Разработана методика выделения РНК из фиксированных

1
УДК 577.152.5
Выделение РНК из фиксированных формальдегидом рибонуклеопротеидов
А.С. Воронина, Е.С. Пшенникова
Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва,
e-mail: voronina_a@mail.ru
Разработана методика выделения РНК из фиксированных формальдегидом
полирибосом и информосом. Рибонуклеопротеиды получены методом
центрифугирования в градиенте плотности CsCl. Показано, что методика позволяет
получать полноразмерные рРНК и мРНК, способные к специфической молекулярной
гибридизации. Удалось амплифицировать 150-нуклеотидные последовательности
для индивидуальных мРНК и показать возможность использования полученных
препаратов РНК для синтеза меченых зондов при работе с РНК-чипами.
Предложенный метод рекомендован для поиска нетранслируемых мРНК и для
изучения изменений в трансляции индивидуальных белков в раннем развитии и при
различных патологических процессах.
Для решения ряда проблем возникает необходимость выделения РНК из
материала, фиксированного формальдегидом. В частности с такой необходимостью
сталкиваются при изучении активности индивидуальных мРНК. Экспрессию генов в
каких-либо клетках или тканях принято оценивать по количеству соответствующей
мРНК. Однако присутствие в цитоплазме мРНК еще не означает ее активного
функционирования, то есть синтеза соответствующего белка. Синтез конкретных
белков строго контролируется и такая трансляционная регуляция в настоящее время
активно изучается [см. обзор 1]. Если мРНК не транслируется в полисомах, она
присутствует в цитоплазме в виде рибонуклеопротеидов (РНП) с определенными
физико-химическими характеристиками. Такие РНП впервые были описаны А.С.
Спириным с соавторами и названы информосомами [2]. В дальнейшем их стали
называть свободными мРНП. Для изучения степени трансляции определенных
2
матриц необходимо уметь разделять полисомы и свободные мРНП. В некоторых
случаях мРНП при центрифугировании седиментируют медленнее рибосом, а
полисомы, естественно, быстрее. Поэтому полисомы и информосомы можно
разделять центрифугированием в сахарозном градиенте или через сахарозную
подушку. Но в эмбриональных объектах (а возможно и не только в эмбриональных)
информосомы образуют олигомеры друг с другом и седиментируют в той же зоне,
где и полисомы [3-5]. Таким образом, выделение полисом седиментационными
методами не дает гарантированной очистки их от свободных мРНП. В работе
Раджасекара с соавторами [6] с помощью РНК-чипа проведено сравнение количества
индивидуальных мРНК в полирибосомах нормальных глиальных клеток и клеток
глиальных опухолей. Было показано, что при малигнизации происходит резкое
изменение в трансляции ряда матриц. В этой работе полисомы выделяли
седиментацией через сахарозную подушку. По нашим представлениям, это не совсем
корректно, так как в препарат могут попасть и тяжелые информосомы. Возможно,
что именно этим объясняется несовпадение результатов, полученных с помощью
РНК-чипов и с помощью иммуноблота, приведенных авторами для одного из
изученных генов ( Miz 1).
Другой метод разделения полирибосом и информосом основан на разности
плавучей плотности этих частиц в растворах CsCl. Плавучая плотность полисом в
растворе CsCl равняется 1,52-1,54 г/см3, а информосом 1,40-1,45 г/см3 [2,3,7].
Трудность при использовании этого метода заключается в том, что для
предотвращения диссоциации белка от РНК в присутствии больших концентраций
соли CsCl приходится предварительно фиксировать материал формальдегидом [2]
или другими альдегидами [8]. Поэтому встает задача выделения РНК из
фиксированных рибонуклеопротеидов и проверки возможности использования этого
препарата РНК в таких методиках, как Нозерн-блот, обратная транскрипцияполимеразная цепная реакция (RT-PCR) и РНК-чипы (RNA-array), позволяющих
оценивать сравнительные количества индивидуальных мРНК.
Цель настоящей работы - разработка методики выделения РНК из
фиксированных полисом и информосом, основываясь на конкурентной «расшивке»
3
оснований Шиффа с помощью глицина и проверка, может ли такая РНК быть
использована для Нозерн-блот анализа, обратной транскрипции и амплификации.
Методика
Получение препаратов полирибосом и информосом.
Цитоплазматические РНП выделяли из зародышей африканской шпорцевой лягушки
Xenopus laevis, взятых на стадии гаструлы (ст. 11). К 50 зародышам добавляли 0.5 мл
раствора 0.25 М сахарозы , 50 мМ триэтаноламина, рН 8.0, 0.1 М KCl , 5 мМ MgCl2 ,
5 мМ β-меркаптоэтанола, 0.1%-ного диэтилпирокарбоната. В этом растворе
проводили гомогенизацию стеклянным пестиком в нитроцеллюлозной пробирке в
ледяной бане. Гомогенат центрифугировали в центрифуге CV-50 «ELMI» (Россия)
при 15000g (rm=4 см) 5 мин. К супернатанту добавляли 20%-ный Тритон X100 до
концентрации 1% и, при быстром перемешивании, 5 мл раствора 4%-ного
формальдегида, 10 мМ триэтаноламина pH 7.8, 0.1 М KCl, 5 мМ MgCl2. Фиксацию
проводили при 4°С в течение 1 сут. Материал центрифугировали в ультрацентрифуге
L2-65B «Beckman» (США), в роторе SW-40 Ti 10 мин при 15000 g (rm=11.27см) для
удаления возможных агрегатов и смешивали с водным раствором CsCl, имеющим
коэффициент преломления n = 1.4150, что соответствует плотности 1.87 г/см3. Для
более быстрого достижения при центрифугировании равновесного состояния
градиента CsCl в пробирку перед центрифугированием заливали две ступени из
смеси материала и CsCl, с плотностями 1.66 и 1.24 г/см3, соответственно. Плотность
раствора вычисляли по формуле ρ= 10.8601×n – 13.4974, где n – коэффициент
преломления раствора CsCl за вычетом поправки на преломление компонентов
буфера с формальдегидом. Эта поправка оценивалась как разница коэффициента
преломления буфера и воды. Центрифугирование в градиенте плотности CsCl
проводили в роторе 50 Ti в ультрацентрифуге L2-65B «Beckman» (США) при 145000
g (rm=5,9 см), 2°С, в течение 24 ч. В собранных фракциях измеряли коэффициенты
преломления для вычисления плотности. Материал фракций использовали для
проведения дот-гибридизации или для выделения РНК.
4
Дот-гибридизация. К фракциям градиента добавляли MgCl2 до 10 мМ и
материал фильтровали через мембрану Qiabrane Nylon Plus («Qiagen GmbH, Hilden»,
Германия) с помощью аппарата Минифолд («Schleicher and Schuell», США).
Фильтры прокаливали 2 ч при 80°С в вакууме. Меченые пробы синтезировали с
помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I («СибЭнзим», Россия) и [α32
P]дАТФ (4000 Ки/моль) («Фосфор», Россия). В качестве матриц использовали
генные вставки, вырезанные из плазмид, как описано ранее [7]. Предгибридизацию в
течение 1 сут и гибридизацию в течение 3 сут проводили при 42°С в растворе: 50%ный формамид, 0.75 М NaCl, 0.075 М Na-цитрат, 0.05 M NaH2PO4, 0.5%-ный ДДС-Na,
0.075% -ный поливинилпирролидон, 0.075%-ный фикол, 0.075%-ный гепарин,
0.075%-ный пирофосфат Na, 250 мкг/мл озвученной денатурированной ДНК из
спермы лосося и 5 мМ смесь ванадил нуклеотидов, синтезированная по методике [9].
Последняя отмывка фильтров происходила при 65°С в трех сменах раствора 0.3 М
NaCl, 20 мМ NaH2PO4, 2 мМ ЭДТА и 0.5%-ный ДДС-Na по 30 мин.
Выделение РНК из фракций градиентов CsCl. За основу метода выделения
РНК из фиксированного материала взята методика, разработанная нами ранее [4, 10],
с некоторыми изменениями. К фракциям градиентов, содержащим полисомы или
информосомы, добавляли 1М MgCl2 до концентрации 10 мМ. Материал наносили
фильтрованием на нитроцеллюлозные фильтры «Millipore» (США). Фильтры
предварительно промывали раствором 3 М NaCl, 0.3 М Na цитрата. После нанесения
материала фильтры медленно, в течение 10 мин, промывали раствором 2 М глицина
с 5 мМ ЭДТА, рН 8.0. Затем фильтр промывали буфером для протеиназы К (10 мМ
трис pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl) и переносили в бюкс с 1 мл того же раствора,
содержащего 1мг протеиназы К и 50 мкг гликогена. После инкубации при 42°С 1 ч
добавляли 1 мл раствора, содержащего 40 мМ трис, pH 7.5, 4%-ный ДДС-Na, 0.4 M
NaCl, 10 мМ ЭДТА и инкубировали еще 30 мин при 42°С и 30 мин при 80°С.
Раствор отбирали в пробирку и проводили стандартную фенол-хлороформную
депротеинизацию [9]. Конечную спиртовую суспензию хранили при -20°С. Качество
и количество полученной РНК оценивали по электрофорезу в 1%-ном агарозном геле
и окраске этидиум бромидом.
5
Нозерн-блот анализ полученной РНК. Электрофорез РНК проводили в 1%-ном
агарозном геле в системе MOPS-CH2O по стандартной методике [9]. Перенос РНК на
нейлоновую мембрану Qiabrane Nylon Plus («Qiagen GmbH, Hilden» Германия)
осуществляли диффузионным методом. Фильтры прокаливали при 80° в вакууме 2 ч
и РНК на фильтре окрашивали метиленовым синим [9]. После фотографирования
окраски РНК фильтры отмывали от метиленового синего 1%-ным ДДС-Na.
Гибридизацию с мечеными пробами проводили как описано выше для дот–
гибридизации.
Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция. кДНК Xwnt-11
получали с использованием праймера TTACTTGCAGACATACCTCT и обратной
транскриптазы M-MulV («СибЭнзим», Россия). Реакцию ПЦР проводили с помощью
Taq-полимеразы («СибЭнзим», Россия) и с праймерами:
AGCTAACCTGCCAAATGACC или ACCCAGGCCACTAAAATTAT или
AGTGACAGCTGCAACCTCAT и тем же праймером, что в обратной транскрипции.
Режим ПЦР: 94°С, 10мин; 30 циклов 96°С, 30 сек; 54°С, 30 сек; 65°С, 4 мин и 65°С, 7
мин. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 6%-ном ПААГ.
Получение радиоактивно меченых проб и гибридизация с пробами,
иммобилизованными на нейлоновых фильтрах.
На нейлоновую мембрану Qiabrane Nylon Plus («Qiagen GmbH, Hilden», Германия)
наносили ДНК линеаризированных и денатурированных плазмид pBS, содержащих
вставки генов Xvent-2 и Xwnt-11. В одном нанесенном пятне содержалось 500 нг
ДНК, содержащей примерно 25 нг последовательности из 150 нуклеотидов,
специфичной для анализируемых генов. Мембраны прокаливали 2 ч при 80°С в
вакууме. Радиоактивные пробы синтезировали в ПЦР (20 циклов) с использованием
[α-32P]дАТФ (4000 Ки/моль), праймеров TTACTTGCAGACATACCTCT,
AGTGACAGCTGCAACCTCAT, GCCTTGGATCCTAATAGGCCAGAG,
ACCCACTAATGGAAACCCTG и кДНК к РНК, выделенной из полисом или
информосом. Праймеры подбирали так, чтобы синтезировались последовательности
в 150 нуклеотидов, специфичные для Xvent-2 и Xwnt-11. Предгибридизацию и
6
гибридизацию проводили как описано для дот-гибридизации. Фильтры отмывали 4
раза по 5 мин при 35°С и 30 мин при 42°С в 0.3 М NaCl, 20 мМ NaH2PO4, 2 мМ
ЭДТА и 0.5%-ном ДДС-Na и затем 2 мин в 0.03 М NaCl, 2 мМ NaH2PO4, 0.2 мМ
ЭДТА и 0,5%-ном ДДС-Na при комнатной температуре.
Результаты и их обсуждение
Проводили тестирование двух мРНК: Xvent-2 и Xwnt-11. Распределение в
градиенте плотности CsCl мРНП, содержащих мРНК Xvent-2 и Xwnt-11, приведены
на рис.1. Плотность, соответствующая плавучей плотности полисом (1,53 г/см3)
приходилась на фракцию 2, а информосом (1,40-1,45 г/см3) - на фракции 5 -7.
Наличие индивидуальной мРНК во фракциях градиента определяли с помощью дотгибридизации. Как видно из рисунка, подавляющее количество мРНК Xvent-2
выявлялось в информосомах, в то время как мРНК Xwnt-11 была распределена между
полисомами и информосомами примерно поровну. Из фракций аналогичных
градиентов, содержащих полисомы или информосомы, выделяли РНК. Препараты
РНК проанализировали электрофорезом в агарозном геле (рис. 2). Размер рРНК из
полисом (рис. 2А) не отличался от размера РНК, выделенной из целых
нефиксированных зародышей (рис. 2В). Трек 2Б свидетельствует об отсутствии
видимых количеств рРНК в препарате РНК из информосом. На рис 3 приведены
результаты Нозерн-блот анализа РНК. Окраска фильтров метиленовым синим
(рис.3А) показывает подвижность и количество рРНК. На рис.3Б и 3В приведены
результаты гибридизации с радиоактивной пробой к мРНК Xvent-2 и Xwnt-11,
соответственно. Видно, что распределение индивидуальных мРНК между
полисомами и информосомами согласуется с оценкой, проведенной с помощью дотгибридизации. Это свидетельствует о том, что РНК, выделенная из фиксированных
частиц, сохраняла способность к специфичной молекулярной гибридизации.
Результат этого анализа свидетельствует так же о наличии полноразмерных рРНК и
мРНК в препарате.
7
Встает вопрос, может ли такая мРНК служить матрицей в ферментативных
реакциях, в частности в реакции обратной транскрипции. Мы провели реакцию
обратной транскрипции Xwnt-11 на РНК, выделенной из смеси полирибрсом и
информосом и, для контроля, из целых нефиксированных зародышей. Для анализа
длины синтезированных кДНК использовали ПЦР с праймерами, задающими разную
длину продукта. Размер и количество полученных фрагментов оценивали
электрофорезом в ПААГ. Как видно из рис.4, количество фрагментов, длиной 150
пар нуклеотидов (пн), в контроле и опыте не различалось. Однако уже при длине 519
пн количество продукта в опыте резко снижалось, а при еще большей длине вообще
не выявлялось. Следовательно, на РНК, выделенной из фиксированных РНП, не
было синтеза полноразмерной кДНК, но происходил синтез цепей длиной не менее
150 пн., что вполне достаточно для идентификации мРНК.
Для выяснения, может ли полученная из формалинизированных частиц мРНК
анализироваться методом РНК-чипов, провели следующий модельный опыт.
Используя праймеры, задающие синтез 150-нуклеотидных последовательностей,
были получены меченые пробы к Xvent-2 и Xwnt-11. Пробы синтезировали на РНК из
полисом или информосом с помощью обратной транскрипции и ПЦР. Гибридизацию
проводили с мембранами, на которые были нанесены последовательности генов
Xvent-2 и Xwnt-11. Как видно из рис. 5 последовательности обеих мРНК
обнаруживались как в препарате полисом, так и информосом. Однако соотношение
каждой из мРНК в этих РНП отличалось от соотношения, выявленного методами
дот-гибридизации и Нозерн-блот анализа. Относительное количество мРНК в
информосомах в методе РНК-чипа оказывлось заниженным. Снижение количества
циклов ПЦР при мечении проб до 10 не изменяло это соотношение (данные не
приведены). Возможно, что формальдегид сильнее модифицирует РНК в составе
информосом, чем в составе полисом, из-за разной структуры этих РНП. Эта разница
модификации несущественна для гибридизации мРНК, но влияет на ее матричные
свойства. Тем не менее, метод РНК-чипов может быть использован для поиска
нетранслируемых матриц, находящихся в информосомах.
8
Проблема анализа РНК, выделенной из фиксированного формальдегидом
материала, разрабатывается, в основном, в медико-биологических работах, имеющих
дело с цитологическими срезами тканей [11,12] или с биоптатами [13-15]. Выделить
полноразмерную РНК из таких препаратов практически не удается. Поэтому и
Нозерн-блот анализ такой РНК не проводился ни в одной работе. Кроме того, при
фиксации формальдегидом некоторые нуклеотиды оказываются
модифицированными монометильными группами, что является препятствием для
обратной транскриптазы [16]. Частичного снятия этих изменений можно добиться
прогреванием РНК при 70°С в течение 30-60 мин [16]. Такое прогревание позволяет
получать более длинные кДНК [14,16]. Определенный прогресс наметился с
появлением метода ПЦР и ПЦР в реальном времени. Для идентификации мРНК
достаточно амплифицировать последовательности в 60 -150 пн [11,12, 17], что
снимает необходимость в выделении полноразмерной РНК. Таким образом,
модификация и деградация мРНК перестали быть лимитирующими факторами в
ставнительном изучении количества мРНК в разных тканях. На первое место вышла
проблема количественного выделения РНК. В разных работах выход РНК,
выделенной из фиксированного материала, сильно различается. Только японским
авторам удалось количественно выделить РНК из кусочков фиксированных тканей
[16]. В другой же работе количество индивидуальных мРНК, выявляемых с
помощью ПЦР в реальном времени, уменьшается в 100 и более раз по сравнению с
нефиксированным свежим материалом, что сделало невозможным проведение
точного сравнительного анализа индивидуальных мРНК в биоптатах из разных
тканей и опухолей [13]. Наилучшие результаты при выделении РНК из
фиксированных срезов достигаются при использовании переваривания исходного
материала протеиназой К в присутствии 1-2%-ного ДДС-Na в довольно жестких
условиях: 55-60°С в течение 14-16 ч [11-13], с последующими фенолхлороформными депротеинизациями.
Наш методический подход к выделению РНК из формалинизированного
материала, примененный еще в 1987 г, оказался похожим на исплоьзуемый в
вышеупомянутых работах. Однако у нас присутствует еще и стадия конкурентной
9
«расшивки» первичным амином (глицином) оснований Шиффа [4]. Основания
Шиффа образуются при реакции альдегидов с аминогруппами, что и приводит к
сшиванию белков как между собой, так и с РНК [10]. В цитируемых выше работах
роль расшивающего агента играет трис, являющийся, как известно, первичным
амином. Это и позволило авторам добиться определенного успеха в выделении РНК.
Фиксация формальдегидом РНП в разбавленном цитоплазматическом экстракте
происходит эффективнее и мягче, чем в тканевых срезах. Деградации РНК в таких
условиях не набдюдается. Поэтому нам удалось выделить полноразмерную РНК и
провести Нозер-блот анализ. К сожалению, даже более жесткие условия обработки
РНК первичными аминами (данные не приводятся), видимо, не удаляют всех
модификаций с РНК, что не позволило нам добиться синтеза на выделенных РНК
полноразмерной кДНК. Однако такие препараты РНК вполне годятся для
амплификации последовательностей в 150 пн и могут быть использованы при
синтезе меченых проб для гибридизации с РНК-чипами. В работе китайских авторов
[18] было показано, что именно такая длина, 150 нуклеотидов, является оптимальной
при синтезе проб для микрочипов.
Работа поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований (грант №
04-04-48129).
Список литературы
1. Воронина А.С. // Молек. биология. 2002. Т. 36. № 6. С. 956-969.
2. Spirin A.S. // Europ. J. Biochem. 1969. Т.10. № 1. С. 20–35.
3. Spirin A.S., Nemer M. // Science. 1965. Т. 150. № 3693. С. 214–217.
4. Воронина А.С., Куприянова Н.С.// Биохимия. 1987. Т. 52. № 6. С. 1028-1036.
5. Chekulaeva M., Hentze M.W., Ephrussi A. // Cell. 2006. Т. 124. № 2. С. 521-533.
6. Rajasekhar V.K., VialeA., Socci N.D., Wiedmann M., Hu X., HollandE.C. // Molecular
Cell. 2003. Т. 12. № 10. С. 889-901.
10
7. Воронина А.С., Потехина Е.С. // Онтогенез.1999. Т.30. № 2. С. 83-90.
8. Воронина А.С., Богатырева С.А., Родионова А.И., Глинка А.В. // Биохимия. 1977. Т.
42. № 9. С. 1585-1594.
9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.
480 с.
10. Глинка А.В., Воронина А.С. // Биоорг. химия. 1977. Т. 3. № 8. С. 1070-1077.
11. Specht K., Richter T., Muller U., Walch A., Werner M., Hofler H. // American J. Path.
2001. Т. 158. № 2. С. 419-429.
12. Abrahamsen H.N., SteinicheT., Nexo E., Hamilton-Dutoit S.J., Sorensen B.S. // J.Mol.
Diagn. 2003. Т. 5. № 1. С. 34-41.
13. von Smolinski D., Leverkoehne I., Samson-Himmelstjerna G., Gruber A.D. //
Histochem. Cell Biol. 2005. Т. 124. № 2. С. 177-188.
14. Gloghini A., Canal B., Klein U., Dal Maso L., Perin T., Dalla-Favera R., Carbone A. // J.
Mol. Diagn. 2004. Т.6. № 4. С. 290-296.
15. Ding J., Ichikawa Y., Ishikawa T., Shimada H. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2004. Т. 64.
№ 3. С. 229-235.
16. Masuda N., Ohnishi T., Kawamoto S., Monden M., Okubo K. // Nucl. Acids Res. 1999. Т.
27. № 22. С. 4436-4443.
17. Macabeo-Ong M., Ginzinger D.G. ,DekkerN., McMillan A., Regrzi J.A., WongD.T.W.,
JordanR.C.K. // Mod. Pathol. 2001. Т.15. № 9. С. 979-987.
18. Chou C.C., Chen C.H., Lee T.T. Peck K. // Nucl.Acids Res. 2004. Т.32. № 12. e99.
11
Рис. 1. Дот-гибридизация фракций градиентов CsCl с радиоактивными пробами к
мРНК Xvent-2 (верхний ряд) и Xwnt-11 (нижний ряд). В опыте – 50 зародышей.
Рис. 2. Электрофорез препаратов РНК в агарозном геле. Окраска этидиум бромидом.
А - РНК из полирибосом, Б - РНК из информосом, В - РНК из целых
нефиксированных зародышей. В опыте – РНК из 2 зародышей.
Рис. 3. Нозерн-блот анализ РНК из полисом (левые треки) и информосом (правые
треки). А - окраска фильтров метиленовым синим. Гибридизация с радиоактивноыми
пробами к мРНК Xvent-2 (Б) или Xwnt-11 (В). В опыте – РНК из 35 зародышей.
Рис. 4. Продукты ПЦР, синтезированные на РНК из смеси полисом и информосом
(слева) или из целых нефиксированных зародышей (справа). Указана длина (пн)
синтезированных фрагментов Xwnt-11 ДНК, заданная соответствующими
12
праймерами и оцененная по маркерам. Окраска этидиум бромидом. В опыте – РНК
из 0,2 зародыша.
Рис. 5. Гибридизация меченых проб, полученных на РНК из информосом (А) или
полисом (Б). В контроле (В) на смеси РНК из полисом и информосом метили только
последовательности Xwnt-11. На фильтрах в верхнем ряду нанесены
последовательности Xvent-2, а в нижнем – к Xwnt-11. В опыте – РНК из 5 зародышей.