ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВЫХ МИКРОЧИПОВ

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВЫХ
МИКРОЧИПОВ
Зубцова Ж. И., Зубцов Д. А.
ВВЕДЕНИЕ
Биологические микрочипы (биочипы) – массивы ячеек, содержащих различные зонды – в
отличие от стандартных методов позволяют проводить многопараметрический анализ
образцов, причем для этого требуется минимальное количество биологического
материала.
«Трехмерный» гидрогелевый
биочип, изготовленный
по технологии,
разработанной в ИМБ РАН под руководством академика А.Д. Мирзабекова [1, 2],
представляет собой матрицу регулярно расположенных на подложке полусферических
гелевых
элементов.
Каждая
ячейка
микрочипа
содержит
иммобилизованный
индивидуальный молекулярный зонд. В основе технологии гидрогелевых микрочипов
лежит метод фотоиндуцируемой сополимеризации. Технология универсальна и позволяет
изготавливать биочипы, содержащие различные по своей природе иммобилизованные
зонды: ДНК, РНК, белки, сахариды, клетки [1-4].
Ранее была показана возможность проведения различных типов иммуноанализа на
белковых гидрогелевых микрочипах [5-11]. Одним из перспективных направлений
исследований является разработка на основе технологии трехмерных гидрогелевых
микрочипов
метода
одновременного
количественного
определения
различных
биологических параметров в сыворотке крови человека, например, таких, как уровень
маркеров онкологических заболеваний (онкомаркеров). В настоящее время известно более
200 онкомаркеров, однако на практике широко используются лишь 10-15 из них. В
клинической практике специализированных онкологических учреждений применение
маркеров подтвердило их эффективность при диагностике рака предстательной железы
(простат-специфический
антиген),
герминогенных
опухолях
(альфа-фетопротеин,
хорионический гонадотропин человека), трофобластических опухолях (хорионический
гонадотропин
человека),
раке
легкого
(раково-эмбриональный
антиген;
нейрон-
специфическая енолаза), раке толстой кишки (раково-эмбриональный антиген, раковый
антиген СА 19-9), раке поджелудочной железы (раковый антиген СА 19-9), первичном
раке печени (альфа-фетопротеин), опухоли молочной железы, раке яичников (раковый
антиген СА 15-3, раковый антиген СА 125), раке шейки матки (раковый антиген 15-3),
опухоли желудочно-кишечного тракта (раковый антиген СА 125) и др. [12-14] Также
онкомаркеры используются в клинической практике для мониторинга проводимой
терапии. Одновременное определение нескольких онкомаркеров позволяет повысить
чувствительность скринингового анализа, увеличивает возможности дифференциальной
диагностики заболеваний, а в ряде случаев обеспечивает определение типа опухоли.
Выявление повышенной концентрации только одного онкомаркера не является
достаточным доказательством для постановки диагноза онкопатологии, поскольку может
быть связано с наличием у обследуемого человека воспалительного процесса [15]. На
практике при первичном обследовании пациента с помощью индивидуальных тест-систем
редко назначают анализ всего спектра онкомаркеров. В результате можно пропустить
повышение концентрации какого-либо из онкомакеров, выявление которого может
поменять сам диагноз. Для определения локализации опухоли важно знать не только
значения концентраций отдельных маркеров, но и их соотношения.
В Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН разработан метод одновременного
количественного иммунофлуоресцентного анализа нескольких антигенов на биочипе. В
данной работе представлена разработка прототипа тест-системы, предназначенного для
одновременного количественного определения девяти серологических онкомаркеров
методом иммунофлуоресцентного анализа на биочипе. В качестве объектов были
выбраны следующие серологические маркеры: альфа-фетопротеин (АФП), раковоэмбриональный антиген (РЭА), хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), раковый
антиген 15-3 (СА 15-3), раковый антиген 125 (СА 125), раковый антиген 19-9 (СА 19-9),
общая форма простат-специфического антигена (ПСАобщ), свободная форма простатспецифического
Концентрации
антигена
данных
(ПСАсвоб)
и
онкомаркеров
в
нейрон-специфическая
крови
повышаются
енолаза
при
(НСЕ).
различных
онкозаболеваниях. Данные маркеры широко используются в клинической практике и
сопряжены с наиболее часто встречающимися видами раковых заболеваний. Различные
сочетания этих онкомаркеров используются для дифференциальной диагностики
заболеваний.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Приборы и реактивы. В работе использовали антигены ПСА, АФП, РЭА, ХГЧ («ХемаМедика», Россия), СА 125, CA 15-3, CA 19-9 («Fujirebio Diagnostics» («CanAg»)).
Антиген
НСЕ
был
любезно
предоставлен
профессором
П.Г. Свешниковым
(Всероссийский научный центр Молекулярной Диагностики и Лечения; Москва,
Россия). Были использованы следующие пары антител фирмы «Fujirebio Diagnostics»
(«CanAg»), Швеция: моноклональные антитела PSA30, распознающие ПСА только в
свободной форме, PSA36 и PSA66, распознающие как свободный ПСА, так и ПСА,
связанный в комплекс с α1-антихимотрипсином; моноклональные антитела против
РЭА CEA12-140-1 и CEA12-140-10; моноклональные антитела против НСЕ NSE17 и
NSE21, моноклональные антитела против СА 125 Ovk95, моноклональные антитела
против СА 19-9 С241. Моноклональные антитела против АФП XFP2 и XFP4,
моноклональные антитела против СА 125 X-52. Моноклональные антитела против СА
15-3 X-19 и моноклональные антитела против α-субъединицы ХГЧ XF-1 и против βсубъединицы ХГЧ XH-51 были приобретены у фирмы «Хема-Медика», Россия.
Антитела PSA30, PSA36, XF-1, XFP4, CEA12-140-1, X-52, X-19, C241 и NSE17
иммобилизовали в гелевых ячейках микрочипа. Антитела PSA66, XFP2, XH-51, CEA12140-10, Ovk-95, X-19, C241 и NSE21 использовали в качестве проявляющих антител.
Бычий сывороточный альбумин (БСА), метилизотиазолон гидрохлорид (MIT),
поливиниловый спирт (PVA), 50 кДа; поливинилпирролидон (PVP), 360 кДа, Tween20 и Сефадекс® G-25 coarse были приобретены у фирмы Sigma (США);
флуоресцентный краситель Су5 и Bind Silane – у фирмы Amersham Pharmacia
Biosciences (США); Micro Bio-Spin хроматографические колонки – у фирмы Bio-Rad
Laboratories (Франция).
В работе использованы стеклянные подложки фирмы Corning, США (Corning 2947
Micro Slides). Для изготовления микрочипов стеклянные слайды обрабатывали
растворами NaOH, H2SO4, промывали водой, затем погружали в раствор 1% Bind
Silane в этиловом спирте, отмывали в этиловом спирте, воде и высушивали.
Cпециально изготовленные камеры объемом 130 мкл использовали для проведения
количественного анализа на микрочипах.
Остальные химические реактивы были получены из коммерческих источников и
использованы без предварительной очистки. Растворы готовили на деионизованной
воде MilliQ.
Образцы сывороток крови были предоставлены ГУ Российским Научным Центром
Хирургии
имени
академика
Б.В. Петровского
РАМН
(Москва,
Россия),
ФГУ
«Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента
Российской Федерации (Москва, Россия), Московской медицинской академией им. И. М.
Сеченова (Москва, Россия).
Температуру
37oC
поддерживали
с
помощью
термостата
фирмы
Lab-line
Instruments (США).
Буферные растворы. В работе использовали следующие буферы: PBS (0,01M
фосфатный буфер, pH 7,2, 0,15M NaCl), отмывочный буфер PBST (PBS, содержащий
0,1% Tween-20), блокирующий буфер PBSP (1% раствор PVA в PBS).
Приготовление смеси флуоресцентно-меченных проявляющих антител. Введение
флуоресцентной метки осуществляли по аминогруппам белков. К раствору Nгидроксисукцинимидного эфира Cy5 в диметилсульфоксиде с концентрацией 10 мг/мл
добавляли раствор антител с концентрацией 0,7-4,6 мг/мл в 0,01М бикарбонатном
буфере (рН 9,5) так, чтобы соотношение белок: краситель составляло 1:15. Реакцию
проводили 1 ч при перемешивании и температуре 20оС. Белок с флуоресцентной меткой
очищали от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией на Micro Bio-Spin колонке,
заполненной сефадексом G-25 и уравновешенной PBS буфером. Количество молекул
красителя, введенных в молекулу белка, определяли спектрофотометрически по
поглощению при длине волны 650 нм для Cy5 и 280 нм для белка. Методика получения
конъюгатов антител с флуоресцентным красителем подобрана таким образом, чтобы
молярное соотношение белок: флуоресцентный краситель Су5 составляло около 1:2.
Проявляющая смесь антител для иммуноанализа на чипе содержала антитела против ПСА
(PSA66-Су5; 4 мкг/мл), антитела против АФП (XFP2-Cy5; 4 мкг/мл), антитела против
РЭА (CEA12-140-10-Cy5; 3 мкг/мл), антитела против α-субъединицы ХГЧ (XH-51-Cy5;
4 мкг/мл), антитела против НСЕ (NSE21-Cy5; 5 мкг/мл), антитела против СА 125 (Ovk-95Cy5; 5 мкг/мл), антитела против СА 15-3 (X-19-Cy5; 10 мкг/мл) и антитела против СА 19-9
(С241-Cy5; 5 мкг/мл). Указана рабочая концентрация проявляющих антител с учетом всех
разведений. Для разведения проявляющих антител использовали 0,15%-ные растворы
PVA и PVP в PBS, содержащие 1% БСА, 0,6% Tween-20 и 0,01 % MIT.
Концентрированную (20-кратную) смесь проявляющих антител хранили в том же
буфере при 2-8оC.
Приготовление
калибровочных
проб.
Калибровочные
пробы
для
построения
калибровочных кривых изготавливали на основе мужской донорской сыворотки крови
человека. Концентрированные растворы АФП, РЭА, ПСА, ХГЧ, СА 125, СА 15-3, СА
19-9 и НСЕ добавляли к образцам сыворотки крови таким образом, чтобы получить
необходимые концентрации каждого антигена в образце.
Были изготовлены калибровочные пробы (KP) следующего состава:
Таблица 1. Состав калибровочных проб (KP).
KP0
АФП, нг/мл
0.0
ХГЧ, МЕ/л
0.0
РЭА, нг/мл
0.0
CA 125, МЕ/мл 0.0
CA 15-3, МЕ/мл 0.0
CA 19-9, МЕ/мл 0.0
НСЕ, нг/мл
0.0
ПСАобщ, нг/мл
0.0
ПСАсвоб, нг/мл 0.0
KP1
7.3
0.8
4.3
3.5
25.4
10.0
3.2
1.6
1.4
KP2 KP3 KP4 KP5 KP6
24.7 73.3 163.8 278.0 322.1
6.8 20.5 62.7 131.0 187.3
13.7 42.0 94.8 241.0 298.0
52.2 165.0 401.3 712.0 906.0
63.8 156.7 260.9 596.0 816.0
29.3 87.3 217.7 443.0 565.0
9.6 29.7 70.6 149.0 213.0
4.4 13.7 30.0 61.0 93.0
3.5 10.6 31.5 57.0 86.0
Аликвоты калибровочных проб были заморожены и хранились при − 70оC.
Изготовление белковых микрочипов.
Гидрогелевые
биочипы
изготавливали
по
технологии полимеризационной иммобилизации, разработанной в ИМБ РАН [1, 2].
Стеклянные слайды для изготовления микрочипов обрабатывали растворами NaOH,
H2SO4, промывали водой, затем погружали в раствор 1% Bind Silane в этиловом спирте,
отмывали в этиловом спирте, воде и высушивали. Полимеризационную смесь,
содержащую гелеобразующие мономеры на основе метакриламида и N-замещенных
аминосахаров, а также подлежащие иммобилизации белки, наносили с помощью робота
QArray («Genetix», Великобритания) в виде микрокапель объемом 0,1 нл на поверхность
активированной подложки. Концентрации белков в полимеризационной смеси составляли:
2,3 мг/мл антител PSA30; 2,3 мг/мл антител PSA36; 4,6 мг/мл антител XF-1; 5 мг/мл
антител XFP4; 2.5 мг/мл антител CEA12-140-1; 2,3 мг/мл антител NSE17; 14.5 мг/мл
антител X-52; 4.4 мг/мл антител X-19; 2.6 мг/мл антител С241; и 20 мкг/мл флуоресцентно
меченого БСА в качестве флуоресцентной метки. Полимеризацию гелевых ячеек
проводили под лампой ультрафиолетового света с максимумом излучения 350 нм
(Sylvania GTE lamp, F15T8/350Bl, Великобритания) на расстоянии 8 см от лампы, в
течение 50 мин при 20°С в токе азота. При нанесении пином 150 мкм получали гелевые
элементы полусферической формы диаметром 120 мкм. Биочипы после полимеризации
отмывали в течение 40 минут PBST, затем ополаскивали дистиллированной водой.
Для уменьшения неспецифических взаимодействий биочипы обрабатывали блокирующим
буфером PBSP в течение 1 ч, затем промывали дистиллированной водой.
Качество полученных биочипов проверяли в проходящем свете с помощью биочипанализатора (ИМБ РАН), снабженного специальным программным обеспечением TestChip
и QualityСontrol (ИМБ РАН). В результате проверки качества отбраковывали биочипы,
для которых отклонения значений радиусов гелевых элементов превышали 5% внутри
каждого биочипа и 8% между всеми биочипами данной партии.
Готовые к использованию биочипы покрывали пластиковыми камерами объемом 130 мкл
с двумя отверстиями для введения образца и хранили при +2-8оС.
«Сэндвич» -иммуноанализ на биочипах. Перед анализом биочипы, калибровочные пробы
и образцы сыворотки крови выдерживали 30 мин при комнатной температуре. На биочип,
находящийся
под
камерой,
наносили
130 мкл
образца
сыворотки
крови
или
калибровочную пробу. Камеры на биочипах заклеивали герметизирующей лентой.
Биочипы инкубировали в течение 20 ч при 37°С. После инкубации с реакционных камер
удаляли
герметизирующую
ленту,
камеры
отрывали.
Биочип
промывали
дистиллированной водой и высушивали в токе воздуха. На биочип наносили 50 мкл смеси
проявляющих антител против всех девяти онкомаркеров. Биочипы инкубировали в
течение 1 ч при 37°С. После инкубации биочипы ополаскивали дистиллированной водой и
отмывали 30 мин в PBST, затем вновь ополаскивали водой и высушивали в токе воздуха,
затем регистрировали флуоресцентные сигналы.
Флуоресцентные измерения. Флуоресцентные измерения проводили с использованием
портативного флуоресцентного анализатора биочипов с возбуждением при помощи лазера
(ИМБ, Москва) [16], снабженного компьютером и программным обеспечением для
обработки флуоресцентных изображений ImaGeAssay (ИМБ, Москва). Измерения с
флуоресцентным красителем Су5 проводили с использованием фильтров 650/670 нм
(возбуждение/регистрация), время экспозиции 1 с.
Вычисление
интенсивности
производили
следующим
флуоресценции
образом:
каждого
изображение
гелевого
каждой
элемента
ячейки
биочипа
окружалось
концентрической окружностью. Флуоресцентный сигнал F определялся согласно формуле
(1):
F
I m  Bd . c .
Br . g .  Bd . c .
,
(1)
где Im – медианный флуоресцентный сигнал, рассчитанный для ячейки микрочипа. Для
того
чтобы
учесть
пространственную
неоднородность
интенсивности
источника
излучения, биочип заменяли красным стеклом с такими же геометрическими размерами.
Получали фоновый сигнал от участков, соответствующих участкам изображения внутри
концентрических окружностей (Br.g.). Для учета шумов микроскопа флуоресцентный и
фоновый сигналы корректировали шумовым сигналом Bd.c., измеренным при нулевой
интенсивности источника.
Обработка
результатов
анализа.
После
проведения иммуноанализа,
получали
флуоресцентные изображения биочипов. Флуоресцентные сигналы от всех гелевых
элементов
рассчитывали
по
формуле (1).
Интенсивность
флуоресценции
от
иммобилизованных антител и антигенов рассчитывали как медианный сигнал от четырех
одинаковых гелевых элементов.
Программа «ImageAssay», разработанная в ИМБ РАН, на основе полученных
изображений биочипов с калибровочными пробами строила девять калибровочных
кривых по концентрациям онкомаркеров в калибровочных пробах и соответствующим
флуоресцентным сигналам, полученным от ячеек с иммобилизованными антителами. Для
всех
калибровочных
кривых
использовали
кусочно-линейную
интерполяцию.
Концентрацию онкомаркеров в сыворотке крови определяли по соответствующей
калибровочной кривой: по сигналам от ячеек с иммобилизованными антителами
программа автоматически определяла концентрации ПСАобщ, ПСАсвоб, АФП, ХГЧ, РЭА,
СА 125, СА 15-3, СА 19-9 и НСЕ в анализируемых образцах сывороток крови.
Аналитические характеристики метода.
Воспроизводимость анализа. При проведении этого теста использовали контрольные
пробы КП0 – КП6. Была проведена серия экспериментов на семидесяти биочипах,
получено десять калибровочных кривых.
Величину коэффициента вариации (КВ) для каждой точки калибровочной кривой каждого
антигена определяли по формуле (2):
K .B. 
100 ( F )  t
F N
(2)
где:
К.В. – коэффициент вариации, %;
σ(F) – среднее квадратичное отклонение для флуоресцентного сигнала;
N – число измерений;
t – коэффициент Стьюдента. Для 10 измерений и доверительной вероятности 95% t=2,3;
 (F ) 
1 N
( Fi  F ) 2

N  1 i 1
(3)
Fi –значение каждого флуоресцентного сигнала для данной точки калибровочной кривой
данного антигена;
F – среднее арифметическое значение флуоресцентного сигнала для данной точки
калибровочной кривой данного антигена.
Воспроизводимость результатов измерения на биочип-анализаторе определяли, измеряя
10 раз сигнал флуоресценции от одного и того же биочипа. Использовали биочипы,
величины флуоресцентных сигналов которых соответствовали линейной области
диапазона измерения прибора. Коэффициент вариации не превышал 3%.
Аналитическая чувствительность. Аналитическую чувствительность метода или предел
обнаружения
для
каждого
онкомаркера
рассчитывали
как
концентрацию,
соответствующую значению флуоресценции, превышающему не менее чем на два
стандартных
отклонения
флуоресцентный
сигнал
измеренной
10
раз
нулевой
калибровочной пробы ( F0 +2SD), где
SD 
 (F )  t
N
Для этого нулевую калибровочную пробу анализировали на 10-ти биочипах из одной
серии.
Чувствительность прибора определяли как концентрацию флуорофора, соответствующую
сигналу флуоресценции, превышающему на 2 стандартных отклонения сигнал от фона
(подложки). Для этого 10 раз измеряли на приборе один и тот же чип, который содержал
иммобилизованный в различных концентрациях флуорофор. Получили, что минимальное
определяемое количество флуорофора на используемом флуоресцентном микроскопе 107
молекул флуорофора в одной ячейке.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В нашей работе были использованы микрочипы с иммобилизованными белками, для
которых был подобран состав полимеризационной смеси, обеспечивающий достаточную
для свободной диффузии исследуемых белков пористость геля и позволяющий проводить
различные типы иммунологических реакций на микрочипе [5].
Биочип для одновременного количественного анализа девяти онкомаркеров. На первом
этапе
работы
необходимо
было
сконструировать
биочип
с
ковалентно
иммобилизованными в гидрогеле антителами, позволяющий проводить одновременный
количественный анализ девяти онкомаркеров.
Для проведения «сэндвич»-анализа для каждого маркера была выбрана оптимальная пара
моноклональных антител, которые не имеют перекрестной реактивности с другими
антителами, используемыми в анализе, не взаимодействуют с другими определяемыми
онкомаркерами, обладающая максимальной дискриминацией между нулевым и каждым
значимым сигналом, а также дают наиболее выраженный рост на участке калибровочной
кривой.
Разработка
онкомаркеров.
процедуры
На
одновременного
основании
выбранных
количественного
пар
анализа
моноклональных
девяти
антител
был
сконструирован
биочип
для
количественного
иммуноанализа
девяти
маркеров
онкологических заболеваний, структура которого приведена на рис. 1. В процессе
изготовления
осуществляется
обработка
биочипов
блокировочным
раствором,
уменьшающим неспецифические связывания. Таким образом, биочип полностью
подготовлен к проведению анализа.
Рис. 1. Биочип для проведения одновременного количественного иммуноанализа девяти
онкомаркеров (АФП, ХГЧ, РЭА, СА125, СА15-3, СА19-9, НСЕ, ПСАобщ, ПСАсвоб).
Флуоресцентное изображение после иммуноанализа. Биочип содержит гелевые элементы,
диаметром 120 мкм и объемом 0,1 нл (по четыре одинаковых элемента в ряду) с
иммобилизованными моноклональными антителами против девяти онкомаркеров и
контрольные ячейки, не содержащие биоматериала (пустые гели). По краям биочипа
расположены маркерные гелевые ячейки (М), содержащие иммобилизованный краситель
Су5.
Нами был использован двустадийный «сэндвич»-иммуноанализ с флуоресцентной
регистрацией сигнала. На первой стадии анализируемый образец (или калибровочную
пробу) инкубировали на биочипе; затем биочипы «проявляли» смесью флуоресцентно
меченых антител против исследуемых антигенов и после отмывки производили
регистрацию флуоресцентных сигналов.
Биочипы инкубировали на первой стадии
реакционным раствором, содержащим анализируемый образец (или калибровочную
пробу), затем инкубировали со смесью флуоресцентно меченых антител против
исследуемых антигенов. После отмывки производили регистрацию флуоресцентных
сигналов. Расчет интенсивности флуоресцентного сигнала от каждой ячейки биочипа
проводили с помощью программного обеспечения ImagelAssay (ИМБ РАН). При анализе
полученных данных интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал
от четырех одинаковых гелевых ячеек.
Для количественного определения концентрации антигена методом иммуноанализа на
биочипе необходимо получить график зависимости флуоресцентного сигнала гелевых
элементов, содержащих иммобилизованные антитела, от концентрации соответствующего
антигена в калибровочной пробе (калибровочную кривую). Для упрощения процедуры
анализа калибровочные пробы содержали одновременно все девять анализируемых
онкомаркеров (АФП, ХГЧ, РЭА, СА 125, СА 15-3, СА 19-9, НСЕ, ПСАобщ, ПСАсвоб) в
диапазонах концентраций, необходимых для проведения клинического анализа в
сыворотке крови. Нулевая калибровочная проба не содержала онкомаркеров. В качестве
проявляющих антител использовали смесь антител против всех девяти онкомаркеров, и,
таким образом, при постановке анализа получали одновременно девять калибровочных
кривых [17].
При автоматической обработке результатов анализа программа ImageAssay на основе
полученных
изображений
биочипов с калибровочными
пробами
строит
девять
калибровочных кривых. Для построения калибровочных кривых использовали кусочнолинейную интерполяцию. Концентрацию каждого онкомаркера в сыворотке крови
определяли по соответствующей калибровочной кривой.
Для того чтобы правильно определить концентрацию онкомаркера в сыворотке крови,
важно избежать так называемого эффекта матрикса, когда на результат анализа влияет
окружение, в котором находится анализируемое вещество. Необходимо, чтобы
анализируемое вещество в образце взаимодействовало с иммобилизованными на биочипе
и проявляющими антителами в тех же условиях, что и в калибровочных пробах, поэтому
калибровочные пробы для анализа девяти онкомаркеров изготавливали на основе
сыворотки крови человека. При необходимости разведения сывороток с высокими
концентрациями онкомаркеров использовали нулевую калибровочную пробу.
Характеристики количественного анализа девяти онкомаркеров на биочипах
Воспроизводимость
анализа.
Для
оценки
воспроизводимости
и
аналитической
чувствительности анализа была проведена серия экспериментов на семидесяти биочипах
(по десять калибровочных кривых для каждого из девяти онкомаркеров). Для повышения
достоверности данных анализа в состав биочипа включали четыре одинаковые гелевые
ячейки для каждого иммобилизованного белка, при этом рассчитывали интенсивность
флуоресценции как медианный сигнал по четырем ячейкам. При производстве
отбраковывали биочипы, отклонения от среднего значения диаметра ячеек которых
превышали 5%-е отклонение внутри биочипа и 8%-е отклонение между биочипами.
Максимально простая методика постановки анализа и автоматический обсчёт результатов
анализа позволили свести к минимуму вероятность мануальных ошибок. Коэффициент
вариации для различных концентраций определяемых антигенов не превышал 15%.
Аналитическая чувствительность. Известно, что одной из основных характеристик
количественного анализа является чувствительность. Аналитическую чувствительность
анализа характеризует наименьшая определяемая концентрация, которую для каждого
онкомаркера
рассчитывали
как
концентрацию,
соответствующую
интенсивности
флуоресценции, превышающей на два стандартных отклонения флуоресцентный сигнал
многократно измеренной (десять раз) нулевой калибровочной пробы. Полученные
значения приведены в таблице 2.
Таблица 2. Чувствительность анализа* онкомаркеров
на гидрогелевых биочипах на
прозрачной и металлизированной подложках и в коммерческих тест-системах
Онкомаркер
Концентрация в крови в норме
На
биочипах
Коммерческих
тестов
АФП
≤ 10 нг/мл (у мужчин и небеременных
женщин)
0,7
0,5 (Canag)
2,0
0,8 (DSL)
0,7
0,5 (Canag)
ХГЧ
РЭА
≤ 10 МЕ/л (у мужчин и небеременных
женщин)
≤ 5 нг/мл
< 10 нг/мл (для курящих)
СА125
≤ 35 МЕ/мл
1,7
1,5 (Canag)
СА15-3
≤ 28 МЕ/мл
(у небеременных женщин)
7,0
1 (Canag)
СА19-9
≤ 37 МЕ/мл
0,4
1 (Canag)
ПСАобщ
0,3
0,1 (Canag)
ПСАсвоб
≤ 4 нг/мл (мужчины до 50 лет)
ПСАcвоб/ПСАобщ > 0.15
0,2
0,03 (Canag)
НСЕ
≤ 12.5 нг/мл
1,3
1 (Canag)
*Коэффициент вариации для определяемых концентраций не превышел 15%.
Как видно из приведенных данных, значения чувствительности анализа на биочипах
лежат в диапазоне не превышающем значений нормы, определенной в индивидуальном
анализа для каждого из онкомаркеров, что позволяет использовать разработанный метод
анализа для клинического применения.
Определение содержания девяти онкомаркеров в сыворотках крови. Разработанный
метод количественного анализа девяти онкомаркеров в сыворотке крови был апробирован
на образцах более 500 сывороток крови больных онкологическими заболеваниями и
здоровых доноров, и был проведен корреляционный анализ. Результаты исследований
сопостовляли с таковыми, полученными традиционными методами ИФА
(«CanAg»
(«Fujirebio») (Швеция), DSL (США) для ХГЧ). Результаты сравнительного определения
девяти онкомаркеров двумя методами приведены на рисунке 2.
Рис. 2. Результат корреляционного анализа концентраций шести онкомаркеров,
полученных после проведения одновременного количественного сэндвич-иммуноанализа
шести онкомаркеров (АФП, ХГЧ, РЭА, СА125, СА15-3, СА19-9, ПСАобщ, ПСАсвоб, НСЕ)
на биочипе, и их концентраций, полученных в индивидуальном анализе с использованием
коммерческих ИФА - систем. Проведенные прямые соответствуют наилучшей линейной
аппроксимации
Результаты корреляционного анализа для каждого онкомаркера представлены в таблице 4.
Таблица 3. Корреляционный анализ онкомаркеров на биочипе.
Коэффициент
Количество
корреляции
измерений
Биочип / ИФА*
АФП
0,91
129
ХГЧ
0,99
41
РЭА
0,93
362
СА 125
0,95
126
СА 15-3
0,90
99
СА 19-9
0,90
243
НСЕ
0,97
26
ПСАобщ
0,89
158
ПСАсвоб
0,86
29
* Для всех измерений p<0,01, где p – уровень значимости, величина которого
дополняет доверительную вероятность до единицы: р = 1 – Рдов [18].
Онкомаркер
Величину коэффициента корреляции вычисляли по формуле для линейной корреляции
Пирсона:
n
Rxy 
где
[( x  x)( y  y)]
i 1
i
i
(n  1) x y
x, y
(4)
- средние значения измеряемых концентраций онкомаркеров,
xi , yi
-
сравниваемые концентрации, n – число сравниваемых наблюдений,  x , y - стандартные
отклонения в сопоставляемых рядах, рассчитываются по формуле (3).
Полученный коэффициент корреляции проверяли на значимость с помощью таблицы
критических значений. Для этого вычисляли количество степеней свободы f  n  2 и на
пересечении с необходимым уровнем значимости находили критическое значение
коэффициента. Если коэффициент корреляции больше критического значения, то уровень
значимости правильный [18]. Получили, что для всех измерений уровень значимости
p<0,01.
Как видно из таблицы 3, значения коэффициентов корреляции находятся в интервале от
0,86 до 0,99.
Также видно из рисунка 2 и таблицы 3, результаты одновременного определения девяти
онкомаркеров в сыворотке крови человека на биочипе коррелируют с результатами,
полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из онкомаркеров
с использованием общепризнанных по качеству коммерческих ИФА тест-систем (CanAg
(Швеция)).
Группировка онкомаркеров в соответствии с диагнозами. Анализируемые сыворотки
обследуемых пациентов с известными диагнозами (674 шт.) были рассортированы по
основным группам согласно международной классификации болезней (МКБ-10). Для
каждой из групп сывороток были определены достоверные значения превышения нормы
концентраций онкомаркеров, как для индивидуальных антигенов, так и комбинаций из
нескольких онкомаркеров. В таблице 4 представлены данные количественного анализа
девяти онкомаркеров в сыворотках крови, сгруппированные в соответствии с диагнозами:
онкологические заболевания, неонкологические заболевания и здоровые доноры.
Поскольку известно, что ни один из онкомаркеров не обладает 100%-ой специфичностью
ни к одному из онкозаболеваний, в исследуемых сыворотках фиксировали превышение
нормы концентрации любого из девяти онкомаркеров, поскольку у здорового человека
уровень каждого из определяемых маркеров должен быть ниже верхней границы нормы.
Таблица 4. Данные количественного анализа девяти онкомаркеров в сыворотках крови
пациентов и здоровых доноров
Группа
Общее
количество
сывороток в
группе
Количество сывороток
с концентрацией хотя
бы одного
онкомаркера выше
нормы
Количество сывороток
с концентрацией хотя
бы одного
онкомаркера выше
нормы, %
341
270
79,2%
148
97
65,5%
185
11
6,0%
Онкологические
больные
Неонкологические
больные
Здоровые доноры
Если оценивать результативность данной тест-системы с точки зрения возможности
скрининга для выявления не только онкологических заболеваний, то сгруппировав все
имеющиеся
результаты
анализов
на
биочипах
в
соответствии
с
диагнозами
больной/здоров, можно вычислить чувствительность и специфичность разработанного
теста. Чувствительность (Se) и специфичность (Sp) рассчитывали по следующей схеме
(Таблица 5): рассмотрим четырехпольную таблицу сопряженности, которая строится на
основе результатов
классификации концентраций
онкомаркеров, измеренных
биочипах, и на основе поставленных диагнозов больной/здоров.
В таком случае, чувствительность тест-системы выражается следующим образом:
Se 
TP
100%
TP  FN
(4)
Специфичность тест-системы:
Sp 
TN
100%
TN  FP
(5)
на
Таблица 5. Принцип расчета сопряженности полученных результатов на биочипах и
стандартных тест-системах.
Обследуемые
больной
здоровый
Выше нормы
TP=270+97=367
FP=11
Ниже нормы
FN=341+148-270-97=122
TN=185-11=174
Биочип
Обозначения:

TP - верно классифицированные положительные примеры, то есть значения
концентраций онкомаркеров в сыворотках больных были выше нормы (так
называемые истинно положительные случаи)

TN - верно классифицированные отрицательные примеры, то есть значения
концентраций онкомаркеров в сыворотках здоровых были ниже нормы (истинно
отрицательные случаи);

FN - положительные примеры, классифицированные как отрицательные, то есть на
чипе значения измеренных концентраций онкомаркеров больных были ниже
нормы;

FP - отрицательные примеры, классифицированные как положительные, то есть на
чипе значения измеренных концентраций онкомаркеров здоровых были выше
нормы.
Чувствительность теста в данном случае определялась как доля лиц с концентрацией хотя
бы одного из девяти онкомаркеров, превышающей значение нормы, от общего числа лиц,
имеющих заболевания (4), и оказалась равной Se=75.1%, специфичность – доля лиц с
отрицательным результатом теста среди здоровых (5) и соответствовала значению
Sp=94.1%. Полученные значения достаточно высоки, и, следовательно, разработанную
тест-систему можно использовать для проведения первичной диагностики заболеваний
(скрининг населения).
Другой важной характеристикой тест-системы является ее прогностическая
значимость. Прогностическая значимость положительного результата — это вероятность
заболевания
при
положительном
результате
теста:
Se
 100%  92.7% .
Se  (100  Sp)
Прогностическая значимость отрицательного результата — это вероятность отсутствия
заболевания
при
отрицательном
результате
Sp
 100%  79.1% .
Sp  (100  Se)
теста:
Полученные данные прогностической значимости положительного результата означают,
что при обнаружении превышения над значением нормы хотя бы одного из девяти
анализируемых
присутствует
онкомаркеров
воспалительное
у обследуемого
или
пациента
онкологическое
с
вероятностью
заболевание,
и
92,7%
требуются
незамедлительное обследование и дополнительные анализы.
На рисунке 3 представлено распределение сывороток с повышенным (выше нормы)
содержанием онкомаркеров для групп пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного
тракта (ЖКТ). В первом случае (левые столбцы) были выбраны сыворотки больных со
злокачественными новообразованиями органов пищеварения. Во вторую группу (правые
столбцы) были включены сыворотки больных с диагнозами язвенная болезнь желудка и
двенадцатиперстной кишки, неинфекционный энтерит и колит, болезни желчного пузыря,
желчевыводящих путей и поджелудочной железы и другие болезни органов пищеварения.
Из приведенных данных следует, что ни один маркер не является абсолютно
специфичным, т.е. специфичность не достигает 100%, что согласуется с литературными
данными.
Однако,
при
сравнении
профилей
частоты
встречаемости
значений,
превышающих норму для онкопатологий ЖКТ и доброкачественных заболеваний, видно,
что для злокачественных новообразований органов пищеварения наиболее характерно
повышение двух онкомакеров РЭА
(40.8%), CA 15-3 (30.0%) и
СА19-9 (26.9%).
Напротив, для неонкологических заболеваний ЖКТ наиболее часто наблюдается
повышенные значения СА125. Из литературных данных известно, что повышение
концентраций онкомаркеров РЭА и СА 19-9, наиболее часто происходит при
злокачественных заболеваниях желудочно-кишечного тракта. С другой стороны, при
неонкологических заболеваниях часто наблюдают повышенные значения СА125, что
подтверждается полученными нами результатами. Также известно, что СА125 обладает
наименьшей специфичностью к типу патологии, поэтому у здоровых людей значение его
концентрации не превышает верхней границы нормы.
Рис. 3. Профили частоты встречаемости значений концентраций онкомаркеров,
превышающих верхнюю границу нормы для групп пациентов с заболеваниями
желудочно-кишечного
тракта.
Левые
столбцы
–
группа
со
злокачественными
новообразованиями органов пищеварения, всего 130 сывороток, правые столбцы – группа
с неонкологическими заболеваниями органов пищеварения, всего 63 сыворотки.
Погрешность измерений рассчитывали по формуле погрешности для биномиального
распределения  
p(1  p) / n , где p – доля сывороток с концентрацией онкомаркера
выше нормы, n – количество сывороток в группе [18].
Известно, что заболевания ЖКТ – наиболее трудно диагностируемые. Если рассмотреть
онкологические
заболевания
предстательной
железы,
для
которых
характерно
превышение ПСА, то мы увидим профиль на рисунке 4.
При увеличении выборки данных для статистического анализа, мы рассчитываем выявить
достоверные комбинации онкомаркеров, характерных для других онкопатологий.
Roc-анализ прототипа тест-системы для анализа девяти онкомаркеров. На
основании полученных результатов тестирования сывороток больных пациентов и
здоровых доноров мы провели roc-анализ нашего прототипа тест-системы. Для этого
меняли верхнюю границу нормы определения каждого онкомаркера и при заданной норме
фиксировали ее превышение у групп здоровых и больных любого из девяти онкомаркеров
(так как мы получили, что при превышении нормы любого из девяти онкомаркеров с
вероятностью 92,7% у обследуемого присутствует воспалительное или онкологиеческое
заболевание). На рисунке 5 представлена полученная roc-кривая для девяти онкомаркеров
и roc-кривые каждого онкомаркера по отдельности. Сравнивая эти модели, видим, что
площадь под кривой при одновременном анализе девяти онкомаркеров гораздо больше
площадей под кривыми анализа онкомаркеров по отдельности. Таким образом, система
анализа на биочипе более эффективна при обнаружении каких-либо заболеваний, нежели
анализ каждого из онкомаркеров по отдельности.
Рис. 4. Профиль частоты встречаемости значений концентраций онкомаркеров,
превышающих верхнюю границу нормы для группы больных с раком предстательной
железы. Всего 62 сыворотки.
Стоит обратить внимание на рок-анализ ПСА по всем диагнозам (рис. 6). Видим, что для
всех заболеваний ПСА обладает низкой специфичностью и высокой чувствительностью.
Но, если провести рок-анализ ПСА только по больных с диагнозом «рак простаты», то
рок-кривая примет вид очень близкий к рок-кривой анализа всех девяти онкомаркеров по
всем диагнозам (рис. 6.)
Увеличение количества выборки данных для статистического анализа позволит выявить
более точные комбинации онкомаркеров, характерных для этих и других патологий.
Рис. 5. Roc-анализ девяти онкомаркеров на гидрогелевом микрочипе при одновременном
анализе (верхний левый график) и по отдельности (все остальные графики). На графиках
представлена пунктирна прямая линия, направленна под 45 градусов, для анализа rocкривой.
Se
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
PSA
9
0
50
100-Sp
100
Рис. 6. Roc-анализ ПСА для диагноза рак простаты. Для сравнения представлен роканализ девяти онкомаркеров по всем заболеваниям.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Rubina A.Yu., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., Barsky V.E.,
Ivanov S.M., Konovalova E.V., Mirzabekov A.D. Hydrogel-based protein microchips:
manufacturing, properties, and applications. // BioTechniques. - 2003. - V. 34. - P. 10081022.
Rubina A.Yu., Pan’kov S.V., Dementieva E.I., Pen'kov D.N., Butygin A.V., Vasiliskov
V.A., Chudinov A.V., Mikheikin A.L., Mikhailovich V.M., Mirzabekov A.D. Hydrogel drop
microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. //
Anal. Biochemistry. - 2004. - V. 325. - P. 92-106.
Rubina A.Yu., Kolchinsky A., Makarov A. A., Zasedatelev A. S. Why 3-D? Gel-based
microarrays in proteomics. // Proteomics. - 2008. - V. 8. - P. 817-831.
Dyukova V.I., Dementieva E.I., Zubtsov D.A., Galanina O.E., Bovin N.V., Rubina A.Yu.
Hydrogel glycan microarrays. // Anal. Biochem. - 2005. - V. 347. - P. 94-105.
Rubina A.Yu., Dyukova V.I., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Nesmeyanov V.A., Grishin
E.V., Zasedatelev A.S. Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein
microchips. // Anal. Biochem. - 2005. - V. 340. - P. 317-329.
Zubtsov D.A., Savvateeva E.N., RubinaA.Yu., Pan’kov S.V., Konovalova E.V., Moiseeva
O.V., Chechetkin V.R., Zasedatelev A.S. Comparison of surface and hydrogel-based
protein microchips. // Analytical Biochemistry. - 2007. - V. 368. - P. 205-213.
Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Дарий Е.Л. . Применение белковых микрочипов
для количественного определения опухолеассоциированных маркеров. // ДАН. 2004. - T. 395. - Стр. 542-547.
Рябых Т.П., Осипова Т.В., Дементьева Е.И., Савватеева Е.Н., Коновалова Е.В.,
Соколова А., Рубина А.Ю., Барышников А.Ю., Заседателев А.С. Тест-система в
формате биочипа для одновременного количественного определения общей и
свободной форм простата-специфического антигена в сыворотке крови. //
Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - T. 5. - 2. - Стр. 49-57.
Коновалова Е.В., Савватеева Е.Н., Дементьева Е.И., Филиппова М.А., Турыгин
А.Ю., Осипова Т.В., Рябых Т.П., Рубина А.Ю., Заседателев А.С. Разработка
биочипа для количественного определения двух форм простата-специфического
антигена с использованием внутренней калибровочной кривой. // Молекулярная
биология. - 2007. - T. 41. - 4. - Стр. 1-6.
Савватеева Е.Н., Дементьева Е.И., Цыбульская М.В., Осипова Т.В.,Рябых Т.П.,
Турыгин А.Ю., Юрасов Р.А., Заседателев А.С., Рубина А.Ю. . Биологический
микрочип для одновременного количественного иммуноанализа маркеров
онкологических заболеваний в сыворотке крови человека. // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - T. 6. - Стр. 679-683.
Konovalova E.V., Savvateeva E.N., Dement'eva E.I., Filippova M.A., Turygin A.Iu.,
Osipova T.V., Riabykh T.P., Rubina A.Iu., Zasedatelev A.S. . Development of a biochip
for quantitative determination of two forms of prostate specific antigen using internal
calibration curve. // Mol Biol (Mosk). - 2007. - V. 41. - I. 4. - P. 734-738.
Eekers D.B., Laschet A., de Groot M., Roelofs E., Kester A., Delaere K., Lambin P., van
Gils F., Nap M., ten Kate J. Why determine only the total prostate-specific antigen, if the
free-to-total ratio contains the information? // Ann. Clin. Biochem. - 2008. - V. 45. - I. 3.
- P. 270-274.
Liao Q., Zhao Y.P., Yang Y.C., Li L.J., Long X., Han S.M. Combined detection of serum
tumor markers for differential diagnosis of solid lesions located at the pancreatic head. //
Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. - 2007. - V. 6. - I. 6. - P. 641-645.
Carpelan-Holmstrom M., Louhimo J., Stenman U.H., Alfthan H., Jarvinen H., Haglund
C. Estimating the probability of cancer with several tumor markers in patients with
colorectal disease. // Oncology. - 2004. - V. 66. - I. 4. - P. 296-302.
15.
16.
17.
18.
Cordero O.J., De Chiara L., Lemos-Gonzalez Y., Paez de la Cadena M., RodriguezBerrocal F.J. How the measurements of a few serum markers can be combined to
enhance their clinical values in the management of cancer. // Anticancer Res. - 2008. - V.
28. - I. 4C. - P. 2333-2341.
Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E.,
Mirzabekov A. Fluorescence data analysis on gel-based biochips. // J. Biomol. Screening.
- 2002. - V. 7. - P. 247–257.
Wild D. // The Immunoassay handbook. ELSEVIER Ltd., ISBN: 0-08-044526-8. - 2005.
- P. 930
Джонсон Н., Лион Ф. Статистика и планирование эксперимента в технике и науке.
Методы обработки данных. 1980, Москва: Мир.