оксид азота и его производные как маркеры обострения

Известия Челябинского научного центра, вып. 1 (27), 2005
МЕДИКО–БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
УДК:612.2
ОКСИД АЗОТА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ
КАК МАРКЕРЫ ОБОСТРЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ
ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЬ
С КЛИНИКО–ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ
Ю.А. Микрюкова, Г.Л. Игнатова
e–mail: Julia_74@mail.ru
Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования,
г. Челябинск, Россия
Статья поступила 22 февраля 2005 г.
Введение
В последние годы актуальны исследования посвященные участию оксидативного стресса
в развитии и прогрессировании хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) [8, 5, 10].
Активные формы кислорода задействованы во многих физиологических и метаболических процессах в организме и вырабатываются фагоцитирующими клетками (нейтрофилами, моноцитами, базофилами, эозинофилами, тканевыми макрофагами) при взаимодействии с возбудителями инфекции, иммунными комплексами или пылевыми частицами [3], и обладают
антибактериальными, антипаразитарными и противоопухолевыми свойствами [1, 4].
В настоящее время, пристальное внимание уделяется еще одному свободному радикалу —
монооксиду азота (NO–) [2]. Окись азота имеет неспаренный электрон, соответственно обладает большой реактогенностью при взаимодействии с другими радикалами [11]. NO– в присутствии супероксида превращается в очень токсичное соединение — пероксинитрит–анион (NO3–),
который затем может вступать в реакции с образованием гидроксильного радикала (НО–) и диоксида азота (NO2). Окись азота образуется из аминокислоты L–аргинина. Реакция катализируется ферментом NO–синтазой, гемопротеином, свойства которого сходны с цитохромом
Р–450, и содержащего как окисляющий, так и восстанавливающий домены. Идентифицированы
три изоформы NO–синтазы. Конститутивные изоформы находятся в эндотелиальных клетках
(еNOS, или тип 3) и нейронах (nNOS, или тип 1) и активируются при увеличении внутриклеточного
кальция. Индуцибельная NO–синтаза (iNOS, или тип 2) — третья изоформа, индуцируется в некоторых видах клеток в присутствии эндотоксина и медиаторов воспаления таких как цитокины.
Важным проявлением повреждающего действия свободных радикалов является перекисное окисление биологических мембран, приводящее к расстройству структурной целостности и
функции клетки и, наконец, ее разрушению и гибели. Оксидативному стрессу у больных с ХОБЛ
могут способствовать инфекции дыхательных путей, за счет активации и рекрутирования фагоцитирующих клеток в легкие во время обострения заболевания [9], а также длительное воздействие различных промышленных пылевых частиц. Оксиданты также способствуют воспалению,
активируя, например, NF–κβ, организующий экспрессию IL–8 и TNF–α, которые как полагают,
имеют большое значение при ХОБЛ.
Известно, что табакокурение играет первостепенную роль в патогенезе хронических заболеваний органов дыхания. Газовая фаза табачного дыма содержит свободные радикалы и ак-
140
Ю.А. Микрюкова, Г.Л. Игнатова
тивные формы кислорода, образованные из NO–/NO2 при взаимодействии с реактивными
составляющими дыма. Было доказано, что «асимптомные» курильщики имеют более низкие
уровни NO– в сыворотке крови и конденсате выдыхаемого воздуха, в то время как лица с симптомами ХОБЛ имеют в несколько раз более высокие уровни NO– и его производных [6]. Особенно повышается их количество в периоды обострения заболевания [7].
1. Методика исследования
В ходе исследования проведена оценка уровней продукции оксида азота (NOx) и его производных — NO2 и NO3, их количество оценивалось в супернатанте культуры моноцитов без и со
стимуляцией пирогеналом, а также в сыворотке крови. Выделение моноцитов производилось на
градиенте плотности фиколл–верографина. Объектом исследования служила венозная кровь,
взятая в стерильных условиях в одном временном интервале утром, натощак. Кровь стабилизировали гепарином (50 Ед/мл). В центрифужные пробирки разливали 1,5 мл раствора фиколл–верографина с удельным весом 1,077—1,078. Отстоявшуюся плазму наслаивали на фиколл–верографина и центрифугировали в течение 40 минут при 1500 об/мин. После
центрифугирования над градиентом образуется отчетливое кольцо из мононуклеаров. Выделенные клетки трижды отмывали в растворе Хенкса центрифугированием в течение 10 минут.
Определение содержания нитритов и нитратов в супернатанте культуры моноцитов производили следующим образом. В каждую ячейку 96–ячеистой планшетки для иммунологических исследований помещали 600.000 тысяч клеток в 0,2 мл среды 199 с добавлением 0,15 мл 10 %
раствора альбумина. Затем планшетка устанавливалась в газо–проточный термостат ГПИ–01,
обеспечивающий деконтаминацию воздуха, с 5 % содержанием углекислого газа в воздушной
среде при температуре 37 °С на 2 часа. После указанного срока планшетку извлекали из термостата, и в условиях стерильного бокса содержание ячеек аспирировалось, с последующим двукратным отмыванием от неадгезированных клеток средой 199. Затем в каждую ячейку добавляли по 200 мкл 199 среды с 10 % альбумином. На каждого пациента заполняли по10 ячеек.
В первые 5 ячеек добавляли по 20 мкл пирогенала. После этого планшетки вновь помещали
в газо–проточный термостат на 48 часов при температуре 37 °С и 5 % содержанием углекислого газа. После этого по 100 мкл супернатанта переносили в каждую ячейку другой планшетки,
и в нее добавляли реагенты Гриса: 50 мкл 0,25 % раствора белого стрептоцида, 50 мкл 1:2 разведенной соляной кислоты и 50 мкл 0,1 % раствора N– нафтилэтилендиаминдигидрохлорида
(НЭДа). Через 10 минут инкубации в темноте при комнатной температуре определяли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов определяли в мкмоль/л (используя нитратный коэффициент 1,465) по стандартной кривой, построенной с помощью известных различных разведений нитрита натрия.
Обследованные пациенты–мужчины, страдающие ХОБЛ были разделены на группы в зависимости от диагноза (хронический бронхит (ХБ) выступает в качестве нулевой стадии — стадии
риска ХОБЛ), наличия профессиональных вредностей (лица, не контактирующие с вредными
производственными факторами и рабочие Челябинского тракторного завода (ЧТЗ), имеющие на
рабочих местах повышенный уровень запыленности, загазованности, контакт со сварочными
аэрозолями), стадии процесса (обострение или ремиссия). Также проводился корреляционный
анализ между показателями концентраций оксида азота и его производных и клинико–
этиологическими данными: определялись средние антропометрические характеристики, наличие
факторов риска (представлены в табл. 1): курение (стаж курения, количество выкуриваемых сигарет
в день, индекс курильщика, индекс пачка/лет), профвредность, стаж заболевания, количество
обострений заболевания в год; сатурация кислорода артериальной крови, тест с 6–минутной
ходьбой, параметры спирограммы: жизненная емкость легких — ЖЕЛ, форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1); показатели периферической крови.
Оксид азота и его производные как маркеры обострения хронической обструктивной болезни 141
Таблица 1
Антропометрические данные и наличие факторов риска развития ХОБЛ
в различных группах
Без контакта с профвредностями
ХБ
Рабочие ЧТЗ
ХОБЛ
ХБ
ХОБЛ
обостр
ремисс
обостр
ремисс
обостр
ремисс
обостр
ремисс
n (чел)
12
12
15
13
13
13
12
12
группа
1
2
3
4
5
6
7
8
Возраст
(лет)
47,2±2,68
49,5±2,56
57,8±1,89
57,4±1,95
53,0±1,86
52,6±2,17
56,8±1,42
56,8±1,42
Рост
(см)
171,4±1,15 172,4±2,15 169,4±1,06 169,4±1,12 172,1±2,05 171,2±2,29 171,5±1,47 171,5±1,47
Вес
(кг)
75,8±3,01
75,4±3,04
73,7±2,43
73,7±2,56
Проф–
вред–ть
(лет)
0
0
0
0
75,1±2,84
74,3±3,26
70,9±2,20
70,9±2,20
23,33±2,45 23,27±2,79 27,84±2,24 27,84±2,24
Стаж
болезни 11,26±2,42 11,26±2,42 17,05±1,62 16,63±1,65 10,61±1,73 11,66±1,91 13,47±1,93 13,47±1,93
(лет)
Число
обостр.
в году
2,52±0,18
2,52±0,18
3,40±0,25
3,26±0,21
2,81±0,26
2,72±0,28
3,57±0,29
3,57±0,29
Стаж
курения 15,47±2,63 15,47±2,63 27,90±3,33 27,26±3,45 24,23±3,04 23,38±3,34 34,32±3,16 34,32±3,16
(лет)
Кол–во
сигарет в 12,63±2,11 12,63±2,11 16,75±2,18 16,58±2,29 14,09±2,12 14,28±2,39 21,84±2,10 21,84±2,10
день
Индекс
курильщика1
Пачка/
лет2
151,58±
±25,29
151,58±
±25,29
201,00±
±26,22
198,95±
±27,55
169,14±
±25,44
171,33±
±28,69
262,11±
±25,22
262,11±
±25,22
13,78±2,75 13,78±2,75 27,09±3,82 26,41±3,96 21,81±4,32 21,83±4,89 41,12±5,23 41,12±5,23
Примечание. 1 — Индекс курильщика — число сигарет, выкуриваемых в день, умноженное на 12;
2 — индекс пачка/лет — число сигарет, выкуриваемых в день, умноженное на стаж курения и деленное
на 20.
2. Результаты и обсуждение
В табл. 2 представлены средние значения уровней оксида азота и его производных (нитратов и нитритов), а также приведены различия между соответствующими группами, где они
являлись статистически достоверными. На основании полученных данных, можно заключить,
что уровни сывороточного оксида азота повышались с нарастанием тяжести болезни у лиц
с наличием профессиональных вредностей, а также значимо повышались в периоды обострения по сравнению с ремиссией процесса. Показатели NO3 при стимуляции пирогеналом в культуре моноцитов были статистически достоверно выше у участкового населения, страдающего
ХОБЛ, по сравнению с группой лиц, страдающих хроническим бронхитом (ХБ).
142
Ю.А. Микрюкова, Г.Л. Игнатова
Таблица 2
Средние показатели уровней оксида азота и его производных в различных группах
Без контакта с профвредностями
ХБ
ХОБЛ
обостр
ремисс
обостр
ремисс
n (чел)
группа
12
1
NO2 б\с
8,82± 1,97
NOx б\с
35,70± 5,97
NO3 б\с
26,88± 5,61
NO2 стим
12,59± 2,95
NOx стим
46,25± 6,41
NO3 стим 33,65± 5,70*
12
2
10,40±
±1,01
45,01±
±2,50
34,60±
±2,68
31,50±
±20,5
83,15±
±6,58
51,65±
±4,60
15
3
10,87±
±3,19
44,50±
±8,16
33,63±
±5,91
16,75±
±3,04
64,86±
±11,51
48,12±
±9,25*
p1–3= 0,005
13
4
10,48±
±9,51
40,50±
±31,5
30,02±
±21,98
15,05±
±13,95
28,50±
±25,5
13,45±
±11,53
Рабочие ЧТЗ
ХБ
обостр
ремисс
обостр
13
5
13
6
12
7
6,54±1,73
23,85±
±5,18
17,30±
±4,08
ХОБЛ
ремисс
7,86±1,99 6,14± 1,04 7,85± 1,09
31,95±
±6,97
33,19±
±5,11
25,33±
±4,41
12,20±
±2,99
49,20±
±10,08
29,65±
±6,05
23,50±
±5,69
12,51±
±3,34
46,75±
±14,97
25,29±
±6,97
37,01±
±8,06
34,19±
±12,13
6,65±1,39
12
8
NO2 сыв
3,16± 0,71
6,30± 2,61 4,26± 0,84 2,85± 1,75 3,18± 0,78* 3,38± 0,75
NOx сыв
19,46± 2,09
20,65±
±11,05
22,81±
±2,92
17,01±
±7,01
21,55±
±2,37
19,97±
±2,18
NO3 сыв
16,29± 2,12
14,35±
±13,65
18,54±
±2,26*
14,15±
±5,25
17,66±
±1,96
16,67±
±2,18
38,68±
±10,2
30,83±
±9,65
9,31±1,10
43,31±
±8,97
33,99±
±8,34
3,67± 0,80*
2,97± 0,53
p5–7= 0,042
20,01±
23,39±
2,57*
±2,87*
p7–8= 0,043
19,72±
17,02±
±2,56*
±2,41
p3–7= 0,039
Примечание. * — достоверность различия, согласно критерию Вальда–Вольфовица, p < 0,05.
При проведении корреляционного анализа (вычисление коэффициента корреляции Спирмена) было выявлено, что в период обострения болезни со стажем бронхита напрямую коррелировали показатели NOx , NO3 в культуре моноцитов без и со стимуляцией (r = 0,31, p = 0,023,
r = 0,29, p = 0,035 соответственно). Обратная корреляционная зависимость наблюдалась со
стажем (r = –0,30, p = 0,027) и интенсивностью курения (r = –0,29, p = 0,035). С увеличением
продукции NO2 стимулированного в супернатанте моноцитов достоверно снижались показатели
ЖЕЛ (r = –0,34, p = 0,012), ФЖЕЛ (r = –0,38, p = 0,004) и ОФВ1 (r = –0,35, p = 0,008), а также
соответственно повышение уровня NO2 без стимуляции было взаимосвязано с падением ЖЕЛ
(r = –0,35, p=0,008). Обратная статистически достоверная взаимосвязь была выявлена при
оценке уровня NO2 без стимуляции (r = –0,31, p = 0,019) и со стимуляцией (r = –0,33, p = 0,014)
в культуре моноцитов и числа палочкоядерных лейкоцитов периферической крови.
В период же ремиссии процесса, наиболее тесные взаимосвязи были установлены между
сниженными уровнями оксида азота и его производных и факторами табачной зависимости:
количеством выкуриваемых сигарет в день (r = –0,44, p = 0,034) индексом курильщика (r = –0,42,
p = 0,047), индексом пачка/лет (r = –0,43, p = 0,039). Нарастание уровней оксида азота и его
производных было тесно взаимосвязано также с повышением числа лимфоцитов периферической крови (r = 0,45, p = 0,038) и снижением числа моноцитов (r = –0,48, p = 0,021). Повышенные
уровни сывороточной двуокиси азота коррелировали лишь с числом эозинофилов периферической крови (r = 0,44, p = 0,034).
Оксид азота и его производные как маркеры обострения хронической обструктивной болезни 143
Заключение
Таким образом, основываясь на полученных данных, можно говорить о том, что длительное
и интенсивное курение снижает уровни продукции окиси азота и его производных в культуре
моноцитов и сыворотке крови, тем самым снижая их защитный антибактериальный потенциал
у больных с хронической патологией легких, что отражается на функциональных параметрах
(снижение ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ОФВ1). В то же время длительный стаж самой болезни и наличие профессиональных вредных воздействий (пыли, газа) приводит к гиперпродукции оксида азота
и его производных, что влечет за собой нарастание степени тяжести и прогрессирование заболевания. Наличие корреляций нитроксидергической активности культуры клеток и сыворотки
крови с эозинофилами, лимфоцитами и моноцитами периферической крови свидетельствует
о действительном непосредственном участии этих фагоцитирующих клеток в развитии оксидативного стресса при ХОБЛ.
Список литературы
1. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М., Медицина, 1998. 367 с.
2. Владимиров Ю.А. Хемилюминесценция в биологических системах // Природа, 1997. № 3. С. 18—28.
3. Оксидантные и антиоксидантные системы легких при хронических обструктивных заболеваниях / Соодаева С.К. В кн. Хронические обструктивные болезни легких под редакцией А.Г. Чучалина. М.: ЗАО
«Издательство БИНОМ», 1999. С. 92—111.
4. Bellavite P. The superoxide forming enzimatic system of phagocytes. // Free Radic. Biol. Med., 1988. Vol. 4.
P. 225—261.
5. Halliwell B. Antioxidants in human health and disease. // Ann.Rev.Nutr. 1996. Vol. 16. P. 33—50.
6. Kharitonov S.A., Barnes P.J. Exhaled markers of pulmonary disease. // Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2001.
Vol. 163: P. 1693—1722.
7. Maziak W., Loukides S., Culpitt S. et al. Exhaled nitric oxide in COPD // Am. J. Respir. Crit. Care Med.,
1998. Vol. 157. P. 998—1002.
8. Oxidants and antioxidants in the lung. / Bast A. In: COPD: diagnosis and treatment. Eds. C.L. A.van Herwaarden., et al. Excerpta Medica, 1996. P. 33—39.
9. Rahman I., Mac Nee W. Oxidant–antioxidant imbalance in smokers and COPD // Thorax, 1996. Vol. 51.
P. 348—350.
10. Repine J.E., Bast A., Lankhorst I. — Oxidative stress in COPD. // Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1997. Vol.
156. P. 341—357.
11. Singh S., Evans T.W. Nitric oxide, the biological mediator of the decade: fact or fiction? // Eur. Respir. J.,
1997. Vol. 10. P. 699—707.