к этим изменениям, «остаются за кадром». Таким образом, полученные нами данные о составе анизотропных морфотипов сыворотки крови на этапе обследования больных раком гортани отражают два основных сменяющих друг друга вида реальных событий, происходящих в ткани опухоли: активного роста злокачественного новообразования и дегенеративно-дистрофического процесса в ткани опухоли. 49 ГЛАВА 4. ДИНАМИКА МАРКЕРОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО РОСТА И ДЕГЕНЕРАТИВНО-ДИСТРОФИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА У БОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП НА ЭТАПАХ ЛЕЧЕНИЯ И АМБУЛАТОРНОГО НАБЛЮДЕНИЯ Из 70 больных раком гортани у 61 проведено динамическое наблюдение на этапах лечения и после его окончания, а также на протяжении двух лет при амбулаторном исследовании. Наряду с общепринятыми методами обследования, при каждом осмотре забиралась кровь для определения состава анизотропных морфотипов сыворотки крови с целью выявления маркеров злокачественного роста и дегенеративно-дистрофического процесса. В дальнейшем, по результатам наблюдения была прослежена смена этих морфологических маркеров на этапах лечения и амбулаторного наблюдения у каждого конкретного больного. В зависимости от вида проводимого лечения, больные были распределены на три группы: 61 пациент 1 группа n = 17 I группа n=8 II группа n=9 2 группа n = 13 I группа n=6 IIгруппа n=7 3 группа n = 31 I группа n = 15 IIгрупп а n = 16 1 группа (хирургическое лечение) - 17 больных (восемь человек средней, девять - старшей возрастных групп), у которых диагностирован 50 продолженный рост опухоли после проведения лучевой терапии по радикальной программе; 2 группа (комбинированное лечение) - 13 больных, (шесть человек средней, семь - старшей возрастных групп) которым на первом этапе проводилась хирургическое лечение с последующей лучевой терапией. 3 группа (лучевая терапия по радикальной программе) - 31 больной. (15 человек средней, 16 - старшей возрастных групп). 4.1. Динамика маркеров злокачественного роста и дегенеративнодистрофического процесса у больных раком гортани разных возрастных групп на этапах хирургического лечения В 1-ю группу вошли пациенты, поступившие в Лор-отделение с диагнозом рак гортани, состояние после лучевой терапии по радикальной программе, продолженный рост. После проведения обследования были установлены следующие стадии заболевания: Т1N0М0 - один пациент, Т2N0М0 - четыре, Т3N0М0 – девять, Т3N1М0 - один Т3N2М0 - один, Т4N2М0 - один. Больным были выполнены следующие виды хирургических операций: различные виды резекции гортани - 14, операция по типу Крайля - 3, ларингэктомия - 3. Исследование морфологической картины сыворотки крови из локтевой вены проводилось послеоперационном периоде, и далее до операции, в раннем при амбулаторном наблюдении в течение двух лет. Результаты наблюдений представлены в табл. 8. По результатам первого (до лечения) морфологического исследования сыворотки крови все больные были распределены на две подгруппы: ДД (дегенеративно-дистрофический процесс) и ЗР (злокачественный рост). Подгруппу ДД составили больные с преобладанием маркера дегенеративно-дистрофического процесса, в нее вошли 7 пациентов из групп среднего и старшего возраста (n=3 и n=4 соответственно). 51 Подгруппа ЗР - включала 10 обследуемых с преобладанием маркера злокачественного роста (по 5 больных в каждой возрастной группе). В подгруппе ДД, в послеоперационном периоде и на протяжении двух лет наблюдения у пациентов обеих возрастных групп ни разу не выявлялся маркер злокачественного роста. Клинически также отмечен положительный эффект, что свидетельствовало о благоприятном течении заболевания и адекватности проведенного лечения. Таблица 9. Результаты морфологического исследования сыворотки крови больных раком гортани на этапе хирургического лечения и наблюдения в разных возрастных группах Вид процесса ДД ЗР Всего Число больных до лечения в разных возрастных группах I группа n=3 II группа n =4 I группа n=5 II группа n=5 17 * летальный исход Число больных с видом патологического процесса после через через 6 через через 1,5 через операции 1-2 мес мес 1 год года 2 года ЗР ДД ЗР ДД ЗР ДД ЗР ДД ЗР ДД ЗР ДД 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 1 4 2* 3 0 3 0 3 0 3 0 3 1 4 1* 4 0 4 0 4 1 3 1 3 17 17 14 14 14 14 Среди больных подгруппы ЗР (с наличием маркера злокачественного роста до лечения) в раннем послеоперационном периоде этот маркер сохранялся у двух из десяти больных (по одному больному в каждой возрастной группе) со стадиями заболевания Т3N0М0, Т4N2М0, что указывало на продолжение опухолевого процесса, хотя по данным гистологического заключения опухоль была удалена в пределах здоровых тканей. Через один месяц после операции при повторном морфологическом исследовании сыворотки крови, маркер злокачественного роста у этих двух 52 больных сохранялся и был выявлен еще у одного больного в средней возрастной группе (Т3N2М0). Во всех трех случаях после дополнительного обследования были выявлены отдаленные метастазы. Летальный исход у этих больных наступил в сроки от двух до восьми месяцев. В ходе дальнейшего наблюдения за больными этой подгруппы, через полтора года, еще у одного пациента (Т3N0М0) в старшей возрастной группе был выявлен маркер злокачественного роста, но при осмотре, включая УЗИ органов шеи и брюшной полости, признаков продолженного роста опухоли и метастазов не выявлялось. При следующем морфологическом исследовании сыворотки крови у данного больного, помимо маркера злокачественного роста, выявлен особый волнистый микросферолит. Была проведена компъютерная томография органов грудной клетки и обнаружены метастазы в легких. Таким образом, у 7 пациентов из обеих возрастных групп, у которых до проведения операции выявлялся только маркер дегенеративно- дистрофического процесса (подгруппа ДД), на протяжении двух лет наблюдения был отмечен хороший результат лечения. Из 10 пациентов обеих возрастных групп, у которых перед операцией был выявлен маркер злокачественного роста (подгруппа ЗР) в четырех случаях отмечен неблагоприятный исход (по два пациента в каждой возрастной группе). 4.2. Динамика маркеров злокачественного роста и дегенеративнодистрофического процесса у больных раком гортани разных возрастных групп на этапах комбинированного лечения Группа больных, получавших комбинированное лечение, составила 13 человек. По стадиям заболевания больные распределились следующим образом: Т1N0М0 - два человека, Т2N0М0 – три, Т3N0М0 - 5 человек, Т3N1М0 - один, Т4N0М0 - два. Всем пациентам первым этапом проводились различные виды хирургических операций, вторым - лучевая терапия на аппарате РОКУС АМ в дозе 56 Гр. Забор крови для морфологического 53 исследования проводился до лечения (перед операцией), в раннем послеоперационном периоде, после проведения лучевой терапии и далее при каждом ежемесячном амбулаторном осмотре в сроки до двух лет. Результаты морфологического исследования сыворотки крови за два года представлены в табл. 10. Таблица 10. Результаты морфологического исследования сыворотки крови больных раком гортани на этапах комбинированного лечения и наблюдения в разных возрастных группах Вид Число Число больных с видом патологического процесса процесса больных п/о ЛТ 1-2 6 1 1,5 2 года до мес мес год года лечения дд зр дд зр дд зр дд в разных зр дд зр дд зр дд зр возрастн ых группах I группа n =3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 ДД II группа 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 n=5 I группа n=3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 ЗР II группа 0 2 2 0 2 0 2* 0 0 0 0 0 0 0 n=2 Всего 13 13 13 13 13 11 11 11 *летальный исход у двух больных По результатам первого (до лечения) морфологического исследования сыворотки крови больные были подразделены на две подгруппы: подгруппа ДД - насчитывала восемь человек (три среднего и пять старшего возраста ) подгруппа ЗР - включала пять человек (три среднего и два старшего возраста). 54 При анализе такого распределения обращает на себя внимание, что у пациентов среднего возраста (Iгруппа) с одинаковой частотой выявлялись маркер дегенеративно-дистрофического процесса и злокачественного роста (n=3). Среди больных старшей возрастной группы (II группа) в большинстве случаев определялся маркер дегенеративно-дистрофического процесса (n=5) и только у двух был выявлен маркер злокачественного роста. В подгруппе больных, у которых до операции имело место преобладание дегенеративнодистрофического процесса (подгруппа ДД, n=8), за все время наблюдений отмечен положительный эффект, не зависимо от возраста. Все пациенты живы и продолжают наблюдаться в амбулаторных условиях. Из пяти пациентов подгруппы ЗР (обеих возрастных групп), у которых при морфологическом исследовании сыворотки крови до операции был выявлен маркер злокачественного роста, после операции у всех регистрировался только маркер дегенеративно-дистрофического процесса, по данным гистологического исследования операционного материала, в краях резекции опухолевого роста не обнаружено. Однако, после окончания лучевой терапии у двух больных старшего возраста (стадии заболевания Т3N0М0) был выявлен маркер злокачественного роста. Вместе с тем, при клиническом осмотре данных за продолженный рост и метастазирование ни одного них не было выявлено. При последующем морфологическом исследовании сыворотки крови у этих больных сохранялся маркер злокачественного роста. Было проведено КТ органов грудной клетки и выявлены метастазы в легкие. Ниже приводим клинический пример. Клинический пример 1. Больная Б. 72 лет поступила в отделение оториноларингологии МОНИКИ 19.05.2011 с диагнозом: Рак гортани Т3Н0М0, трахеостома. Гепатит В, гипертоническая болезнь 2 стадии, риск 3. Ишемическая болезнь сердца, диффузный кардиосклероз, атеросклероз аорты. При поступлении больная предъявляла жалобы на осиплость, наличие трахеостомы. Из анамнеза известно, что в течение шести месяцев отмечает затруднение дыхания. В связи с явлениями стеноза гортани 25.04.2011 по месту жительства была выполнена срочная трахеостомия. 55 При осмотре: в просвете гортани опухоль смешанного роста серого цвета с бугристой поверхностью, суживает просвет гортани на 1/3, установить зону роста не представляется возможным. R-графия шеи по Земцову: надгортанник не изменен, воздушный столб на уровне С4-5 не прослеживается. R-графия органов грудной клетки: легочные поля без очаговоинфильтративных изменений. Легочной рисунок в базальных отделах с признаками пневмосклероза. УЗИ органов шеи и брюшной полости: диффузные изменения поджелудочной железы. Данные за метастазы не выявлены. Морфологическое исследование сыворотки крови 20.05.11: выявлен маркер злокачественного роста. х400 х400 х400 х630 Проведена биопсия новообразования при непрямой ларингоскопии. Цитологическое исследование новообразования гортани 23.05.2011 №868-871 от 02.06.2011 гиперкератоз. Гистологическое исследование новообразования 23.05.2011: фрагменты слизистой, выстланной реактивно измененным многослойным плоским эпителием с акантозом, гипер- и паракератозом, лейкоцитарной инфильтрацией и отдельно лежащие роговые массы, инфильтрированные лейкоцитами. 56 Морфологическое исследование сыворотки крови 24.05.13 вновь выявлены маркеры злокачественного роста, а так же особые волнистые микросферолиты. микросферолиты. х400 х400 В связи с отсутствием гистологической верификации онкологического процесса, при наличии клинической картины рака гортани и данных морфологического исследования сыворотки крови, 01.06.2011 была проведена прямая ларингоскопия с биопсией новообразования гортани. Цитологическое исследование новообразования гортани 01.06.2011 872-74 от 02.06.2011 клетки эпителия секреторного типа. Гистологическое исследование новообразования 01.06.2011 №21176/80: высокодифференцированный ороговевающий плоскоклеточный рак с инвазией в субэпителиальные отделы. 08.06.2011 произведена ларингэктомия. Цитологическое исследование операционного материала 08.06.2011 946-48 - плоскоклеточный рак. Гистологическое исследование операционного материала 08.062011 22926/33 высокодифференцированный плоскоклеточный рак с поражением левой голосовой связки без прорастания хрящей гортани. В краях резекции опухолевого роста не обнаружено. При морфологическом исследовании сыворотки крови в раннем послеоперационном периоде 15.06.2011 - маркеров злокачественного роста не выявлено. Вторым этапом была проведена лучевая терапия - СОД 56 Гр. При морфологическом исследовании сыворотки крови после завершения лучевой терапии 30.09.2011 вновь выявлены маркеры злокачественного роста и особые микросферолиты с волнистой структурой. 57 х200 РКТ грудной клетки 15.10.2011 - выявлена центральная опухоль левого легкого. Проанализировав данный клинический случай, нами было выдвинуто предположение: что особые микросферолиты с волновой структурой, обнаруженные при морфологическом исследовании сыворотки крови до операции и после завершения лучевой терапии, являются продуктом жизнедеятельности опухолевых клеток более злокачественного клона, которые образовались в результате эволюции опухоли [20]. Таким образом, обнаружение данных структур при морфологическом исследовании сыворотки крови у больных раком гортани свидетельствует о прогрессии опухоли. Это должно насторожить врача и послужить доводом в пользу более радикального лечения. Выявление же такого микросферолита в сыворотке крови у больного после завершения лечения является поводом для более пристального обследования на предмет выявления метастазов. Заслуживает внимания тот факт, что в данном случае микросферолит с волнистой структурой выявлялся еще до лечения (в сыворотке крови олученной из операционной раны), затем исчез после проведенной операции и вновь был выявлен только после проведения лучевой терапии. 58 Таким образом, часть результатов исследований, приведенные в табл. 8, совпадают с данными табл. 7, а именно: в группе больных, получавших комбинированное лечение, как и в группе больных с хирургическим лечением, результаты оказались лучше у тех пациентов, у которых до лечения определялся маркер дегенеративно-дистрофического процесса. 4.3. Динамика маркеров злокачественного роста и дегенеративнодистрофического процесса у больных раком гортани разных возрастных групп на этапах лучевой терапии Лучевая терапия по радикальной программе была проведена 31 больному. По стадиям заболевания больные распределились следующим образом: Т1N0М0 – один пациент, Т2N0М0 - 8, Т3N0М0 - 21. По результатам морфологического исследования сыворотки крови до лечения все больные в каждой возрастной группе были распределены на две подгруппы: подгруппа ДД включала 14 больных (четыре среднего и десять старшего возраста), у которых при первом морфологическом исследовании сыворотки крови (до лечения) преобладал маркер дегенеративно- дистрофического процесса, подгруппа ЗР - 17 пациентов (11-среднего и шесть старшего возраста) с наличием маркера злокачественного роста. Результаты морфологического исследования сыворотки крови на этапах лучевой терапии и амбулаторного наблюдения показали, что среди больных с признаками дегенеративно-дистрофического процесса до лечения (подгруппа ДД), после проведения первого этапа лучевой терапии у четверых пациентов (одного среднего и трех старшего возраста со стадиями Т2N0M0 два человека, N3N0M0 - два человека) произошли изменения в сторону появления маркера злокачественного роста (табл. 10). При этом клинически у всех больных отмечалось уменьшение опухоли на 50% и более, в связи с чем была продолжена лучевая терапия. После завершения лучевой терапии, при 59 осмотре у всех этих четверых больных отмечалась полная резорбция опухоли. Однако при исследовании состава морфотипов сыворотки крови у двух пациентов старшего возраста со стадией заболевания Т2N0M0 и Т3N0M0 (при отсутствии клинических продолженного роста) сохранялся маркер злокачественного роста и, кроме того, был выявлен особый микросферолит с волнистой структурой; а у других двух больных (по одному среднего и старшего злокачественного возраста) роста и отмечено возврат в исчезновение сторону маркера дегенеративно- дистрофического процесса. Таблица 11. Результаты морфологического исследования сыворотки крови больных раком гортани разных возрастных групп на этапах лучевой терапии и наблюдения Число больных с видом патологического процесса Вид процесса ДД ЗР Всего Число больных до лечения в разных возрастны х группах Первый курс ЛТ 33-40Гр Второй курс ЛТ 66-70Гр 1-2 мес 6 мес ЗР ДД ЗР ДД ЗР ДД ЗР ДД ЗР I группа n=4 1 3 0 4 0 4 0 4 II группа n=10 3 7 2 8 5 5 1 I группа n=11 II группа n=6 31 6 5 0 11 1 10 0 4 0 2 31 6 31 0 6 31 0 1 год 1.5года 2 года ДД ЗР ДД ЗР ДД 0 4 0 4 0 4 5 1 5 0 5 0 5 10 0 10 0 10 0 10 6 26 0 6 26 0 6 25 0 6 25 При амбулаторном осмотре через 2 месяца после завершения лучевой терапии, у тех же двух больных по результатам исследования состава морфотипов сыворотки крови маркер злокачественного роста сохранялся, и тогда же, при осмотре, был выявлен продолженный рост опухоли. Больным была произведена ларингэктомия. 60 При исследовании состава морфотипов сыворотки крови в этой же подгруппе в те же сроки маркер злокачественного роста был выявлен еще у трех пациентов старшего возраста, со стадией заболевания Т3N0М0, а также особый микросферолит с волнистой структурой. У одного из них, одновременно был выявлен продолженный рост опухоли, у второго - только через 2 мес. после окончания лучевой терапии. У третьего пациента, ни при осмотре, ни при выполнении УЗИ органов шеи и брюшной полости, данных за продолженный рост и метастазирование не было выявлено. Наблюдение за этим больным продолжалось на протяжении одного года. Вместе с тем, при последующих морфологических исследованиях сыворотки крови у больного определялся маркер злокачественного роста, но при других видах исследованиях, включая КТ органов грудной клетки, данных за опухолевый процесс не было получено. Только при проведении повторного КТ органов грудной клетки через 1 год обнаружены метастазы в легкие. Таким образом, в группах больных старшего и среднего возраста с маркером дегенеративнодистрофического процесса до лечения (n=14) в ходе лучевой терапии у семи больных (Т3N0М0 - пять человек, Т2N0М0 - 2 человека) на разных этапах регистрировался маркер злокачественного роста (один пациент среднего и шесть старшего возраста). отмечено При этом в двух случаях (Т2N0М0, Т3N0М0) его транзиторное появление, после проведения первого курса лучевой терапии, с последующим возвратом процесса в дегенеративно- дистрофическое состояние. У этих пациентов в течение двух лет наблюдался положительный эффект. В пяти случаях (все пациенты старшего возраста, из них четверо со стадией заболевания -Т3N0М0, один - Т2N0М0) маркер злокачественного роста сохранялся в течение всего курса лучевой терапии или обнаруживался в ранние сроки после завершения лечения. У четырех из этих пяти больных выявлен продолженный рост опухоли в сроки от одного до двух месяцев после завершения лучевой терапии, у одного (Т3N0М0) - отдаленные метастазы обнаружены через 1 год. 61 Клинический пример 2. Пациент К. 70 лет поступил в отделение оториноларингологии МОНИКИ 07.02.2011 с диагнозом: новообразование гортани. При поступлении больной предъявлял жалобы на осиплость, дискомфорт в горле при глотании. Из анамнеза известно, что данные жалобы беспокоят около 1 года, был осмотрен отоларингологом по месту жительства, диагностирован хронический гиперпластический ларингит. Проводилась биопсия гортани, данных за онкологический процесс не получено. При осмотре: визуализируется новообразование экзофитной формы, серого цвета, с бугристой поверхностью, занимающее левую голосовую складку с переходом на комиссуру. При фонации обе половины гортани симметрично подвижны. Подскладковый отдел свободный. Умеренная охриплость, дыхание свободное. Рентгенотомография гортани: левая голосовая складка больше за счет дополнительного образования, распространяющагося в сторону желудочка. Грушевидные синусы свободны. Подскладковое пространство сохранено. Морфология сыворотки крови 04.02.2011: обнаружен маркер дегенеративно-дистрофического процесса, маркер злокачественного роста не выявлен. 10.02.2011 проведена биопсия новообразования. Цитологическое исследование новообразования гортани 10.02.2011: единичные клетки с признаками атипии. Нельзя исключить злокачественную опухоль. Гистологическое исследование новообразования 10.02.2011: бородавчатая гиперплазия эпителия с признаками тяжелой дисплазии и очагом микроинвазивной плоскоклеточной карциномы. Рентгенография органов грудной клетки 08.02.2011 легочные поля без очагово-инфильтративных изменений. Легочной рисунок с признаками пневмофиброза. УЗИ органов брюшной полости 11.02.2011 - данных за метастазирование не получено. Клинический диагноз: T2N0M0. Выработан условно комбинированный план лечения с проведением на первом этапе предоперационного курса лучевой терапии. При осмотре, после завершения предоперационного курса лучевой терапии СОД 48 Гр 04.05.2011 отмечено уменьшение размера опухоли более чем на 50%, в связи с чем план лечения был изменен на лучевую терапию по радикальной программе. Морфология сыворотки крови после проведения 1 курса ЛТ (48 Гр): выявлен маркер злокачественного роста и особые волнистые микросферолиты. 62 Х400 Х400 При осмотре после завершения лучевой терапии 08.06.2011 отмечена полная резорбция опухоли, однако при морфологическом исследовании сыворотки крови обнаружен маркер злокачественного роста. х200 х200 В дальнейшем при динамическом наблюдении наряду с осмотром также проводилось морфология сыворотки крови. Через 1 месяц после полного курса луч терапии 06.07.2011 при осмотре признаков злокачественного роста нет, но при проведении морфология сыворотки крови вновь обнаружен маркер злокачественного роста. Х400 Х400 63 При следующем осмотре 28.09.2011 через 3 месяца после полного курса лучевой терапии выявлен продолженный рост опухоли. При проведении морфологии сыворотки крови 28.09.2011 также сохранялся маркер злокачественного роста. Х630 Х630 Гистологическое исследование новообразования 12.10.2011 высокодифференцированный ороговевающий плоскоклеточный рак инвазией в подэпителиальную строму. с На данном клиническом примере демонстрируется, что у больного К. в возрасте 70 лет с дегенеративно-дистрофическим маркером до начала лечения на фоне лучевой терапии произошло изменение процесса в сторону злокачественного роста. Сохранение маркера злокачественного роста на протяжении проведения всей лучевой терапии и после ее завершения свидетельствует о неблагоприятном течении злокачественного процесса. Среди пациентов подгруппы ЗР , с признаками злокачественного роста до лечения, у части больных уже после первого курса лучевой терапии произошли изменения в сторону дегенеративно-дистрофического процесса, при осмотре у всех пациентов отмечалось уменьшение опухоли на 50%. После окончания лучевой терапии у всех больных, обеих возрастных групп, отмечена полная резорбция опухоли, по данным морфологического исследования сыворотки так же отмечен хороший результат лечения: во всех случаях выявлен только маркер дегенеративно-дистрофического процесса. Однако, через 1 месяц после завершения лучевой терапии, у одного больного 64 среднего возраста, со стадией заболевания Т2N0М0, при морфологическом исследовании сыворотки крови вновь стал регистрироваться маркер злокачественного роста, а так же был выявлен микросферолит с волновой структурой, но при осмотре не было получено данных за продолженный рост. Только через 2 месяца после завершения лучевой терапии у пациента был выявлен продолженный рост опухоли и, в последующем, была произведена ларингэктомия. Клинический пример 3: Пациент С. поступил в отделение оториноларингологии МОНИКИ 24.02.11с жалобами на осиплость, кашель, одышку при физической нагрузке. Из анамнеза известно, что данные жалобы беспокоят больного около шести месяцев. При осмотре: определяется опухоль смешанной формы роста, серорозового цвета, занимающая всю левую голосовую складку с переходом на комиссуру. Опухоль распространяется на вестибулярную складку. При фонации отмечается ограничение подвижности левой голосовой складки. Голосовая щель 5-6 мм, умеренная осиплость, дыхание в покое компенсированное, при физической нагрузке - одышка. Морфологическое исследование сыворотки крови 28.02.2011- высокий риск злокачественного роста, либо начало злокачественного роста. х400 х400 х100 х200 65 R-графия гортани, R-томография гортани: левая голосовая складка утолщена за счет наличия дополнительного образования, Морганиевые желудочки не прослеживаются. УЗИ органов шеи и брюшной полости: диффузные изменения поджелудочной железы. По ходу кивательной мышцы лимфоузлы до 5 мм, однородной структуры. Гистологическое исследование 01.03.2011: инвазивный умеренно дифференцированный ороговевающий плоскоклеточный рак. Клинический диагноз: Умеренно дифференцированный ороговевающий плоскоклеточный рак гортани, Т2Н0М0. Больному была проведена лучевая терапия. 1-й этап лучевой терапии с 21.03.2011 по 13.04.2011- СОД 46 Гр. Морфологическое исследование сыворотки крови 04.04.2011. Признаки злокачественного роста. х200 х200 При клиническом осмотре отмечена резорбцияс опухоли на 50%. 2й этап лучевой терапии с 16.05.2011 03.06.2011 - СОД 66 Гр за 2 этапа. Морфологическое исследование сыворотки крови 02.06.2011 признаки злокачественного роста не обнаружены. Дегенеративно-дистрофический процесс. х200 х200 66 При контрольном осмотре через 1месяц после полного курса лучевой терапии 06.07.2011- данных за продолженный рост не выявлено. Морфологическое исследование сыворотки крови 06.07.2011 выраженный дегенеративно-дистрофический процесс. х200 х200 х200 При исследовании морфотипов сыворотки крови через 2 месяца после полного курса лучевой терапии, 31.08.2011- был выявлен микросферолит с волнистой структурой. Больной был госпитализирован, выявлен продолженный рост опухоли. х800 Цитологическое исследование 08.09.2011 № 7046-50: элементы базальных клеток, гиперплазия. Гистологическое исследование 08.09.2011 № 34937/40 умеренно дифференцированный плоскоклеточный рак с изъязвлениями и очаговым ороговением. 22.09.2011 произведена ларингэктомия. Интраоперационное гистологическое исследование 37283/93 умеренно дифференцированный плоскоклеточный рак с ороговением и прорастанием в мышечный слой. В окружающих тканях опухолевого роста нет. Контроль в послеоперационном периоде Морфологическое исследование сыворотки крови на 7-е сутки после операции 29.09.2011: выявлен маркер злокачественного роста, а также микросферолиты с волнистой структурой. 67 Х630 х400 Через 2 мес после ларингэктомии Морфологическое исследование сыворотки крови 23.11.11 признаков злокаственного роста не выявлено. Дегенеративно-дистрофический процесс. х400 х400 Через 7 месяцев после операции Морфологическое исследование сыворотки крови 24.04.2012 -признаков злокачественного роста не выявлено. Дегенеративно-дистрофический процесс. х400 х630 68 9 мес после операции 27.06.2012. Морфологическое исследование сыворотки крови 27.06.2012 - признаков злокачественного роста не выявлено. Дегенеративно-дистрофический процесс. х630 х630 14 мес после операции 14.11.12 Морфологическое исследование сыворотки крови 14.11.12 – признаки на злокачественный рост сомнительны. Дегенеративно-дистрофический процесс. При осмотре данных за продолженный рост не выявлено. х630 х630 Дальнейшее наблюдение за больным продолжено. 69 4.4. Морфологический маркер прогрессии рака гортани В ходе динамического наблюдения за 61 больным, во время проведения лечения (лучевая и комбинированная терапия) и на протяжении двух лет после его завершения, у двенадцати больных клинически наблюдался продолженный рост опухоли: три пациента среднего и девять - старшего возраста. При морфологическом исследовании сыворотки крови этих больных, у одиннадцати из них (Т2N0M0 - 2 человека, Т3N0М0 - 8; Т3N2М0 - 1), наряду с ранее описанными маркерами злокачественного роста и маркерами дегенеративно-дистрофического процесса, были выявлены особые микросферолиты. Ранее микросферолиты выявлялись у больных раком гортани в составе комбинации БС+м, и в изолированном виде у людей с наличием очага хронической патологии, но в этих случаях микросферолиты имели зернистую структуру («зернистый» микросферолит). Вновь выявленные микросферолиты располагались изолированно (не в комбинации с макросферолитами) и характеризовались наличием волнистых структур («волнистый» микросферолит). Описанные отличия четко видны на рис. 8. а б Рис. 8. Морфотипы сыворотки крови: а - морфологический маркер прогрессии злокачественного роста – волнистый микросферолит; б – зернистый микросферолит. Ув. 800 70 Кроме того, волнистые микросферолиты были выявлены у двух больных без клинических подтверждений продолженного роста. Но сроки наблюдений за этими пациентами составляли всего четыре-пять месяцев, что не позволяет с уверенностью исключить продолженный рост в будущем. Наблюдения продолжаются (табл.12). Таблица 12. Признаки клинической прогрессии и результаты морфологического исследования сыворотки крови Морфологическое исследование сыворотки крови Выявленs «волнистые» микросферолит n=13 «волнистые» микросферолиты не выявлены n=48 Клинические признаки продолженного роста опухоли или метастазирования. Выявлены n=12 Не выявлены n=49 11 2 1 47 Сопоставив результаты морфологического исследования сыворотки крови (наличие «волнистого» микросферолита) и клинические данные в этих группах, было отмечено, что из 17 больных, получавших хирургическое лечение, у четырех выявлялись «волнистые» микросферолиты (по два пациента среднего и старшего возраста) и клинически у всех этих пациентов наблюдался продолженный рост опухоли (табл. 13). Следует уточнить, что в двух случаях «волнистые» микросферолиты обнаруживались до операции и сохранялись после нее, в третьем – были выявлены только через 1 месяц после операции. У всех этих больных наступил летальный исход. В четвертом случае волнистый микросферолит впервые был зарегистрирован через полтора года после операции, и только спустя три месяца были выявлены метастазы в легких. 71 Таблица 13. Признаки клинической прогрессии и выявления «волнистого» микросферолита в сыворотке крови у больных раком гортани Число больных с Вид лечения Хирургическое n=17 Комбинированное n= 13 Лучевая терапия n=31 Всего В группе Клинически Наличием Клинически выявленная «волнистого» выявленным прогрессия при микросферолита продолженным наличие ростом или «волнистого» метастазированием микросферолита 4 4 4 2 2 1 7 6 6 13 12 11 больных, получавших комбинированное лечение (n=13), «волнистый» микросферолит был выявлен у двух больных старшего возраста. У одного пациента данный маркер был выявлен до операции, и сохранялся после проведения лучевой терапии, через 1 месяц были выявлены метастазы в легкие. У второго больного «волнистый» микросферолит был выявлен только после окончания лучевой терапии, однако в настоящее время клинических данных за продолженный рост не выявлено (наблюдение продолжается). У одного больного данной группы старшего возраста наблюдалась прогрессия заболевания, но при морфологическом исследовании сыворотки крови «волнистый» микросферолит не выявлен. Среди 31 пациентов, получавших лучевую терапию в качестве монотерапии, «волнистый» микросферолит определялся у семи больных, при этом клиническая прогрессия наблюдалась у шести из этих пациентов. Из них у одного больного «волнистые» микросферолиты появились после первого курса лучевой терапии при СОД 46 Гр, клинически же было отмечено уменьшение размера опухоли на 50% и лучевая терапия 72 продолжена до 70 Гр. После завершения лечения, при осмотре данных за продолженный рост не получено, но при морфологическом исследовании сыворотки крови вновь обнаружен волнистый микросферолит, через 2 месяца клинически диагностирован продолженный рост. У четверых пациентов, получавших лучевую терапию по радикальной программе в дозе 70 Гр, после ее завершения отмечена полная резорбция опухоли. Но при морфологическом исследовании сыворотки крови, через 1- 2 месяца после завершения лечения, обнаружен волнистый микросферолит. Во всех этих случаях появление данного маркера предшествовало клиническому проявлению продолженного роста в среднем на 2 месяца. У одного больного волнистый микросферолит был выявлен через 1 год после завершения лучевой терапии, но при ежемесячных осмотрах, включая проведение УЗИ шеи и органов брюшной полости, КТ грудной клетки, не было получено данных за продолженный рост либо метастазирование. Только через 5 месяцев после обнаружения данного маркера при повторном КТ грудной клетки были выявлены метастазы в легкие. Кроме того, среди пациентов получавших лучевую терапию, в одном случае волнистый микросферолит был выявлен через 3 месяца после завершения лечения, без клинического подтверждения прогрессирования заболевания. В настоящее время сроки наблюдений за этими пациентами составляют четыре-пять месяцев и обследование продолжается. Следует отметить, что из одиннадцати больных с клинически выявленной прогрессией двух заболевания пациентов и наличием данный маркер «волнистого» микросферолита, у обнаруживался одновременно с клиническими признаками, а у девяти - на два месяца раньше. Из проведенных наблюдений следует, что «волнистый» микросферолит выявлялся у больных раком гортани независимо от возраста и вида проводимого лечения. Данный маркер обнаруживался до начала лечения, на разных этапах лучевой терапии (после первого курса, окончания лучевой 73 терапии), в отдаленные периоды после ее завершения. Однако результаты проведенных нами исследований показывают, что в большинстве случаев появление «волнистого» микросферолита указывает на неблагоприятное течение онкологического процесса (р=0,043). 74 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Рак гортани составляет 2,6% в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди мужского населения, а среди опухолей Лор-органов занимает лидирующую позицию. Заболеванию более подвержены мужчины в возрасте от 50 до 70 лет [29, 90, 135]. Диагноз рака гортани устанавливается на основе жалоб, анамнеза, данных осмотра методами непрямой ларингоскопии и фиброларингоскопии, лучевых методов исследования. Золотым стандартом является гистологическое исследование образования. С конца ХХ века ведутся активные исследования по поиску лабораторных тестов выявления онкомаркеров - продуктов метаболизма опухолевых клеток, определение которых позволило бы не только диагностировать присутствие опухоли в организме человека, но и контролировать эффективность лечения. Количество онкомаркеров, предлагаемых для диагностики рака, постоянно растет, но на сегодняшний день идеальный опухолевый маркер так и не найден. Несмотря на появление новых диагностических возможностей более 60% опухолей гортани выявляется на III, IV стадиях, а смертность в течение первого года после установления диагноза составляет 33% [57]. Вместе с тем, успех лечения онкологических больных всех возрастов напрямую зависит от сроков выявления опухоли. Особого внимания заслуживает проблема выбора наиболее оптимального метода лечения рака гортани у пациентов старшего возраста. Сопутствующая соматическая патология зачастую ограничивает возможности и утяжеляет прогноз лечения, особенно при распространенных формах заболевания, требующих проведения обширных хирургических операций. Остается нерешенной проблема мониторинга за больными после завершения лечения, с целью наиболее раннего выявления продолженного роста опухоли и метастазирования. 75 Таким образом, сохраняется актуальность поиска новых методов диагностики рака гортани, позволяющих на ранних стадиях заболевания выявлять признаки злокачественного роста, оценивать эффективность терапии и прогнозировать генерализацию онкологического процесса. Цель исследования: разработать диагностические критерии активности злокачественного процесса по морфологической картине сыворотки крови и оценить их значение в выборе оптимального способа лечения для больных раком гортани среднего и старшего возраста. Задачи исследования состояли в следующем: необходимо было исследовать анизотропные морфотипы сыворотки крови и оценить их значимость в определении активности злокачественного процесса; изучить динамику активности злокачественного процесса на этапах обследования, хирургического лечения, лучевой терапии и амбулаторного наблюдения по морфологической картине сыворотки крови; установить зависимость эффективности хирургического и лучевого лечения от исходного состояния злокачественного процесса (активный рост, дегенеративно-дистрофический процесс); сопоставить клинические и морфологические признаки прогрессии злокачественного роста. В исследование были включены 70 больных раком гортани (38 человек старшего и 32 человека среднего возраста) поступивших в ЛОР-отделение МОНИКИ им М.Ф. Владимирского, в период с февраля 2011 г. по июль 2013. По результатам гистологического заключения во всех случаях верифицирован плоскоклеточный рак. У большинства больных (70%) диагностированы III-IV стадии заболевания. Помимо общепринятого клинического обследования всем больным, при поступлении в стационар, проводилось морфологическое исследование сыворотки крови методом краевой дегидратации. Динамическое наблюдение на этапах лечения и после его завершения на протяжении двух лет было проведено у 61 больного. При изучении состава анизотропных морфотипов сыворотки крови больных раком гортани при поступлении в стационар было выявлено два 76 основных морфологических маркера: маркер злокачественного роста и маркер дегенеративно-дистрофического процесса. При этом маркер дегенеративно-дистрофического процесса определялся у всех больных, тогда как маркер злокачественного роста был выявлен у 75% больных среднего и 53% - старшего возраста. Полученные данные, а именно, оценка состояния опухолевого процесса как активный злокачественный рост или дегенерация, отражают взаимоотношения опухоли и организма. Из литературных источников известно, что с одной стороны опухолевая клетка синтезирует большое количество ферментов, их ингибиторов и активаторов, соотношение ингибиторов и активаторов определяет состояние опухоли: ее рост или стабильное состояние [51]. С другой стороны, опухолевая болезнь всегда сопровождается локальным и системным деструктивными процессами. Локальный деструктивный процесс обусловлен инвазивным ростом опухоли, который происходит за счет разрушения экстрацеллюлярного матрикса, а также гибелью клеток опухоли вследствие апоптоза и некроза из-за воздействия иммунологических факторов и недостаточного кровоснабжения. Доля некротизированных клеток растет по мере увеличения размеров опухоли. Системный деструктивный процесс обусловлен действием опухоли на весь организм: опухоль конкурирует с органами и тканями, непосредственно не затронутыми опухолевым процессом, за метаболиты (глюкозу, витамины, железо, азотистые основания и др.). В результате воздействия опухоли на организм нарастает дистрофия тканей из за дефицита глюкозы, азотистых оснований, обусловленного гипогликемическим давлением опухоли и высокой активностью в ней синтетических процессов. Дефицит αтокоферола, потребляемого опухолью, вызывает избыток перекисей липидов в результате их повреждающего действия на мембраны, происходит выход лизосомальных гидролаз в цитозоль тканей, что обуславливает усиленный распад белков [51, 52]. Деструктивный процесс у пациентов старшего 77 возраста вызван не только воздействием опухоли, но и инволютивными изменениями органов и тканей, обусловленных возрастной ишемией в результате атеросклеротических изменений. Морфологический анализ структур сыворотки крови позволяет оценить качество продукции, т.е. белковых молекул, синтезируемых клетками самой опухоли и всего организма в целом. Это дает возможность не только выявить признаки злокачественной опухоли в организме человека, но и определить, какие процессы превалируют в организме и в самой опухоли на этапе исследования. В ходе дальнейших исследований была прослежена смена морфологических маркеров активности опухолевого процесса на этапах лечения и амбулаторного наблюдения у 61 больных. Из них у 17 проведено хирургическое лечение (восемь человек средней, девять - старшей возрастных групп), у всех больных диагностирован продолженный рост опухоли после проведенной лучевой терапии по радикальной программе. У 13 - комбинированное лечение (шесть человек средней, семь - старшей возрастных групп), хирургическая операция первым этапом с последующей лучевой терапией. У 31 - лучевая терапия (15 человек средней, 16 - старшей возрастных групп). Морфологическое исследование сыворотки крови, полученной из локтевой вены, проводили после каждого этапа лечения (при лучевой терапии после каждого курса: 20-46 Гр; 69-70 Гр, при выполнении хирургической операции - в до и послеоперационном периоде). Далее исследования продолжались при амбулаторном наблюдении за пациентами ежемесячно на протяжении двух лет. Сопоставление клинических данных и результатов морфологических исследований показало, что эффективность лечения в обеих возрастных группах зависела от того, в каком состоянии – рост или дегенерация (по морфологии сыворотки крови), находится опухоль в период начала лечения. При этом среди пациентов старшего возраста значительно чаще выявлялся 78 маркер дегенеративно-дистрофического процесса. Так, у больных, получивших хирургическое лечение, неблагоприятный исход заболевания в обеих возрастных группах, отмечался только у больных с наличием маркера злокачественного роста до начала лечения. Следует особо подчеркнуть, что у всех больных, по данным гистологического исследования операционного материала, опухоль была удалена в пределах здоровых тканей. Однако результаты морфологического исследования проведенной операции, показали, что сыворотки крови, после маркер злокачественного роста сохранялся. И только через несколько месяцев у больных выявлялись отдаленные метастазы. В группе больных с комбинированным лечением (первый этап – хирургический) и среднего и старшего возраста, также отмечены лучшие результаты при наличии маркера дегенеративно-дистрофического процесса до лечения. В группе больных, получавших лучевую терапию, зарегистрированы противоположные результаты. В подгруппе с исходно выявляемым маркером злокачественного роста отмечен постепенный переход к дегенеративнодистрофическому состоянию опухоли под действием лучевой терапии в обеих возрастных группах, что было ожидаемо и закономерно. Но среди больных среднего возраста, в одном случае, при очередном исследовании морфологической картины сыворотки крови, через один месяц после завершения лучевой терапии, вновь был выявлен маркер злокачественного роста, без клинически подтвержденного продолженного роста. Клинически продолженный рост опухоли был диагностирован только через два месяца. В группе больных с исходно дегенеративно-дистрофическим процессом опухоли в ходе лучевой терапии у семи больных (один пациент среднего и шесть - старшего возраста) на разных этапах регистрировался маркер злокачественного роста. При этом, в двух случаях отмечено транзиторное появление маркера злокачественного роста после проведения первого курса лучевой терапии с последующим его исчезновением, т.е. 79 возвратом процесса в дегенеративно-дистрофический. В этих случаях в течение двух лет наблюдался положительный эффект. В пяти случаях (все пациенты старшего возраста, четверо со стадией заболевания -Т3N0М0, один - Т2N0М0) маркер активного злокачественного роста сохранялся в течение всего курса лучевой терапии или обнаруживался в ранние сроки после завершения лечения. У четырех из этих пяти больных выявлен продолженный рост опухоли в сроки от одного до двух месяцев после завершения лучевой терапии, у одного (Т3N0М0) отдаленные метастазы обнаружены через 1 год. При статистическом анализе наличием результатов лечения маркера злокачественного роста пациентов с в группах хирургического и комбинированного лечения достоверных различий не выявлено (P=1). В обеих группах результаты лечения были лучше у пациентов с маркером дегенеративно-дистрофического процесса. При сопоставлении результатов лечения больных с наличием маркера злокачественного роста в группах хирургического и лучевого лечения выявлено, что результаты лечения у больных с маркером злокачественного роста достоверно лучше при лучевой терапии по сравнению с результатами хирургического лечения (р=0,02). При сравнении результатов лечения больных с маркером злокачественного роста в группах комбинированного лечения и лучевой терапии, лучшие результаты также оказались в группе лучевой терапии (Р=0,05). При анализе результатов лечения больных с маркером дегенеративнодистрофического процесса выявлена обратная зависимость, результаты лечения таких больных в лучевой группе оказались достоверно хуже, чем результаты хирургического и комбинированного лечения (p=0,01). При помощи корреляционного анализа Пирсена в группах хирургического и комбинированного лечения выявлена прямая умеренная зависимость между видом процесса в опухоли (злокачественный рост или 80 дегенеративно-дистрофический процесс) и эффективностью лечения (r=0,447, р=0,013). В группе больных с лучевой терапии выявлена прямая зависимость между активностью опухоли и эффективностью лечения (r=0,247, р<0,05). Полученные данные находят объяснения в литературных источниках. Известно, что часть клеток в новообразовании находится вне митотического цикла, в состоянии покоя. В этот момент они резистентны к химиопрепаратам и лучевой терапии. Наличие таких покоящихся клеток обуславливает развитие рецидивов после проведения лечения. При малых дозах лучевой терапии и химиопрепаратов начинают размножаться клоны клеток, устойчивых к терапии. Повышение дозы ЛТ усиливает деструктивные процессы в опухоли. После окончания лучевого воздействия еще какое-то время продолжают нарастать изменения в опухоли [148]. Таким образом, морфологическое исследование сыворотки крови позволяет не только прогнозировать эффективность лечения онкологического больного, но и проводить динамический контроль за больными после завершения лечения в целях раннего выявления продолженного роста и метастазирования. Помимо маркеров активного злокачественного роста и дегенеративнодеструктивного процесса, при ретроспективном анализе морфологической картины крови двенадцати больных раком гортани с прогрессированием заболевания, на всех этапах лечения, у одиннадцати из них были выявлены особые, не обнаруживаемые ранее микросферолиты. Выявленные микросферолиты располагались изолированно (не в комбинации с макросферолитами) и характеризовались наличием волнистых структур («волнистый» микросферолит). «Волнистый» микросферолит выявлялся у больных независимо от возраста и вида проводимого лечения в различные сроки: до начала лечения, в послеоперационном периоде, на этапах лучевой терапии, а так же отдаленные периоды после ее завершения. Следует отметить, что из одиннадцати больных с клинически выявленной 81 прогрессией заболевания и наличием «волнистого» микросферолита, у двух пациентов данный маркер обнаруживался одновременно с клиническими признаками, а у девяти - на два месяца раньше. Их появление в сыворотке крови больных мы расценивали как признак прогрессии опухоли. Согласно теории L. Foulds, сформулированной еще в 1969 году, в опухоли происходит постоянный стадийный прогрессирующий рост [20]. В в 1988 г. доказал, что при ходе дальнейших исследований P. Nowell прогрессии опухоли может происходить ее клональная эволюция [48]. В результате вторичных мутаций могут появляться новые клоны опухолевых клеток, что приводит к поликлоновости опухоли и доминированию наиболее агрессивных клонов. Считаем, что выявленный нами с помощью метода краевой дегидратации сыворотки крови «волнистый» микросферолит является маркером прогрессии новообразования, структура появление в вырабатываемых крови больного доминирующим качественно более которого отражает новых макромолекул, злокачественным клоном опухолевых клеток (р=0,043). 82 Выводы 1. Диагностическая технология - морфологический анализ биологических жидкостей - позволяет получить информацию молекулярного уровня, формирующуюся в наиболее ранних фазах заболевания, что отличает ее от клеточных технологий, регистрирующих надмолекулярные изменения в тканях, которые развиваются в более поздних периодах патологического процесса. 2. У больных раком гортани в старших возрастных группах преобладает высокодифференцированный плоскоклеточный рак, тогда как у больных средней возрастной группы – умеренно дифференцированный. Корреляция между возрастом больных и локализацией опухоли в гортани статистически незначима. 3. Среди анизотропных морфотипов сыворотки крови больных раком гортани выявлены три вида маркерных структур: маркер активного роста злокачественной опухоли (патологическая агрегация макросферолита и зернистого микросферолита с одинаковой степенью анизотропии); маркер дегенеративно-дистрофического процесса (та же агрегация, но с разной степенью анизотропии); маркер прогрессии злокачественного роста («волнистый» микросферолит вне агрегации). Установлено, что у больных раком гортани старших возрастных групп достоверно чаще выявлялся маркер дегенеративно-дистрофического процесса по сравнению с больными среднего возраста. 4. Состояние активности опухолевой ткани (активный рост или дегенеративно-дистрофический процесс) служит важным критерием выбора определенного вида лечения: в фазу дегенеративно-дистрофического процесса рака гортани наиболее благоприятный эффект дает хирургическое лечение, а в период активной фазы злокачественного роста - лучевая терапия. 83 5. Выявление «волнистого» микросферолита у больных раком гортани указывает на прогрессию злокачественного роста и позволяет диагностировать эту фазу развития опухоли на два месяца раньше еѐ клинической манифестации. 6. Морфологическое исследование сыворотки крови позволяет выявить специфические критерии злокачественного роста, указывающие на фазу его активности, устанавливать наиболее эффективный вид лечения больного раком гортани, проводить динамический контроль после завершения лечения в целях раннего выявления продолженного роста и метастазирования. 84 Практические рекомендации 1. Для выбора наиболее эффективного способа лечения больных раком гортани на этапе обследования следует проводить морфологическое исследование сыворотки крови с целью определения активности опухолевого процесса. 2. При выявлении дегенеративно-дистрофической фазы опухолевого процесса у больных раком гортани предпочтительнее проводить хирургическое лечением первым этапом. 3. При выявлении фазы активного опухолевого процесса предпочтительнее проводить лучевую терапию первым этапом. 4. В комплекс диагностических мероприятий при мониторинге больных раком гортани после завершения лечения следует включать морфологическое исследование сыворотки крови. 5. При выявлении морфологического маркера прогрессии злокачественного роста в сыворотке крови больных раком гортани следует проводить коррекцию терапии. 85 Список литературы 1. Азнаурян, А.М. Разработка неинвазивных методов диагностики при хроническом гнойном среднем отите с холестеотомой / Азнайрян А.М. // Российская оториноларингология. - 2007. - №1. - С. 14. 2. Акопян, Л.О. Сравнительная характеристика кристаллографической картины слезы у здоровых и у больных глаукомой / Л.О. Акопян // Глаукома. - 2005. - №1. - С. 10-12. 3. Аладин, А.С. Хирургия рецидивного рака гортани. Роль пекторального лоскута / А.С.Аладин, О.С. Элбакидзе // Онкохирургия 2013. V5. - №1. - С. 22. 4. Алиметов, Х.А. 20- летний опыт пластической хирургии рака голосовой складки / Х.А. Алиметов, Л.И. Салимов, А.Х. Алиметов // Материалы ХVIII съезда оториноларингологов России; [гл. ред. Ю.К. Янов] – Спб.: Российское общество оториноларингологов, 2011. - Т.3. - С.320. 5. Антропова, И.П. Кристаллизация биожидкости в закрытой ячейке на примере слюны / Антропова И.П. // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - № 8. - С. 36-38. 6. Балмуханов, С.Б. Общий белок, натрий и калий в клетках асцитной опухоли С-37 мышей при воздействии ионизирующего излучения и радиосенсибилизирующих средств/ С.Б. Балмуханов, М.И. Сысоева, Л.С. Сцлаева и др.// Вопросы онкологии и радиологии. - Алма-Ата, 1975. - С. 329 334. 7. Барер, Г.М. Вариабельность кристаллических агрегатов ротовой жидксти в норме / Г.М. Барер, А.Б. Денисов, Т.М. Стурова // Российский стоматологичекский журнал. - 2003. - №1. - С.33-35. 8.Белоглазов, В.Г. Возможности применения метода кристаллографии слезы при патологии слезоотводящей системы / В.Г. Белоглазов, Е.Л. Атькова, А.А. Федоров // Вестник офтальмологии. - 2003. - №4. - С. 49 - 51. 86 9. Бережная, Р.М. Система интерлейкинов и рак./ Р.М. Бережная, В.М. Чихун . - Киев: ДИА,2000. - 224 с. 10. Бичурина, Т.А. Результаты комплексной диагностики хронического гиперпластического ларингита / Т.А Бичурина, И.В. Литвиненко// Российская оториноларингология. - 2009. №4. - С. 33 - 38. 11.Битюцкий, П.Г. Оценка онкологических и функциональных результатов использования модификаций функционально-щадящих операций у больных раком гортани / П.Г. Битюцкий, Е.И. Трофимов, В.В. Милованов // Сб. трудов: Актуальные вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей головы и шеи. - М. - 1991. - С. 86-89. 12. Балукова О.В., Папилломавирусная инфекция в предопухолевых и опухолевых образованиях гортани/ О.В. Балукова, Л.Н. Щербак , Н.А. Савелов и др. // Вестник оториноларингологии. - 2004. - Т.1. - С. 36 - 38. 13. Берштейн, Л.М. О суточном содержании натрия и калия в моче больных раком легкого/Л.М. Берштейн//Вопросы онкологии. - 1970. - №1. -С. 38 - 42. 14. Быкова, В.П. Опухоли гортани. Патологоанатомическая диагностика опухолей человека / Под ред. Н.А. Краевского, А.В. Смольянникова, Д.С. Саркисова. - М: Медицина, 1993. - Т.1. - С. 443 - 457. 15. Васильев, П.В. МСКТ семиотика рака гортани / П.В. Васильев, А.Л. Юдин, А.М. Сдвижков, Л.Г. Кожанов // Вестн. Рентгенологии радиологи. 2007. - №5. - С. 4 - 8. 16. Васильев, компьютерной П.В. томографии дифференциальной Значение с диагностике мультиспиральной внутривенным рака рентгеновской контрастированием гортани и гортаноглотки в с опухолевидными образованиями другой этиологии / П.В. Васильев, А.Л. Юдин // Мед. визуализация. - 2009. - №3. - С. 119 - 128. 17. Винорадов, В.В. Новый взгляд на этапность комбинированного лечения рака гортани и гортаноглотки Т3-4N1-3М0 / В.В. Виноградов, А.Л. Клочихин // Вестник оториноларингологии. - 2012. - №1. - С. 15-18. 87 18. Воробьев, А.В. Общие вопросы скрининга / А.В. Воробьев, А.Э. Протасова //Практическая онкология. - 2010. - Т.11, № 2. - С. 53 - 59. 19. Волченко, Н.Н. Цитологический метод в выявлении метастатическогопоражения лимфатических узлов / Н.Н. Волченко,З.Д. Гладунова, Е.Н. Славнова, А.Г. Ермолаева, В.Ю. Мельникова // Российский онкологический журнал. 2010. - №3. - С. 9-12. 20. Ганцев, Ш.Х. Патология и морфологическая характеристика опухолевого роста. Учебное пособие / Ш.Х. Ганцев, Ш.М. Хуснутдинов. Москва.: Медицинское информационное агентство, 2003. - 208с. 21. Глыбочко, П.В. Молекулярные маркеры в диагностике мышечнонеинвазивного рака мочевого пузыря / П.В. Глыбочко, Н.К. Шахпазян, А.Н. Понукалин, Н.Б. Захарова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. №5. - С. 16 - 20. 22. Головин, Д.И. Ошибки и трудности гистологической диагностики опухолей. / Д.И. Головин. - Ленинград.: Медицина, Ленинградское отделение, 1982. - С. 96 - 113. 23. Гольбрайх, Е. О формировании узора трещины в свободно высыхающей пленке водного раствора белка / Е. Гольбрайх, Е.Г. Рапис, С.С. Моисеев // Журнал технической физики. - 2003. - Т. 73, вып. 10. - С. 116 121. 24. Горбань, Н.А., Экспрессия антигена Кi-67 и белка р53 как показателей агрессивности течения плоскоклеточного рака гортани/ Н.А. Горбань., В.П. Тен ., В.А. Панкратов // Вопросы онкологи. - 2007. - Т. 53. №6. - С. 668 - 673. 25. Горбань, иммуногистохимическая Н.А. Клинико-морфологическая характеристика и прогностические и критерии плоскоклеточного рака гортани: автореф. дис. канд. мед. наук / Н.А. Горбань. - М., 2008. - 25 с. 88 26. Громов, В.В. Клиническая онкология / В.В. Громов, Н.Н. Мацар . Краткое руководство для практических врачей ответ ред Ю.А. Ратнер. Казань.: Казанский государственный институт усовершенствования врачей им В.И. Ульянова-Ленина, 1970. - Т1. - 626с. 27. Давыдова, И.И. Оценка отдаленных результатов лечения рака гортани с полимерным эндопротезированием / И.И. Давыдова // Российская оториноларингология. - 2007. - №1(26). - С. 58 - 60. 28. Давыдова, М.Г. Проблема лечения папилломатоза гортани как предракового состояния / М.Г. Давыдова, В.В. Виноградов, С.С. Решульский // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 83. 29. Дайхес, Н.А. Клиническая патология гортани: Руководство-атлас для последипломного обучения специалистов научных, лечебных и учебных медицинских учреждений / Н.А. Дайхес, В.П. Быкова, А.Б. Пономарев, Х.Ш. Давудов. - М.: Медицинское информационон агенство, 2009. - 160с. 30. Дасаева, Л.А. Выявление больных на ранних стадиях мочекаменной болезни и оценка эффективности их лечения с помощью литос системы /Л.А. Дасаева, С.Н. Шатохина, Е.М. Шилов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2003. - №9. - С40 - 41. 31. Деев, Л.А. Структурные особенности твердой фазы внуриглазной жидкости у лиц пожилого возраста с различными стадиями глаукомы / Л.А. Деев,В.Н. Шабалин, С.Н. Шатоина // Актуальные проблемы геронтологии. М., 1999. - С. 181-183. 32. Де Же В. Физические свойства жидкокристаллических веществ. / Де Же В. - М.: Мир, 1982. - 75с. 33. Денисов, А.Б. Кристаллические агрегаты ротовой жидкости у больных с патологией желудочно-кишечного тракта / А.Б. Денисов, Г.М. Барер, Т.М. Стурова // Российский стоматологический журнал. - 2003. - №2. С. 27 - 29. 89 34. Деньгина, Н.В. Применение альтернативной схемы химиолучевого лечения больных плоскоклеточным раком головы и шеи / Н.В.Деньгина, О.В. Шабалина, А.С. Хацкевич // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 33. 35. Жуковец, А.Г. Интраоперационная диагностика метастазов в лимфатических узлах шеи / А.Г. Жуковец, Т.В. Францкевич, В.Н. Чалов, М.А. Возмитель // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 36. 36. Залеский, М.Г. Физико-химические закономерности структуризации капли биологической жидкости на примере диагностикума «Литос-система» / М.Г. Залеский, В.Л. Эмануэль, М.Ф. Краснова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №8. - С. 20 - 24. 37. Заридзе, Д.Г. Канцерогенез./ Д.Г. Заридзе. - Москва.: научный мир, 2000. - 418 с. 38. Имянитов, Е.Н. Молекулярная онкология: клинические аспекты. / Е.Н. Имянитов, К.П. Хансон . - СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2007. 211с. 39. Исмагулова, Э.К. Разрешающие возможности лучевых методов исследования в диагностике опухолей глотки / Э.К. Исмагулова, В.Ф. Антониев // Вестник оториноларингологии. - 2005. - №1. - С. 38. 40. Какурина, Г.В. Анализ протеома сыворотки крови больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи / Г.В. Какурина, И.В. Кондакова, Е.Л. Чойнзонов, О.В. Черемисина // Онкохирургия 2013. - V5. №1. - С. 38. 41. Каликштейн, Д.Б. Кристаллографическое исследование биологических субстратов / Д.Б. Каликштейн, Л.А. Мороз, Н.Н. Квитко, Н.Е. Шмелева, Б.А. Павлов // Клиническая медицина. - 1990. - № 4. - С. 28 - 31. 42. Калинин, А.П. О кристаллографическом исследовании сыворотки крови при некоторых эндокринных заболеваниях / А.П. Калинин, Л.А. Мороз, С.А. Макеев // Советская медицина. - 1987. - № 7. - С. 36 - 39. 43. Камакин, Н.Ф. Характеристика тезиокристаллоскопического портрета биологических жидкостей организма человека в норме и при 90 патологии / Н.Ф. Камакин, А.К. Мартусевич // Вестник новых медицинских технологий. - 2003. - Т.10, № 4. - С. 57 - 59. 44. Каприн, А.Д. Злокачественные новообразования в России в 2012г (заболеваемость и смертность)./ А.Д. Каприн, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. -М.:ФГБУМНИОИ им П.А. Герцена Минздрава России, 2014.-250с. 45. Киселев, Ф.Л. Вирус-ассоциированные опухоли человека/ Ф.Л. Киселев // Биохимия. - 2000. - №65. - С. 68-77. 46. Кицманюк З.Д., Чойнзонов Е.Л., Новиков В.А., Карасаева В.В. Злокачественные опухоли головыи шеи. - Томск:SST, 1998. - 384 с. 47. Клочихин, А.Л. Оценка отдаленных результатов лечения рака гортани с применением полимерного эндопротезирования / А.Л. Клочихин, Е.И. Трофимов, И.И. Давыдова // Вестник оториноларингологии. - 2010. №1. - С. 26 - 28. 48. Коган, Е.А. Автономный рост и прогрессия опухолей/ У.А. Коган // Российский журнал гастроентерологии, гепатологии, колопроктологии.2002. - №4. Т. 12. - С. 45 - 49. 49. Коваленко, С.Н. Иммуногистохимическая диагностика степени дисплазии эпителия гортани / С.Н. Коваленко, Л.М. Михалева, А.С. Лапченко и др. // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 85. 50. Ковтуненко, А.В. Прогностическое значениемолекулярных маркеров у больных раком гортани относительно метастазирования / А.В. Ковтуненко, С.Н. Тымчук, Б.В. Шпортько // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. С. 86. 51. Коган, Е.А. Межклеточные взаимодействия при опухолевом росте // М.А. Пальцев, А.И. Иванов. Межклеточные взаимодействия.- М.: Медицина, 1995. - С. 127 - 189. 52. Коган, Е.А. Опухолевый рост. Патологическая анатомия: Курс лекций / Под ред. В.В. Серова, М.А. Пальцева.- М.: Медицина, 1998. - С. 224 - 247. 91 53. Кожанов, Л.Г. Клиническое значение эхосонографии гортани в диагностике рака / Л.Г. Кожанов, А.М. Сдвижков, М.В.Мулярец, Е.С. Романова // Вестн. Оториноларингологии. - 2008. - №2. - С. 46 - 49. 54. Кожанов, А.Л. К вопросу диагностики рака гортани /А.Л. Кожанов.// Вестник оториноларингологии. - 2011. - №5. - С. 289. 55. Кожанов, Л.Г. Онкологические результаты резекций гортани с эндопротезированием.// Л.Г. Кожанов, Е.С. Романова// Вестник оториноларингологии. - 2011. - №5. - С. 291. 56. Кожанов, Л.Г. Принципы ранней диагностики злокачественных новообразований ЛОР органов / Л.Г. Кожанов, Н.Х. Шацкая, Л.А. Лучихин // Вестник оториноларингологии. - 2008. - №5. - С. 7 - 10. 57. Кожанов, Л.Г. Клиническое значение мультиспиральной рентгеновской компьютерной томографии при планировании лечения у больных раком гортани/ Л.Г. Кожанов, А.Л.Юдин, О.А. Кушхов // Опухоли головы и шеи. - 2012. - №1. - С. 28-31. 58. Кожанов, Л.Г. Клинические аспектымультиспиральной рентгеновской компьютерной томографии при раке гортани / Л.Г. Кожанов, А.Л. Юдин, О.А. Кушхов, А.Л. Кожанов // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. С.39. 59. Колединцев, М.Н. Современные методы анализа слезной жидкости. / М.Н. Калединцев, Н.В. Майчук // Новое в офтальмологии. – 2002. - №4. - С. 32 - 37. 60. Кондакова, И.В. Молекулярные маркеры прогноза течения течения и эффективности лучевой и химиолучевой терапииплоскоклеточного рака головы и шеи / И.В. Кондакова, Л.В. Спирина, Е.В. Клишо и др. // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 39. 61. Корниенко, А.М. К вопросу о классификации предраковых заболеваний гортани./ А.М. Корниенко, Р.А. Корниенко, А.А. Хасанов// тез. докл. Х научно-практическая конференция: Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии. - М. - 2012. - С25. 92 62. Кулагин, Р.Н. Дифференцировка и пролиферация клеток рака гортани (иммуногистохимическое исследование) автореферат канд мед наук Санкт-Петербург 2000. - 24 с. 63. Кулагин, Р.Н. C-myc в плоскоклеточном раке гортани / Р.Н. Кулагин, С.В. Петров, А.Р. Уткузов // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 87. 64. Курышова, Н.И. Кристаллография слезной жидкости как метод прогнозирования риска развития катаракты у больных первичной глаукомой / Н.И. Курышева, М.Н. Колединцев // Вестник офтальмологии. - 1999. - №5. С. 5-6. 65. Кушлинский, Н.Е. Опухолевый рост / Н.Е. Кушлинский // Патофизиология гл.12.3; под ред. В.В. Новицкого, Е.Д. Гольдберга. - Томск. : 2001. - 716с. 66. Ларин, Р.А. Осложнения при выполнении расширенной/ комбинированной ларингэктомии / Л.А. Ларин, А.В. Шахов // Материалы ХVIII съезда оториноларингологов России; [гл. ред. Ю.К. Янов] – Спб. : Российское общество оториноларингологов, 2011. - Т.3. - С. 360 - 362. 67. Литвиненко, И.В. Воможности магнитно-резонансной томографии гортани (обзор литературы)/И.В. Литвиненко, Т.А. Бичурина//Российская оториноларингология. - 2012. - №2(57). - C. 168 - 172. 68. Литвиненко И.В. Роль лучевых методов в дифференциальной диагностике гиперпластических процессов и рака гортани. Автореферат дис на соискание канн мед наук Москва 2010., 24 с. 69. Лялина, Л.В., Вяткина Г.П., Петрова Т.Ф. и др. Проблемы эпидемиологической новообразований, диагностики и ассоциированных профилактики с злокачественных хроническими вирусными инфекциями/ Л.В. Лялина, Г.П. Вяткина, Т.Ф.Петрова и др. // Проблемы эпидемиологической новообразований, диагностики и ассоциированных профилактики с злокачественных хроническими вирусными инфекциями. - 2003. - №4(4). - С. 147 - 151. 93 70. Маджидов, М.Г. Современные подходы к диагностике и лечению местнораспрастранненого рака гортаноглотки (T3-4 N0-3M0) / М.Г. Маджидов автореферат докт. мед. наук Москва 2005. - 45с. 71. Мартусевич, А.К. Исследование Кристаллоенеза биосубстратов как способ раскрытия их информационной емкости / А.К. Мартусевич // Успехи современного естествознания. - 2006. - № 9. - С. 86. 72. Марченко, М.Г. Сравнительная характеристика методов диагностики регионарных метастазов рака гортани и их значение для выбора методов лечения //М.Г. Марченко, Е.И. Трофимов, В.В. Виоградов // Материалы ХVIII съезда оториноларингологов России; [гл. ред. Ю.К. Янов] – Спб.: Российское общество оториноларингологов, 2011. - Т.3. - С. 363 - 366. 73. Матакова, И.С. Результаты химиолучевого лечения рака гортани Т3N0М0 / И.С. Матакова // Материалы VIII Российского онкологического конгресса. - М. - 2004. 74. Махов, В.А. Патогенетическое значение острофазовых белков и провоспалительных цитокинов в диагностике предраковых заболеваний и рака гортани. Авторев. канд. мед. наук Новосибирск, 2004. 75. Мацко, Д.Е. Современные методы в практической онкоморфологии / Д.Е. Мацко, К.В. Шелихова // Практическая онкология. - 2007. - Т.8, № 1 .С. 182- 187. 76. Машкова, Т.В. Влияние возрастных изменений тканей гортани на пути малигнизации предрака / Т.А.Машкова, Н.А. Знаткова // Новости клинической цитологии России. - 1998. - Т3 - 4. - С. 133. 77. Мингалев, Н.В. особенности рака гортани Клиническое и иммуноморфологические в диагностике, прогнозировании течения заболевания и выборе метода лечения: Дисс.. д-ра мед наук /Н.В. Имнгалев.Новокузнецк, 1998. -256с. 78. Митрейкин, В.Ф. Цитокины и их роль в развитии типовых патологических процессов.\ В.Ф. Митрейкин, Н.М. Калинина, С.В. 94 Фабричников, Н.И. Фабричникова.-Под. ред. С.А. Кетлинского, Н.Н. Петрищева. СПб.: Изд-во СПбГМУ, 2000. - 77 с. 79. Мороз, Л.А/ Кристаллографический метод исследования биологических субстратов / Л.А. Мороз, И.Л. Теодор, В.Е Брык и др. Методические рекомендации. - М.,1981. - 16 с. 80. Мулярец, М.В./ Ультразвуковая диагностика рака гортани / М.В. Мулярец, Л.Г. Кожанов, А.М. Сдвижников, Н.Х. Шацкая // Вестник оториноларингологии. - 2011. - №5. - С 293. 81. Мустафаев, Д.М. Хирургическое лечение больных раком гортани / Д.М. Мустафаев, В.М. Свистушкин, Х.Ш. Давудов и др. // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 91. 82. Нажмудинов, И.И. К вопросу о лечении предраковых заболеваний гортани / И.И. Нажмудинов // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 91. 83. Найден, А.Л. Методы дифференциальной диагностики предопухолевых состояний и опухолевых заболеваний гортани/ А.Л. Найден, Т.Л. Остринская В.А. Куква// Российская оториноларингология. -2012. №2(57). - С. 105 - 110. 84. онкологии/ Нейман, И.М. И.М. Об Нейман, основных С.А. направлениях Гулиева.-Баку.: теоретической Озербайджанское государственное издательство, 1990. - 93 с. 85. Неретин, В.Я. Кристаллографический метод исследования спинномозговой жидкости при заболеваниях центральной нервной системы / В.Я. Неретин, В.А. Кирьяков // Советская медицина. - 1977. - № 7. - С. 96103. 86. Новожилова, Е.Н. Хирургические аспекты восстановления голосовой функции у больных после ларингофарингэктомии / Е.Н. Новожилова, Н.П. Забазный, М.Н. Журавлев, С.А. Сергеев, А.С. Бурлаков, А.В. Сороколетов, И.Ф. Чумаков, В.В. Радлевич, И.В. Кузьмин // Российский онкологический журнал. - 2008. - №2. - С. 13 - 15. 95 87. Ольхова, Е.Б. Ультразвуковое исследование гортани: возможности, перспективы, ограничения / Е.Б. Ольхова, Ю.Л. Солдатский, Е.К. Онуфриева, Н.В. Щепин // Вестник оториноларингологии. - 2009. - №5.-С. 9 - 12. 88. Осипов В.Д. Роль неспецифических опухолевых маркеров и клинико-морфологических показателей в диагностике и лечении предрака и раннего рака гортани. Автореферат дис. на соискание уч. степени доктора мед. наук Томск 2006 г. - 37 с. 89. Пальцев, М.А. Атлас патологии опухолей человека / М.А. Пальцев. – М: Медицина, 2005. - 424 с. 90. Пачес, А.И. Опухоли головы и шеи. / А.И. Пачес. – 4-е изд. - М. : Медицина, 200. - 480 с. 91. Пашинский, В.Г. Водно-солевой обмен и рак/. В.Г. Пашинский. Томск, 1981. - 256 с. 92. Перелыгин, К.В. Отделенные результаты органосохраняющих операций в оценке качества жизни больных опухолями гортани / К.В. Перелыгин, Б.В. Куц // Российская оториноларингология. - 2007. - №1 (26). С. 141 - 144. 93. Плаксина, Г.В. Кристаллооптический метод оценки адекватности перитонеального диализа у больных с хронической почечной недостаточностью / Г.В. Плаксина, О.Н. Ветчинникова, Н.Г. Морозова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №10 . - С. 55. 94. Погосов, В.С. Рак гортани./В.С. Погосов, С.И. Алексеева. - учебное пособие Москва 1971. 28 с. 95. Поддубный, Б.К. Диагностическая и лечебная эндоскопия верхних дыхательных путей / Б.К. Поддубный, Н.В. Белоусова, Г.В. Унгиадзе. – М.: Практич. Медицина, 2006. - 256 с. 96. Постникова. И.В. Перспективы применения комплексного кристаллографического исследования биологических жидкостей / И.В. Постникова // Успехи современного естествознания. - 2007. - № 6. С. 91 - 92. 96 97. Потехина, Ю.П. Кристаллография и вискозиметрия желчи при желчнокаменной болезни / ЮП. Потехина, П.С. Зубеев, А.В. Страхов и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2001. - №3. - С.33 - 35. 98. Преображенский, Ю.Б. Микроларингоскопия и эндоларингеальная микрохирургия. / Ю.Б. Преображенский, Д.Г. Черешкин, Н.С. Гальперина. – М.:Медицина, 1980. - 176 с. 99. Пригожин, И. Порядок из хаоса. / И. Пригожин, И Стенгерс /Пер. с анг., М.: Прогресс, 1986, 429 с. 100. Пьянкова, О.Б. Морфологический анализ фации биологических жидкостей в диагностике генеза механической желтухи. / Ю.Б. Бусырев, О.Б. Пьянкова, Т.И. Карпунина // Вестник Российского университета дружбы народов. - 2008. - №6. - С. 101 - 103. 101. Рапис, Е. К проблеме нуклеации (образования клеток) при самоорганизации наноструктур белка in vitro и in vivo / Е. Рапис // Журнал технической физики. - 2005. - Т.75, вып. 6. - С. 107 - 113. 102. Рафалович, М.Б. Содержание калия и натрия в эритроцитах и плазме больных со злокачественными и доброкачественными новообразованиями женских половых органов/ М.Б. Рафалович, Н.И. Зильберг// Акушерство и гинекология. - 1971. - №. - С. 66-67. 103. Решетов, И.В. Видеоассистированные резекции гортани при раке с радиочастотной термоаблацией / И.В. Решетов, А.К. Голубцов, Ф.Е. Севрюков, О.В. Маторин // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 61. 104. Романенко, С.Г. Дифференциальная диагностика предраковых заболеваний гортани при помощи NBI-эндоскопии / С.Г. Романенко, И.М. Мальцева, Д.И. Красникова, А.С. Иноземцев // Онкохирургия 2013. - V5. №1. - С. 95. 105. Романов, Ю.А. Теория биологических систем и проблема их временной организации / Ю.А. Романов // Проблемы хронобиологии, 1992, №3-4, С. 105 - 123. 97 106. Ростовцев, М.В. Лучевая диагностика гиперпластических процессов и опухолей гортани / М.В. Ростовцев, И.В. Литвиненко// Мет. пособ. для врачей рентгенологов. - Челябинск. - 2009. - 73 с. 107. Савина, Л.В. Поляризационная микроскопия в диагностике обменных нарушений / Л.В. Савина, С.А. Павлищук, В.Ю. Самсыгин // Клиническая лабораторная диагостика. - 2003. № 3 - С. 11 - 14. 108. Садовский, В.И. Прямая микроларингоскопия в диагностике и лечении доброкачественных новообразований, предраковых заболеваний и рака гортани. Автореферат канд. мед. наук Минск, 1994. - 24 с. 109. Сазонов, А.М. Кристаллографический метод исследования в медицине / А.М. Сазонов, Л.А. Мороз, Д.Б. Каликштейн // Советская медицина. - 1985. - № 6. - С. 27 - 33. 110. Самбулов, В.И. Новый подход к диагностике холестеотомы среднего уха у больных различных возрастных групп / В.И. Самбулов, С.Н. Шатохина, В.Г. Зенгер // Геронтология и гериатрия. - 2001. - вып1. - С. 104 105. 111. Самусев, С.Р. Изменение кристаллографических свойств синовиальной жидкости коленного сустава при остеоартрозе на фоне применения протезов синовиальной жидкоти/ С.Р.Самусев, В.В.Новочадов, Д.А.Маланин, А.А.Беликов. // Актуальные проблемы современной ревматологии: Сб. трудов. - Волгоград, 2007. - С. 89. 112. Светлаков, М.И. Раковые опухоли гортани./ И.М. Светлаков.Лениград.: Медицина, 1964. - 309 с. 113. Сдвижков, А.М. Отдаленные результаты лечения больных раком гортани в Москве. / А.М. Сдвижков, Л.Г. Кожанов, Н.Х. Шацкая, О.Я. Ядыков / / Вестник оториноларингологии. – 2009. - №1. - С. 20. 114. Севостьянова, Н.В. Особенности и механизмы экспрессии молекулярно-биологических маркеров опухолевого роста при раке легкого / Н.В. Севостьянова // автореф. дис. докт. мед. наук. - Томск. - 2004. - 20 с. 98 115. Сейц, И.Ф. О роли протоонкогенов в фундаментальных проявлениях жизни / Сейц И.Ф. // Экспериментальная онкология. - 1990. №6. - С. 14 - 26. 116. Селиваненко, В.Т. Диагностическое значение морфологической картины сыворотки крови у больных инфекционным эндокардитом / В.Т. Селиваненко, С.Н. Шатохина, В.А. Дудаков, М.А. Мартаков // Кардиология. 2008. - № 2. - С. 13 - 21. 117. Семенов, В.Ю. Ресурсы и основные показатели деятельности учреждений здравоохранения Московской области за 5 лет (2005-20099гг.) под редакцией Семенова В.Ю.,М. 2010. - вып 36. - С. 37. 118. Сивкович, О.О. Пластика задней стенки гортани после комбинированных резекций при лечении местно-распространенного рака гортани / О.О. Сивкович, Е.И. Трофимов, Н.А. Дайхес, Е.М. Фуки // Cборник материалов: Национальный конгресс Пластическая хирургия. -Москва. 2012. - С. 77. 119. Сигал, М.З. Клиническая онкология. /Сигал М.З. Краткое руководство для практических врачей ответ. ред. Ю.А. Ратнер. - Казань.: Казанский государственный институт усовершенствования врачей им В.И. Ульянова-Ленина, 1970. - Т1. - 626 с. 120. Смирнов, искусственной А.Е. вентиляции возможности легких при струйной высокочастотной резекции гортани с эндопротезированием / А.Е. Смирнов, Д.В. Лилеев, А.Л. Клочихин, В.В. Виногадов // Вестник оториноларингологии. - 2012. - №1. - С. 29 - 32. 121. Соколов, В.В. Видиоэндоларингеальная хирургия и фотодинамическая терапия с использованием гибкой эндоскопической техники при предраке и раннем раке гортани / В.В.Соколов, Л.В. Телегина, А.А. Гладышев, И.В. Решетов,В.О. Ольшанский, А.К. Голубцов // Российский онкологический журнал. - 2010. - №2. - С. 4 - 10. 122. Странадко, Е.Ф. Фотодинамическая терапия рецидивных и «остаточных» опухолей орофаринголарингеальной области / Е.Ф. Странадко, 99 М.И.Гарбузов, В.Г. Зенгер, А.Н. Наседкин, Н.А. Маркичев, М.В. Рябов, И.В. Лесков // Вестник оториноларингологии. - 2001. - №3. - С. 36. 123. Субботина, М.В. Возможности ультразвуковой доплерографии для исследования физиологии и патологии гортани / М.В. Субботина Ю.Г. Сенькин, В.О. Иванов // Рос. Оториноларинголония. - 209. - № 2. - С. 374 380. 124. Суровцев, И.Ю. Мониторинг рака гортани в процессе специального лечения / И.Ю. Суровцев, В.Н. Королев, К.И. Кулаев, К.С. Зуйков, А.С. Аладдин // Опуоли головы и шеи. - 2012. - №1. - С. 42 - 45. 125. Тарасевич, Ю.Ю. Механизмы и модели дегидратационной самоорганизации биологических жидкостей / Ю.Ю. Тарасевич // Успехи физических наук. - 2004. - Т174, №7. - С. 779 - 790. 126. Теодор, И.Л. Применение метода кристаллических налетов в диагностике некоторых патологических процессов / И.Л. Теодор, Л.А. Мороз, Д.Б Каликштейн, В.Б. Лесин, М.Г. Погосян, В.И. Лященко // Лабораторное дело. - 1985. - № 5. - С. 295 - 298. 127. Трофимов, Е.И. Хирургическая реконструкции гортаноглотки после ее резекции по поводу местно-распространенного рака / Е.И. Трофимов, Е.М. Фуки, Г.А. Полев, В.А. Сметухин // Cборник материалов: Национальный конгресс Пластическая хирургия. - Москва. - 2012. - С. 79 80. 128. Трубникова, Л.И. Особенности липидного обмена и кристаллографических показателей биологических жидкостей при сахарном диабете у беременных / Л.И. Трубникова, М.П. Албутова, Т.В. Кузнецова // Акушерство и гинекология. - 2004. - №6. - С. 14 - 18. 129. Унгиадзе, Г.В. Эндоскопическая диагностика раннего рака гортани / Г.В. Унгиадзе, Е.С. Вакурова // Сибирский онкологический журнал. - 2010. приложение № 2. - С. 49 - 50. 100 130. Ушаков, В.С. Рак гортани: современные возможности и перспективы / В.С. Ушаков, С.В. Иванов // Практическая онкология. - 2003. Т. 4, № 1. - С. 56 - 60. 131. Фомина, С.Л. Диагностика рака гортани методом компъютерной дермографии / С.Л. Фомина, Г.Т. Обыденников, Е.Н. Кабанов // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2007. - №4. - С. 73 - 75. 132. Черемисина, О.В. Возможности эндоскопической диагностики предопухолевых заболеваний и рака гортани в современной онкологии / О.В. Черемисина, Е.Л. Чойнзонов // Сибирский онкологический журнал. - 2007. №3(23). - С. 5 - 9. 133. Чесноков, А.А. Четвертый вариант чресщитовидной субтотальной резекции гортани как шанс социальной реабилитации больных раком гортани IV стадии / А.А. Чесноков // Вестник оториноларингологии. - 2012. - 5. - С. 300 - 301. 134. Чиж, Г.Н. Наш опыт повышения эффективности выявления и диспансеризации больных со злокачественными опухолями ЛОР органов головы и шеи / Г.Н. Чиж // Журнал ушных носовых горловых болезней. 1990. - №1. - С. 8 - 11. 135. Чисов, В.И. Состояние онкологической помощи населению Российской Федерации / В.И. Чисов, В.В. Старинский, Б.Н. Ковалев // Российский онкологический журнал. - 2000. - №1. - С. 5 - 12. 136. Злокачественные новообразования в Российской федерации в 2002 г.: заболеваемость и смертность / под ред. В.И. Чисова, В.И. Старинского, Г.В. Петровой. - М., 2004. - 256 с. 137. Чисов, В.И. Некоторые аспекты и обоснования для воздействия на систему ФНО- растворимые рецепторы ФНО(рФНО-Р1 т рФНО-Р2) у онкологических больных / В.И. Чисов, Н.С. Сергеева, Н.В. Маршутина, Е.В. Филоненко // Российский онкологический журнал. - 2009. - №6. - С.50 - 51. 138. Ченцова, О.Б. Кристаллографический метод исследования слезной жидкости в диагностике некоторых заболеваний глаз / О.Б. Ченцова, О.И. 101 Прошина, Л.И. Маркушева // Вестник офтальмологии. - 1990. - Т 106, №2. С. 44 - 47. 139. Чумаков, П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью./ П.М. Чумаков // Биохимия. - 2000. - Т. 65. - Вып.1. - С. 34 - 47. 140. Шевченко, А.О. Лабораторная диагностика повреждения атеросклеротической бляшки у больных ишемической болезнью сердца: РАРР-А (обзор литературы)/А.О. Шевченко, Ю.С. Слесарева,О.П. Шевченко//Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - №5. - С. 3 - 10. 141. Шабалин, В.Н. Принципы аутоволновой самоорганизации биологических жидкостей / В.Н. Шабалин, С.Н. Шатохина // Вестник РАМН. - 2000. - №3. - С. 45 - 49. 142. Шабалин, В.Н. Морфология биологической жидкости в клинической лабораторной диагностике / В.Н. Шабалин, С.Н. Шатохина // Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - №3. - С. 25 - 32. 143. Шатохина, С.Н. Маркеры злокачественного роста в морфологической картине биологических жидкостей человека / С.Н. Шатохина, В.Н. Шабалин // Вопросы онкологии. - 2010. - Т.56,№3. - С. 293 300. 144. Шатохина, С.Н. Атлас структур неклеточных тканей человека в норме и патологии: в 3 томах, Том 2. Морфологические структуры сыворотки крови. С.Н. Шатохина, В.Н. Шабалин. - М -Тверь: Триада, 2013. 213с. 145. Шевердин, Ю.П. Кристаллографическое исследование крови у больных острым панкреатитом / Ю.П. Шевердин, П.Я. Чумак // Клиническая хирургия. - 1987. - № 11. - С. 64 - 65. 146. Шилова, О.Ю. Ассоциация рака гортани с вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр / О.Ю. Шилова // Сибирский онкологический журнал. - 2007. Прил. №2. - С. 126 - 127. 147. Янов, аутофлюоресцентной Ю.К. Возможности эндоскопии в видеоэндостробоскопии дифференциальной диагностике 102 органических заболеваний гортани / Ю.К. Янов, Ю.Е. Степанова, Д.И. Певцов // Онкохирургия 2013. - V5. - №1. - С. 99. 148. С.П. Ярмоненко А.А. А.А. Вайнсон Радиобиология человека и животных :Учеб. пособие / C.П. Ярмоненко, А.А. Вайнсон; Под ред. С.П. Ярмоненко.- М.: Высш.шк., 2004. - 549с. 149. Яхно, Т.А. Основы структурной эволюции высыхающих капель биологических жидкостей / Т.А. Яхно, В.Г. Яхно //Журнал технической физики. - 2009. - Т 79, вып. 8. - С. 133 - 141. 150. Abou-Elhamd, K.E. The role of chromosomal aberrations in premalignant and malignant lesion in head and neck squamous cell carcinoma / K.E. Abou-Elhamd, T.N. Habib // Eur. Arch. Otorhinolaryngol. – 2008. – Vol. 265(2). – P. 203-207. 151. Acicalin, M.F. Prognostic significance of Ki-67 expression for patients with laryngeal squamous cell carcinoma primarily treated by total laryngestomy/ M.F. Acikali., U Oner., N Tel., et al.// Eur Arch Otorhinojaryngol. - 2004. - Vol. 261. -№7. - P. 376 - 380. 152. Al-Mamgani A, Tans L, van Rooij P, Levendag PC. A singleinstitutional experience of 15 years of treating T3 laryngeal cancer with primary radiotherapy, with or without chemotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2012. V. 83(3). - P. 1000 - 6. 153. Allen, C.T. Role of activated nuclear factor-kappa B in the pathogenesis and therapy of squamous cell carcinoma of the head and neck/ C.T. Allen // Head Neck. - 2007. - Vol. 29(10). - P. 959 - 971. 154. Anker, P. Detection of circulating tumor DNA in the blood (plasma/serum of cancer patients / P. Anker, H. Mulcahy, X.Q. Chen, M. Stroun // Cancer Metastasis Rev. - 1999. - Vol. 18. - P. 65 - 73. 155. Anniko M. Early morphological changes following gamma irradiation. A comparison of human pituitary tumours and human acoustic neurinomas (schwannomas). Acta Pathol Microbiol Scand A. 1981 Mar;89(2):113 - 24. 103 156. Ataman, O.U. Molecular biomarkers and site of first recurrence after radiotherapy for head and neck cancer // O.U. Ataman ., S.M. Bentzen., G.D.W ilson. et. al. // Eur J cancer. - 2004. - Vol.40. - №18. - P. 2734 - 2741. 157. Becker, M. Imaging of the larynx and hypopharynx / M. Becker, K. Burkhardt, P. Dulguerov, A. Allal // Eur J Radiol. - 2008. - № 66 (3). - P 460 479. 158. Berkiten, G Comparison of magnetic resonance imaging findings with postoperative histopathologic result in laryngeal cancer / G Berkiten, I. Topaloglu, C. Babuna, K. Turkoz //Kulak Burun Bogaz Ihtis Derg. - 2002. - № 9(3). - Р. 203 207. 159. Berman J.J. Henson D.E. Classifying the precancers: a metadata approach//BMS Medical Informatics and Decision Making. - 2003. - N3. - P.8 htt://www.biomedcentral.com/1472-6947/3/8 160. Bishop,J.M. Molecullar themes in oncogenesis/ J.M. Bishop //Cell.1991. - Vol. 64. - P. 235 - 248. 161. Bozzato, A. Influence of thyroid cartilage ossification in laryngeal ultrasound / Bozzato, J. Zenk, F Gottwald, M. Koch // Iro H. Laryngorhinootologie. - 2007. - № 86(4). - P. 276 - 281. 162. Bray I., Brennan P., Boffetta P. Projections of alcohol-and tobaccorelated cancer mortality in Central Europe // Int. J.Cancer. - 2000. - Vol. 87, N1. P. 122 - 128. 163. Brennan J.A. Association between cigarette smoking and mutation of the p53 gene in squamous cell carcinoma of the head and neck // N. Engl. J. Med. 1995. - Vol. 332(11). - P. 712 - 717. 164. Casiraghi, O. Chondroid tumors of the larynx: a clinicopathologic study of 19 cases, including two dedifferentiated chondrosarcomas / O. Casiraghi, F Martines- Madrigal , K. Pineda- Daboin, G. Mamelle et al // Ann Diagn Pathol.2004. -№8 (4). - P. 189 - 197. 104 165. Cautschi, O. Circulating deoxyribonucleic acid as prognostic marcer in non-smal-cell lung cancer patients undergoing chemotherapy / O. Cautschi, C. Bigosch, B. Huegli // J. Clinical oncology. - 2004. - Vol. 15. - P. 4157 - 4164. 166. Chera BS, Amdur RJ, Morris CG, Kirwan JM et al. T1N0 to T2N0 squamous cell carcinoma of the glottic larynx treated with definitive radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2010 Oct 1;78(2):461 - 6. 167. Chandler S.W., Rassekh C.H., Rodman S.M. Dukatman B.S. Immunohistochemical localization of interleukin-10 in human oral and pharyngeal carcinomas // Laryngoscope. - 2002. - Vol. 112,N5. - P. 808 - 815. 168. Сheng G., Shao J.Y., Chen Z., Zeng R.P., He Y.S. Study of immunological indicators in peripheral blood for nasopharyngeal carcinoma // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. -2002. - Vol.22, № 12. - P.1104 - 1105. 169. Child, E. S., Hendrycova T., Mc Cague K. et al. A cancer-derived mutation in the PSTAIRE helix of cyclin-dependent kinase 2 alters the stability of cyclin binding / E. S. Child, T.Hendrycova, K. Mc Cague et al. // Biochim. Biophys Acta. - 2010. - Vol. 1803(7). - P. 858 - 864. 170. Chow K.C., Chiou S.H., Ho S.P., Tsai M.H., Chen C.L., Wang L.S., Chi K.H. The elevated serum interleukin-6 correlates with the increased serum butyrate level in patients with nasopharyngeal carcinoma // Oncol. Rep. - 2003. Vol.10,N4. - P. 813 - 819. 171. Deliiski, T. Sybdermal laterocranial mapping of sentinel lymph nodes in breast cancer as an alternative to the peritumoral mapping / T. Deliiski // J. BUON. - 2008. - N 13(3). - P. 391 - 393. 172. Delsupebe, K.G. Voice quality after narrow-margin laser cordectomy compared with laryngeal irradiation / K.G. Delsupebe, I. Zink, M. Lejaegere // Otolaryngology Head Neck Surgery. 1999. - Vol. 121, N5. - Р. 528 - 533. 173. de Souza, R.P.Value of computed tomography for evaluating the subglottis in laryngeal and hypopharyngeal squamous cell carcinoma / de R.P.Souza, de N. Barros, A.J. Paes Junior, S.Tornin Ode et al. // Sao Paulo Med J. - 2007. - №125(2). - P. 73 - 76. 105 174. Dreyer, T. Laryngeal epithelial dysplasia vs. laryngeal intraepithelial neoplasia / T.Dreyer // Glanz Hpathologe - 2004. - №25 (1). - P. 9 - 13. 175. Eckel, H.E. Potential role of transoral laser surgery for larynx carcinoma / H.E. Eckel, C. Scbneider, M. Jungebulsing // Laser Surg. Med. - 1998. - Vol. 23, N 2. - Р. 79 - 86. 176. El-Naggar, A. K. Heterogeneity of the proliferative faction and cyclin D1/CCND1 gene amplification in head and neck squamous cell carcinoma/ A. K.El-Naggar, K.Steck, J.G. Batsakis // Cytometry. - 1995. - Vol. 21(1). - P. 47 51. 177. El-Naggar, A.K. Methods in molecular surgical pathology / A.K. ElNaggar // Semin. Diagn. Pathol. - 2002. - P. 56 - 71. 178. Fakhry C. Clinical Implications of Human Papillomavirus in head and Neck Cancer/ С. Fakhry, M.L. Gillison // J. Clin. Oncol. - 2006. - Vol. 24 (17). - P. 2606 - 2611. 179. Fries, K.L. Epstein-Barr virus. Latent membrane protein 1 block p53mediated apoptosis through the induction of the A20 gene / K. L. Fries, W.E.Miller, N.R.Traub // J. Virol. - 1996. - N70. - P. 8653 - 8659. 180. Garcya Callejo, F.J. Use of imaging criteria to identify cervical metastases using CT scans in head and neck tumours / F.J. Garcya Callejo // ActaOtorrinolaringol Esp. - 2008. - № 59(6). P. 257 - 262. 181. Germani, R.M., Molecular markers of micrometastasis in oral cavity carcinomas / R.M. Germani, F.J. Civantos, G. Elgart et al. // Otolaryngol. Head Neck Surg. - 2009. - Vol. 141(1). - P. 52 - 58. 182. Gillison M.L. Current topics in the epidemiology of oral cavity and oropharyngeal cancers // Head Neck. - 2007. - Vol. 29(8). - P. 779 - 792. 183. Gillison M.L., Distinct risk factor profiles for Human Papillomavirus type 16-positive and Human Papillomavirus type 16-negative head and neck cancer/ M.L. Gillison, G.D`Souza, W.Westra et al. // J. Natl. Cancer Inst. 2008. Vol. 100(6). - P. 407 - 420. 106 184. Henry, R.C. The transformation of laryngeal leucoplacia to cancer / R.C. Henry // J Laryng. - 1979. -93 (5). - P. 447 - 459. 185. Herrero, R. Human Papillomavirus and oral cancer: the International Agency for Research on Cancer multicenter study/ R. Herrero // J. Natl. Cancer Inst. - 2003. - Vol. 95 (23). P. 1772 - 1783. 186. Jecker, P. Ultrasound of hypopharyngeal and oesophageal cancer: possibilities and limitations to staging and planning of therapy / P. Jesker, R. Schuon, A. Hlawatsch // Ultraschall Med. - 2005. - №26 (4). - P. 312 - 317. 187. Just, T. Confocal microscopic evaluation of epithelia of the larynx / T Just, J. Stave, H.J. Kreutzer et al. // Laryngorhinootologie. - 2007. - № 89 (9). -P. 44 - 48. 188. Klussmann, J.P. Prevalence, distribution and viral load of Human Papillomavirus 16 DNA in tonsillar carcinomas /J.P. Klussmann // Cancer. - 2001. - Vol. 92(11). - P. 2875 - 2884. 189. Kondi-Pafiti A., Smyrniotis V., Frangou M., Papayanopoulou A.,Englezou M.,Deligeorgi H. Immunohistochemical study of ceruloplasmin, lactoferrin and secretory component expression in neoplastic and non-neoplastic thyroid gland diseases // Acta. Oncol. - 2000. - Vol.39, N6. - P. 753 - 756. 190. Kuropkat C., Dunne A.A., Plehn S., Ossendorf M., Hers U., Renz H., Werner J.A. Macrophage colony-stimulating factor as a tumor market for squamous cell carcinoma of the heard and neck// Tumour. Biol. - 2003. - Vol. 24, N5. - P. 236 - 240. 191. Lai J.P., Tao Z.D. Xiao J.Y., Chen X.H., Zhao S.P., Tian Y.Q., Betz C.S. Microinvasive Nd: YAG laser therapy of early glottic carcinoma and its effect on soluble interleukin-2 receptor, interleicon-2, and natural killer cells//Laryngoscope. - 2001. - Vol. 111, N9. - 1585 - 1588. 192. Lazaris A. Ch., Rigopoulou A., Tseleni-Balafouta S., Kavantzas N., Trimara I., Zorzos H.S., Eutychiadis C.A., Petraki K., Kandiloros D., Davaris P. Immunodetection and clinico-pathological correlates of two tumour growth 107 regulators in laryngeal carcinoma // Histol Histopathol. - 2002. -Vol. 17, N1. - P. 131 - 138. 193. Lee, T. L. A signal network involving coactivated NF- kappa B and STAT3 and altered p53 modulates BAX/BCL-XL expression and promotes all survival of head and neck squamous cell carcinomas / T. L. Lee // Int. J. Cancer. 2008. - Vol. 122(9). - 1987 - 1998. 194. Leon, S.A. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy / S.A. Leon, B. Shapiro, D.M.Sklaroff, M.J. Yaros // Cancer Res. - 1977. Vol. 37. - P. 646 - 650. 195. Lin S.U., Wang U.U., Sheu W.H., Preoperative plasma concentration of vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase 9 are associated with stage progression in papillary thyroid cancer// Clin. Endocrinol.(oxf). - 2003. - vol. 58, №4. - P. 513 - 518. 196. Liu L.H., Gladwell W., Teng C.T. Detection of exon polymorphisms in the human lactoferrin gene// Biochem. Cell. Biol. - 2002. - Vol. 80, N1. - P. 17 22. 197. Loercher, A. Nuclear factor-kappa B is an important modulator of the altered gene expression profile and malignant phenotype in squamous cell carcinoma/ A.Loercher // Cancer res. – 2004. Vol. 64(18). - P. 6511 - 6523. 198. Longatto Filho A., Alves V.A. Kanamura C.T., Nonogaki S., Bortolan J.,Lombardo V., Bisi H. Identification of the primary site of metastatic adenocarcinoma in serous effusions. Value of an immunocytochemical panel addeb to the clinical arsenal // Acta. Cytol. - 2002. - Vol. 46, N4. - P. 651 - 658. 199. Lorke DE, Wenzel S, Siebert K, Zywietz F. Microvascular and tumor cell alterations during continuous hyperfractionated irradiation: an electron microscopic investigation on the rat R1H rhabdomyosarcoma.// Int J Radiat Oncol Biol Phys. - 1999. - V. 44, №4. - Р. 895 - 904. 200. Lothaire, P. Molecular markers of head and neck squamous cell carcinoma: promising signs in need of prospective evaluation/ P. Lothaire // Head Neck. - 2006. - vol. 28(3). P. 256-269. 108 201. Luo, C.W. Human Papillomavirus in oral squamous cell carcinoma and precancerous lesions detected by PCR-based gene-chip array / C.W. Luo, C.H. Roan, C. J. Liu // Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 2007. - Vol. 36(2). - P. 153 - 158. 202. McKenzie, H.A. Predicting functional significance of cancer – associated p16(INK 4a) mutetions in CDKN2A/ H.A McKenzie, C.Fung, T. M. Becker et al. // Hum. Mutat. - 2010. - Vol. 31(6). - P. 692 - 701. 203. Mielcarek-Kuchta, D. p53, Ki 67 and cyclin as prognosticators of lymph node metastases in laryngeal carcinoma./ D. Mielcarek-Kuchta., J. Olofsson., W Golusinski // Eur Arch Otorhinojaryngol. - 2002. - Vol. - 260(10). -P. 549 - 54. 204. Musat, M. Cyclins and their related proteins in pituitary tumourigenesis/ M.Musat, D.G.Morris, M.Korbonits, A.B. Grossman // Mol.Cell Endocrinol. - 2010. Vol.27. - P. 123 - 134. 205. Neidobitek, G. Epstein-Barr virus persistence and virus-associated tumours / G. Neidobitek, L.S.Young // Lancet. - 1994. - Vol. 343. - P. 333 - 335. 206. O’Connor S.L. The application of molecular tech-niques to solid tumors / S.L. O’Connor, J.H. Cho, T.J. McDonnell // Semin. Diagn. Pathol. 2002. - P. 94 - 103. 207. Ozterc, C. The relationship between lymph node size and metastasis and extracapsular spread in squamous cell carcinoma of the larynx, orohypopharynx, and oral cavity / C. Ozterc., et al. // Kulak Burun Bogaz Ihtis Derg. - 2008. - N 18(1). P. 7 - 13. 208. Pacella-Norman R., Urban M.I., Sitas F., Carrara H., Sur R., Hale M., Ruff P., Patel M., Newton R., Bull D., Beral V. Risk Factors for oesophageal, lung, oral, and laryngeal cancers in black South Africans // Br.J. Cancer. - 2002. -Vol. 86, N11. - 1751 - 1756. 209. Pisani P., Erratum: Estimates of the worldwide mortality from 25 cancer in 1990/ P. Pisani, D.M. Parkin, F.Bray, J.Ferlay // Int. J. Cancer. - 1999. Vol. 83(6). - P.870 - 873. 109 210. Ragin, C.C., The epidemiology and risk factor of head and neck cancer: a focus of Human Papillomavirus / C.C. Ragin, F.Modungo, S.M. Gollin // J. Dent. Res. - 2007. - Vol. 86(2). - P. 104 - 114. 211. Rodrigo, J.P. Distinctive clinicopathological associations of amplification of the contactin gene at 11q13 in head and neck squamous cell carcinomas/ J.P. Rodrigo, D.Garcia-Carracedo, L.A. Garcia, S.Menendez // J.Pathol. - 2009. - Vol. 217(4). - P. 516 - 523. 212. Ross, J.S. MiRNA: the new gene silencer/ J.S. Ross, J.A.Carlson, G. Brock // Am. J. Clin. Pathol. - 2007. - Vol. 128(5). - P. 830 - 836. 213. Rubin, J.S. The potential role of ultrasound in differentiating solid and cystic swellings of the true vocal fold / J.S. Rubin, S Lee, J. McGuinness et al. // J Voice.- 2004.- № 18 (2). - P.231 - 235. 214. Rzewniski I., Luczaj J., Olszewska E. Delayed treatment of laryngeal and hypopharynx cancer in the North-Eastern part of Poland in years 1986 - 1999 // Otolaryngol. Pol. - 2002. - Vol. 56, N2. - P. 169 - 171. 215. Sabri, M. Management of laryngeal dysplasia : a review / M. Sabri, J.Mcmahon, A. Parker // Eur Arch Otorhinolaryngol. - 2006. - Vol. 263, № 9. - P. 843 - 852. 216. Saetti, R. Efficacy of autofluoroscence videoendoscopy in the diagnosis of laryngea / R. Saetti, F. Derosas, M. Silvestrini, S. Narne // Acta Otorhinolaryngol Ital. - 2007. - № 27(4). - P. 181 - 185. 217. Sanderson R.J.., Ironsaide J.A.D. Squamous cell carcinomas of the heard and neck // BMJ. - 2002. - Vol. 325. - P. 822 - 827. 218. Sbab, J.P. Patterns of care for cancer of the larynx in the United States / J.P. Sbab, L.H. Karnell, H.T. Hoffman // Arch. Otolaryngology Head Neck Surgery. - 1997. - Vol. 123, N 5. Р. 475 - 483. 219. Shabalin, V.N. Diagnostic markers in the structures of human biological liquids / V.N.Shabalin, S.N. Shatokhina // Singapore Med. J. - 2007. Vol. 48, №5. - P. 440 - 446. 110 220. Shapiro J.A., Jacobs E.J. Thun M.J. Cigar smoking in men and risk of death from tobacco-related cancers// J. Natl. Cancer Inst. - 2000. - Vol. 92, N4. -P. 333 - 337. 221. Shwab, A. Oncogene amplification in neoplastic development and progression of human cancers/А. Shwab // Oncogenesis. - 1990. - Vol. 2. -P . 35 51. 222. Silva, J.M. Presence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients: clinicopathological correlation. / J.M. Silva, G. Dominguez, J.M. Garcia, R. Gonzalez, M.J. Villanueva, F. Navarro, M. Provencio, S. San Martin, P. Espana, F. Bonilla // Cancer Res. - 1999. - Vol. 59. - P. 3251 - 3256. 223. Stroun, M. Isolation and characterization of DNA from the plasma of cancer patients / M. Stroun, P. Anker. J. Lyautey, C. Lederrey, P.A. Maurice // Eur.J. Cancer Clinical oncology. - 1987. - Vol. 23 P. 707 - 712. 224. Teppo H., Koivunen P., Sipila S., Jokinen K., Hyrynkangas K.,Laara E., Pykkala E., Sovio U., Alho O.P. Decreasing incidence and omproved survival of laryngeal cancer in Finland // Acta. Oncol. - 2001. - Vol. 40, N7. - P. 791 - 795. 225. Thomas, G.R. Molecular predictors of clinical outcome in patients with head and neck squamous cell carcinoma/ G.R.Thomas, H.Nadiminti, J.Regalado // Int. J. Exp. Pathol. - 2005. - Vol.86(6). - P. 347 - 363. 226. Tran, N. Role of Human Papillomavirus in the etiology of head and neck cancer / N.Tran, B.R. Rose, C.J. O`Brien // Head Neck. - 2007. - Vol. 29(1). P. 64 - 70. 227. Tsang, J.C. Circulating nucleic acids in plazma/serym/ J.S.Tsang, Y.M.Lo // Patology/ - 2007. - Vol. 39. P. 197 - 207. 228. Van Waes, C. Nuclear factor-kappa B in development, prevention and therapy of cancer / C. Van Waes // Clin. Cancer Res.- 2007. - Vol. 13(4). - P. 1076 - 1082. 229. Woods, K.V. Analysis of Human Papillomavirus DNA in oral squamous cell carcinomas/ K.V. Woods // J.Oral Pathol. Med. - 1993. - Vol. 22(3). - P. 101 - 108. 111 230. Yoo, W. J. Loss of heterozygosity on chromosomes 3p, 8p, 9p and 17p in the progression of squamous cell carcinoma of the larynx/ W. J. Yoo, S. H.Cho Y. S. Lee et al. // J. Korean Med. Sci. - 2004. - Vol. 19(3). - P. 345 - 351. 231. Zajkowski, P. Ultrasound imagin in laryngology / P. Zajkowski, E.J. Bialek // Otolaryngol Pol. - 2007. - №61 (4). - P. 544 - 549. 232. Zywietz F, Hahn LS, Lierse W. Ultrastructural studies on tumor capillaries of a rat rhabdomyosarcoma during fractionated radiotherapy. Acta Anat (Basel). 1994;150(1):80-5. 112
