Коновалова Елизавета Владимировна
реклама
на правах рукописи УДК 577.2.08 Коновалова Елизавета Владимировна РАЗРАБОТКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ГИДРОГЕЛЕВЫХ МИКРОЧИПАХ 03.00.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2006 Диссертация выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН, на кафедре молекулярной биофизики МФТИ (ГУ). Научный руководитель: кандидат химических наук, старший научный сотрудник Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН Рубина Алла Юрьевна Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник ИМБ РАН Нечипуренко Юрий Дмитриевич доктор биологических наук, профессор, заведующий Лабораторией молекулярной иммунологии ИБХ РАН Деев Сергей Михайлович Ведущая организация: ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Защита состоится « 22 » ноября 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408–57–00, 408–56–27. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета). Автореферат разослан «___» октября 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент Брагин В.Е. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Злокачественные опухоли являются одними из самых распространенных заболеваний с летальным исходом. Рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место по смертности от онкологических заболеваний у мужчин. Своевременное распознавание злокачественного процесса является ключевым этапом при лечении рака, поскольку оно определяет прогноз заболевания и терапию. Поэтому разработка и внедрение в практику быстрых, чувствительных и недорогих методов анализа приобретает все большее значение. Для диагностики злокачественных новообразований и контроля за лечением в настоящее время (онкомаркеры), широко используются определяемые в сыворотке опухолеассоциированные крови с помощью антигены специфических моноклональных антител. Их уровень в крови, как правило, коррелирует с размером опухоли или стадией заболевания. Количественный анализ онкомаркеров проводится иммунохимическими методами (ИФА) в основном на плашках (стрипах). Традиционные иммунологические методы позволяют выявлять содержание только одного маркера в одном клиническом образце, в то время как для постановки точного диагноза требуется анализ на содержание в крови нескольких онкомаркеров. Эта проблема решается при помощи метода, представленного в данной диссертационной работе, позволяющего количественно анализировать содержание нескольких антигенов в образце с использованием трехмерных гидрогелевых микрочипов. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью исследования является разработка метода одновременного количественного анализа общей и свободной форм простата-специфического антигена (ПСА) в сыворотке крови на биологическом микрочипе. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Разработать условия ковалентной иммобилизации белков в гелях с максимальным сохранением биологической активности. 2. Оптимизировать проведение иммуноанализа с использованием микрочипов на основе гидрогелей. Выбрать оптимальный состав геля. 3. Создать микрочип с ковалентно иммобилизованными антителами к ПСА. Ввести в состав биочипа внутреннюю калибровочную кривую (гелевые ячейки с иммобилизованным ПСА), позволяющую проводить количественное определение двух форм ПСА на одном микрочипе. 4. Оценить параметры количественного иммуноанализа ПСА на микрочипе. 3 НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ В диссертационной работе предложен оригинальный метод количественного анализа двух форм ПСА на биологическом микрочипе в формате «один образец - один микрочип». Данный метод не требует дополнительного построения калибровочных кривых при каждом проведении анализа. Создан микрочип, содержащий иммобилизованные антитела против общей и свободной форм ПСА и внутреннюю калибровочную кривую, представляющую собой гелевые ячейки с иммобилизованным в различных концентрациях ПСА. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков в гелевых элементах микрочипа с максимальным сохранением исходной активности белков. Показано, что разработанный метод одновременного количественного анализа двух форм простата-специфического антигена на биологическом микрочипе позволяет с достаточной чувствительностью, воспроизводимостью и точностью проводить определение содержания двух форм данного онкомаркера в растворах и сыворотках крови. Созданный метод может служить основой для разработки тест-системы для ранней и дифференциальной диагностики рака предстательной железы. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались на XIV зимней молодежной научной школе «Перспективные (9-12 февраля, направления 2004, Москва). физико-химической Отдельные биологии фрагменты и биотехнологии» диссертационной работы многократно докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН. ПУБЛИКАЦИИ По результатам диссертации опубликовано две научные статьи, опубликованы два тезиса докладов. Ссылки на работы даны в конце автореферата. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение; выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на __ страницах машинописного текста, содержит __ рисунков и __ таблиц. Библиография включает __ наименования. 4 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В соответствии с целями и задачами данного исследования на первом этапе разработки метода количественного анализа онкомаркеров необходимо было подобрать условия для создания белковых микрочипов, содержащих иммобилизованные антитела к двум формам ПСА и разработать сконструированном процедуру микрочипе проведения была иммуноанализа проведена оценка на микрочипе. надежности На результатов количественного иммуноанализа, воспроизводимости измерений и чувствительности метода. На втором этапе работы, для определения концентраций двух форм ПСА на одном микрочипе без предварительного построения калибровочных кривых в ходе каждого анализа, в структуру биочипа были введены дополнительные элементы (ячейки с иммобилизованным в различных концентрациях ПСА), выполняющие функцию внутренней калибровочной кривой. Проведено сравнение результатов измерений двух форм ПСА, полученных на биочипах с помощью внутренней калибровочной кривой, и стандартными иммунохимическими методами. 1. Простата-специфический антиген (ПСА) ПСА продуцируется клетками предстательной железы и представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 32 кДа. С точки зрения биохимических свойств, ПСА является ферментом - сериновой протеазой с субстратным сродством к химотрипсину и, в меньшей степени, к трипсину. При поступлении в кровь ПСА связывается с ингибиторами протеаз, в результате чего в сыворотке крови он обнаруживается как в свободной форме, так и в различных связанных молекулярных формах, не обладающих специфической ферментативной активностью: преимущественно в комплексе с антихимотрипсином (АХТ) — ПСА-АХТ и макроглобулином (МГ) — ПСА-МГ. Установлено, что доминирующей связанной формой в сыворотке крови (до 90%) является комплекс ПСА-АХТ, тогда как на долю комплекса ПСА-МГ приходится менее 1%. В сыворотке крови также всегда циркулирует не связанная с ингибиторами (свободная) форма антигена. Большая часть простатаспецифического антигена, доступная для иммунологического определения, находится в комплексе с антихимотрипсином. Незначительная часть ПСА, связанная с макроглобулином, недоступна для определения обычными иммунными методами, так как молекула ПСА экранирована комплексом. Для исследования концентрации этой фракции требуются специальные методы лабораторной диагностики. Под определением двух форм ПСА имеется в виду определение концентрации свободного ПСА (ПСАсвоб), и общего 5 ПСА (ПСАобщ). Общей формой ПСА называют сумму концентраций свободного ПСА и ПСА, связанного в комплекс с антихимотрипсином. Измерение концентрации общего и свободного ПСА в сыворотке крови больного, а также соотношения этих двух форм, позволяет различать злокачественные и доброкачественные заболевания предстательной железы. В норме у здорового мужчины и при доброкачественных заболеваниях соотношение [ПСАсвоб]/[ПСА общ] в сыворотке крови более 0.25, а при РПЖ – менее 0.1. Принимая во внимание высокую клиническую значимость ПСА как диагностического маркера, было решено создать специальный микрочип для одновременного количественного определения двух форм ПСА, который может найти применение для ранней дифференциальной диагностики рака предстательной железы, включая массовое обследование населения. 2. Белковые микрочипы В лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта разрабатываются микрочипы на основе трехмерных гидрогелей. Технология гидрогелевых микрочипов достаточно универсальна и может быть применена для изготовления чипов, содержащих различные по своей природе иммобилизованные зонды: ДНК, РНК, белки, пептиды и пр. Олигонуклеотидные микрочипы уже используются для диагностики целого ряда инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний. Биочип представляет собой подложку (пластик, стекло и др.), на которую нанесены полусферические гелевые элементы (ячейки). Каждый гелевый элемент микрочипа содержит иммобилизованный индивидуальный зонд. Носителем обработанные для иммобилизации специальным агентом гидрогелей (Bind являются Silane) для стеклянные создания пластинки, непредельной метакрильной группы на поверхности стекла. Далее на активированное таким образом стекло роботом с пиновой технологией нанесения наносится полимеризационная смесь в виде микрокапель, содержащая иммобилизуемые зонды и гелеобразующие мономеры. Ячейки находятся на гидрофобной поверхности подложки с определенным периодом; число ячеек на микрочипе и их размер определяются задачей и условиями предполагаемого эксперимента. Ковалентная иммобилизация зондов происходит при облучении микрочипа ультрафиолетовым светом. Иммобилизация протекает одновременно с полимеризацией геля, т.е. происходит ковалентное связывание зонда с компонентами растущей полимерной цепи в ходе фотоиндуцируемой полимеризации. 6 Рисунок 1. Получение ячеек гидрогеля, содержащих молекулярный зонд, методом фотоиндуцированной сополимеризации. Для того чтобы участвовать в реакции фотоиндуцируемой полимеризации, биологические соединения должны содержать активные группы, способные вступать в реакции замещения или присоединения с бифункциональными гелеобразующими мономерами (кросс-линкерами). В качестве таких активных групп могут выступать амино- и сульфгидрильные группы. Биологические соединения, такие как белки, не нуждаются в дополнительной модификации, а олигонуклеотиды, ДНК и сахара перед проведением иммобилизации необходимо модифицировать введением в их структуру амино- либо сульфгидрильных групп. В качестве гелеобразующих соединений в нашей работе использовали производные метакриламида и N,N-метиленбисакриламид. 2.1. Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа Регистрацию результатов анализа осуществляли флуориметрически или хемилюминометрически непосредственно с гелевых элементов микрочипа. Белки, используемые для детекции, содержали флуоресцентную метку (Су5) или являлись ферментами, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хемилюминесценция). Флуоресцентные измерения проводили на анализаторе биочипов (ИМБ РАН) с использованием фильтров 650/670 нм (возбуждение/регистрация). Расчет интенсивности флуоресцентного сигнала производили с помощью программного обеспечения ImaGelAssay (ИМБ РАН). Хемилюминесцентные сигналы, полученные во время реакции окисления люминола перекисью водорода, катализируемой пероксидазой, в присутствии усилителей хемилюминесценции, регистрировали CCD-камерой флуоресцентного микроскопа с выключенным источником света. 7 2.2. Подбор условий иммобилизации белков В процессе образования полимерного геля белок подвергается различным денатурирующим воздействиям, в результате чего может происходить его инактивация, вплоть до полной потери каталитической или биологической активности. Причиной искажения структуры белка могут быть неспецифические взаимодействия (электростатические, гидрофобные, водородные связи) между белком и носителем; инактивация может происходить под действием свободных радикалов, образующихся при радикальной полимеризации; также денатурацию белка могут вызывать компоненты реакционной смеси, в первую очередь, мономер. Важной задачей являлся подбор условий иммобилизации белков с сохранением ими биологической активности. Для решения этой задачи для иммобилизации на чипах были выбраны ферменты, как белки чувствительные к различным видам модификаций и позволяющие детектировать не только степень их иммобилизации на чипе, но и сохранение ферментативной активности. В качестве объектов были выбраны широко используемые в аналитической биохимии и иммунохимии пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. В первых экспериментах для изготовления белковых микрочипов использовали стандартные условия изготовления микрочипов, содержащих ДНК и олигонуклеотиды (время полимеризации 90 мин, ультрафиолетовое излучение с максимумом при длине волны 312 нм). При проведении полимеризации в этих условиях, сигналы от ячеек, содержащих иммобилизованную пероксидазу, в концентрации 1мг/мл были всего на 10% выше фона. Предположили, что данные условия получения микрочипов могут приводить к инактивации белков. Было проверено действие ультрафиолетового излучения на активность пероксидазы и щелочной фосфатазы в растворе. Через определенные промежутки времени облучения отбирали аликвоты растворов и спектрофотометрически определяли активность ферментов по скорости взаимодействия с субстратами [реакция окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы (460нм) и реакция гидролиза п-нитрофенилфосфата в присутствии щелочной фосфатазы (405нм)]. Активность измеряли по тангенсу угла наклона прямолинейного начального участка кинетической кривой. 8 Рисунок 2. Инактивация пероксидазы (1) и щелочной фосфатазы (2) под действием ультрафиолетового излучения в течение времени. Раствор пероксидазы и фосфатазы (1мг/мл) облучали УФ-светом с максимумом излучения 312(▲) и 350(●) нм. Оказалось, что через 50 мин облучения пероксидазы УФ-света с длиной волны 312 нм теряется более 90% активности. Необходимо было подобрать более мягкие условия изготовления микрочипов. Для этого: (1) использовали УФ излучение с максимумом 350 нм при полимеризации, (2) полимеризацию производили при охлаждении, чтобы температура полимеризационной смеси не превышала 20оС, (3) уменьшили время полимеризации до 50 мин, (4) вводили в гель сахарозу в качестве стабилизирующей добавки (от 10 до 60%). Сигналы, получаемые от иммобилизованной пероксидазы в выбранных нами условиях, были в 20–30 раз выше, чем в стандартных условиях изготовления ДНК-микрочипов. Известно, что сахара препятствуют дегидратации и способствуют стабилизации белков. Поэтому в дальнейшем в работе использовали гели на основе мономеров, производных метакриламида и аминосахаров. Для измерения сохранения активности пероксидазы после иммобилизации на микрочипе в выбранных условиях, фермент иммобилизовали на микрочипе в разных концентрациях (10–60 мкг/мл геля). Получили зависимость интенсивности хемилюминисцентного сигнала гелевых эелементов от концентрации иммобилизованной пероксидазы. По этим данным рассчитали удельную активность фермента (с учетом эффективности иммобилизации). Для измерения активности пероксидазы, не подвергающейся влиянию иммобилизации, фермент сорбировали на пустых гелевых 9 элементах; ферментативную активность определяли как интенсивность хемилюминесценции гелевых элементов после добавления субстрата (люминол и перекись водорода). Удельная ферментативная активность сорбированной пероксидазы составила 105 отн.ед., после иммобилизации 7·104 отн.ед. Таким образом, после иммобилизации фермент сохранил около 70% активности. В результате были подобраны условия ковалентной иммобилизации белков в геле с сохранением ими биологической активности. 2.3 Выбор состава геля для проведения иммуноанализа на гелевых белковых микрочипах на примере прямого анализа ПСА Необходимо было выбрать состав геля, обладающий достаточной пористостью для проникновения антигена и образования бинарного комплекса антитело-антиген. Технология изготовления трехмерных гелевых микрочипов позволяет создавать гели различной пористости, необходимой для проведения анализа разных типов биомолекул. для иммобилизации антител. Для выражения состава геля используют обозначения Т(%) – суммарная масса всех гелеобразующих мономеров к объему геля, и С(%) – вес сшивки к суммарному весу всех гелеобразующих мономеров. Известно, что повышение пористости геля возможно достичь за счет уменьшения концентраций гелеобразующих мономеров (Т %). В то же время, размер пор также сильно зависит от концентрации добавляемого в раствор мономера “сшивающего” агента (С %). В случае акриловых полимеров эта зависимость имеет вид кривой с минимумом при концентрации сшивки около 5% [И.В.Березин, 1987]. Мы исследовали влияние процентного содержания мономера и сшивки на пористость получаемых гелей. Для этого изготовили микрочипы с гелями различного состава, содержащими иммобилизованые антитела к ПСА в равных концентрациях. На этих микрочипах были получены кинетические кривые образования бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА-Су5 с моноклональными антителами (рис. 3). Раствор флуоресценто-меченного антигена в PBS (фосфатно-солевой буфер, 0.15 М NaCl, рН 7.2), содержащем 0.15% поливинилового спирта и 0.15% поливинилпирролидона, наносили на микрочипы, и регистрировали рост флуоресцентного сигнала на гелевых ячейках микрочипа с течением времени. Во всех гелях в качестве основного мономера использовали 2-метакриламидо-2-дезокси-D-глюкозу, в качестве сшивающего агента N,N-метиленбисакриламид. 10 Рисунок 3. Кинетические кривые образования бинарного комплекса ПСА-Су5 с антителами к ПСА (0.6 мг/мл в геле), иммобилизованными в гелях состава T3%C2.5% (1), T4%C2.5% (2), T3%C25% (3), T5%C4% (4) и T6%C5% (5). Концентрация антигена в буфере PBS 100 нг/мл. Т= 20°С. Как видно из рисунка, максимального флуоресцентного сигнала удается достичь при использовании композиции Т3%С2.5%, минимальный сигнал был получен от ячеек с гелем T6%C5%. Эффективность иммобилизации антител во всех гелях была примерно одинакова и составляла 30-40%. Таким образом установили, что гель с минимальной концентрацией мономеров и сшивки обладал наибольшей пористостью, что согласуется с данными, известными для акриловых полимеров. В дальнейшей работе для изготовления микрочипов был выбран гель состава Т3%С2.5%. 2.4. Сравнение двумерных и трехмерных микрочипов Для изготовления белковых микрочипов используются различные технологии, в большинстве случаев белки закрепляют (за счет физической сорбции или ковалентно) на поверхности твердых носителей; такие микрочипы являются ‘двумерными’. Чтобы сравнить трехмерную гелевую поверхность с двумерной, были изготовлены микрочипы, содержащие антитела к ПСА, иммобилизованные в различных концентрациях. Для получения двумерных чипов поверхность стеклянных слайдов обрабатывали реагентом (3-глицидилоксипропил)-триметоксисиланом. Эпоксидирование слайда даёт возможность получать спейсер, отделяющий белок от носителя, это имеет значение для уменьшения потери исходной активности белка за счет стерических затруднений, возникающих в процессе иммобилизации. В качестве трехмерных 11 микрочипов использовали гелевые микрочипы, изготовленные по технологии, описанной выше. Микрочипы инкубировали с раствором ПСА (в различных концентрациях), после инкубации промывали 20 мин PBS, содержащим 0.1% Tween-20, и проявляли антителами, специфичными к другому эпитопу, меченными Су-5 (15 мкг/мл), в течение 2 ч. Регистрацию сигналов проводили при помощи флуоресцентного микроскопа. Для двух типов микрочипов были получены графики зависимости интенсивности флуоресцентных сигналов от концентрации антигена (ПСА) в растворе (рис.4). Рисунок 4. Зависимость интенсивности флуоресцентных сигналов от концентрации ПСА в растворе в случае трехмерных (а) и двумерных (б) микрочипов. Концентрации иммобилизованных антител к ПСА в ячейках микрочипов: [1] – 220мкг/мл, [2] – 110мкг/мл, [3] – 50 мкг/мл, [4] – 25мкг/мл, [5] – 14мкг/мл. Как видно из рисунка, флуоресцентные сигналы, соответствующие максимальной концентраций иммобилизованных антител в случае гелевых микрочипов на порядок превосходят сигналы от аналогичных ячеек двумерных микрочипов. В то же время, сигналы для минимальной концентрации антител в геле превышают сигналы от иммобилизованных на двумерных микрочипах антител в четыре раза. Это можно объяснить тем, что в случае двумерных микрочипов существует зависимость эффективности иммобилизации от исходной концентрации иммобилизуемого белка; и довольно быстро наступает насыщение по количеству иммобилизованных молекул на единицу поверхности, при достижении которого не происходит дальнейшего увеличения количества иммобилизуемого соединения. Трехмерная структура геля повышает емкость иммобилизации по сравнению с поверхностным слоем, увеличивая возможное количество 12 иммобилизуемого белка в пересчете на единицу поверхности; при этом иммобилизованные соединения равномерно распределены по всему объему геля на достаточно удаленном расстоянии друг от друга (более 1000Å) даже при высокой концентрации иммобилизуемых зондов [Rubina 2004]. Кроме того, иммобилизация в объеме гелевого элемента предохраняет молекулы от контакта с гидрофобной поверхностью подложки, что предотвращает денатурацию белков. Все это позволяет получить более высокую чувствительность анализа на гелевом микрочипе, по сравнению с двумерными микрочипами. 3. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами При выборе антител важной характеристикой является их аффинность, характеризующаяся константой ассоциации. На микрочипах были измерены константы ассоциации для антител, специфически связывающих общую(PSA-36) и свободную(PSA30) формы ПСА. Для определения константы ассоциации образования бинарных комплексов ПСА, меченного флуоресцентным красителем Су-5 с иммобилизованными антителами к свободной и общей форме, на микрочипах получили зависимость интенсивности флуоресцентных сигналов от концентрации ПСА-Су5 в растворе. Из полученных данных рассчитали Kass антигена с антителами (по формуле 1). Рисунок 5. Определение константы ассоциации (Kass) образования бинарных комплексов между ПСА-Су5 и иммобилизованными на микрочипе антителами PSA-30 и PSA-36 (200 мкг/мл в геле). Сигналы Iфлуор для разных концентраций ПСА измерены в насыщении. 13 1 1 1 1 = + I α Kass [ Ab0 ] [ Ag 0 ] α [ Ab0 ] (1), где I — интенсивность флуоресцентного сигнала; α – коэффициент пропорциональности; [Ab0] — общая концентрация иммобилизованных антител в геле, [Ag0] — общая концентрация антигена в растворе. Более подробное описание расчета констант ассоциации представлено в [Rubina A. Yu. 2005]. График зависимости интенсивности сигнала от концентрации антигена в растворе, представленный в двойных обратных координатах, можно аппроксимировать в виде прямой линии с углом наклона 1 1 , пересекающей ось ординат в точке . α Kass [ Ab0 ] α [ Ab0 ] Значение константы ассоциации может быть рассчитано из соотношения Kass= − точке 1 в [ Ag 0 ] 1 =0. I Расчётная константа ассоциации для флуоресцентно-меченного ПСА и антител PSA-36 к общей форме составила (1.5±0.4)*108 М-1 , для антител PSA-30 к свободной форме (1.1±0.4)*108 М-1. Полученные значения констант соответствуют значениям для данных антител, известных от производителей, что говорит об иммобилизации антител без потери биологической активности. 4. Белковый гидрогелевый микрочип для количественного анализа двух форм ПСА Основной задачей данной работы являлось создание аналитической системы для одновременного количественного определения двух форм ПСА на основе гидрогелевого микрочипа. На первом этапе необходимо было создать микрочип с иммобилизованными антителами и оптимизировать процедуру анализа на микрочипе. Известно, что наиболее чувствительным из возможных типов иммуноанализа является сэндвич-иммуноанализ. Сэндвич-вариант иммуноанализа возможен, если использовать антитела, специфичные к разным эпитопам белковой молекулы. В случае сэндвич-иммуноанализа микрочип содержит иммобилизованные антитела, реакционная среда (образец) содержит антиген, и на первой стадии происходит образование специфического бинарного комплекса антиген-иммобилизованное антитело. После образования 14 комплекса микрочип обрабатывают проявляющими флуоресцентно-меченными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антигена. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа. В результате получают график зависимости флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих антитела, от концентрации антигена в растворе (калибровочную кривую), по которой далее определяют неизвестную концентрацию антигена в исследуемом образце. Для иммобилизации были выбраны моноклональные антитела против свободной формы ПСА (PSA-30) и общей формы ПСА (PSA36); в качестве проявляющих антител выбрали PSA66 фирмы CanAg (Швеция). Антитела PSA30 специфичны к участку сайта связывания ПСА с антихимотрипсином, антитела PSA-36 специфичны к открытому участку ПСА, общие проявляющие антитела PSA-66 специфичны к другому открытому участку ПСА. Иммуноанализ проводили следующим образом: микрочипы после полимеризации отмывали в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7.2, содержащем 0.15 М NaCl (PBS) и 0.1% Tween-20, и затем дистиллированной водой. Для уменьшения неспецифических взаимодействий микрочипы обрабатывали блокирующим раствором: 1% поливинилового спирта (ПВС) в PBS, в течение 40 мин, затем промывали дистиллированной водой и наносили 30 мкл образца. Далее микрочипы инкубировали в течение 17 ч при 22-25°С. После инкубации микрочипы промывали 20 мин PBS, содержащим 0.1% Tween-20, и проявляли антителами PSA-66, меченными Су-5 (15 мкг/мл), в течение 2 ч. Регистрацию и расчет интенсивности флуоресцентного сигнала проводили с помощью программного обеспечения ImaGelAssay; при анализе полученных данных интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых ячеек. 4.1. Характеристики количественного иммуноанализа ПСА на биочипах На микрочипах, содержащих иммобилизованные антитела против ПСАобщ и ПСАсвоб была проведена оценка воспроизводимости измерений и чувствительности метода. Для оценки воспроизводимости в серии экспериментов на 100 микрочипах получили графики зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации антигена в растворе (рис. 6). Рабочий диапазон концентраций для определения ПСАобщ составляет 0,3 – 60 нг/мл, для ПСАсв — 0,2 – 20 нг/мл. Коэффициент вариации (К.В.), значение которого определяли как отношение стандартного отклонения к средней величине флуоресцентного сигнала, выраженное в процентах, для различных концентраций определяемого антигена 15 находился в интервале 7–10 % для серии из 10 калибровочных кривых, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости анализа ПСА на микрочипах. Рисунок 6. Сэндвич-иммуноанализ ПСА на микрочипах. Зависимость интенсивности флуоресценции гелевых ячеек микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против ПСАобщ (а) и ПСАсвоб (б), от концентрации ПСА в растворе. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений. На вставках к рис. (а) и (б) приведены начальные участки соответствующих кривых. На осях ординат показаны значения интенсивности флуоресценции нулевой пробы, I0, а также I0 плюс два стандартных отклонения (I0 + 2SD). Чувствительность анализа, т.е. наименьшую определяемую концентрацию ПСА, рассчитывали как концентрацию, соответствующую значению флуоресценции, превышающему не менее чем на два стандартных отклонения флуоресцентный сигнал многократно измеренной (более 10 раз) нулевой калибровочной пробы, не содержащей анализируемого соединения. Чувствительность определения для ПСАобщ составила 0,3 нг/мл, а для ПСАсв – 0,2 нг/мл (рис. 3в, 3г). Результаты по воспроизводимости и чувствительности полностью удовлетворяют иммунологическим аналитическим системам. 16 требованиям, предъявляемым к 2.5. Внутренняя калибровочная кривая Для определения концентрации двух форм ПСА в образце в одном анализе в состав микрочипа, помимо гелевых ячеек с иммобилизованными антителами, были введены ячейки, содержащие иммобилизованный антиген (ПСА) в различных концентрациях. Структура микрочипа с внутренней калибровочной кривой приведена на рис. 7. Рисунок 7. Флуоресцентное изображение гелевых ячеек микрочипа для количественного определения двух форм ПСА после проведения иммуноанализа. Структура микрочипа: иммобилизованные антитела к ПСАобщ, 200 мкг/мл геля (ряд 1), иммобилизованные антитела к ПСАсв, 200 мкг/мл геля (ряд 2), иммобилизованный ПСА в концентрации 0 (ряд 3), 7 мкг/мл (ряд 4), 14 мкг/мл (ряд 5), 25 (ряд 6) мкг/мл, 55 мкг/мл (ряд 7), 80 мкг/мл (ряд 8), 160 мкг/мл (ряд 9) мкг/мл геля. При проведении сэндвич-анализа иммобилизованный ПСА взаимодействует с проявляющими флуоресцентных флуоресцентно-меченными сигналов от антителами; соответствующих при гелевых этом ячеек интенсивность пропорциональна концентрации иммобилизованного ПСА (рис. 8). Рисунок 8. Внутренняя калибровочная кривая — зависимость интенсивности флуоресценции гелевых ячеек от концентрации иммобилизованного на микрочипе ПСА. Каждая точка кривой является средним из измерений на 50 микрочипах. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений. 17 Полученную зависимость использовали в качестве индивидуального калибровочного графика на каждом микрочипе (внутренняя калибровочная кривая). Концентрации ПСА для иммобилизации выбирали таким образом, чтобы интенсивности флуоресцентных сигналов соответствовали диапазону флуоресцентных сигналов калибровочных кривых для ПСАобщ и ПСАсвоб, получаемых в растворе (рис. 6 и 8). Ряд 3 не содержит иммобилизованного антигена, и служит, в том числе, для контроля неспецифического связывания с гелем. Для оценки воспроизводимости внутренней калибровочной кривой на 50 микрочипах после проведения сэндвич-иммуноанализа, получили зависимость флуоресцентного сигнала от концентрации иммобилизованного в ячейках ПСА. Концентрацию ПСА в растворе варьировали от 0 до 60 нг/мл при постоянной концентрации проявляющих антител. Величина флуоресцентного сигнала от ячеек с иммобилизованным антигеном не зависела от концентрации антигена в растворе, коэффициент вариации для всех концентраций иммобилизованного антигена не превышал 10% (рис. 8). 4.3. Определение значений «эффективных» концентраций для внутренней калибровочной кривой Для проведения количественного анализа на микрочипе с внутренней калибровочной кривой необходимо было соотнести флуоресцентные сигналы от ячеек, содержащих иммобилизованный антиген с сигналами, получаемыми от гелевых элементов с иммобилизованными антителами. Для этого флуоресцентные сигналы, полученные от ячеек с иммобилизованным антигеном, сравнивали с сигналами калибровочных кривых для ПСА в растворе (см. рис. 6 и 8), и каждой из ячеек с иммобилизованным антигеном присваивали значение «эффективной» концентрации, соответствующей данному сигналу, полученному от антигена в растворе. Было показано, что отнесение сигналов и определение «эффективных» концентраций можно производить один раз для большой (100 и более) партии микрочипов, и далее данные «эффективные» концентрации использовать при проведении анализа на каждом микрочипе этой партии. 4.4. Получение результатов иммуноанализа Определение концентрации ПСАобщ в образце с использованием внутренней калибровочной кривой показано на рис. 9. После измерений интенсивности флуоресцентных сигналов гелевых элементов с иммобилизованными антителами против ПСАобщ (ряд 1 на рис. 9 ) и элементов внутренней калибровочной кривой (ряды 3–9 на рис. 7), строили зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации ПСА с 18 использованием предварительно полученных «эффективных» концентраций для ПСАобщ, по которой рассчитывали концентрацию ПСАобщ в образце (пунктирная линия на рис. 9 ). Рисунок 9. Получение результатов анализа ПСАобщ с помощью внутренней калибровочной кривой на микрочипе. На диаграмме показаны флуоресцентные сигналы от гелевых элементов с иммобилизованными антителами против ПСАобщ (ряд 1), сигналы внутренней калибровочной кривой (ряды 3–9) и «эффективные» концентрации, рассчитанные для ПСАобщ. В данном образце [ПСАобщ] = 37 нг/мл. Определение концентрации ПСАсв проводили аналогичным образом по интенсивности флуоресценции гелевых элементов с иммобилизованными антителами против ПСАсвоб (ряд 2 на рис. 7) и «эффективным» концентрациям, рассчитанным для ПСАсвоб. Для обработки результатов иммуноанализа на микрочипах была специально разработанна программа «ImaGelAssay» (ИМБ РАН). Программа регистрирует флуоресцентные сигналы от гелевых ячеек биочипа, строит калибровочные кривые по «эффективным» концентрациям и сигналам, полученным от ячеек с иммобилизованным антигеном. Затем по сигналам от ячеек с иммобилизованными антителами программа автоматически определяет концентрации двух форм ПСА и их соотношение в исследуемом образце. 19 4.5. Определение содержания двух форм ПСА в сыворотках крови С использованием микрочипов с внутренней калибровочной кривой и программы «ImaGelAssay» проведено определение концентраций двух форм ПСА в сыворотках крови доноров и больных раком предстательной железы. В качестве референсых значений использовали концентрации использованием двух диагностических форм наборов ПСА, определенные фирмы CanAg методом (Швеция). ИФА с Результаты измерений 17 сывороток в двух системах приведены на рис. 10 а,б. Рисунок 10. Сравнение результатов анализа общей (а) и свободной (б) форм ПСА на микрочипах, содержащих внутреннюю калибровочную кривую, с результатами ИФА, полученными при использовании набора фирмы CanАg (Швеция). Как видно из рисунка, полученные данные хорошо коррелируют между собой: коэффициент корреляции составил r = 0.988 для общей формы ПСА и r = 0.987 для свободной формы ПСА. 5. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами и ПСА Иммобилизация в геле способствует стабилизации белков. В особенности это важно для ПСА, который является ферментом и, как известно, плохо хранится в растворе. Микрочипы с иммобилизованными антителами и ПСА хранили при +2 – 8°С. В данной работе были получены калибровочные кривые от антигена в растворе и внутренние калибровочные кривые на свежеизготовленных микрочипах и микрочипах, после хранения в течение года. Флуоресцентные сигналы в обоих случаях находились в 20 пределах допустимых значений разброса (К.В. ≤ 10%). Минимально определяемая концентрация антигена не менялась в зависимости от хранения микрочипов. Рисунок 11. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами и ПСА. (а) Внутренняя калибровочная кривая. Флуоресцентные сигналы гелевых ячеек получены на биочипах непосредственно после изготовления (1) и после хранения биочипов в течение 6 месяцев при 2–8оС (2). (б) Калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа общей формы ПСА, полученные на контрольных микрочипах (хранение в течение суток) (1) и после хранения в течение 6 месяцев при 2–8оС (2). Подобранный нами состав гелеобразующих мономеров, в который входят производные аминосахаров, препятствует дегидратации сформированных гелевых элементов при хранении микрочипов, что также способствует сохранению исходных свойств иммобилизованных белков. 21 ВЫВОДЫ 1. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков в гелевых элементах микрочипов с максимальным сохранением исходной активности белков. 2. Разработан биологический микрочип для количественного анализа общей и свободной форм простата-специфического антигена. Подобраны условия для проведения одновременного иммуноанализа двух форм ПСА на микрочипе. 3. Показана возможность проведения количественного анализа двух форм ПСА на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные антитела и внутреннюю калибровочную кривую, иммобилизованный антиген. Разработанный метод позволяет значительно упростить процедуру анализа, проводя его в формате один микрочип – один анализ. 4. Получены основные аналитические характеристики разработанного метода: проведена оценка воспроизводимости и чувствительности иммуноанализа двух форм ПСА на микрочипе. Результаты полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к иммунологическим аналитическим системам. 5. Показано, что результаты измерений содержания в сыворотках крови ПСАобщ и ПСАсв на биочипах коррелируют с результатами, полученными в стандартных тестсистемах. МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ: 1. A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, A.A. Stomakhin, E.L. Darii, S.V. Pan’kov, V.E. Barsky, S.M. Ivanov, E.V. Konovalova, and A.D. Mirzabekov. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. //Biotechniques 34: 1008–1022 (May 2003) 2. Е.В. Коновалова, А.Ю. Рубина. Разработка метода иммуноферментного анализа на гелевых микрочипах. Тезисы докладов и стендовых сообщений ХVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 9-12 февраля 2004г. С. 86-87. 3. Т.П. Рябых, Т.В. Осипова, Е.И. Дементьева, Е.Н. Савватеева, Е.В. Коновалова, А. Соколова, А.Ю. Рубина, А.Ю. Барышников, А.С. Заседателев. Тест-система в формате биочипа для одновременного количественного определения общей и свободной форм простата-специфического антигена в сыворотке крови. //Российский биотерапевтический журнал, 2006, № 1, Т. 5, С. 49-57. 4. Т.П. Рябых, Т.В. Осипова, Е.И. Дементьева, Е.Н. Савватеева, Е.В. Коновалова, А. Соколова, А.Ю. Рубина, А.Ю. Барышников, А.С. Заседателев. “Разработка диагностической тест-системы на основе биочипа на простатический специфический антиген (общую и свободную формы)”. Российский биотерапевтический журнал, 2006, № 1, Т. 5, С. 10. 22 Коновалова Елизавета Владимировна Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах Подписано в печать 19.10.06. Формат 60х84 1/16. Печать офсетная. Усл.печ.л.1,0. Уч.-изд.л.1,0 Тираж 60 экз. Заказ № фГосударственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский физико-технический институт (государственный университет) Отдел автоматизированных издательских систем "ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ" 141700, Моск.обл., г.Долгопрудный, Институтский пер.,9
