Синтез биологически активных комплексных соединений
реклама
1 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИРКУТСКИЙ ИНСТИТУТ ХИМИИ ИМ. А.Е. ФАВОРСКОГО На правах рукописи СТОЛПОВСКАЯ ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА Синтез биологически активных комплексных соединений на основе дигидрокверцетина – продукта глубокой переработки древесины лиственницы 05.21.03 – Технология и оборудование химической переработки биомассы дерева; химия древесины Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: кандидат химических наук Трофимова Н.Н. Иркутск - 2015 2 Оглавление Список сокращений ..................................................................................................... 6 Введение ....................................................................................................................... 7 Глава 1 Комплексные соединения металлов с флавоноидами (литературный обзор) .......................................................................................................................... 12 1.1 Флавоноиды: структуры, содержание в древесине лиственниц ........................ 13 1.2 Флавоноиды в качестве органических лигандов в реакциях комплексообразования с ионами металлов .............................................................. 16 1.3 Некоторые металлы в координационной химии и их биологическая роль ...... 17 1.4 Способы получения и возможные структуры комплексных соединений флавоноидов с ионами металлов ............................................................................... 20 1.5 Методы исследования структур комплексных соединений металлов с флавоноидами............................................................................................................. 27 1.5.1 Методы определения стехиометрии комплексов ............................................ 28 1.5.2 УФ-спектроскопия в анализе флавоноидов и комплексных соединений ...... 29 1.5.3 Использование ИК-спектроскопии в исследовании комплексных соединений металлов с флавоноидами.......................................................................................... 31 1.5.4 Исследование структур комплексных соединений металлов с флавоноидами с помощью спектроскопии ЯМР ............................................................................... 37 1.5.5 Использование метода масс-спектрометрии в исследовании металлокомплексов флавоноидов ............................................................................. 44 1.5.6 Методы определения количества связанной воды в составе флавоноидов и комплексов на их основе ........................................................................................... 46 1.6 Биологическая активность флавоноидов и их комплексов с металлами .......... 47 1.6.1 Биологическая активность флавоноидов ......................................................... 47 1.6.2 Биологическая активность комплексных соединений металлов с флавоноидами............................................................................................................. 52 1.7 Использование метода циклической вольтамперометрии в исследовании окислительно-восстановительных свойств флавоноидов и их производных ......... 55 Заключение ................................................................................................................. 56 3 Глава 2 Синтез биологически активных комплексных соединений на основе дигидрокверцетина – продукта глубокой переработки древесины лиственницы (обсуждение результатов).......................................................................................... 58 2.1 Способы выделения дигидрокверцетина из древесины лиственницы .............. 59 2.2 Физико-химическая характеристика и стереоизомерия дигидрокверцетина ... 61 2.3 Оптимизация реакций комплексообразования дигидрокверцетина с ионами цинка, меди (II) и кальция ......................................................................................... 63 2.3.1 Синтез и оптимизация реакции комплексообразования цинка с дигидрокверцетином .................................................................................................. 64 2.3.2 Изучение реакции образования комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином .................................................................................................. 71 2.3.3 Синтез и оптимизация реакции получения комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином ............................................................................................... 78 2.4 Установление структур комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином .................................................................................................. 85 2.4.1 Характеристика комплексных соединений методом электронной микроскопии ............................................................................................................... 85 2.4.2 Определение растворимости комплексных соединений ................................. 85 2.4.3 Определение количества связанной воды в составе комплексов ................... 86 2.4.4 DART масс-спектральная фрагментация комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином .............................................................. 88 2.4.5 Определение элементного состава комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином .............................................................................. 91 2.4.6 ИК-спектроскопия комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином .................................................................................................. 92 2.4.7 Спектроскопия ЯМР комплексных соединений цинка и кальция с дигидрокверцетином .................................................................................................. 93 2.4.8 Спектроскопия ЭПР комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином .................................................................................................. 96 4 2.5 Изучение электрохимической активности комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином ............................................................ 100 2.6 Определение антиоксидантной активности комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином ............................................................ 104 2.6.1 Выбор действующей концентрации комплексов........................................... 105 2.6.2 Определение влияния комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином на процессы перекисного окисления липидов в опытах in vitro............................................................................................................................ 105 2.7 Перспективы использования комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином в качестве фармацевтической субстанции для лечения ожоговых ран............................................................................................................ 107 Глава 3 Экспериментальная часть........................................................................... 110 3.1 Спектрофотометрическое определение содержания дигидрокверцетина в анализируемом растворе .......................................................................................... 112 3.2 Условия синтезов комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином ................................................................................................ 113 3.2.1 Синтез и оптимизация комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином ................................................................................................ 114 3.2.2 Синтез и оптитмизация комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином ................................................................................................ 117 3.2.3 Синтез и оптимизация комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином ................................................................................................ 119 3. 3 Определение ионов металлов в анализируемых растворах ............................ 122 3.3.1 Определение содержания ионов цинка .......................................................... 122 3.3.2 Определение содержания ионов меди (II) ..................................................... 123 3.3.3 Определение содержания ионов кальция....................................................... 124 3.4 Расчет количества связанной воды в составе комплексов ............................... 124 3.5 Определение антиоксидантной активности комплексных соедиений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином in vitro ................................................ 125 3.5.1 Приготовление растворов для выбора действующей концентрации ........... 125 5 3.5.2 Определение малонового диальдегида в плазме крови ................................ 125 3.5.3 Определение диеновых и триеновых конъюгатов в плазме крови ............... 125 3.5.4 Определение активности каталазы ................................................................. 126 ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 128 Список литературы .................................................................................................. 129 Приложение А .......................................................................................................... 150 Приложение Б ........................................................................................................... 153 Приложение В .......................................................................................................... 163 Приложение Г........................................................................................................... 173 Приложение Д .......................................................................................................... 183 6 Список сокращений L – депротонированный дигидрокверцетин Met – ион металла ДК - диеновые конъюгаты ДКВ – дигидрокверцетин ДМСО - диметилсульфоксид КС – комплексное соединение МДА - малоновый диальдегид МЭ – микроэлемент ПОЛ – перекисное окисление липидов РСЭДМА - рентгеновский микроанализ ТБК - тиобарбитуровая кислота ТГ - термогравиметрия ТК- триеновые конъюгаты ХС – химический сдвиг спектральный энергодисперсионный 7 Введение Актуальность работы и степень ее разработанности. Актуальность данной работы обусловлена исследовательской выполнением работы тематического (государственного Плана задания) научно- Федерального государственного бюджетного учреждения науки Иркутского института химии им Е.А. Фаворского СО РАН V.48.1. «Разработка теоретических основ комплексной переработки биомассы хвойных пород Сибири для создания технологий получения инновационных медицинских и ветеринарных препаратов» (Рег. № 01201281998) и работ по проекту Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» на 2013-2014 гг. (№ ФНМ-2012-02) «Разработка инновационного препарата для комбустиологии на основе продуктов комплексной переработки биомассы лиственницы сибирской». Одним из важнейших направлений исследований химии древесины является изучение химических компонентов древесной биомассы с целью выявления ее практического потенциала. В последние годы пристальное внимание уделяется разработкам химических превращений уже существующих, коммерчески доступных первичных продуктов переработки биомассы растительного сырья, на основе которых можно расширять ассортимент продуктов с полезными свойствами и добавленной стоимостью, что в целом будет способствовать повышению уровня переработки всей растительной биомассы. Основным компонентом флавоноидной фракции (80-85%) древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы Гмелина (L. gmelinii (Rupr.) Rupr.) является транс-(+)2R3R-дигидрокверцетин (ДКВ), содержание которого значительно преобладает по отношению к содержанию цис-изомера. Применение технологических схем, отличающихся использованием различных экстрагирующих систем, приводит к получению субстанций ДКВ с разной биологической активностью, обусловленной соотношеним транс- и цисизомеров. Дигидрокверцетин, содержащий 98 % энантиомера транс-(+)-2R3R, выпускается ООО «Химия древесины» (г. Иркутск). ДКВ привлекает к себе 8 неизменный исследовательский и практический интерес, обусловленный как ярко выраженным биологическим потенциалом, так и коммерческой доступностью. Одним из подходов к расширению арсенала лекарственных средств является направленная модификация структуры базового соединения, для которого уже известна фармакологическая активность. В последнее время флавоноиды часто используются в качестве органических лигандов для получения комплексов металлов с ценными функциональными свойствами, в том числе и усиленной биологической активностью. Комплексы Zn, Cu(II), Fe(II), Fe(III), Al, Ca, Mg, Sn(II) и других металлов с полифенольными лигандами демонстрируют высокую антиоксидантную активность, превосходящую активность исходных флавоноидов. Однако, примеры использования (+)-дигидрокверцетина как лиганда для получения новых координационных соединений весьма немногочисленны. Получение ценных биологически активных комплексных соединений с биогенными металлами на основе ДКВ с целью создания новых высокоэффективных медицинских препаратов позволит расширить ассортимент импортозамещающих лекарственных средств и повысить рентабельность химической переработки биомассы лиственницы. Цель и задачи работы. Целью данной работы является синтез и оптимизация реакций образования биологически активных комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином. Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи: - направленный синтез комплексных соединений (КС) цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином с сохранением конфигурации 2R3R аномерных центров и функциональных антиоксидантной активности группировок, исходного отвечающих соединения-лидера за проявление (катехольный фрагмент молекулы флавоноида); -оптимизация реакций комплексообразования по выходу продукта; -установление структур полученных соединений; -оценка электрохимического поведения и антиоксидантной активности КС; -оценка возможности использования КС цинка с ДКВ в медицине. 9 Объект исследования – реакции комплексообразования ионов металлов с транс-(+)-2R3R дигидрокверцетином. Предмет исследования - комплексные соединения цинка, меди (II) и кальция с транс-(+)-2R3R дигидрокверцетином. Научная новизна работы. Впервые изучены реакции комплексообразования цинка, меди (II) и кальция с транс-(+)-2R3R дигидрокверцетином – флавоноидом древесины лиственницы в водной и водно-спиртовой среде; оптимизированы условия реакций, что позволило с высокими выходами (70-89 %) выделить индивидуальные продукты в виде порошков и установить их строение с применением современных физико-химических методов исследования: ЯМР 1Н и 13 С, ИК, масс-спектрометрии DART, элементного анализа, рентгеновского спектрального энергодисперсионного микроанализа (РСЭДМА) и термогравиметрии (ТГ). Разработаны лабораторные регламенты получения комплексов цинка, меди (II) и кальция с ДКВ. Методом циклической вольтамперометрии изучено электрохимическое поведение КС и подтверждены факторы, определяющие их антиоксидантные свойства. Определена антиоксидантная активность КС в экспериментах in vitrо на сливной плазме крови здоровых доноров. В опытах in vivo установлены ранозаживляющая и антимикробная активности фармацевтической композиции, разработанной на основе цинкового комплекса ДКВ. Практическая значимость работы. Результаты оптимизации реакции получения КС дают возможность выдать исходные данные для проектирования и создания экспериментальных установок по наработке опытных партий КС для разработки фармакологических субстанций и нормативной документации. Создание высокоэффективных медицинских препаратов на основе производных ДКВ может существенно увеличить рентабельность химической переработки древесины лиственницы, что в свою очередь будет способствовать развитию отечественного лесопромышленного комплекса. Это позволит более полно использовать экстрактивные вещества древесины лиственницы для расширения круга импортозамещающих лекарственных средств, биологически активных 10 добавок и улучшенной косметики. Разработанные лабораторные регламенты получения КС позволят наработать экспериментальные партии для дальнейших биологических исследований. На защиту выносятся: - методики синтеза и идентификации комплексов цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином; - результаты структурного анализа новых комплексных соединений на основании данных спектроскопии ЯМР 1Н и 13С, ИК, масс-спектрометрии DART, элементного анализа, РСЭДМА и термогравиметрии; - результаты исследования электрохимического поведения комплексов цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином; - оценка антиоксидантной активности комплексных соединений. Личный вклад автора. Автором выполнены экспериментальные исследования и разработаны лабораторные регламенты. Автор принимал непосредственное участие в планировании эксперимента, расшифровке спектров и обсуждении структурных и спектральных данных, интерпретации полученных результатов, поиске литературы, формулировке выводов и написании статей. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены в виде устных докладов на VI международной конференции «Traditional medicine: ways of integration with modern health care» (Улан-Удэ, 2013), XXVII международной (Иркутск, 2013), научно-технической всероссийской конференции научно-методической «Реактив-2013» конференции с международным участием «Инновационные технологии в фармации» (Иркутск, 2014). Публикации. Основное содержание работы изложено в 14 публикацях, из которых 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патент. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 168 наименований, и 5 приложений. Работа изложена на 183 страницах, содержит 14 таблиц, 24 рисунка и 4 схемы. 11 Во введении обоснована актуальность, научная и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи. Первая глава (литературный обзор) посвящена анализу литературных данных о синтезированных комплексных соединениях металлов с флавоноидами, их биологической активности. Во второй главе обсуждены результаты собственных исследований. В третьей главе приведены подробности проведения эксперимента. В конце рукописи представлены выводы. Соискатель выражает благодарность сотрудникам лаборатории физической химии и лаборатории структурной химии ИрИХ СО РАН за проведение физикохимических анализов; сотруднику лаборатории прикладной химии к.фарм.н. Костыро Я.А. за помощь в проведении биологических экспериментов. Отдельную благодарность выражаю директору Центра «Прима» ФГБОУ ВПО "Российский университет дружбы народов" д.х.н., профессору Калабину Г.А. за регистрацию масс-спектров DART. Также выражаю глубокую благодарность коллективу лаборатории химии древесины за поддержку и доброе отношение, отдельно к.т.н. Малкову Ю.А. за ценные советы во время написания лабораторных регламентов и Золотареву Е.Е. за помощь в проведении и интерпретации данных электрохимических исследований. Самую глубокую благодарность я выражаю своему научному руководителю к.х.н. Трофимовой Наталье Николаевне и д.х.н., профессору Бабкину Василию Анатольевичу за внимательность, требовательность и терпение, проявленные в период выполнения работы. 12 Глава 1 Комплексные соединения металлов с флавоноидами (литературный обзор) Комплексные соединения ионов различных металлов с природными флавоноидами представляют собой уникальный класс производных полифенолов, которые зачастую проявляют усиленную фармакологическую активность по сравнению с активностью исходных соединений и заключают в себе огромный терапевтический потенциал для разработки новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов [1]. Использование лекарственных средств на основе продуктов растительного происхождения имеет ряд преимуществ перед их синтетическими аналогами благодаря более мягкому, но выраженному лечебному эффекту комплекса биологически активных веществ лекарственных растений [2]. Поскольку флавоноиды по своей химической структуре являются полифенолами, содержащими гидроксильные и карбонильную группу, они проявляют выраженные электронодонорные свойства [3] и благодаря этому способны образовывать с ионами металлов комплексные соединения, содержащие координационные связи. Комплексообразование флавоноидов с ионами металлов обусловлено также и низким восстановительным потенциалом (Е7), который для большинства флавоноидов лежит в диапазоне 0,25-0,75 В [3]. Реакция начинается с электрофильной атаки иона металла на молекулу флавоноида с образованием связи металл-лиганд путем переноса электрона с d-орбитали металла на π*орбиталь флавоноида [4]. Комплексообразование флавоноидов с ионами металлов традиционно использовалось с аналитическими целями для идентификации растительных красителей и установления их строения [5]. С середины прошлого века металлсодержащие комплексы флавоноидов начали превращаться в самостоятельный объект исследования. Публикации 1970-х годов посвящены определению стехиометрии комплексов, кинетики реакций комплексообразования кверцетина [6-10] и морина [6, 8] с d-элементами и алюминием, а более поздние исследования – установлению строения разнообразных комплексных соединений на основе флавоноидов различного строения и широкого спектра металлов. 13 В настоящее время различные флавоноиды исплользуются в качестве органических лигандов для получения комплексных соединений с ионами металлов. Такие соединения часто проявляют повышенную биологическую активность и другие ценные свойства. Данные исследования развиваются в основном по двум направлениям. С одной стороны, значительное внимание уделяется определению структурных фрагментов молекулы флавоноида, участвующих в образовании валентной и координационной связей с ионом металла и установлению стехиометрии и структуры комплекса в зависимости от природы используемых соединений и условий синтеза. С другой стороны, практический интерес представляет изучение как физико-химических, так и биологических свойств комплексных соединений [11]. Литературные источники, связанные с этими исследованиями, публикуются авторами из самых различных стран: России, США, Китая, Пакистана, Бразилии, Франции, Украины, Греции, Белоруссии, Италии, Польши, Сербии, Казахстана, Венесуэлы, Венгрии, Германии, Канады, Румынии, Португалии. В данном литературном обзоре обобщены сведения о комплексных соединениях с ионами металлов на основе природных полифенолов, о методах, используемых для установления стехиометрии и структур металлокомплексов, а также сведения о биологической, в том числе и антиоксидантной, активности этих соединений, представленные в научной литературе за 1970-2013 гг. 1.1 Флавоноиды: структуры, содержание в древесине лиственниц Флавоноиды являются группой полифенольных веществ, определяющим структурным признаком которых является углеродный скелет С6-С3-С6, включающий конденсированную систему двух колец – бензольного (А) и гетероциклического (С) – и фенильный заместитель (В) [12]. Простейшим представителем флавоноидов является флаван (рис. 1.1). 14 3' 2' 8 8a O 2 A C 3 4a 4 5 7 6 4' B 5' 6' Рисунок 1.1 - Структура флавана Флавоноиды отличаются большим структурным разнообразием. По строению пиранового цикла они подразделяются на типы, основными из которых являются флавоны и их гидроксильные производные флавонолы, содержащие γ– пироновый цикл. Двойная связь образует с карбонильной группой сопряженную систему, а кольца А и В проявляют ароматический характер, благодаря чему флавоны и флавонолы ведут себя аналогично фенолам. Дигидрофлавоны (флаваноны) и дигидрофлавонолы (флаванонолы) представляют собой продукты восстановления пиронового ядра в молекулах флавонов и флавонолов. Флаван-3олы (катехины) образуются (лейкоантоцианидинов, при восстановлении проантоцианидинов). флаван-3,4-диолов Антоцианидины, производные бензопирилия, наиболее близки по структуре к флавонолам. Изофлавоноиды, в которых фенильный заместитель находится в положении С-3 γ–пиронового цикла, также относят к классу флавоноидов [3, 5, 13]. Разнообразие флавоноидов обусловливается не только различным строением пиранового цикла, но и введением гидроксильных, алкоксильных (метоксильных), алкильных, фурильных, гликозидных и других заместителей [5]. Катехины, в отличие от других флавоноидов, образуют вместо гликозидов галлаты, присоединяя в положение С-3 остаток галловой кислоты [3]. Для флаван-3-олов, дигидрофлавонов, дигидрофлавонолов и флаван-3,4диолов характерна стереоизомерия, поскольку в соединениях этих классов существует возможность расположения гидроксильной группы при С-3 и фенильной группы при С-2 как в cis-, так и в trans- положении относительно плоскости пирана. 15 Флавоноиды представляют собой слабые органические кислоты, поскольку входящие в их состав гидроксильные группы способны диссоциировать, причем диссоциировать может несколько гидроксогрупп, каждая из которых характеризуется своей «микроскопической» константой диссоциации. Отнести каждую из таких констант к диссоциации определенной гидроксильной группы довольно сложно. Однако, с помощью спектров ЯМР 13 С было показано, что степень диссоциации гидроксильных групп возрастает в последовательности 5ОН < 4'-ОН < 7-ОН [3, 14]. Кроме того, гидроксильные группы флавоноидов различаются способностью к окислению при воздействии различных оксидантов. Как правило, наиболее легко подвергается окислению катехольная группа кольца В, образуя семихиноновые анион-радикалы, превращающиеся затем в орто-хиноны. Диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФА), метилгликоль и спирты очень хорошо растворяют большинство флавоноидов. В воде растворимость полифенолов различна и понижается с уменьшением количества гидроксильных групп в молекуле флавоноида. Производные флавоноидов, представляющие собой гликозиды, более гидрофильны по сравнению со свободными полифенолами [3]. Флавоноиды чрезвычайно широко распространены в растительном мире [15]. Они содержатся в семенах, кожице плодов, коре и цветах растений. Наиболее богаты флавоноидами гречиха, яблоки, лук, а также другие овощи и фрукты. Богата флавоноидами древесина хвойных пород. Основными флавоноидными соединениями рода Larix являются дигидрокверцетин и дигидрокемпферол [11]. Флаванонол дигидрокверцетин впервые был выделен из ядровой древесины дугласовой пихты (Douglas fir) [16] и из ее коры [17, 18] в середине прошлого века, позже - из представителей других хвойных пород [19], а в 1973 г. - из лиственниц сибирской (L. sibirica Ledeb.) и Гмелина (L. gmelinii (Rupr.) Rupr.) [20]. В суммарном экстракте флавоноидов, получаемом из древесины этих двух видов лиственниц, его содержание составляет более 80 % и может достигать 4 % от массы абсолютно сухой древесины [11]. Наряду с 16 родственными флавоноидами, такими как кемпферол, дигидрокемпферол, нарингенин, эриодиктиол, ДКВ является хемотаксономическим признаком древесных растений рода Larix [11]. В растениях других семейств ДКВ встречается часто, однако его содержание, как правило, составляет менее одного процента. 1.2 Флавоноиды в качестве органических лигандов в реакциях комплексообразования с ионами металлов Флавоноиды проявляют хелатирующие свойства, поскольку способны связывать ионы металлов, и поэтому они могут влиять на сорбцию металлов в процессе питания человека и животных и воздействовать на баланс металлов в организме и клеточный окислительный статус. Способность флавоноидов образовывать комплексы может быть использована для подавления токсичности при отравлении организма тяжелыми металлами. Формирование уменьшать неврологические кверцетином алюминиевых расстройства, а комплексов молибденовых – может снижать токсичность при облучении [15]. Кроме медицинского аспекта, изучение реакций комплексообразования ионов металлов с флавоноидами связано с возможностью получения соединений с заданными физико-химическими свойствами, которые предполагают их практическое использование в различных областях. Например, изучаются магнитные свойства флавоноидных комплексов лантаноидов [21]; образование комплексов из полигидроксифлавонов и полиметоксифлавонов с металлами II группы приводит к получению флуоресцирующих соединений [22], что предполагает возможность создания фотохромофоров на основе природных полифенолов; взаимодействие флавоноидов с наночастицами различных металлов предполагает ряд преимуществ, важных для практического использования наноразмерных материалов [11, 23]. 17 При большом комплексообразовании разнообразии с ионами флавоноидов металлов их использование ограничивается, в в основном, небольшим рядом соединений, которые, как правило, имеют коммерческую доступность. Например, на основе кверцетина были проведены исследования его комплексообразования с широким спектром металлов: Al3+, Zn2+, Cu2+, Sn4+, Fe2+, Fe3+, Be2+, Mg2+, Ca2+, Cd2+, Ga2+, Pd2+, BF2+ и рядом лантаноидов [15, 21, 22, 24-31, 32-44]. Для морина установлены структуры комплексов морина с ионами Sn4+, Cu2+, Fe2+, Mg2+, Ca2+, Zr4+, MoO 42- [15, 21, 27, 41, 45-49], представлены результаты исследований строения и свойств металлокомплексов рутина с ионами Al3+, Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Sn2+, UO22+ [15, 24, 26, 30, 50-56]. В меньшей степени в научной литературе отображено участие в качестве лигандов металлокомплексов таких флавоноидов, как примулетин (5-гидроксифлавон), дигидроксифлавоны, галангин, гесперидин, нарингин, нарингенин, кемпферол, катехин, эпикатехин, лютеолин, физетин, дигидрокверцетин, байкалеин, хризин, силибинин. 1.3 Некоторые металлы в координационной химии и их биологическая роль Широко исследуются комплексные соединения флавоноидов, содержащие ионы Cu2+ [4, 9, 11, 15, 26, 30, 34, 35, 39, 40, 41, 45, 46, 50, 53, 55, 57-62], Fe2+ и Fe3+ [15, 28, 30, 31, 34, 37, 38, 45, 50, 60, 62-65], Al3+ [15, 24, 25, 29, 34, 36, 55, 6669], Zn2+ [4, 11, 15, 22, 24, 33, 43, 50, 51, 70], Mg2+ [22, 36, 47, 57], Ca2+ [4, 11, 22, 47,], лантаноидов [21, 71-75]. Представлены результаты исследований, посвященных установлению структур и определению свойств металлокомплексов флавоноидов с ионами Be2+ [36], Cd2+ [22], Co2+ [50], Ga2+ [36], K+ [57], La3+ [15, 75], Mn2+ [50], MoO42- [49], Na+ [57], Ni2+ [50], Sn2+ [48, 49], Sn4+ [27], VO2+ [76], Zr4+ [49]. 18 В большинстве случаев выбор металлов в качестве комплексообразователей обусловлен их важной ролью в биологических процессах. В состав живых организмов входит более 70 элементов таблицы Менделеева. По содержанию в организме они делятся на макроэлементы (C, H, O, N, P, S, Ca, K, Na, Cl, Mg - на их долю приходится 99,5 % веса тела) и микроэлементы (МЭ), массовая доля которых в организме менее 0,01 %. МЭ подразделяются на эссенциальные (жизненно необходимые), присутствующие в составе различных белковых структур, необходимые для нормального роста и развития организма, и токсические, в высоких дозах вызывающие поражение клеток, а в малых дозах оказывающие стимулирующее действие на различные биологические процессы. Эссенциальный МЭ, за очень редким исключением, нельзя заменить другим без нарушения биологической функции [77]. Кальций – основной структурный компонент костной ткани. Кроме того, ионы кальция играют важнейшую роль в регулировании различных биологических процессов, таких как мышечное сокращение, свертывание крови, активность ферментов, возбудимость клеточных мембран. Они способствуют секреции гормонов, увеличивают проницаемость мембраны клеток для ионов калия, служат посредниками во внутриклеточной передаче сигналов [78-81]. Железо является одним из наиболее распространенных микроэлементов на Земле. Оно входит в состав более 70 ферментов, выполняющих различные функции, основные из которых – транспорт электронов (цитохромы, железосеропротеиды), транспорт и депонирование кислорода (важнейшим кислородпереносящим белком является гемоглобин), участие в формировании активных центров окислительно-восстановительных ферментов (оксидазы, супероксиддисмутаза и др.), транспорт и депонирование железа (трансферрин, ферритин) [77, 78, 81-83]. Недостаток железа в организме вызывает анемию. Медь представляет собой один из важнейших МЭ, необходимых для жизнедеятельности человека, животных и растений. Ионы меди входят в состав ферментов и белков, играющих важную роль в окислительно-восстановительных процессах, участвующих в реакциях окисления органических субстратов 19 молекулярным кислородом. Являясь переходным металлом, медь может находиться в двух валентных состояниях и в зависимости от природы и расположения лигандов позволяет медьсодержащим белкам охватывать широкий диапазон окислительно-восстановительных потенциалов и обратимо связывать кислород и диоксид углерода [82]. Медь обладает выраженным противовоспалительным свойством и смягчает проявление аутоиммунных заболеваний. Недостаток меди в организме приводит к снижению активности медьзависимого фермента лизилоксидазы, может ингибировать активность супероксиддисмутазы – фермента, ответственного за ингибирование процессов перекисного окисления липидов мембран клеток, может быть одной из причин возникновения расстройств центральной нервной системы и вызывать анемию [77, 81, 82]. Цинк входит в состав более чем 200 металлоферментов, участвующих в различных метаболических процессах. Важную роль играет цинк в синтезе белка и нуклеиновых кислот, он необходим для стабилизации структуры ДНК, РНК и рибосом, участвует в процессах клеточного дыхания, заживления ран, воспроизведения потомства и иммунного ответа, влияет на обмен железа, меди, магния и кальция и на активность более чем 300 ферментов [77, 81, 82]. Цинк не проявляет переменную валентность, поскольку его атом имеет заполненный dподуровень, и в окисленном виде он всегда двухвалентен. В комплексных соединениях цинк, как правило, образует связи с четырьмя лигандами. Такие комплексы имеют тетраэдрическое строение, в отличие от квадратных планарных комплексов, образуемых ионами двухвалентной меди. Однако, известны и октаэдрические комплексы цинка, содержащие 6 лигандов. По сравнению с Cu2+, ион Zn2+ обладает большим сродством к электрону и несет более концентрированный заряд. Это обусловлено меньшим ионным радиусом Zn2+. В окислительно-восстановительных системах цинк выступает как сильная льюисовская кислота, оттягивающая на себя электронные пары [82]. Для обеспечения нормального функционирования органов и систем необходимо присутствие и других микроэлементов, причем в содержаниях, 20 соответствующих очень узкому диапазону концентраций. Марганец имеет важное значение для функции мозга, входит в состав белков и является активатором ряда ферментов. При этом Mn2+ взаимодействует с субстратом, содержащим фосфатный остаток, образуя хелат, или непосредственно реагирует с белком. Биологическую роль марганца в центральной нервной системе связывают с обеспечением нормальной структуры и стабильности мембран [82]. Марганец улучшает усвоение витаминов А, С и группы В, стимулирует процессы тканевого роста, усиливает эффекты цинка, меди, кобальта, необходим для нормального функционирования иммунной системы [77]. Основной биологической функцией кобальта в организме является его присутствие в молекуле витамина В12 [77,82]. Он участвует в различных ферментативных процессах и образовании ряда гормонов [84]. Ванадий в живых системах встречается в виде иона VO 2+ и выступает в качестве кофактора ряда ферментов, активируя или ингибируя их [77]. Молибден проявляет антиоксидантные свойства, ускоряет процессы клеточного роста и развития, необходим для нормального формирования эмали зубов [77]. Цирконий проявляет антибактериальные и противогрибковые свойства [84]. Лантан проявляет иммуномодулирующее действие [77]. Изучение процессов комплексообразования флавоноидов с лантаноидами представляет интерес благодаря открытой китайскими исследователями антиоксидантной и противоопухолевой активности лантаноидных комплексов с кверцетином [71, 72]. 1.4 Способы получения и возможные структуры комплексных соединений флавоноидов с ионами металлов Важными параметрами реакции, определяющими структуры комплексных соединений флавоноидов с ионами металлов, являются рН раствора, использование определенного растворителя, исходное мольное соотношение иона металла и флавоноида. 21 Результаты анализа литературных данных, демонстрирующие влияние параметров реакций комплексов и комплексообразования сайты связывания металла на с стехиометрический флавоноидными состав лигандами, представлены в табл. 1.1. Таблица 1.1 - Условия синтеза и характеристики комплексных соединений флавоноидов с ионами металлов Mg2+ Стехиометрия Условия синтеза Сайты металлокомплек (растворитель, исходные связывания са (ион мольные соотношения ион флавоноида металла:флавоно металла:флавоноид, рН) металлом идный лиганд) Метанол, метанол с 1:1 5-ОН, 4-С=О СН3СООNa (10-1М); от 1:100 до 100:1 [66] Этанол; 1:2 [70] 1:2 5-ОН, 4-С=О Zn2+ Этанол; 1:2 [70] 1:2 5-ОН, 4-С=О Al3+ Метанол, метанол с СН3СООNa (10-1М), метанол с метаноатом натрия (10 -3М), метанолвода (90:10) с NaCl (10 -1 М) и с HCl (рН 2,5); от 1:100 до 1000:1 [67] 1:1 – в чистом метаноле; 1:2 и 1:3 – в присутствии ацетата или метаноата натрия Al3+ Метанол; от 1:1 до 9:1 [24] 1:1 В кислой среде нет комплексообр азования; 3′-ОН,4′-ОН – только в щелочной среде 3-ОН, 4-С=О Zn2+ Метанол; от 1:1 до 9:1 [24] 1:1 3-ОН, 4-С=О Sn4+ Вода-этанол в присутствии антипирина; 1:1:530(антипирин); с HCl до рН 4,4-4,6 [27] 1:1:1 (с антипирином) 3-ОН, 4-С=О Zr4+ Метанол; 1:2; от 1:9 до 9:1 (определение стехиометрии) рН 3,0-8,0 (0,01 моль/л NaOH/HCl) [49] Метанол; 1:1; от 1:9 до 9:1 (определение стехиометрии) [47] Метанол; 1:1; от 1:9 до 9:1 (определение 1:2 3-ОН, 4-С=О 1:1 3-ОН, 4-С=О 1:1 3-ОН, 4-С=О Ион металла Флавоноид Al3+ O OH O 5-гидроксифлавон (Примулетин) OH OH O O 3,4′дигидроксифлавон HO O OH OH O Галангин HO HO OH O OH OH O Морин Ca2+ Cu 2+ 22 Ион металла Флавоноид Mg2+ Sn2+ MoO32- Sn4+ OH OH HO O OH OH O Zr4+ Al3+ Кверцетин Стехиометрия Условия синтеза металлокомплек (растворитель, исходные са (ион мольные соотношения ион металла:флавоно металла:флавоноид, рН) идный лиганд) стехиометрии) [46] Метанол; от 1:9 до 9:1 [41] 1:1 Метанол; 1:1; 1:1 от 1:9 до 9:1 (определение стехиометрии) [47] Метанол; 1:1 [48] 1:1 Метанол; 1:2; 1:2 от 1:9 до 9:1 (определение стехиометрии) рН 3,0-8,0 (0,01 моль/л NaOH/HCl) [49] 1:1:1 (с Вода-этанол в присутствии антипирина; антипирином) 1:1:530(антипирин); с HCl до рН 1,5-2 [27] Вода-этанол [84] 1:2 Метанол; 2:1 от 1:1 до 9:1 [24] 1:1 (в кислой Метанол, метанол-вода среде); 1:2 и 2:1 (90:10) с NaCl (10-1 М) и (в чистом HCl (рН 2,5), метанол с метаноле и в СН3СООNa (10-1М); щелочной среде) от 1:100 до 100:1 [25] Вода-метанол в присутствии антипирина; 1:10:1250(антипирин) – условия наиболее полного связывания Al3+ в комплекс; рН 6; [7] Fe3+ Co 2+ Cu 2+ Вода; 1:2; щелочная среда [34] Вода-этанол с добавлением NaClO4 для создания необходимой ионной силы раствора; 2:1; рН 6 [28] Вода; 1:2; щелочная среда [34] Вода-этанол [84] Вода; 1:1 Сайты связывания флавоноида металлом 3-ОН, 4-С=О 3-ОН, 4-С=О 3-ОН, 4-С=О 3-ОН, 4-С=О 3-ОН, 4-С=О 3-ОН, 4-С=О 3-ОН, 4-С=О; 3′-ОН,4′-ОН В кислой среде 3-ОН; в чистом метаноле 3ОН и затем 3′-ОН, 4′-ОН; в щелочной среде 3′ОН,4′-ОН и затем 3-ОН; 1:1:1(антипирин) 5-ОН, 4-С=О – в небольшом избытке кверцетина; 1:2:1(антипирин) – в избытке кверцетина 1:2 5-ОН, 4-С=О 1:2 или окисление кверцетина ионами Fe3+ Не установлены 1:2 5-ОН, 4-С=О 1:2 1:1 3-ОН, 4-С=О 3-ОН, 4-С=О 23 Ион металла Флавоноид Стехиометрия Условия синтеза металлокомплек (растворитель, исходные са (ион мольные соотношения ион металла:флавоно металла:флавоноид, рН) идный лиганд) от 0,5:1 до 32:1 (определение стехиометрии); рН 6,4 [26] Вода; 1:2; щелочная среда 1:1 [34] Метанол; от 1:9 до 9:1 [41] 1:1 Вода; от 1:2 до 2:1; рН 10 1:2 при [40] небольшом избытке флавоноида; 2:1 при избытке ионов металла Fe2+ Pd2+ Zn2+ Al3+ OH OH HO Zn2+ O O O OH O O OH O OH OH OH Рутин Sn2+ OH OH Cu 2+ UO22+ Cu 2+ 2+ Mg Вода-этанол с добавлением NaClO4 для создания необходимой ионной силы раствора; 2:1; рН 6 [28] Вода-этанол 50%; [15, 44] Метанол; от 1:1 до 9:1 [24] Метанол; от 1:1 до 9:1 [24] Метанол; от 1:1 до 9:1 [24] Метанол; 1:1; от 1:9 до 9:1 (определение стехиометрии) [54] Вода; 1:1; от 0,5:1 до 32:1 (определение стехиометрии), рН 6,4 [26] Этанол, рН 4,0-7,0, [15, 56] Вода; от 0,5:1 до 32:1 [26, 57] 1:1 1:1 2:1 3:2 3:2 3:2 Сайты связывания флавоноида металлом или 5-ОН, 4С=О 5-ОН, 4-С=О, полимерный комплекс, полимеризац ия за счет 3′О-, 4′-ОН 3-ОН, 4-С=О 3′-ОН,4′-ОН при небольшом избытке флавоноида; 5-ОН, 4-С=О и 3′-ОН,4′-ОН при избытке ионов металла Не установлены 3-ОН, 4-С=О 3-ОН, 4-С=О; 3′-ОН,4′-ОН 3′-ОН,4′-ОН; 7-ОН 3′-ОН,4′-ОН; 7-ОН 3′-ОН,4′-ОН; 7-ОН От 1:1 до Х:1, где возможно Х>2 3′-ОН,4′-ОН 1:1 5-ОН, 4-С=О 1:1 3-ОН, 4-С=О или 5-ОН, 4С=О 3-ОН, 4-С=О 3-ОН, 4-С=О Метанол; от 1:9 до 9:1 [41] 2:3 Вода; от 610:1 до 30500:1; 1:1 24 Ион металла Флавоноид OH HO O OH Стехиометрия Условия синтеза Сайты металлокомплек (растворитель, исходные связывания са (ион мольные соотношения ион флавоноида металла:флавоно металла:флавоноид, рН) металлом идный лиганд) рН от 1,89 до 9,18; или только 3изотонические ОН (при медицинские среды [57] рН>3,8) OH OH O Na+ Дигидрокверцетин K+ Cu 2+ OH OH O O O OH OH OH O CH 3 O Вода; от 610:1 до 30500:1; рН от 1,89 до 9,18; изотонические медицинские среды [57] Вода; от 610:1 до 30500:1; рН от 1,89 до 9,18; изотонические медицинские среды [57] Метанол; рН 6,5 [58] Вода-метанол; 1:2 [59] 1:1 1:1 1:1 3-ОН, 4-С=О или только 3ОН (при рН>3,8) 3-ОН, 4-С=О или только 3ОН (при рН>3,8) 5-ОН, 4-С=О 5-ОН, 4-С=О Метанол; от 1:9 до 9:1 [41] 2:3 3-ОН, 4-С=О 1:1 O OH OH OH Нарингин Cu 2+ O HO O CH2OH OCH3 O OH OH OH O Силибинин В качестве растворителя чаще всего используют метанол, воду, этанол и водно-этанольные обусловлен их растворы. Выбор предпочтительностью полярных для протонных реакций, растворителей протекающих по диссоциативному механизму SN1. Мольные соотношения ионов металла и флавоноида варьируют от 1:9 до 9:1. Концентрации растворов солей используют в диапазонах (4х10 -7 - 4х10-3 М), флавоноидов - (1х10-5 – 4х10-5 М). Реакции проводят в буферных растворах с рН от 1,89 до 9,28, в некоторых случаях до 12, и изотонических медицинских средах. Низкие значения рН достигаются добавлением кислоты, а высокие – добавлением щелочи. Многообразие комплексных соединений флавоноидов обусловлено как различным стехиометрическим составом, которое обычно находится в пределах от 1:2 до 2:1, так и разнообразием структур, которые определяются положением связывания флавоноида с металлом. 25 В каждой молекуле флавоноида есть, как минимум, три структурных фрагмента, которые могут взаимодействовать с металлическими ионами. Это 3ОН и 4С=О в кольце С, 5-ОН и 4С=О в кольцах А и С, 3'-ОН и 4'-ОН в кольце В (рис. 1.2) [15]. OH OH OH OH HO HO O O OH O OH O MetL O Met+ Met+ 3 HO O MetL5 Met+ O OH O HO HO O O OH OH OH Met+ OH O O MetL3' MetL4' Рисунок 1.2 – Возможные сайты связывания ионов металлов с флавоноидами на примере кверцетина На основании проведенного теоретического анализа структур комплексных соединений 5-гидроксифлавонолов (байкалеина (3,5-дигидроксифлавона) и кверцетина) с ионами металлов и производными бора установлены две группы факторов, влияющие на образование определенных типов хелатов: топология и особенности электронного строения лигандов, а также размеры и электронное строение ионов металла и бора [36]. Наличие двойной связи в структурах некоторых флавоноидов в положении С-2 и С-3 кольца С влияет как на стехиометрию полученных комплексов, так и на прочность связывания металла, образуя более прочные комплексы [41]. Комплексообразование кверцетина с ионами Fe2+ в водно-этанольных и водных растворах в диапазоне рН 3-7 с использованием исходного мольного 26 соотношения металл : флавоноид 2:1 приводит к образованию продукта со стехиометрическим соотношением металл : флавоноидный лиганд, равным 1:1 [28], причем оптимальным является рН 6. Связывание ионов Fe3+ происходит в меньшей степени из-за частичного окисления кверцетина. Образование комплексов кверцетина с Fe2+ отражено также в [31, 38]. Изучая механизм образования железосодержащих комплексов флавоноидов кверцетина, лютеолина, галангина, кемпферола и кризина, было установлено, что наиболее предпочтительным сайтом связывания металла для всех изученных авторами комплексов является фрагмент 3-ОН и 4С=О, затем 5-ОН и 4С=О и затем катехольный фрагмент кольца В, если он присутствует в молекуле исходного флавоноида [37]. Для насыщения связей иона железа требуется три молекулы кверцетина с образованием шести ортогональных связей Fe-O. При этом максимальная энергия связи реализуется в комплексе, в состав которого входят две молекулы кверцетина и один атом железа. В случае образования комплексов с соотношением металл : флавоноидный лиганд, равным 1:1, термодинамически всегда более устойчивыми являются соединения, в которых металл координирован с участием атомов кислорода гидроксильной группы 3-ОН и карбонильной группы 4С=О или 5-ОН и 4С=О [22]. Формирование комплексов со стехиометрическим соотношением 1:2 также может происходить с участием карбонильного атома кислорода [22]. Этот же сайт связывания (3-ОН и 4С=О) отмечен как наиболее предпочтительный и энергетически наиболее выгодный при изучении структур и свойств медных комплексов кверцетина, лютеолина и галангина с различными стехиометрическими соотношениями (1:1, 1:2 и 1:3) [39]. Предпочтительное образование комплексов с участием атома кислорода карбонильной группы объясняется тем, что на нем сконцентрирован наибольший отрицательный заряд в молекуле флавоноида, и именно этот фрагмент молекулы подвергается электрофильной атаке иона металла [36]. При изучении комплексообразования кверцетина с алюминием в растворе метанола и в водно-метанольных растворах при различных рН было установлено, 27 что в кислой среде и в растворе чистого метанола комплексообразование происходит с преобладающим участием групп 3-ОН и 4С=О; в щелочной среде более сильными хелатирующими свойствами обладает катехольный фрагмент молекулы кверцетина, который, по утверждению авторов, никогда не вовлекается в комплексообразование с Al3+ в кислой среде [25]. Таким образом, на состав, структуру и свойства комплексных соединений флавоноидов с ионами металлов может оказывать влияние целый ряд факторов: от природы металла и строения используемого полифенола до условий проведения реакции, таких как рН, исходное мольное соотношение реагентов, растворитель. Наиболее существенным фактором, влияющим на образование комплекса определенной структуры, является рН раствора. Учитывая, что за проявление антиоксидантных свойств флавоноидов отвечают определенные фрагменты молекулы, варьирование рН при получении комплексов можно использовать для направленного синтеза соединений с усиленной биологической, в том числе и антиоксидантной, активностью. 1.5 Методы исследования структур комплексных соединений металлов с флавоноидами Комплексные соединения металлов с флавоноидами часто представляют собой порошки, плохо растворимые в большинстве растворителей. В связи с этим вырастить кристалл, удовлетворяющий требованиям РСА, не представляется возможным, и для установления структур исследователи используют комплекс физико-химических термогравиметрию, спектроскопию УФ, методов, включающий дифференциальную ИК, ЯМР, спектроскопию и другие методы. элементный анализ, сканирующую калориметрию, масс-спектрометрию, флуоресцентную 28 1.5.1 Методы определения стехиометрии комплексов Стехиометрический состав металлсодержащих комплексов на основе флавоноидов обычно определяется следующими методами. Метод Остромысленского-Джоба (метод непрерывных изменений или изомолярных серий) [38, 46, 47, 49, 66, 67] основан на определении соотношения изомолярных концентраций реагирующих веществ, отвечающего максимальному выходу образующегося комплекса. Экстремальная точка на кривой зависимости выхода соединения от концентрации состава комплекса, раствора а ее соответствует положение максимально отражает возможной стехиометрическое соотношение иона металла и лиганда в составе комплексного соединения [41, 85]. Метод Бент-Френча [27, 15] основан на построении логарифмической зависимости оптической плотности раствора от концентрации ионов металла в растворе. Тангенс угла наклона прямой характеризует стехиометрическое соотношение компонентов в составе комплекса [41, 85]. Метод молярных отношений [9, 10, 15, 25, 49, 66, 67,] также позволяет определить стехиометрический состав комплексов и широко используется в исследовании металлокомплексов флавоноидов. Использование метода непрерывных изменений позволяет получить наиболее надежные результаты. Метод Бент-Френча приемлем для комплексов с соотношением металл : флавоноидный лиганд 1:1, но недостаточно точен для комплексов со стехиометрией 1:2 [11, 15]. Методы изомолярных серий, Бент-Френча, Асмуса были использованы при исследовании комплексообразования кверцетина и морина с Sn4+ в присутствии антипирина, который использовали для повышения чувствительности реакций [27]. Состав комплексов, содержащих кверцетин, Al3+ и антипирин, синтезированных в водно-метанольных растворах, определяли методом сдвига равновесия и изомолярных серий [29]. Наиболее полное связывание Al3+ в комплекс происходит при использовании исходного мольного соотношения ионов металла, флавоноида и антипирина, равного 1:10:1250. Стехиометрическое 29 соотношение компонентов в составе комплекса при небольшом избытке кверцетина составляло 1:1:1, при увеличении избытка кверцетина в составе реакционной смеси оно менялось до 1:2:1 (Al3+ : флавоноидный лиганд : антипирин). По рассчитанным константам равновесия, характеризующим прочность связи структурных звеньев в комплексе, определено, что прочность связи Al3+-депротонированный кверцетин выше, чем депротонированный кверцетин-антипирин. При рН>5,5 хелатирующей является группировка 5-ОН и 4С=О, возможная структура [(Qv)2Al(OH)2]-HAnt+, где Qv – депротонированный кверцетин, Ant – антипирин. Стехиометрия комплексов кверцетина с Zn2+ и Cu2+, полученных в водноспиртовых растворах, устанавливалась методами молярных отношений [32, 33] и изомолярных серий [32]. Cu2+ может образовывать два типа комплексов со стехиометрическими соотношениями, равными 1:1 и 1:2, а Zn2+ - один комплекс с соотношением металл : флавоноидный лиганд 1:1. Прочность медных комплексов примерно на два порядка выше, чем цинкового. Наиболее полное взаимодействие между кверцетином и ионом цинка происходит при более высоких значениях рН, чем образование медных комплексов. 1.5.2 УФ-спектроскопия в анализе флавоноидов и комплексных соединений Молекулы флавоноидов способны поглощать свет в области 320-420 нм (полоса 1), что обусловливает желтый цвет большинства соединений этой группы. Эта полоса присутствует в спектрах поглощения флавоноидов, в которых присутствует двойная связь между атомами углерода С-2 и С-3. Положение максимума этой полосы зависит от строения флавоноида и от степени окисленности кольца С. Так, в спектрах поглощения флавонов, флавонолов и их гликозидов максимум поглощения полосы 1 находится в области 360-385 нм, для дигидрофлавонов и дигидрофлавонолов максимум смещен в ультрафиолетовую область с λmax 310-330 нм, в спектрах антоцианидинов и антоцианов максимум 30 поглощения находится в области 490-540 нм, а в спектре катехинов полоса 1 отсутствует. В спектре поглощения флавонов и флавонолов, кроме полосы 1, присутствует полоса 2 с максимумом поглощения в области 240-285 нм, которая обусловлена π→π* переходами в бензоильной системе кольца А. Полоса поглощения 1 описывается переходами в кольце В, в циннамоильной системе [3, 15]. Для дигидрофлавонолов полоса 2 немного смещена в длинноволновую область, а полоса 1 сдвинута в противоположном направлении, и поэтому УФ спектр соединений этого класса представляет собой выраженную полосу с плечом [3]. При окислении флавоноидов происходят характерные изменения в спектрах поглощения – полосы 1 и 2 исчезают и появляется новый максимум при 325 нм, указывающий на образование продукта окисления. При этом полученный продукт окисления может быть как конечным продуктом реакции, так и промежуточным в зависимости от используемого окислителя. В зависимости от структуры исходного флавоноида новая полоса поглощения может появляться в области 350450 нм (для дигидрофлавонолов) или с максимумом при 430 нм и плечом 480-520 нм (для катехинов). При добавлении хлорида алюминия, этилата натрия, безводного ацетата натрия, борной кислоты с ацетатом натрия к растворам полифенолов в спектрах поглощения происходит сдвиг максимума в соответствии с расположением различных функциональных групп в молекуле флавоноида. Такие реакции комплексообразования классически используются для идентификации и исследования строения флавоноидов на основании их УФ спектров [5]. УФ-спектроскопию использовали в исследовании комплексных соединений металлов с флавоноидами различных классов [15, 24-33, 37-41, 46-49, 51, 53, 54, 57-59, 61, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 76, 86]. При комплексообразовании в спектрах поглощения полоса 1 претерпевает батохромный сдвиг, однако это наблюдается не для всех классов флавоноидов. При взаимодействии ионов металлов с дигидрофлавонолами и катехинами заметных спектральных изменений не происходит. В этом случае исследование хелатирующих свойств флавоноидов 31 можно проводить сочетанием спектрофотометрии с методом конкурентного замещения, основанном на способности сильных хелаторов вытеснять из комплексных соединений менее эффективные лиганды [3]. Этот метод используют также и для сравнения разных флавоноидов в отношении способности к комплексообразованию. 1.5.3 Использование ИК-спектроскопии в исследовании комплексных соединений металлов с флавоноидами Инфракрасные спектры органических соединений всегда имеют довольно сложную структуру. Колебательные спектры флавоноидов сложны из-за наличия кольцевой системы, а также из-за присутствия водородных связей, что затрудняет расшифровку спектров. При их интерпретации важно обращать внимание не только на положение максимумов характеристических полос, которые свидетельствуют о наличии в молекуле соответствующих им функциональных групп, но и на их расположение относительно других полос, а также на их интенсивности, которые являются количественной характеристикой содержания вещества [87]. Введение в молекулу заместителей приводит к изменениям частот и интенсивностей полос, поскольку ни одна группа не является полностью изолированной от колебаний остальной части молекулы. Исследования структур комплексных соединений металлов с флавоноидами с помощью ИК-спектроскопии сводятся к сравнению областей поглощения различных групп атомов, присутствующих в свободных флавоноидах и в образуемых ими комплексах. Внимание исследователей в основном привлекают структурные фрагменты, которые теоретически могут взаимодействовать с ионами металлов с образованием хелатных соединений, такие как 3',4'гидроксильные группы в кольце В, 3-ОН или 5-ОН и 4С=О в кольце С [15]. В ИКспектрах чаще всего анализируются области поглощения карбонильной группы ν(С=О), которая для свободных флавоноидов находится обычно в диапазоне 16821643 см-1, а также области 1613-1556 см-1 (ν(С=С)), 1310-1246 см-1 (ν(С-О-С)) и 32 области поглощения гидроксильных групп. Особое внимание уделяется появлению новых полос в ИК-спектрах в области «отпечатков пальцев» при 1500500 см-1 [88], поскольку положение и интенсивность полос поглощения в этой области индивидуальны для каждого органического соединения. Отмечаются изменения в полосах, принадлежащих вибрациям кольца В и характеризующих колебания катехольного фрагмента молекулы флавоноида. Участие в координационной связи с металлом кислородного атома карбонильной группы, как правило, сопровождается значительным сдвигом максимума полосы поглощения этой группы в ИК-спектре в область низких частот. При этом величина сдвига зависит от природы как флавоноида, так и металла, участвующего в комплексообразовании. Отмечены существенные изменения в спектрах комплексов кверцетина с Al3+ [24, 34], Zn2+ [24], Cu2+ [34, 40], Pd2+ [15], Fe3+ [34]. Так, в спектрах алюминиевого комплекса кверцетина максимум поглощения карбонильной группы претерпевает сдвиг в область низких частот на 78 см-1 по сравнению со спектром исходного флавоноида [24], в спектрах цинкового комплекса этого же флавоноида – на 50 см-1 [24], комплексного соединения меди с кверцетином в избытке ионов металла – на 40 см-1 [40]. Из данных ИК-спектроскопии не всегда возможно точно определить сайт связывания металла с флавоноидным лигандом (например, атом кислорода гидроксильной группы 5-ОН или 3-ОН). Однако, участие атома кислорода группы 5-ОН кверцетина с ионом Cu2+ предполагается наиболее вероятным [40], поскольку, во-первых, 6-членное хелатное кольцо было бы более стабильным по сравнению с 5-членным, и, во-вторых, диссоциация 5-ОН происходит раньше, чем 3-ОН, исходя из констант диссоциаций индивидуальных гидроксильных групп. В спектрах металлокомплексов галангина сдвиг максимума полосы поглощения карбонильной группы в область низких частот по сравнению со спектром галангина наблюдается на 57 и 45 см-1 для алюминиевого и цинкового комплексов, соответственно [24]. Введение иона Cu2+ в молекулу нарингина сопровождается изменением максимума поглощения карбонильной группы в ИКспектре по сравнению со спектром исходного флавоноида на 31 см-1 [58, 59], на 33 основании чего предложена структура комплекса, в котором Cu2+ координируется через атом кислорода 5-ОН с участием карбонильной группы нарингина. Связывание морина различными металлами (Cu2+, Sn2+, Ca2+, Mg2+, Zr4+ и МоО32-) в разной степени изменяет область поглощения карбонильной группы в ИК-спектре свободного флавоноида [46-49]. Среди металлокомплексов морина, содержащих представленные ионы, максимальный сдвиг максимума поглощения карбонильной группы по сравнению со спектром морина наблюдается в циркониевом комплексе (45 см-1) [49], минимальный – в комплексе, содержащем МоО32- (6 см-1) [49]. В спектрах комплексов морина, содержащих ионы Ca2+, Sn2+, Cu2+, Mg2+, соответствующие величины составляют 27, 15, 12 и 9 см-1 [46-48]. Несмотря на такие разные изменения в спектрах металлокомплексов, исследователи предполагают участие карбонильной группы и атома кислорода ближайшей гидроксильной группы в комплексообразовании. Связывание примулетина (5-гидроксифлавона) ионами VO2+, Mg2+ и Zn2+ также приводит к сдвигу максимума поглощения карбонильной группы в ИКспектре в область низких частот на 26 [76], 20 и 22 см-1 [70], соответственно, по сравнению со спектром свободного флавоноида, а связывание хризина ионом VO 2+ - на 19 см-1 по сравнению со спектром хризина [76]. В ряде работ, посвященных исследованию структур металлокомплексов, авторы используют спектроскопию комбинационного рассеяния [63, 66, 67], которая также является методом колебательной спектроскопии. В спектре железосодержащего комплекса физетина, полученного в кислой среде, сдвиг максимума поглощения карбонильной группы наблюдается на 13 см-1 по сравнению со спектром физетина [63]. Для комплексов, полученных в нейтральной и щелочной средах (рН 7 и рН 9), этого не наблюдается. На основании рамановских спектров авторы утверждают, что в кислой среде комплексообразование происходит с участием карбонильного фрагмента. В ИК-спектрах рутиновых комплексов, как правило, значительных изменений в области поглощения карбонильной группы по сравнению со спектром рутина не отмечается. Разница в положении максимумов поглощения 34 карбонильной группы рутина и комплексов, содержащих ионы Al3+, Zn2+ [24], Sn2+ [54], составляет от 2 до 5 см-1. Отсутствие заметных изменений в спектрах объясняется тем, что атом кислорода близлежащей гидроксильной группы 5-ОН не участвует в комплексообразовании. Присутствие в молекуле рутина гликозидного остатка, соединенного с атомом кислорода при С-3, препятствует образованию связи с металлом через указанный атом кислорода. Сдвиг максимума поглощения карбонильной группы рутинового комплекса меди(II) на 25 см-1 по сравнению со спектром рутина авторами признан незначительным, и была предложена вероятная структура комплекса со стехиометрическим соотношением металл : флавоноидный лиганд 3:2, в котором ион меди координируется с участием атомов кислорода гидроксильных групп кольца В и 7-ОН [53]. В ИК-спектрах комплексного соединения, образованного ионами Cu2+ и кверцетином в избытке флавоноида, основные изменения наблюдались в полосах, принадлежащих вибрациям кольца В, которые для кверцетина присутствовали при 1567, 1368 и 1176 см-1. В этой области было отмечено появление новой полосы с частотой 1455-1456 см-1, которую авторы приписывают поглощению катехольной группы [40], что указывает на то, что при небольшом избытке флавоноида кверцетин может координироваться ионами Cu2+ как бидентатный лиганд через атом кислорода катехольного фрагмента флавоноида. При изучении способности физетина связывать ионы железа на основании рамановских спектров было показано, что в нейтральной и щелочной средах комплексообразование происходит с участием атомов кислорода гидроксильных групп кольца В. Полоса, присутствующая в спектре физетина при 1463 см-1 и характеризующая колебания катехольного фрагмента молекулы флавоноида, при образовании комплекса в нейтральной среде сдвигается в область низких частот на 23 см-1, что объясняется участием атомов кислорода катехольного фрагмента флавоноида в координации с ионом железа [63]. Исследование ИК-спектров комплексных соединений металлов с флавоноидами включает анализ области, характеризующей валентные колебания 35 фрагмента -С-О-С- кольца С. Отсутствие заметных изменений в этой области по сравнению со спектрами свободных флавоноидов указывает на сохранение этого фрагмента при комплексообразовании. Незначительные изменения в спектрах металлокомплексов происходят в области, характеризующей валентные колебания двойной связи. В представленных выше исследованиях в большинстве случаев сдвиг ν(С=С) в низкочастотную область по сравнению со спектрами исходных флавоноидов наблюдается в пределах 1-3 см-1. Широкие полосы, присутствующие в ИК-спектрах алюминиевых и цинковых комплексов кверцетина, галангина и рутина в области 3725-2357 см-1, соответствующие частотам валентных колебаний гидроксильных групп, свидетельствуют о наличии координационной воды в соединениях, что было подтверждено термическим анализом [24]. В спектрах мориновых комплексов, содержащих ионы Cu2+, Sn2+, Zr4+, отмечено наличие широкой полосы в области 3600-3000 см-1, что указывает на присутствие в комплексах воды [46, 48, 49]. В спектрах комплексов примулетина с ионами Mg2+ и Zn2+ присутствует интенсивная широкая полоса в области 3600-2600 см-1, которая уширена по сравнению с полосой свободного флавоноида (3200-2600 см-1), характеризующей валентные колебания связи О-Н, что свидетельствует о сильной внутримолекулярной водородной связи и о присутствии в составе комплексов воды [70]. Новые полосы в спектрах поглощения металлокомплексов, появляющиеся обычно в области 606-645 см-1 [24], указывают на образование новой связи металл-кислород. В спектрах мориновых комплексов, содержащих ионы Cu2+, Sn2+, Mg2+ и Ca2+, новые сильные полосы появляются при 603, 519, 648 и 646 см-1, соответственно [46-48]. В спектре циркониевого комплекса морина средняя полоса появляется в области 978-738 см-1, которую авторы приписывают новой связи металл-кислород [49]. В ИК-спектре молибденового комплекса морина появляется 3 новых характеристических полосы, которые дает пероксид металла: ν1(О-О) при 831-850 см-1, симметричная ν2(Мо-О) при 650-697 см-1 и асимметричная ν3(Мо-О) при 730-746 см-1. Сильная полоса при 968-981 см-1, 36 характеризующая связь Мо=О, указывает на искаженную октаэдрическую структуру комплекса. При 550 см-1 наблюдается новая широкая полоса, характеризующая образование новой связи ν(Мо-О) через кислородный атом гидроксильной группы 3-ОН [49]. При исследовании этими же авторами рутинового комплекса, содержащего ионы Sn2+ [54], образование координационной связи металл-флавоноидный лиганд было определено по появлению новой полосы при 428 см-1. Сравнение ИК-спектров рутина и его комплекса с ионами Cu2+ подтверждает образование связи металл-лиганд по появлению в спектре комплекса новой полосы при 623 см-1, отсутствовавшей в спектре свободного рутина [53]. В спектрах ванадиловых комплексов примулетина и хризина новые полосы поглощения появляются в областях 984 и 530-522 см-1, которые исследователи приписывают соответственно колебаниям группы V=O и новой связи V-O, образованной в результате хелатирования [76]. Иногда при исследовании ИК-спектров комплексных соединений металлов с флавоноидами авторы обращают большее внимание на сравнение спектров изучаемых комплексов и исходных солей металлов. Образование комплексов дигидрокверцетина и кверцетина с ионом Cu2+ в [26, 57] авторами подтверждается по образованию новых интенсивных полос, отсутствовавших в спектрах исходного флавоноида и ацетата меди. Новые полосы поглощения при 1570 см-1 (ν as) и 1440 см-1 (ν s), по утверждению авторов, относящиеся к асимметричному и симметричному валентным колебаниям карбоксилат-иона, соответствовали смещенным на 50 см-1 в низкочастотную область валентным колебаниям карбоксилат-иона исходного ацетата меди. Из вышеперечисленных примеров можно сделать вывод, что образование комплексных соединений на основе флавоноидов сопровождается рядом изменений в ИК-спектрах по сравнению со спектрами свободных полифенолов. Появление новой полосы в области 603-648 см-1 указывает на образование новой связи металл-кислород (иногда эта полоса появляется при 427-428 см-1 и 519 см-1 [48, 54]). Значительный сдвиг максимума поглощения карбонильной группы в область низких частот объясняется участием атома кислорода соседней 37 гидроксильной группы в комплексообразовании, а изменение полосы поглощения флавоноида при 1463 см-1 указывает на участие кислорода гидроксильной группы катехольного фрагмента кольца В в связывании флавоноида металлом. Причем, на величины сдвигов полос поглощения в низкочастотную область влияет не только положение сайта связывания металла с лигандом, но и природа металла. Так, сдвиг максимума поглощения карбонильной группы происходит обычно на 9-45 см-1 относительно положения полосы поглощения флавоноида, но может достигать 45-50 см-1 в случае образования цинковых комплексов галангина и кверцетина и 57-78 см-1 при образовании алюминиевых комплексов этих же флавоноидов [24]. ИК-спектры предоставляют очень полезную информацию относительно структур комплексных соединений. Но эта информация не всегда является достаточной для точного определения сайтов связывания ионов металлов с депротонированными флавоноидами. Например, значительный сдвиг максимума поглощения карбонильной группы может свидетельствовать об участии в комплексообразовании кислорода гидроксильной группы как при 3-ОН, так и при 5-ОН. Кроме того, при вовлечении атомов кислорода других гидроксильных групп в процесс связывания флавоноида металлом сдвиг полосы поглощения карбонильной группы также происходит, но менее значительный. Этот метод удобно использовать в качестве дополнительного подтверждения образования комплекса с одновременным применением других методов, например, спектроскопии ЯМР. 1.5.4 Исследование структур комплексных соединений металлов с флавоноидами с помощью спектроскопии ЯМР Для установления строения и доказательства структур соединений различных классов широко используется метод ЯМР, основанный на резонансном поглощении или излучении электромагнитной энергии веществом во внешнем магнитном поле. Исследования флавоноидов и полученных на их основе 38 комплексов с ионами металлов проводят на ядрах 1 Н и 13 С, обладающих магнитным моментом и моментом количества движения [89]. Спектроскопию ЯМР использовали для установления строения соединений, полученных в результате реакции комплексообразования кверцетина с ионами Zn2+ [24, 51, 86], Al3+ [24], Ga3+ [86], кверцетина и его алкильных производных с ионами Be2+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Cd2+ [22], морина с Cu2+ [46], Ca2+, Mg2+ [47], Sn2+ [48], Zr4+, MoO32- [49], рутина с Sn2+ [54], для доказательства структур цинковых комплексов рутина, кемпферола, катехина и эпикатехина [51] и медного комплекса нарингина [58, 59]. Для определения положения координации иона металла с флавоноидным лигандом наиболее существенным является сопоставление сигналов протонов гидроксильных групп в спектрах 1 Н свободного флавоноида и комплекса. Отсутствие сигнала протона гидроксильной группы может указывать на замещение его ионом металла. Исследуя спектры ПМР, часть исследователей анализирует сигналы всех протонов [24, 58, 59], другие - только сигналы протонов гидроксильных групп [46, 48, 49, 54, 22]. В некоторых случаях анализу подвергаются только сигналы протонов, находящихся при атомах углерода [51, 86]. В большинстве случаев сигналы протонов в спектрах полученных комплексов претерпевают изменения по сравнению с соответствующими сигналами в спектрах свободных флавоноидов, что может быть обусловлено увеличением сопряжения, вызванного эффектом координации [24]. Для определения центров комплексообразования в структурах мориновых комплексов меди (II) [46], олова (II) [48], циркония (IV) и молибдата [49] и рутинового комплекса олова (II) [54] были использованы данные ЯМР 1Н. Отсутствие сигнала протона 3-ОН группы в спектрах представленных мориновых комплексов предполагает хелатирование с участием атомов кислорода групп 3ОН и 4С=О с образованием пятичленного кольца в одной плоскости с кольцом С (рис. 1.3). 39 HO HO OH B O A + C O OH O Cu(II)(H2O)n Рисунок 1.3 – Структура комплексного иона меди (II) с морином [46] Изменение значения химического сдвига (ХС) протона 5-ОН группы в спектре комплекса Cu(II)-морин на 1,85 м.д. в сторону сильного поля, более значительное по сравнению с изменениями ХС протонов остальных гидроксогрупп (от 0,05 до 0,50 м.д.), авторы приписывают возможному участию атома кислорода этой группы в комплексообразовании. В спектре комплекса Sn(II)-морин изменения значений ХС незначительны (0,02 м.д.) для протонов гидроксильных групп 5-ОН и 7-ОН (оценивались величины химических сдвигов только протонов гидроксильных групп 3-ОН, 5-ОН и 7-ОН). В спектре циркониевого комплекса морина наиболее значительные изменения значений ХС наблюдаются для протонов 2'-ОН и 7-ОН (на 1,10 м.д. в сторону сильного поля и на 1,26 м.д. в сторону слабого поля, соответственно) и в спектре молибдатного комплекса морина для протонов 2'-ОН, 4'-ОН и 7-ОН (на 3,20, 3,02. и 4,17 м.д., соответственно, в сторону слабого поля), что можно объяснить возможной фиксацией кольца В, вызванного координацией [49]. Отсутствие в спектре рутинового комплекса олова (II) [54] сигналов протонов двух гидроксильных групп (при 7-ОН и 3'-ОН) после комплексообразования дает основания предполагать, что в полученном комплексе присутствуют два центра хелатирования. Координация рутина ионами Sn2+ осуществляется с участием фенольных групп 3'-ОН и 4'-ОН путем замещения одного из протонов, связываясь с атомом кислорода гидроксильной группы 3'-ОН обычной ковалентной связью; при этом атом кислорода 4'-ОН образует с ионом металла координационную связь. Второй сайт связывания приписывается атому 40 кислорода 7-ОН, о чем свидетельствует отсутствие протона при соответствующем гидроксиле. Следует отметить, что протонные сигналы двух оставшихся гидроксильных групп претерпевали лишь незначительные сдвиги в слабое поле, как это происходило и в случае моринового комплекса олова (II) [48]. Полученное стехиометрическое соотношение в комплексе Sn(II)-рутин, равное 3:2 (металл лиганд), было предварительно рассчитано методом Джоба и подтверждено данными УФ- и ИК-спектроскопии. Благодаря значительным размерам Sn2+ легко может удержать две громоздкие молекулы депротонированного рутина через атом кислорода гидроксильной группы 7-ОН и молекулы растворителя (рис. 1.4) [54]. Sn(H2O)x (H2O)x Sn O O HO OH (H2O)x O O Sn O O Cl2 OC12H21O9 OC12H21O9 O OH O Рисунок 1.4 – Предполагаемая структура комплексного соединения олова (II) с рутином [54] Методом спектроскопии ЯМР 1Н установлено строение комплексов ионов металлов II группы (Be2+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Cd 2+) с кверцетином и его алкильными производными, представляющими собой метокси- и метилендиоксипроизводные [22]. Оценивалось наличие и значения ХС сигналов протонов только групп 3-ОН и 5-ОН в спектрах полученных соединений. Ион Be2+ со всеми исследуемыми флавонами образует комплексы с участием кислородного атома гидроксильной группы 5-ОН. Остальные металлы образуют с кверцетином и его производными комплексы с участием атомов кислорода гидроксильной группы 3-ОН и карбонильной 4С=О. При комплексообразовании флавоноидов с металлами выявлена корреляция величины изменения ХС этих протонов от величины ионного радиуса металла. Так, величины ионных радиусов исследуемых металлов 41 (в Å) уменьшаются в ряду: Ca2+ (1,05) > Cd2+ (0,99) > Mg2+ (0,78) > Zn2+ (0,57). С уменьшением радиусов ионов металлов наблюдается увеличение изменения значений ХС сигналов протонов 5-ОН в комплексах: 0,06-0,34 м.д. (для кальциевых комплексов) > 0,29-0,56 м.д. (для кадмиевых комплексов) > 0,49-0,61 м.д. (для магниевых комплексов) > 0,68-0,75 м.д. (для цинковых комплексов). Ранее этими же авторами на примере комплексов кверцетина с другими металлами было продемонстрировано, что состав и структура комплексов существенно зависят от величины ионного радиуса и электронной конфигурации конкретных ионов [36]. Кверцетин, метилированный по четырем гидроксильным группам, кроме 5ОН, 2-(3,4-диметоксифенил)-5-гидрокси-3,7-диметокси-4Н-хромен-4-он, образует комплексы с ионами Be2+, Mg2+ и Zn2+, на что указывает отсутствие сигнала протона гидроксильной группы 5-ОН в спектрах ЯМР 1Н продуктов реакции. Ионы Ca2+ и Cd2+ не образуют аналогичных комплексов, поскольку полость, образованная карбонилом и 5-ОН группой, недостаточна для того, чтобы удержать крупные ионы Ca2+ и Cd2+. Более мелкие ионы Ве2+ (0,31Å), Mg2+ и Zn2+ могут хелатироваться через эту область, поскольку их радиусы соответствуют размерам этой полости [22]. Анализ сигналов всех протонов в спектрах свободных флавоноидов и их комплексов с ионами металлов проводили при установлении структур соединений на основе кверцетина, рутина и галангина, содержащих ионы Al3+ и Zn2+ [24], и комплекса Cu(II)-нарингин [58, 59]. На основании отсутствия сигналов соответствующих протонов определены сайты связывания ионов металлов с флавоноидными лигандами: атом кислорода гидроксильной группы 3-ОН – в комплексах кверцетина и галангина, 7-ОН – в комплексах рутина, 5-ОН – в комплексе нарингина. Значения ХС сигналов остальных протонов в спектрах полученных комплексов не претерпевают значительных изменений по сравнению со спектрами свободных флавоноидов. В спектрах рутиновых комплексов разница в значениях ХС протона Н-6' составила 1,06-1,076 м.д., что предполагает возможность образования структуры, аналогичной представленной на рис. 1.4. 42 Методом ЯМР-титрования исследовали комплексообразование Zn2+ с рядом флавоноидов и их производных [51]и определяли возможные сайты связывания Fe2+ и Fe3+ с кверцетином, используя диамагнитные ионы металлов Zn2+ и Ga3+ [86]. Регистрировали только значения ХС протонов, находящихся при атомах углерода, и образование комплексов наблюдали по изменению в спектрах значений ХС протонов, соседних с предполагаемыми сайтами связывания. В растворах кверцетина и кемпферола [51] при увеличении концентрации ионов цинка происходило уширение резонансных линий сигналов протонов Н-6' и Н-2', что предполагало участие атомов кислорода гидроксильной 3-ОН и карбонильной 4С=О групп кольца С в связывании Zn2+ с флавоноидным лигандом. На второй стадии образования цинкового комплекса кверцетина возможно хелатирование через атом кислорода гидроксильной группы 3'-ОН кольца В. При аналогичных исследованиях комплексообразование иона цинка с флавоноидами, не содержащими в своем составе гидроксильных групп при С-3 кольца С: рутином, происходило, лютеолином, (+)-катехином поскольку никаких изменений и (-)-эпикатехином, не значений ХС протонов не наблюдалось. Возможно, выбранные условия реакции подходили для образования комплексов именно с участием атом кислорода гидроксильной группы 3-ОН. Наиболее вероятными сайтами связывания Fe2+ и Fe3+ с кверцетином также предполагаются атомы кислорода групп 3-ОН и 4С=О [86], поскольку при моделировании процесса комплексообразования с использованием ионов Zn2+ и Ga3+ с увеличением доли ионов металлов в растворах происходило уширение и смещение в сторону слабого поля на 0,2-0,4 м.д. сигналов протонов Н-6, Н-8, Н-2' и Н-6'. Изменения в значениях ХС наблюдались для тех протонов, которые связаны с атомами углерода, находящимися от связанного с металлом кислорода через 4 сопряженные связи. Изменения значения ХС Н-5' в спектрах обоих комплексов менее значительные, поскольку атом углерода С-5' находится от предполагаемого сайта связывания на одну связь дальше. Методы спектроскопии ЯМР 1Н и 13 С использовали для установления строения комплексных соединений примулетина (5-гидроксифлавона) с ионами 43 Mg2+ и Zn2+ [70] и морина с ионами Са2+ и Mg2+ [47]. Отсутствие в спектрах ЯМР 1 Н комплексов сигналов протона гидроксильной группы 5-ОН указывает на участие в образовании комплексов примулетина атомов кислорода групп 5-ОН и 4С=О, что подтверждается сохранением положения сигналов атомов углерода в спектрах ЯМР 13 С в кольце В при незначительном смещении сигналов атомов углерода колец А и С по сравнению со спектром примулетина. Координация морина ионами Ca2+ и Mg2+ происходит с участием кислородных атомов 3-ОН и 4С=О, на что указывает отсутствие в спектрах 1Н обоих комплексов сигналов протонов гидроксогруппы 3-ОН. Поскольку введение электроноакцепторных ионов или групп смещает резонансные сигналы в область слабого поля, значения ХС практически всех протонов в спектрах ПМР комплексов сдвинуты в слабопольную область по сравнению со свободным морином. Анализ спектров ЯМР 13 С демонстрирует, что почти каждый атом углерода в молекуле морина подвержен влиянию комплексообразования. Но поскольку при образовании комплексов с участием атомов кислорода групп 3-ОН и 4С=О ионы металлов оттягивают на себя электронную плотность и приводят к электронодефицитному состоянию атомы углерода С-3 и С-4, то максимальное влияние от процесса комплексообразования, как и изменение ХС сигнала в спектрах обоих комплексов, приходится именно на атом углерода С-3 (на 4,6 и 2,8 м.д. в слабое поле для магниевого и кальциевого комплексов, соответственно). Отсутствие заметного изменения значений ХС в сигналах С-4 и С-5 для магниевого комплекса указывает на их участие во внутримолекулярном связывании С5-ОН ∙ ∙ ∙ О=С4 [47]. Таким образом, ЯМР-спектроскопия является надежным и информативным методом для установления структур комплексных соединений флавоноидов. Исследование спектров сводится либо к анализу сигналов протонов только гидроксильных групп (иногда не всех), либо к анализу сигналов всех протонов, присутствующих в молекулах свободных флавоноидов. При ЯМР-титровании анализируются только величины химических сдвигов протонов, находящихся при атомах углерода, но не протонов гидроксильных групп. При этом в спектрах 44 оценивают изменения величин химических сдвигов протонов, связанных с атомами углерода, соседних с предполагаемыми сайтами связывания. В некоторых случаях анализ протонных спектров подкрепляется исследованием спектров ЯМР 13 С. Отсутствие сигнала протона при определенной гидроксильной группе свидетельствует о замещении этого протона ионом металла и участии кислорода этой гидроксогруппы в комплексообразовании. При этом ХС остальных протонов часто претерпевают изменения, которые зависят как от природы металла, так и от природы флавоноида и могут быть как незначительными (0,01-0,2 м.д.), так и более выраженными (> 1,0 м.д.). Максимальные изменения химических сдвигов сигналов атомов углерода в спектрах 13 С происходят с атомами, наиболее близко расположенными к сайту связывания флавоноида с металлом, поскольку ионы металлов оттягивают на себя электронную плотность и приводят эти атомы углерода к электронодефицитному состоянию. 1.5.5 Использование метода масс-спектрометрии в исследовании металлокомплексов флавоноидов Масс-спектрометрия используется для установления подлинности, структур органических веществ и их количественного определения. Важной проблемой масс-спектрометрии сложных органических соединений является способ их ионизации, который должен быть высокоэффективным и не приводить к существенной фрагментации анализируемых соединений. Среди различных способов ионизации, применяемых в масс-спектрометрии, для установления структур преимущественно два: сложных органических образование ионов при соединений используют распылении раствора анализируемого соединения в электрическом поле (электроспрей) и ионизацию посредством десорбции ионов из органической матрицы импульсным лазерным излучением (MALDI), который сочетают с анализатором масс TOF [90]. Несмотря на существенные технические различия, оба эти способа заключаются в захвате 45 протона молекулой органического соединения с образованием протонированного иона. Получение информативных масс-спектров для комплексных соединений флавоноидов с металлами не всегда возможно, с одной стороны, из-за сложности подбора матрицы для MALDI-TOF анализа [91], с другой стороны, многие комплексы плохо растворимы в подходящих для анализа растворителях. При исследовании алюминиевых комплексов с различными 18 флавоноидами с помощью метода тандемной масс-спектрометрии было отмечено, что в полученных соединениях доминирует стехиометрическое соотношение Al(III):флавоноидный лиганд 1:2. Комплекс типа [Al(III)(флавоноид-H)2]+ образуется при условии, что в структуре флавоноида содержится кетогруппа и хотя бы одна соседняя гидроксильная группа (4С=О и 3-ОН или 5-ОН). Наиболее эффективно комплексообразование протекает в среде метанола. В случае проведения реакции в водной среде необходимо добавление небольшого количества слабой кислоты для образования промежуточного комплекса, который облегчает последующее связывание алюминия с флавоноидом. В противном случае комплексообразование затруднено, поскольку вода усиливает диссоциацию комплекса [52]. С помощью метода электроспрей масс-спектрометрии изучали процесс образования железных и медных комплексов, содержащих флавоноиды различных классов: флавоны мирицетин, кверцетин, лютеолин и кемпферол, флаванон нарингенин и флаванол катехин. Исследовались комплексы со стехиометрическими соотношениями металл : флавоноидный лиганд, равными 1:1, 1:2, 1:3, 2:2 и 2:3, среди которых наиболее предпочтительным оказалось соотношение 1:2. Для флавонов и флаванона наиболее вероятным местом хелатирования иона металла с флавоноидом было установлено положение 4С=О и 5-ОН [60]. Процесс образования комплексных соединений металлов с флавоноидами и тройных комплексов с использованием вспомогательного лиганда исследовали методом электроспрей ионизационной масс-спектрометрии. Максимальное увеличение сигнала происходило после добавления к растворам комплексов 46 флавоноидов вспомогательного лиганда 2,2'-бипиридина (bpy). Среди тройных комплексов, образованных двухвалентными переходными металлами Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ и Fe2+, ионы Cu2+ образовывали комплексы [Cu(II)(флавоноидH)]+ и [Cu(II)(флавоноид-H)bpy]+ с наиболее интенсивными сигналами, возможно, благодаря формированию этим ионом комплексов одного типа координации. Ионы Co2+ также образовывали два комплекса, которые по интенсивности имели несколько меньшие значения. Ионы остальных металлов могли формировать комплексы нескольких типов, при этом поток ионов разделялся, и интенсивность комплексов была ниже [50]. Таким образом, метод масс-спектрометрии также является информативным для установления строения комплексных соединений металлов с флавоноидами. 1.5.6 Методы определения количества связанной воды в составе флавоноидов и комплексов на их основе Кристаллическая ячейка флавоноидов, согласно литературным данным [92], может содержать две независимые молекулы соединения, в которых фенильный заместитель по-разному ориентирован относительно плоскости бензопироновой системы: от почти параллельного расположения до почти перпендикулярного. Методом рентгеноструктурного анализа было определено наличие связанной воды в кристаллах образца дигидрокверцетина, выделенного из опилок древесины лиственницы сибирской путем водно-ацетоновой экстракции при нагревании и последующем очищении методом полупрепаративной ВЭЖХ [92]. Было показано, что кристаллы ДКВ, полученные в водно-этанольном растворе, структурируются в кристаллической ячейке, содержащей две молекулы ДКВ с пятью молекулами воды. Молекулы ДКВ в кристалле связаны друг с другом и с молекулами воды межмолекулярными водородными связями, образуя сложный структурный мотив. Однако, получение кристаллов для РСА возможно только в случае хорошей растворимости вещества в каком-либо растворителе. 47 Альтернативными методами определения содержания связанной воды в образцах являются термогравиметрический анализ (ТГ) и дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). Эти методы широко используются для анализа различных объектов и позволяют изучить характер термического разложения индивидуальных веществ. С помощью этих методов было определено наличие двух видов связанной воды в составе образцов кверцетина, ДКВ и препарата диквертина: слабо- и прочносвязанной, сорбционной и "псевдокристаллогидратной", упорядоченной, являющейся составной частью кристаллогидрата флавоноида, которые различались по температурным интервалам их удаления и по величинам энтальпии фазовых переходов [93, 94]. Поскольку существенное присутствие влияние связанной на воды различные в соединениях свойства этих оказывает веществ, термогравиметрические методы широко используются для анализа различных соединений, в частности, аминокислот, лекарственных веществ и др. [95, 96]. Методами ТГ и ДСК исследовался характер разложения медного [46], кальциевого и магниевого [47] комплексов морина, медного комплекса кверцетина [40] и ванадиловых комплексов 5-гидроксифлавона и хризина [76]. 1.6 Биологическая активность флавоноидов и их комплексов с металлами 1.6.1 Биологическая активность флавоноидов Спектр биологической активности флавоноидов очень широк и реализуется посредством различных механизмов: специфическим, обусловленным взаимодействием с активными центрами ферментов, и неспецифическим окислительно-восстановительным взаимодействием с небольшими молекулами, радикалами или ионами. Особое внимание исследователей привлекает проявление антиоксидантной и антирадикальной активностей. Способность флавоноидов взаимодействовать со свободными радикалами лежит в основе их антиоксидантного действия [97]. В 48 биологических системах реакции могут происходить как с неорганическими, так и с органическими радикалами. В зависимости от структуры флавоноида (FlOH), природы свободнорадикальной частицы (R) и условий реакции трансформация флавоноида в феноксильный радикал может проходить двумя путями, где флавоноиды могут выступать в качестве доноров протона (1) или доноров электрона (2): FlOH + R● → FlO● + RH (1) FlO - → FlO● + e- (2) Образующийся феноксильный радикал представляет собой нестабильное соединение, которое быстро трансформируется в производное исходного флавоноида или вовлекается в новый цикл окислительно-восстановительных реакций. Взаимодействие флавоноидов с супероксид анион-радикалом заключается в одноэлектронном восстановлении супероксида с последующим генерированием пероксида водорода: FlO - + O 2●- → FlO● + O22- [97] Антирадикальная активность флавоноидов зависит от их структуры [97, 98]. Предполагается, что реакции флавоноидов с супероксид анион-радикалами осуществляются за счет гидроксильных групп катехольного фрагмента в кольце В, поскольку наиболее эффективными восстановителями супероксида являются флавоноиды, содержащие в своем составе этот структурный фрагмент [97]. Наличие гидроксильной группы в положении С-3 и увеличение числа гидроксогрупп в молекуле повышает антирадикальную активность флавоноидов. Плоская конфигурация молекулы флавоноида (у флавонов и дигидрофлавонов) повышает стабильность феноксильного радикала за счет делокализации неспаренного электрона, и антирадикальные свойства усиливаются [3, 99]. Ингибирование свободнорадикального окисления может осуществляться разными путями. Флавоноид может выступать в качестве ловушки активных форм кислорода, как хелатор металлов с переменной валентностью или как агент, обрывающий цепь [11]. Например, предотвращение окислительного повреждения 49 ДНК может осуществляться прямым взаимодействием со свободными радикалами или путем связывания ионов железа [100]. В ферментативных реакциях окисления и восстановления флавоноиды выступают в качестве ловушек свободных радикалов, и в некоторых случаях они подвергаются окислению без непосредственного взаимодействия с ферментом, в ходе побочных окислительновосстановительных реакций [97]. Кверцетин, дигидрокверцетин, рутин, нарингенин тормозят образование свободных радикалов в митохондриях на всех трех стадиях апоптоза: при образовании первичных супероксидных радикалов дыхательной цепью митохондрий, при образовании радикалов липида комплексом цитохрома с с кардиолипином и при цепном окислении липидов [101]. При изучении влияния кверцетина, гесперетина и эпикатехина на интенсивность перекисного окисления лецитина в модельных системах показано как антиоксидантное, так и прооксидантное действие флавоноидов, причем направленность и эффективность действия зависит от структуры флавоноида и от его концентрации в реакционной смеси [102]. Флавоноиды могут тормозить развитие воспалительных процессов и онкологических белками, заболеваний выполняющими благодаря рецепторную способности функцию, взаимодействовать или другим с образом участвующими в передаче внутриклеточных сигналов [103]. Апигенин и кверцетин подавляют развитие меланомы и процесс метастазирования и, следовательно, могут быть использованы в комбинированной терапии при лечении меланомы [104]. Отмечены нейропротекторные свойства кверцетина, дигидрокверцетина и 3-метилпроизводного кверцетина [105]. Флавоноиды, содержащие в своем составе кетогруппу, одну или несколько гидроксильных групп, двойную связь между атомами С-2 и С-3, и не содержащие амино- и нитрогруппы, могут проявлять антимутагенную активность [106]. В литературе отражены и другие полезные свойства флавоноидов. Они защищают от возрастных расстройств зрения, уменьшают симптомы сенной лихорадки, синусита, признаки астмы, облегчают воспалительные заболевания 50 кожи, сокращают воспаления в суставах и мышцах при ревматоидном артрите, минимизируют менопаузные приливы, сокращают геморрой, уменьшают варикоз вен [15]. Отмечены антиаллергические, антиканцерогенные, противовоспалительные, противовирусные, противоопухолевые, антибиотические свойства этой группы соединений [107]. Биологическая активность веществ зависит от их способности взаимодействовать с биологическими объектами и, в частности, с клеточными фосфолипидами [108]. Структуры, полученные при взаимодействии кверцетина и юглона с клеточным фосфатидилхолином, проявляют устойчивость благодаря увеличению сопряжения. Среди флавоноидов особое место занимает дигидрокверцетин. Сочетание его высокого содержания в древесине лиственниц сибирской и Гмелина, которое позволило разработать сотрудникам лаборатории химии древесины Иркутского института Химии промышленную технологию его получения, с широким спектром биологического действия делает его востребованной биологически активной добавкой. Антиоксидантная и капилляропротекторная активность ДКВ превосходит соответствующую активность многих известных соединений. Отмечены его противовоспалительная, радиопротекторная, гиполипидемическая, диуретическая, мембранотропная активности. Гастро- и гепатопротекторная активность ДКВ была доказана при изучении влияния флавоноида на репаративные процессы в поврежденной слизистой желудка [11]. Молекула дигидрокверцетина способна перехватывать образующиеся в рибофлавинсодержащей фотосистеме анионрадикалы кислорода, действуя как СОД-миметик: FlOH + O2●- + H + → H 2O2 + FlO ● FlO● + O2●- + H + → O 2 + FlOH [3]. Разнообразная биологическая активность ДКВ предполагает создание различных лекарственных форм на его основе. Для определения совместимости флавоноида с биологическими средами было проведено изучение растворимости и устойчивости растворов ДКВ в различных медицинских средах. Показано, что 51 растворимость флавоноида в изотонических растворах «гемодез», «хлосоль», «дисоль», «реополиглюкин», «глюкоза», а также в бидистиллированной воде и в смеси спирт-вода удовлетворяет требованиям ампульной лекарственной формы фитопрепарата [57]. ДКВ проявляет клеточную активность и способен оказывать стабилизирующее действие на коллагеновый матрикс за счет образования дополнительных сшивок между молекулами коллагена, что позволяет рекомендовать его в тканеинженерных конструкциях [109, 110]. Микроэмульсия с дигидрокверцетином, разработанная для повышения биологической доступности лекарственных веществ, проявляет стабильность и обеспечивает равномерное пролонгированное высвобождение действующего вещества [111]. Получение наноматериалов, в состав которых входят биологически активные вещества, открывает новые возможности адресной доставки лекарственных препаратов. Структуры микро- и нанофибрилл, сформированные из ДКВ при быстром перемешивании насыщенного раствора, представляют собой прозрачные полые трубки с тонкими стенками, едва различимыми под микроскопом вследствие их малой электронной плотности [112]. Интерес к полученному продукту обусловлен тем, что полученные структуры образованы сравнительно небольшими молекулами природного происхождения, обладающими биологической активностью, в которые можно дополнительно включить лекарственные вещества, и благодаря антиоксидантному действию ДКВ они будут защищены. Широкий и разнообразный спектр биологической активности природного флавоноида дигидрокверцетина в сочетании с достаточно высоким его содержанием в составе доступного возобновляемого сырья позволил разработать ряд лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище на его основе [11]. 52 1.6.2 Биологическая активность комплексных соединений металлов с флавоноидами Флавоноиды способны образовывать стабильные хелатные комплексы при связывании ионов металлов с переменной валентностью. Это одна из причин, приводящая к ингибированию свободнорадикальных процессов. Благодаря этому флавоноиды могут влиять на ионный баланс в организме и окислительный статус клеток и тканей. Независимо от того, подвергается ли флавоноид окислению в результате хелатирования, молекулярная структура и биологическая активность флавоноида в составе комплекса всегда отличается от соответствующих характеристик свободного флавоноида. Медные комплексы флавоноидов являются наиболее эффективными ловушками анион-радикалов кислорода, возможно, из-за частичного высвобождения ионов меди из комплекса, поскольку ионы Cu2+ сами проявляют высокую антирадикальную активность. Железосодержащие комплексы флавоноидов также проявляют высокую антирадикальную активность, несмотря на отсутствие подобной активности у свободных ионов Fe2+ и Fe3+. Скорость окисления флавоноидов в составе этих комплексов значительно ниже, чем свободных лигандов [3]. Мориновые комплексы, содержащие ионы Ca2+, Mg2+ [47], Cu2+, Pt2+, La3+, Gd 3+ [113, 114], продемонстрированы как соединения, проявляющие более высокую антирадикальную активность по сравнению с морином. Комплексы, содержащие ионы Cu2+, Fe2+ и Fe3+, связанные с флавоноидами ДКВ, кверцетином, рутином, физетином, кемпферолом, лютеолином, также более эффективные антирадикальные агенты по сравнению со свободными флавоноидами. Кобальтовый комплекс кверцетина проявляет более выраженную антирадикальную активность по сравнению с исходным флавоноидом, а вовлечение Zr4+ в структуру флавоноида, наоборот, снижает антирадикальную активность свободного кверцетина [84]. Тот факт, что металлокомплексы флавоноидов являются более активными перехватчиками анион-радикала кислорода, чем свободные лиганды, можно 53 объяснить, предположив, что ион металла в комплексе действует как супероксиддисмутирующий каталитический центр, и в реакции с анионрадикалом кислорода он принимает и отдает электроны в соответствии с уравнением: Met(n+1)+ + O2●- → Metn+ + O2 Metn+ + O 2●- + 2H + → Met(n+1)+ + H2O2 [3]. Среди различных видов активности, проявляемых флавоноидами и комплексными соединениями с ионами металлов, наиболее широко изучается антиоксидантная активность. Алюминиевые и цинковые комплексы кверцетина, рутина, галангина и катехина проявляют более сильные антиокислительные свойства по сравнению со свободными флавоноидами [24, 115]. Вовлечение иона Fe3+ в молекулу физетина [63] и иона Cu2+ в молекулу нарингина [58] также усиливает антиоксидантные свойства исходного флавоноида. Железосодержащие комплексы на основе ряда флавоноидов (дигидрокверцетина, кверцетина, рутина, физетина и др.) со стехиометрическим ссотношением 2:1 (флавоноидный лиганд : Fe3+) проявляют более высокую антиоксидантную активность, чем аналогичные комплексы, содержащие Fe2+ [30]. Отмечено увеличение антиоксидантной активности дигидрокверцетина в присутствии аспарагинатов хрома и цинка [116]. Комплексы на основе морина, содержащие ионы Cu2+ [46, 113, 114], Sn2+ [48], Zr2+ [49], MoO42- [49], Ca2+ и Mg2+ [47], Pt2+, La3+, Gd3+ [113, 114], проявляют более высокую антиоксидантную активность по сравнению с морином [46, 48, 49]. Антиоксидантная активность рутинового комплекса, содержащего ионы Sn2+, напротив, ниже по сравнению с активностью свободного рутина [54]. Таким образом, во многих случаях комплексные соединения биогенных металлов с флавоноидами обладают усиленной антиоксидантной активностью, иногда в отсутствие подобной активности у свободных ионов. Как правило, в комплексообразовании в этих случаях принимает участие карбонильная группа. 54 Если же хелатирование происходит через катехольный фрагмент кольца В, то антиоксидантная активность комплекса снижается, что подтверждает приписывание антиоксидантных свойств флавоноида присутствию в молекуле катехольного фрагмента в кольце В. Кверцетин проявляет сильные железосвязывающие свойства, более выраженные, чем известный хелатор ионов Fe2+, феррозин, при рН 7,2 [86]. Это первый пример более сильного связывания иона Fe2+ с лигандом через атом кислорода, по сравнению со связыванием Fe2+ с лигандом через атом азота. Благодаря этому кверцетин может быть эффективным модулятором клеточного гомеостаза железа в физиологических условиях, а также подавлять реакцию Фентона как на микромолярных уровнях, так и в присутствии важных клеточных хелаторов железа. Среди других видов усиленной биологической активности комплексных соединений флавоноидов можно отметить более высокую противовоспалительную и противоопухолевую активности медного комплекса нарингина по сравнению со свободным флавоноидом [58], антибактериофаговую и слабовыраженную антимикробную активности кобальтового и циркониевого комплексов кверцетина [84]. Улучшение нервозрительного аппарата при диабетической ретинопатии происходит в присутствии ДКВ и аспарагинатов хрома и цинка [116]. Оксованадиевые комплексы хризина и 5-гидроксифлавона предложены в качестве потенциальных инсулин-миметиков [76]. Лантансодержащий комплекс кверцетина проявляет цитотоксический и генотоксический эффекты на раковые клетки шейки матки [117]. Железосодержащие комплексы полифенолов проявили более высокую активность в защите изолированных гепатоцитов крыс от травм гипоксией реоксигенации по сравнению со свободными флавоноидами [30]. Медно-рутиновый комплекс проявляет защитное действие при развитии экспериментального фиброза в опытах in vivo и выраженную противосудорожную активность при моделировании эпилепсии [3]. Исследования антибактериальной активности комплексов Mn2+, Co2+, Cd2+, Hg2+ с кверцетином показали, что по 55 сравнению с пенициллином комплексы, содержащие ионы Mn2+ и Co 2+, проявляли меньшую активность по отношению к Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae. Комплексы, содержащие ионы Cd2+ и Hg2+, проявили более высокую активность против Bacillus сereus при том, что пенициллин не проявил никакой активности [118]. Таким образом, введение в молекулы флавоноидов ионов металлов во многих случаях приводит к усилению антирадикальных, антиоксидантных и других видов активности, а также к проявлению новых видов специфической биологической активности. 1.7 Использование метода циклической вольтамперометрии в исследовании окислительно-восстановительных свойств флавоноидов и их производных Антиоксидантные свойства флавоноидов связаны с их окислительновосстановительными свойствами, которые могут быть исследованы с помощью электрохимических методов. Наиболее часто для оценки электрохимических свойств используют метод циклической вольтамперометрии, с помощью которого определяется величина окислительно-восстановительного потенциала соединения (ОВП). Склонность к окислению тем выше, чем ниже значение этой величины. На окислительно-восстановительные свойства флавоноида оказывают влияние как наличие, количество и степень ионизации гидроксильных групп, так и присутствие карбонильной группы и ненасыщенных связей [97]. С помощью этого метода изучались окислительно-восстановительные свойства рутина, 2,6дитрет-бутил-4-метилфенола [119], кверцетина [97, 119, 120, 121] и его производных в различных средах [121], дигидрокверцетина [97, 119], хризина, морина [97]. Методом циклической вольтамперометрии также оцениваются и антиоксидантные свойства производных флавоноидов [24, 48, 54, 122]. При исследовании электрохимических свойств цинковых и алюминиевых комплексов 56 кверцетина и рутина было установлено, что алюминиевые комплексы проявляют более высокую антиоксидантную активность, чем цинковые [24]. С использованием этого метода отмечено увеличение антиоксидантной активности моринового комплекса, содержащего ионы Sn2+ [48], по сравнению с активностью свободного флавоноида, и снижение антиоксидантной активности рутинового комплекса по сравнению со свободным рутином [54]. При исследовании моносукцината дигидрокверцетина методом циклической вольтамперометрии с использованием графитового электрода была отмечена более сложная природа его окислительно-восстановительных превращений по сравнению с базовым флавоноидом [122]. Заключение Таким образом, изучение литературы, посвященной флавоноидам и созданным на их основе комплексным соединениям с ионами металлов, позволяет сформулировать следующие выводы. Важное место среди биологически активных соединений природного происхождения занимают природные полифенолы. Изучены свойства широкого спектра флавоноидов с различными видами биологической активности. Успешно развиваются исследования в области комплексных соединений флавоноидов с ионами металлов. Усиленное внимание исследователей уделяется изучению состава и структур полученных комплексов, определению видов проявленной активности этих соединений. При этом наряду с широким исследованием комплексов кверцетина, морина и рутина недостаточно внимания уделено изучению дигидрокверцетином комплексных – соединений флавоноидом широкого биогенных спектра металлов с биологической активности, который является основным компонентом флавоноидной фракции древесины лиственницы сибирской, основной лесообразующей породы Сибири, и производится в промышленном масштабе. 57 Предложенный материал позволяет сделать вывод о высокой перспективности комплексных соединений природных полифенолов с ионами металлов для медицинской химии. Развитие работ по исследованию состава и структур металлокомплексов флавоноидов является актуальным и перспективным для создания новых соединений с различными видами фармакологической активности. 58 Глава 2 Синтез биологически активных комплексных соединений на основе дигидрокверцетина – продукта глубокой переработки древесины лиственницы (обсуждение результатов) Проведенный в главе 1 анализ литературных данных свидетельствует о том, что для ряда комплексных соединений ионов металлов с флавоноидами выявлена усиленная антиоксидантная активность, часто превышающая активность свободных флавоноидов. Основной задачей настоящей работы является направленный синтез комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином с сохранением конфигурации 2R3R аномерных центров и функциональных группировок, отвечающих за проявление антиоксидантной активности исходного соединения-лидера (катехольный фрагмент молекулы флавоноида), оптимизация реакций комплексообразования, установление структур комплексов и характеристика их свойств. Работа выполнялась по следующим направлениям: 1. Синтез комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с (+)дигидрокверцетином с использованием различных водорастворимых солей в водных, спиртовых и водно-спиртовых растворах. 2. Оптимизация реакции комплексообразования; анализ влияния параметров реакции на выход продуктов и содержание иона металла в составе комплексных соединений. 3. Изучение кинетики реакции комплексообразования. 4. Установление структур комплексов по данным термогравиметрического и элементного анализов, рентгеноспектрального энергодисперсионного микроанализа, масс-спектрометрии, спектроскопии ИК, ЯМР 1Н и 13 С, ЭПР. 5. Изучение электрохимического циклической вольтамперометрии. поведения комплексов методом 59 6. Оценка антиоксидантной активности полученных соединений в экспериментах in vitro. 7. Оценка перспективности использования цинкового комплекса дигидрокверцетина в качестве фармацевтической субстанции для лечения ожоговых ран. 8. Рарзаботка лабораторных регламентов получения комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином 2.1 Способы выделения дигидрокверцетина из древесины лиственницы Извлечение экстрактивных веществ из древесины лиственницы производят с использованием органических растворителей или смесей органических растворителей с водой, из которых чаще всего используются системы метанол (этанол) – вода или ацетон – вода. Использование водно-ацетоновой смеси для выделения ДКВ защищено патентами [123-125]. Предложено получение диквертина, содержащего 90-92 % ДКВ, экстракцией опилок древесины лиственницы водно-ацетоновым экстрагентом в кислой среде непосредственно после обработки сырья кипящей водой с последующей кристаллизацией целевого продукта из спирта или водноспиртового раствора [123]. Для упрощения, сокращения времени процесса выделения ДКВ и повышения выхода целевого продукта с сохранением высокой степени его чистоты опилки древесины лиственницы, предварительно увлажненные горячей водой до влажности 60-70 %, экстрагировали ацетоном при нагревании с последующим упариванием экстракта и кристаллизацией из водносолевого или водно-спиртового раствора [124]. Существует способ выделения нативных биофлавоноидов – дигидрокверцетина и дигидрокемпферола, включающий абсорбцию полученного из спиртоэфирной фазы сухого экстракта флавоноидов водноацетоновым растворителем. После вакуумной разгонки раствора биофлавоноиды перекристаллизовывают из воды [125]. Данный способ переработки древесины лиственницы предполагает двухстадийную экстракцию из 60 деструктурированной древесины в условиях нахождения компонентов в псевдоожиженном состоянии. В качестве растворителей используют эмульсии: на первой стадии - неполярного углеводорода алифатического ряда в воде, а на второй – низкокипящего эфира и водного этилового спирта в воде. Ранее был предложен способ выделения ДКВ экстракцией древесины лиственницы водой с последующим отделением экстракта от полисахаридной части на колонке с полиамдным сорбентом, элюированием с полиамида водно-ацетоновой смесью в соотношении 3:7 и упариванием водно-ацетонового экстракта [11]. На основе использования в качестве экстрагента этилацетата разработаны три способа выделения ДКВ, в одном из которых охлажденный экстракт, полученный экстракцией опилок древесины лиственницы водой при нагревании, смешивают с полиамидным порошком, целевой продукт экстрагируют этилацетатом и кристаллизуют из горячей воды [126]. Два другие способа получения ДКВ не предполагают использование полиамидного сорбента. В одном из них экстракцию измельченной древесины лиственницы этилацетатом проводят при температуре кипения этилацетата, затем экстракт фильтруют и упаривают до получения сухого остатка, который затем смешивают с бензином или гексаном с последующей отгонкой растворителя [127]. Другой способ разработан для упрощения процесса выделения ДКВ и снижения расхода органических растворителей и энергетических затрат, в котором древесина перед экстрагированием этилацетатом предварительно пропитывается водой. После обработки упаренного экстракта гексаном (или бензином) ДКВ перекристаллизовывается из горячей воды [128]. Разработаны и другие способы получения ДКВ. Например, лиственничные опилки, полученные при измельчении отходов лесозаготовки и лесопереработки лиственницы, подвергают твердофазной механохимической обработке в присутствии сухого NaOH, после чего смесь заливают водой, фильтруют и осаждают ДКВ из водного экстракта подкислением HCl до рН 1,5-2,0 [129]. Предполагается, что данный способ позволяет повысить чистоту и выход 61 целевого продукта, но использование таких жестких условий для выделения флавоноида вряд ли сохранит его нативную структуру. Создание в лаборатории химии древесины ИрИХ СО РАН комплексной безотходной технологии переработки биомассы лиственницы устраняет недостатки предложенных способов выделения ДКВ. Благодаря полному использованию всех компонентов древесины и коры по экологически безопасным технологиям повышается степень извлечения экстрактивных веществ до 85-95 % от их содержания в древесине, уменьшаются потери растворителя (до 1 %) благодаря разработанной системе регенерации экстрагентов. При этом все выделяемые вещества благодаря сохранению нативных свойств обладают высокой биологической активностью. Одновременно с получением широкого спектра биологически активных продуктов решаются экологические проблемы утилизации отходов лесозаготовительных и деревоперерабатывающих производств [11]. 2.2 Физико-химическая характеристика и стереоизомерия дигидрокверцетина Исследования физико-химических свойств дигидрокверцетиина, выделенного из древесины лиственницы, позволили разработать и создать нормативную документацию на его стандартный образец [12, 130]. ДКВ представляет собой белый мелкокристаллический порошок, хорошо растворимый в ацетоне, метаноле, этаноле, этилацетате, очень мало растворимый в воде при 25 оС, с температурой плавления 220-222 оС, значение удельного оптического вращения плоскости поляризации [α]D20 составляет +35о [130]. УФ-спектр ДКВ характеризуется присутствием полосы поглощения с максимумом при 290±2,0 нм с плечом в области 320-327 нм. ИК-спектр ДКВ содержит полосы поглощения, соответствующие структурным фрагментам молекулы (валентные колебания: ν(ОН) 3300 – 3500 см-1; ν(С=О) 1637 – 1647 см-1; деформационные колебания: δ(С-Н) ароматического ядра 650-850 см-1) [12]. ИК-спектр твердого образца ДКВ в 62 вазелиновом масле характеризуется более высоким разрешением, чем соответствующий спектр, полученный в таблетках с КBr. В нем хорошо разрешаются полосы поглощения ν(О-Н) свободных (3550 см-1), а также связанных внутримолекулярной и межмолекулярной водородной связью (3406 см-1 и широкая полоса с максимумом при 3250 см-1, соответственно). Валентные колебания ν(С-Н) в ароматическом кольце при 3080 см-1 и валентные колебания ароматического кольца при 1615 и 1588 см-1 также хорошо проявляются. На участие карбонильной группы в водородной связи указывает положение интенсивной полосы ν(С=О) (1644 см-1) [130]. Спектры 1Н и 13 С ЯМР ДКВ в ДМСО-D 6 в области 0,5-12 м.д. для протонного спектра и в области 70-200 м.д. для углеродного спектра содержат сигналы, представленные в [130]. Поскольку ДКВ является представителем флаванонолов, его молекула содержит два асимметрических атома углерода (С-2 и С-3) в дигидро-γпироновом фрагменте (цикл С), и возможно существование ДКВ в виде четырех энантиомеров (двух пар диастереоизомеров) (рис. 2.1). OH HO O OH OH HO O OH OH OH OH O OH транс-(2R3R)- O транс-(2S3S)OH HO O OH OH HO O OH OH OH OH O OH цис-(2R3S)- O цис-(2S3R)- Рисунок 2.1 – Энантиомеры дигидрокверцетина Для установления абсолютной структуры кристаллических веществ используют разные методы. Определение стереоизомерии ДКВ проводят с 63 помощью спектроскопии ЯМР 1Н, РСА и определения удельного оптического вращения [131]. По величине константы спин-спинового взаимодействия (КССВ) протонов при С-2 и С-3 (11,5 Гц) определено их trans-расположение, которое характеризует энантиомеры 2R,3R и 2S,3S. С помощью метода РСА была доказана 2R3R-конфигурация молекул. Контроль состава разных образцов природного ДКВ осуществляется обычно хроматографическими методами. Например, предложено разделение энантиомеров ДКВ методом обращеннофазовой ВЭЖХ в условиях динамической хиральной модификации с использованием β-циклодекстрина [132]. Существование гидратов ДКВ приводит к аномалиям в значениях температур плавления, удельного оптического вращения плоскости поляризации и других физико-химических характеристик. Рассмотрение стереоизомерного состава и физико-химических свойств ДКВ позволило объяснить ряд противоречий в литературных значениях констант этого соединения [132, 133]. 2.3 Оптимизация реакций комплексообразования дигидрокверцетина с ионами цинка, меди (II) и кальция Являясь классическими комплексообразователями, ионы цинка и меди широко используются в координационной химии в дизайне новых соединений с различными органическими лигандами. Получение комплексных соединений с флавоноидами на основе кальция также возможно, несмотря на то, что его атом относится к семейству s-элементов. Например, в комплексе с морином [47] Са2+ выступает в качестве комплексообразователя, образуя связь с участием карбонильной группы флавоноида. Получение комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином приводилось ранее в [26, 41, 57], но данные о его строении носят лишь предварительный характер, а сведения о его свойствах отсутствуют. Кроме того, эти реакции проводились в области низких концентраций. Таким образом, основная задача исследования комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином заключается в оптимизации реакций, 64 установлении строения, наработке соединений в достаточных количествах для проведения экспериментов по определению их электрохимического поведения, антиоксидантной и биологической активностей. Все выбранные металлы являются биогенными и перспективными для создания комплексов с усиленной биологической, в том числе и антиоксидантной, активностью. Для синтеза комплексов на основе ДКВ в качестве исходных реагентов использовали водорастворимые соли цинка, меди (II) и кальция и транс-(+)-2R3R дигидрокверцетин, полученный по технологии [128], который очищали перекристаллизацией из горячей воды, высушивали в сушильном шкафу при 50 оС до влажности не более 7 %, а затем при 105 оС до постоянной массы. Его индивидуальность подтверждали соответствием т. пл. 228 оС, а также данными ВЭЖХ. В УФ-спектре ДКВ содержится полоса поглощения с минимумом при 247 нм, максимумом при 292 нм с плечом в области 320-327 нм. По данным ТГ дигидрокверцетин представляет собой гидрат с количественным соотношением, равным 1 моль воды на 2 моль ДКВ. 2.3.1 Синтез и оптимизация реакции комплексообразования цинка с дигидрокверцетином Вследствие диссоциативного характера механизма образования комплексных соединений металлов с флавоноидами [8] целесообразно проводить реакции в полярных растворителях. С точки зрения перспективы разработки фармакологических субстанций на основе производных ДКВ для производства медицинских и пищевых продуктов, применение экологически безопасных процессов и растворителей, отсутствие токсичных и легко воспламеняющихся органических растворителей соответствует требованиям, предъявляемым к безопасности продукции. Поэтому предпочтительным является проведение реакций получения КС на основе ДКВ в водных, спиртовых и водно-спиртовых растворах. Реакции взаимодействия солей цинка с ДКВ, проведенные в водноспиртовых растворах при 25 оС, показали низкие выходы целевого продукта (не 65 более 20 %) по сравнению с выходами, полученными в водной среде. Таким образом, изучение взаимодействия ZnCl2, ZnSO4∙7Н2О и Zn(CH 3COO)2∙2Н 2О с о ДКВ проводили в водных растворах при 80 С для обеспечения полного растворения ДКВ в воде и проведения реакции в гомогенной фазе. Получены образцы цинкового комплекса ДКВ 1-15 (схема 1). Цинковые соли ZnCl2 и ZnSO 4∙7Н2О содержат в качестве анионов остатки сильных кислот. рН растворов ДКВ в присутствии этих солей составляло 3,0-3,5, и комплексообразование начиналось только после доведения рН до 5 (образцы 14). Реакция ДКВ с Zn(CH3COO)2∙2Н2О начиналась сразу после смешивания реагентов (рН реакционного раствора составлял 5,1). Диссоциация флавонолов на примере кверцетина [28] характеризуется равновесием, сдвиг которого зависит от рН среды. Проведение реакции в сильнокислых растворах неэффективно, поскольку флавоноид находится преимущественно в протонированной форме (II), которая не склонна к комплексообразованию. OH OH OH OH + HO H+ O HO O OH OH OH OH O δI OH II При увеличении рН раствора происходит образование формы I флавоноида, проявляющей электронодонорные свойства, и, следовательно, способной взаимодействовать с ионами металлов, образуя комплексы. Для дигидрокверцетина минимальное значение рКа, обусловленное присутствием в молекуле флавоноида фенольной гидроксильной группы в положении 7, составляет 7,3±0,1, и при рН≈рКа в растворе присутствуют одновременно диссоциированная и недиссоциированная формы флавоноида [131]. 66 +ZnCl2; Zn2+:ДКВ=1:1 (1) +ZnCl2; Zn2+:ДКВ=1:2 (2) +ZnSO4·7H2O; Zn2+:ДКВ=1:1 OH (3) HO O +ZnSO4·7H2O; Zn2+:ДКВ=1:2 OH (4) о OH OH O Н2О, 80 С +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; +буфер рН 4,01; Zn2+:ДКВ=1,5:1 (5) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; рН 5,11; Zn2+:ДКВ=1:1; С(ДКВ) 0,066 М (6) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; +буфер рН 7,5; Zn2+:ДКВ=1,5:1 (7) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; +буфер рН 9,18; Zn2+:ДКВ=1,5:1 (8) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; рН 5,11; Zn2+:ДКВ=1:1; С(ДКВ) 0,0066 М (9) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; рН 5,11; Zn2+:ДКВ=1:1; С(ДКВ) 0,033 М (10) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; рН 5,11; Zn2+:ДКВ=1:1; С(ДКВ) 0,11 М (11) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; Zn2+:ДКВ=1:2 (12) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; Zn2+:ДКВ=1:1 (13) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; Zn2+:ДКВ=2:1 (14) +Zn(CH3COO)2∙2Н2О; Zn2+:ДКВ=3:1 (15) Схема 1 – Условия синтеза образцов комплексного соединения цинка с (+)-дигидрокверцетином 67 Создание кислотности среды с рН 3,0-3,5 приводит к подавлению диссоциации фенольных гидроксильных групп [130]. Увеличение рН раствора предполагает усиление диссоциации фенольной гидроксильной группы флавоноида в положении 7 и возможность последующей диссоциации 4'-ОНгруппы. Для изучения влияния кислотности среды на образование комплексов используют различные буферные системы [33, 43]. Реакцию Zn(CH 3COO)2∙2Н2О с ДКВ проводили с использованием буферных растворов (рН 4,01, 7,50, 9,18) (табл. 2.1). Таблица 2.1 - Зависимость выхода цинкового комплекса дигидрокверцетина от рН раствора Образец 5 6 7 8 С рН раствора 4,01 5,1 7,5 9,18 наибольшим Выход продукта, % 24,7 54,8 43,9 34,8 выходом получен Содержание Zn2+ в комплексе, % 8,5 7,8 10,8 11,4 комплекс, синтезированный без использования буферных систем, при рН 5,1. Снижение выхода продукта с увеличением рН можно объяснить гидролизом цинковой соли при рН, близкой к 8 (ПР (Zn(OH)2) 3,0∙10-13 и 1,2∙10-17), и других побочных процессов. Выбор ацетата цинка для дальнейшей оптимизации реакции образования комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином по выходу был обусловлен наиболее благоприятной величиной рН реакционного раствора, не требующей ее корректировки и тем самым исключающей протекание возможных побочных процессов. Далее для оптимизации этой реакции варьировали концентрации исходных веществ, их мольное соотношение, продолжительность реакции [134, 135]. Поскольку дигидрокверцетин является дорогостоящим продуктом, важно было подобрать диапазон концентраций, обеспечивающий наиболее полную его конверсию. Для обеспечения полноты расходования ДКВ был выбран интервал концентраций Zn2+ и ДКВ, представленный в табл. 2.2, где демонстрируется влияние концентраций исходных веществ на выход продукта. Исходное соотношение Zn2+:ДКВ составляло 1,5:1 моль. 68 Таблица 2.2 - Зависимость выхода цинкового комплекса дигидрокверцетина от концентраций исходных веществ в растворе 9 10 6 11 С (Zn2+)х102, моль/л 1,0 5,0 10,0 16,5 Выход комплексного Образец концентраций исходных С (ДКВ) х10 2, Выход Содержание Zn2+ в моль/л продукта, % комплексе, % 0,67 11,7 9,4 3,33 32,8 10,3 6,67 54,8 7,8 11,0 57,4 8,9 соединения веществ в цинка с ДКВ исследуемом при увеличении диапазоне стабильно увеличивается, при этом содержание Zn2+ в составе комплекса не претерпевает значительных изменений. Формирование стабильных металлокомплексов флавоноидов происходит в широком интервале исходных мольных соотношений иона металла и флавоноида. Как правило, варьирование этих соотношений не влияет на стехиометрический состав комплекса и положение связывания иона металла с флавоноидным лигандом. Для изучения влияния этого параметра реакции на выход цинкового комплекса ДКВ были использованы мольные соотношения исходных веществ, представленные в табл. 2.3. Таблица 2.3 - Зависимость выхода цинкового комплекса дигидрокверцетина от соотношения исходных реагентов Образец 12 13 14 15 Исходное соотношение Zn2+:ДКВ, моль 1:2 1:1 2:1 3:1 Выход продукта, % Содержание Zn2+ в комплексе, % 59,6 60,3 72,1 68,2 10,2 9,4 10,0 10,7 При увеличении доли ионов металла в составе исходных реагентов выход комплекса увеличивается и достигает максимума (72,1 %) при двукратном мольном избытке ионов цинка по сравнению с ДКВ. Дальнейшее увеличение доли ионов металла в составе реакционной смеси нецелесообразно. Независимо от используемого исходного мольного соотношения Zn2+:ДКВ (от 1:2 до 3:1), содержание Zn2+ в составе комплекса соответствует расчетной 69 структуре комплексного соединения, в котором комплексообразователь связан с двумя флавоноидными лигандами, что предполагает усиление антиоксидантных свойств полученного соединения по сравнению с исходным флавоноидом. Важным параметром реакции является ее продолжительность, поскольку она определяет экономические затраты процесса получения продукта. Большинство реакций образования металлокомплексов флавоноидов относятся к быстрым реакциям недостаточно. [6], однако Исследованию механизмы кинетики подобных образования реакций изучены металлокомплексов флавоноидов посвящено очень немного работ с ограниченным числом природных флавоноидов, таких как кверцетин, морин [6, 8-10]. Для определения стабильности стехиометрии цинкового комплекса дигидрокверцетина в ходе реакции был проведен мониторинг изменения содержания Zn2+ и ДКВ в реакционном растворе в течение 2 ч. Исходное мольное соотношение Zn2+:ДКВ составляло 1,5:1 моль; рН реакционного раствора 5,1. По разнице концентраций каждого реагента в исходном растворе и в определяемый момент времени были рассчитаны содержания компонентов в составе комплекса во времени. На рис. 2.2 представлен график изменения содержания компонентов в составе комплекса во времени, который состоит из двух частей («а» и «б»). 1 а - в течение первых 15 мин, б - в течение 2 ч; 1 – ДКВ -, 2 – Zn2+ Рисунок 2.2 - Изменение содержания компонентов в составе цинкового комплекса дигидрокверцетина во времени 70 Как видно из рис. 2.2а, в условиях данного эксперимента установление стехиометрического соотношения Zn2+:ДКВ- 1:2 в составе комплекса происходит в первую минуту реакции. Увеличение продолжительности реакции до двух часов не оказывает значительного влияния на это соотношение (рис. 2.2б). Скорость реакций образования металлокомплексов флавоноидов соответствует скорости обмена молекул воды в аква-ионах металлов [8]. Процесс образования цинкового комплекса дигидрокверцетина в водной среде протекает в несколько стадий. Учитывая образование комплекса со стехиометрическим соотношением Zn2+:ДКВ- 1:2, можно предположить протекание следующих основных реакций: K Zn(СН3СОО)2∙2H2O+2Н2О → 2CH 3COO-+[Zn(H2O)4] 2+, 1 K [Zn(H2O)4]2+ → [Zn(H2O)4-n]2++nH2O, где n<4, 2 K ДКВ → ДКВ-+Н +, 3 K [Zn(H2O)2]2+ +2ДКВ- → [Zn(ДКВ)2(H2O)2]. 4 Скорость образования полученного комплекса, рассчитанная по формуле υ = ΔС/Δt = (С0 - Сi)/(ti - t0), соответствует скорости выхода молекул воды во внешнюю координационную сферу в аква-ионах цинка [Zn(H2O)n]2+, поскольку лимитирующей стадией комплексообразования является стадия обмена воды [8]. Зависимость скорости реакции от продолжительности синтеза представлена на рис. 2.3. Скорость реакции ·104, моль/л∙с 15 10 5 0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Продолжительность реакции, мин Рисунок 2.3 - Изменение скорости реакции образования цинкового комплекса дигидрокверцетина во времени 71 Характер кривой, показывающий резкое уменьшение скорости реакции после первой минуты синтеза и практически постоянную скорость реакции после пятнадцатой минуты до конца эксперимента (2 ч), подтверждает, что основная масса продукта реакции образуется в первую минуту синтеза, и изучаемый процесс можно отнести к быстрым реакциям. В результате оптимизации реакции образования цинкового комплекса дигидрокверцетина, а также в результате изучения кинетики этой реакции установлены следующие закономерности. Комплексообразование в случаях использования цинковых солей, содержащих в качестве анионов остатки сильных кислот (ZnCl2 и ZnSO 4∙7Н2О), начинается после доведения рН до 5. Реакция ДКВ с Zn(CH3COO)2∙2Н2О начинается сразу после смешивания растворов реагентов, и в водном растворе в первую минуту реакции образуется комплекс, в котором ион цинка связывает два флавоноидных лиганда, что предполагает усиление антиоксидантных свойств полученного соединения по сравнению с исходным флавоноидом. Максимальный выход комплекса 72,1 % наблюдается при проведении реакции в водной среде с исходным мольным соотношением Zn2+:ДКВ 2:1, рН 5,1. 2.3.2 Изучение реакции образования комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином Ранее реакцию образования комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином изучали в области низких концентраций ДКВ (3х10-3 - 10-5 М), обусловленных пределом насыщения флавоноида в водной среде в температурных условиях, при которых были получены основные данные (309 К), что не предполагало получение продукта с высоким выходом [26]. Анализ комплекса ограничивался интерпретацией полос поглощения, относящихся к асимметричному и симметричному валентным колебаниям карбоксилат-иона в ИК-спектре, и данных УФ-спектроскопии водных растворов, содержащих ДКВ и Cu2+. В нашем исследовании мы использовали более высокие концентрации ДКВ 72 (6х10 -2 – 10 -1 М) и более высокую температуру реакционной смеси (343-353 К) для увеличения растворимости ДКВ в водном растворе и более полной его конверсии, что предполагало более высокий выход целевого продукта для дальнейшего изучения его свойств. Кроме того, реакцию проводили как в водных, так и в водно-спиртовых растворах. Анализ продукта реакции был подкреплен данными спектроскопии ИК и ЭПР. Реакцию образования комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином проводили с использованием водорастворимых солей CuSO 4 и Cu(CH 3COO)2. Выбор в качестве источника меди (II) для комплексообразования с ДКВ был сделан в пользу последней соли, т.к. в первом случае образование продукта начиналось только после доведения рН до 5, а во втором случае этого не требовалось. Оптимизацию реакции образования комплексного соединения меди (II) с ДКВ по выходу продукта изучали при варьировании исходных мольных соотношений Cu2+:ДКВ 1:1 и 2:1 в водных и водно-спиртовых растворах. Оценивали влияние рН раствора на выход комплекса. Получены образцы комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином 16-27 (схема 2). В табл. 2.4 представлены результаты оценки влияния мольного соотношения Cu2+:ДКВ и используемого растворителя на выход комплекса в образцах 16-21. Таблица 2.4 - Зависимость выхода комплексного соединения от мольных соотношений Сu2+:ДКВ и растворителя Образец 16 17 18 19 20 21 Исходное соотношение Cu2+:ДКВ, моль 1:1 2:1 2:1 1:1 2:1 1:1 Растворитель (Этанол/вода, об. %) 0 0 50 50 70 70 Выход Темпера продукта, тура, оС % 80 71,8 80 77,1 25 79,5 25 71,4 25 86,3 25 73,5 Содержание Сu2+ в комплексе, % 12,4 17,1 17,1 12,5 19,1 14,5 73 +Cu(CH3COO)2; вода; Cu2+:ДКВ=1:1, 80 оС (16) +Cu(CH3COO)2; вода; Cu2+:ДКВ=2:1, 80 оС (17, 27) OH HO O O (18) OH OH OH +Cu(CH3COO)2·Н2О; этанол/вода (1:1); Cu 2+:ДКВ=2:1, 25 оС +Cu(CH3COO)2·Н2О; этанол/вода (1:1); Cu 2+:ДКВ=1:1, 25 оС (19) +Cu(CH3COO)2·Н2О; этанол/вода (7:3); Cu 2+:ДКВ=2:1, 25 оС (20) +Cu(CH3COO)2·Н2О; этанол/вода (7:3); Cu2+:ДКВ=1:1, 25 оС (21) +Cu(CH3COO)2; вода; Cu 2+:ДКВ=2:1, 70 оС, рН 4,3 +Cu(CH3COO)2; вода; Cu 2+:ДКВ=2:1, 70 оС, рН 5,0 +Cu(CH3COO)2; вода; Cu 2+:ДКВ=2:1, 70 оС, рН 6,0 +Cu(CH3COO)2; вода; Cu 2+:ДКВ=2:1, 70 оС, рН 7,2 +Cu(CH3COO)2; вода; Cu 2+:ДКВ=2:1, 70 оС, рН 8,0 (22) (23) (24) (25) (26) Схема 2 – Условия синтеза образцов комплексного соединения меди (II) с (+)-дигидрокверцетином В условиях эквимольного соотношения исходных реагентов в водной среде при 80 оС реакция начинается моментально с образованием объемной массы продукта с хорошим выходом (71,8 %). Увеличение доли ионов меди (II) в реакционном растворе позволяет увеличить выход продукта до 77,1 %. Увеличение доли этанола в составе растворителя при соотношении исходных реагентов 1:1 не влияет на выход комплекса, а в условиях двукратного избытка ионов Cu2+ увеличение этанола в составе растворителя до 70 % повышает выход 74 продукта до 86,3 %. Реакцию в водно-спиртовых растворах благодаря хорошей растворимости ДКВ проводили при 25 оС. Таким образом, использование двукратного мольного избытка ионов Cu2+ увеличивает выход комплекса на 7,4-17,4 % по сравнению с выходом продукта при эквимольных концентрациях реагентов как в водной, так и в водно-спиртовой средах. В водно-спиртовой среде выход комплекса повышается с увеличением доли этанола в составе реакционной среды при проведении реакции в условиях избытка ионов Cu2+. Содержание ионов меди (II) во всех образцах характеризует комплекс, в составе которого комплексообразователь связан с флавоноидным лигандом в отношении, близком к 1:1. Результаты оценки влияния рН раствора на выход комплексного соединения меди (II) с ДКВ представлены в табл. 2.5. Реакцию проводили при 70 оС, исходное соотношение Cu2+:ДКВ составляло 2:1. Таблица 2.5 - Зависимость выхода комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином от рН раствора Образец 22 23 24 25 26 рН раствора Выход продукта, % 4,3 66,5 5,0 88,9 6,0 89,4 7,2 86,8 8,0 86,2 Содержание Сu2+ в комплексе, % 11,5 17,9 17,1 17,0 16,9 Максимальный выход комплекса 88,9-89,4 % наблюдается в диапазоне значений рН 5-6. Незначительное снижение выхода продукта на 2-3 % при увеличении рН раствора до 7-8 можно объяснить гидролизом ацетата меди (II) (ПР (Cu(OH)2) 2,2∙10-13 и 2,2∙10-20). В более кислой среде (рН 4,3) накопление в растворе протонированной формы флавоноида приводит к уменьшению выхода комплекса. Для определения стабильности соотношения Met:L в составе комплекса, где Met – ион металла, L – депротонированный ДКВ, был проведен мониторинг изменения содержания Cu2+ и ДКВ в реакционном растворе. Реакцию проводили в водной среде при нагревании до 80 оС в течение 1 ч (образец 27). Для уменьшения 75 потерь ДКВ использовали двукратный избыток ионов Cu2+ в исходном растворе. Результаты исследования представлены на рис. 2.4. Рисунок 2.4 - Изменение содержания ионов меди (II) (кривая 1) и ДКВ (кривая 2) в растворе в ходе реакции образования комплекса Представленные кривые носят согласованный характер, что предполагает образование соединения, в котором ион металла связан с флавоноидным лигандом в определенном стехиометрическом соотношении. Для определения этого соотношения по полученным данным были рассчитаны количества компонентов в составе комплекса в каждый момент времени (табл. 2.6) [135-137]. Таблица 2.6 - Рассчитанные количества Cu2+ и (ДКВ-Н+)- (х10-3моль) в составе комплексного соединения 22 Время, мин 1 5 10 15 30 45 60 Cu2+, моль 2,7 5,2 6,2 6,8 7,6 8,2 8,6 ДКВ-Н +, моль 6,1 6,8 7,2 7,4 7,7 7,9 8,0 Начиная первой минуты, реакция протекает по пути образования соединения с соотношением Met:L 1:2. Далее, к пятой минуте синтеза, это соотношение меняется до 1:1,3 и далее до конца эксперимента (60 мин) не претерпевает значительных изменений и устанавливается близким к соотношению 1:1. Такое протекание реакции возможно при условии, что 76 комплекс со стехиометрическим соотношением Cu2+:ДКВ-Н +, равным 1:1, является более устойчивым в рассматриваемых условиях эксперимента, чем соединение, образующееся на первой минуте реакции. Выход полученного комплекса составил 80,9 %, из которых 82,2 % соединения образовалось в течение первых 15 мин реакции. Поскольку реакция проводилась в водной среде, и в качестве источника ионов меди (II) использовалась соль, образованная слабым основанием и слабой кислотой, можно предположить протекание частичного гидролиза: Cu(CH 3COO)2 + HOH ↔ (CuOH)CH3COO + CH3COOH и включение молекул воды во внутреннюю сферу комплекса: (CuOH)CH 3COO + С15Н12О 7 + Н2О → [Cu(С15Н 12О7)(OH)(H2O)]. Ранее было отмечено, что реакции образования комплексных соединений металлов с флавоноидами относятся к быстрым реакциям [6] и часто протекают спонтанно при комнатной температуре [15]. На рис. 2.5 представлен график изменения скорости реакции образования медного комплекса ДКВ 27 во времени Скорость реакции ∙ 104 моль/л∙с в водной среде. 8 6 4 2 0 0 15 30 45 60 75 Продолжительность реакции, мин Рисунок 2.5 - Изменение скорости реакции образования комплекса меди (II) с дигидрокверцетином во времени Характер кривой показывает, что процесс образования медного комплекса также можно отнести к быстрым реакциям. Резкое снижение скорости реакции с первой минуты и практически постоянная минимальная скорость реакции после 77 пятнадцатой минуты синтеза подтверждает образование основной массы продукта в течение первых 15-ти мин эксперимента. В ходе эксперимента проводилось наблюдение за изменением рН реакционного раствора, которое представлено на рис. 2.6. 4,9 4,8 4,7 pH 4,6 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 0 15 30 45 60 75 Продолжительность реакции, мин Рисунок 2.6 - Зависимость pH реакционного раствора от продолжительности реакции Снижение рН в процессе комплексообразования связано с накоплением протонов в растворе при расходовании ДКВ, который вступает в реакцию в депротонированной форме. Как видно из рис. 2.6, наиболее резкое изменение рН наблюдается в первые 5 мин реакции, когда устанавливается стехиометрический состав комплекса. Таким образом, при взаимодействии ацетата меди (II) с ДКВ в водных и водно-спиртовых растворах при соотношении реагентов 1:1 и 2:1 (моль) получены образцы комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином 16– 27. В результате изучения кинетики этой реакции установлено, что в водном растворе стехиометрическое соотношение Сu2+:ДКВ в составе комплекса 1:1 устанавливается после пятой минуты синтеза и в течение 1 ч не претерпевает значительных изменений. В результате оптимизации реакции показано, что максимальный выход комплекса 89 % наблюдается в условиях двукратного избытка ионов Сu2+ при нагревании водного раствора до 70 оС, рН 5-6. 78 2.3.3 Синтез и оптимизация реакции получения комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином Изучение реакции образования комплексного соединения кальция с (+)дигидрокверцетином проводили с использованием солей Ca(CH 3COO)2∙Н2О, Ca(NO 3)2∙4Н2О, CaCl2 и растворителей воды, этанола и их смеси при варьировании начальных концентраций исходных реагентов, их мольных соотношений, продолжительности реакции. Выбор солей в качестве источника комплексообразователя был обусловлен как их хорошей растворимостью в используемых средах, так и отсутствием влияния этих солей на окислительновосстановительные, рацемические и другие изменения молекулы флавоноида, что предполагало сохранение 2R3R конфигурации и, соответственно, биологической активности ДКВ. Получены образцы 28-38 (схема 3). Описанное в литературе кальциевое производное дигидрокверцетина с содержанием металла 12 %, полученное с использованием Са(ОН)2∙8Н2О, запатентовано как вещество, обладающее противогриппозной активностью [138]. Однако, нет данных по оптимизации реакции и доказательств структуры полученного соединения. Подбор оптимальных условий синтеза кальциевого комплекса ДКВ для получения продукта с постоянным содержанием иона металла позволит разработать субстанции. технологию получения фармакологически активной 79 +CaCl2; Ca2+:ДКВ=1:1; этанол/вода (7:3) (28) +Ca(CH3COO)2∙Н2О; Ca2+:ДКВ=1:1; этанол/вода (7:3) (29) OH HO O OH OH OH O +Ca(NO3)2∙4Н2О; Ca2+:ДКВ=1:1; этанол/вода (7:3) +Ca(NO3)2∙4Н2О; Ca2+:ДКВ=1:1; этанол (30) (31) +Ca(NO3)2∙4Н2О; Ca2+:ДКВ=1:1; вода (32) +Ca(CH3COO)2∙Н2О; вода; Ca2+:ДКВ=1:1; С(ДКВ) 0,025 М (33) +Ca(CH3COO)2∙Н2О; вода; Ca2+:ДКВ=1:1; С(ДКВ) 0,050 М +Ca(CH3COO)2∙Н2О; вода; Ca2+:ДКВ=1:1; С(ДКВ) 0,100 М +Ca(CH3COO)2∙Н2О; вода; Ca2+:ДКВ=1:1; С(ДКВ) 0,200 М +Ca(CH3COO)2∙Н2О; вода; Ca2+:ДКВ=2:1 +Ca(CH3COO)2∙Н2О; вода; Ca2+:ДКВ=3:1 (34) (35) (36) (37) (38) Схема 3 - Синтез образцов комплексного соединения кальция с (+)дигидрокверцетином 80 В табл. 2.7 приведены результаты оценки влияния аниона кальциевой соли и используемого растворителя на выход комплекса в образцах 28-32. Исходное мольное соотношение Са2+:ДКВ во всех опытах составляло 1:1, начальные концентрации реагентов - 0,1 М. Таблица 2.7 - Влияние аниона кальциевой соли и используемого растворителя на выход комплекса Обр азец Кальциевая соль 28 CaCl2 29 Ca(CH3COO)2∙Н2О 30 Ca(NO3)2∙4Н 2О 31 32 Ca(NO3)2∙4Н 2О Ca(NO3)2∙4Н 2О Раствори тель Этанол (70 %) Этанол (70 %) Этанол (70 %) Этанол Вода Темпер атура, о С Содержание Са2+ в комплексе, % Выход продук Данные Данные та, % элементно РСЭДМА го анализа 25 9,7 9,2 3,5 25 9,8 10,6 13,2 25 9,3 9,7 13,3 25 80 10,7 10,8 11,0 14,2 49,4 57,7 Использование ацетата и нитрата кальция в реакции с ДКВ показывают одинаковый выход продукта, а выход комплекса при проведении реакции с хлоридом кальция существенно ниже. Для оценки влияния растворителя на выход продукта в качестве источника комплексообразователя был выбран нитрат кальция. Выбор водной среды в качестве растворителя повышает выход кальциевого комплекса более чем в 4 раза по сравнению с выходом продукта в водно-спиртовой среде и на 16,8 % по сравнению с выходом комплекса в спиртовой среде. Рассмотренные параметры реакции не оказывают значительного влияния на содержание металла в составе комплекса, который соответствует соединению со стехиометрическим соотношением Met:L 1:1. Для определения влияния начальных концентраций реагентов и их мольного соотношения на выход продукта были проведены синтезы с использованием этих параметров в диапазонах, представленных в табл. 2.8. 81 Реакцию проводили в водной среде с использованием ацетата кальция моногидрата в течение 1 ч. Таблица 2.8 - Влияние концентраций реагентов и исходных мольных соотношений Са 2+:ДКВ на выход комплекса Образец С(ДКВ), моль/л 33 34 35 36 37 38 0,025 0,050 0,100 0,200 0,100 0,100 Содержание Са2+ в Исходное комплексе, % соотношение Данные Cа2+:ДКВ, Данные элементного моль РСЭДМА анализа 1:1 10,6 9,1 1:1 10,7 12,2 1:1 10,4 11,9 1:1 9,3 11,5 2:1 11,0 11,7 3:1 10,6 11,8 Выход продукта, % 6,6 22,4 54,1 58,9 58,4 70,2 Восьмикратное увеличение концентраций исходных реагентов в интервале 0,025-0,200 моль/л при использовании их эквимольных соотношений повышает выход кальциевого комплекса в 9 раз. Повышение выхода продукта на 29,6 % наблюдается при использовании трехкратного избытка ионов Са2+ [139, 140]. Приведенные в табл. 2.8 данные демонстрируют, что варьирование изучаемых параметров реакции не оказывает значительного влияния на содержание металла в составе комплекса. Для изучения кинетики реакции образования кальциевого комплекса дигидрокверцетина в водной среде и установления стехиометрического состава полученного соединения был проведен мониторинг изменения содержания реагирующих веществ в реакционном растворе в течение 2,5 ч. Исходные реагенты, ацетат кальция моногидрат и ДКВ, были взяты в мольном отношении 2:1. На основании полученных данных по разнице концентраций каждого реагента в исходном растворе и в определяемый момент времени были рассчитаны содержания компонентов в составе комплекса в ходе реакции (рис. 2.7). Анализ содержания компонентов в составе кальциевого комплекса ДКВ в ходе реакции демонстрирует, что стехиометрическое соотношение Met:L с первой минуты устанавливается как 1:1 и в течение 2,5 ч существенно не меняется. 82 1 Содержание ДКВ- и Са2+ в КС, моль х 103 3,5 3 2,5 2 2 1,5 1 0,5 0 0 30 60 90 120 150 Продолжительность реакции, мин 1 – ДКВ -, моль х 10 3, 2 – Са 2+, моль х 10 3 Рисунок 2.7 - Изменение содержания ДКВ - и Са 2+ в составе комплекса во времени Для установления оптимального времени комплексообразования по данным кинетического исследования были рассчитаны масса и выход кальциевого комплекса в разные моменты времени реакции (рис. 2.8). Основная масса комплекса (81 %) образовалась в течение первых 60 мин реакции. Увеличение продолжительности реакции до 2,5 ч повышает выход продукта незначительно, что позволило определить оптимальное время Выход комплекса, % проведения синтеза 1 ч. 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 y = 7,0112ln(x) + 6,1553 R² = 0,9435 0 30 60 90 120 150 Продолжительность реакции, мин Рисунок 2.8 - Зависимость выхода комплексного соединения кальция с (+)дигидрокверцетином от продолжительности реакции 83 Необходимо отметить, что во всех представленных экспериментах кальциевый комплекс образовывался при условии рН≥8. Во избежание процессов рацемизации и окисления ДКВ реакции не проводили при рН выше 9. Спектральные изменения дигидрокверцетина в водных и водно-спиртовых растворах при различных значениях рН приведены на рис. 2.9. б а 1 – 5,5; 2 – 7,7; 3 – 8,5; 4 – 9,7; 5 – 10,9 в водной (а) и водно-спиртовой (70% этанол) (б) средах Рисунок 2.9 - УФ-спектры растворов ДКВ при различных значениях рН Как в водной, так и в водно-спиртовой среде при повышении рН растворов происходит батохромный сдвиг максимума поглощения ДКВ при 290±2 нм [139]. Подобные изменения в спектрах поглощения флавонов и флавонолов объясняются их диссоциацией с образованием соответствующих анионов флавонолятов [3]. Диссоциация флавоноида в водной среде наблюдается с более низких значений рН (7,7), чем в водно-спиртовой, в которой сдвиг максимума поглощения ДКВ от 290 нм до 330 нм начинается только с рН 9,7. Возможно, этим можно объяснить более высокий выход кальциевого комплекса при проведении реакции в водной среде, где количество диссоциированных флавоноидов при рН 8 значительно больше по сравнению с водно-спиртовой средой, и процесс комплексообразования протекает полнее. Таким образом, при взаимодействии кальцийсодержащих солей Ca(CH3COO)2∙Н 2О, Ca(NO 3)2∙4Н2О и CaCl2 с (+)-дигидрокверцетином в водных, водно-спиртовых и спиртовых растворах, при использовании концентраций исходных реагентов в интервале 0,025-0,200 моль/л и мольных соотношений 84 Cа2+:ДКВ от 1:1 до 3:1 получены образцы кальциевого комплекса 28–38 с содержанием металла 9,3 – 11,0 %. В результате изучения кинетики реакции установлено, что в водном растворе в первую минуту реакции образуется комплекс со стехиометрическим соотношением Met:L 1:1, которое не меняется в течение 2,5 ч. Максимальный выход комплекса 70,2 % наблюдается при проведении реакции в водном растворе при исходном мольном соотношении Са2+:ДКВ 3:1. Комплексообразование начинается после доведения рН до 8. В результате проведенных исследований реакций образования комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином можно сделать следующие выводы: - выход всех синтезированных металлокомплексов повышается при увеличении концентраций исходных реагентов (до 0,1-0,2 моль/л ДКВ) и при увеличении доли иона металла в исходных растворах; - при проведении реакции образования цинкового комплекса в водной среде максимальный выход наблюдается при рН, равном 5,1; оптимальное значение рН реакции образования КС меди (II) с ДКВ в водной среде составляет 5-6; образование кальциевого комплекса как в водной, так и в водно-спиртовой и спиртовой средах начинается только после доведения рН до значения 8,0; - состав цинкового и кальциевого комплексов не зависит от используемых концентраций исходных реагентов и их исходных молярных соотношений; при увеличении доли ионов меди в исходном растворе содержание металла в комплексе повышается на 5-7 %; - стехиометрические соотношения Met:L в составе цинкового и кальциевого комплексов ДКВ, равные 1:2 и 1:1, соответственно, устанавливаются в первую минуту реакции и остаются постоянными в ходе эксперимента (1 ч); связывание ионом цинка двух флавоноидных лигандов предполагает усиление антиоксидантных свойств полученного соединения по сравнению со свободным дигидрокверцетином; стехиометрическое соотношение Met:L в составе комплексного соединения меди (II), равное 1:1, устанавливается только после 85 пятой минуты синтеза и не претерпевает значительных изменений до конца эксперимента (2,5 ч). Полученные данные позволили оптимизировать по выходу процесс получения цинкового, медного и кальциевого комплексов дигидрокверцетина и установить их физико-химические характеристики. 2.4 Установление структур комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином 2.4.1 Характеристика комплексных соединений методом электронной микроскопии Все полученные соединения представляют собой порошки. Согласно РСЭДМА, частицы образцов комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином имеют размеры не более 6 мкм (рис. 2.10). а б в Рисунок 2.10 - Данные электронной микроскопии, полученные с помощью РСЭДМА, для образцов комплексов цинка 13 (а), меди (II) 18 (б) и кальция 37 (в) с дигидрокверцетином 2.4.2 Определение растворимости комплексных соединений Синтезированные комплексы нерастворимы в воде, метаноле, этаноле, ацетоне. Частично растворимы в диметилсульфоксиде (ДМСО). Определение растворимости комплексов в ДМСО проводили по методике [141]. 86 Как видно из данных, представленных в табл. 2.9, комплексные соединения цинка и кальция с ДКВ можно отнести к классу мало растворимых (от 100 до 1000 мл растворителя на 1 г вещества), а КС меди (II) с ДКВ – к классу очень мало растворимых соединений (от 1000 до 10000 мл растворителя на 1 г вещества) [142]. Таблица 2.9 - Определение растворимости комплексных соединений в ДМСО Условные термины Очень легко растворим Легко растворим Растворим Умеренно растворим Мало растворим Очень мало растворим Количество растворителя (мл), [ZnL2(Н2О)2], [CuLOH(H2O)], [CaL(OН)(H 2O)], необходимое М (707) М (402) М (378) для растворения 1 г вещества До 1 - - - От 1 до 10 - - - От 10 до 30 - - - От 30 до 100 - - - От 100 до 1000 + - + От 1000 до 10000 + + + Поскольку полученные комплексы практически не растворимы в органических растворителях, кроме ограниченной растворимости в ДМСО, вырастить кристаллы, удовлетворяющие требованиям РСА, не представилось возможным. Установление строения полученных соединений было проведено на основании данных комплекса различных физико-химических методов. 2.4.3 Определение количества связанной воды в составе комплексов Многие природные полифенольные соединения проявляют полиморфизм, и различные формы одного и того же вещества имеют разные физико-химические 87 константы. Это одна из причин, которая мешает однозначно установить физикохимические характеристики исследуемого соединения. Другая причина несоответствия констант - наличие в составе соединения связанной воды. Так, увеличение содержания воды в образцах дигидрокверцетина приводит к понижению температуры плавления флавоноида, что говорит о возможности существования разнообразных гидратных форм этого соединения. Образованием нестабильных гидратов объясняется несовпадение рентгенограмм разных промышленных образцов ДКВ, а также низкая воспроизводимость УФспектральных характеристик, растворимости в воде и значений оптической активности. Значения [α]D20 дигидрокверцетина в безводных органических растворителях (+17-25о) ниже, чем в растворителях, содержащих воду (+35-47о), и с разбавлением растворов увеличиваются [131]. Таким образом, наличие связанной воды в составе соединения искажает характеристики индивидуального вещества. То же касается и различия в биологической активности разных гидратных форм одного и того же соединения. Для определения количества связанной воды в полученных комплексах на основе ДКВ использовался метод термогравиметрии (рис. 2.11). Усредненные данные по результатам исследования представлены в табл. 2.10 [143, 144]. В результате расчетов установлено, что количество связанной воды, приходящееся на один моль комплексного соединения, составляет 2, 1 и 1 моль, соответственно, для КС цинка, меди (II) и кальция с ДКВ. а б 88 в г Рисунок 2.11 – Кривые ТГ и ДСК образцов ДКВ (а) и комплексных соединений ципка (б), меди (II) (в) и кальция (г) с ДКВ Таблица 2.10 - Средние значения температурных интервалов и потери массы при термогравиметрии для ДКВ и образцов комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с ДКВ Образец т.пл., оС ДКВ Пик 1 Пик 2 Δt, оС Δm, % Δt, оС Δm, % 228 80-126 2,8 - - 5-8 200±5 120-170 3,0±0,86 180-215 2,47±0,90 16-17 241±7 110-140 2,0±0,28 190-230 1,14±0,20 36-37 243±5 100-180 5,7 - - 2.4.4 DART масс-спектральная фрагментация комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином Для определения молекулярной массы комплексов использованы десорбционные методы масс-спектрометрии MALDI и DART. При анализе образцов КС цинка (5), меди (II) (17) и кальция (37) с ДКВ методом массспектрометрии MALDI, проведенном в режиме регистрации отрицательных и положительных ионов, записать масс-спектры комплексов не удалось. Массспектры образцов были получены методом масс-спектрометрии DART после подбора условий анализа в режиме регистрации отрицательных ионов (рис. 2.12). 89 а б в г Рисунок 2.12 – Масс-спектры DART ДКВ (а) и комплексных соединений цинка (б), меди (II) (в) и кальция (г) 90 Масс-спектры DART синтезированных соединений не содержат депротонированных молекулярных ионов, возможно, из-за их нестабильности даже в условиях «мягкой» ионизации DART. Действительно, получение информативных масс-спектров для комплексов металлов с флавоноидами не всегда возможно по разным причинам [91]. В спектрах КС наиболее интенсивными являются пики с m/z 303 и m/z 301, соответствующие депротонированному ДКВ (ДКВ-H)- и, по-видимому, продукту элиминирования двух атомов водорода из него (ДКВ-2Н-Н)-. Кроме того, в масс-спектрах всех КС содержатся характеристичные пики с m/z 285 и 152, соответствующие фрагментации флаванонолов: иону (ДКВ-H-Н 2О)- и иону В3+• (Схема 4) [145]. O + C + OH O OH O + H C CH B+3 R Схема 4 - Характеристичная масс-спектральная фрагментация дигидрофлавонолов [145] Таким образом, масс-спектральный анализ комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином в использованных условиях регистрации спектров не позволил напрямую установить молекулярные массы соединений, но однозначно свидетельствует о нативности структуры исходного дигидрокверцетина в качестве флавоноидного лиганда в составе КС [143]. 91 2.4.5 Определение элементного состава комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином Определение состава, брутто-формул КС и их молярных масс (М) проводили с помощью элементного анализа и подтверждали данными элементного состава с точки поверхности образца методом электронно-зондового энергодисперсионного анализа на электронном микроскопе (РСЭДМА). Для расчета использовали значения содержания элементов в образцах цинкового, медного и кальциевого комплексов ДКВ 5-15, 16-27 и 28-38, соответственно, по данным элементного анализа, и данные РСЭДМА для образцов 6, 27 и 38. Результаты представлены в табл. 2.11 [143]. Таблица 2.11 - Найденные и вычисленные значения содержания элементов для КС, их состав и молекулярная масса Элемент С Н О Zn С Н О Cu С Н О Са Содержание, % Найдено Вычислено Элементный для: РСЭДМА анализ C30H26O16Zn 48,9±2,0 49,0 50,9 3,5±0,4 3,7 40,0 36,2 9,8±0,7 9,8 9,2 C15H14O 9Cu 44,9±1,8 45,2 44,8 3,3±0,4 3,5 38,0 35,8 15,6±1,7 14,7 15,9 C15H14O 9Ca 43,6±1,6 43,1 47,6 4,0±0,3 3,7 41,4 38,1 10,3±0,4 11,8 10,6 Состав комплекса, М (г/моль) [ZnL2(Н2О)2], М (707) [CuL(OH)(H2O)], М (402) [CaL(OН)(H 2O)], М (378) Применение методов математической статистики при расчете элементов в составе комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином на основании массива данных элементного анализа позволило определить доверительный интервал значений содержания металла в 92 составе соединения (Приложение А). Статистическую обработку результатов эксперимента проводили в соответствии с требованиями статьи 14 ГФ XII. 2.4.6 ИК-спектроскопия комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином При сопоставлении ИК-спектров КС 5-38 со спектрами ДКВ отмечены изменения полос поглощения в областях 600-650, 1700-1350 см-1. В ИК-спектрах образцов КС цинка, меди (II) и кальция с ДКВ появляются новые полосы при 605616, 616-625 и 597-605 см-1, соответственно, относящиеся к валентному колебанию связи Мet-О и свидетельствующие о формировании связи иона металла с кислородным атомом гидроксильной группы флавоноидного лиганда [146]. Значения максимумов поглощений этих полос смещены на 3-21 см-1 в низкочастотную область по сравнению с ν(Мet-О) ацетатов цинка, меди (II) и кальция (622, 629 и 618 см-1, соответственно) и механических смесей ДКВ с каждой из солей в соотношениях 1:1 моль (622, 628, 617 см-1, соответственно). На образование комплексов также указывают существенные сдвиги в область низких частот (до 89 см-1) максимума полосы поглощения свободной карбонильной группы и положения полос поглощения гидроксильных групп, связанных внутримолекулярными и межмолекулярными водородными связями в области 3346-3436 см-1 [146]. Сдвиг полосы поглощения валентных колебаний карбонильной группы в область низких частот по отношению к 1638 см-1 для свободного ДКВ (1555-1549, 1562-1549 и 1571-1568 см-1 для образцов КС цинка, меди (II) и кальция, соответственно) свидетельствует об ионизации группы С=О вследствие введения электроноакцепторного заместителя в молекулу флавоноида [146-148]. 93 2.4.7 Спектроскопия ЯМР комплексных соединений цинка и кальция с дигидрокверцетином Структуры комплексов на основе дигидрокверцетина, содержащих в своем составе диамагнитные ионы цинка (5) и кальция (37), исследованы методом спектроскопии ЯМР. Полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР 1Н и 13 С соединений 5 и 37 проведено на основании сравнения с данными для дигидрокверцетина, в том числе литературными [130], данными двумерных ЯМР спектральных экспериментов (COSY, HMBC, HSQC) и представлено в табл. 2.12 [143]. В спектре ЯМР 1Н КС цинка с ДКВ 5 КССВ протонов Н-2 и Н-3, равная 11,0 Гц, соответствует транс-положению этих протонов при асимметрических атомах С-2 и С-3 в плоскости гетерокольца флавоноидной части молекулы. Соответствие значений КССВ и ХС Н-2 и Н-3 для транс-2R,3R-2,3-дигидро-2(3,4-дигидроксифенил)-3,5,7-тригидрокси-4Н-1-бензопиран-4-она доказывает сохранение 2R,3R конфигурации аномерных центров С-2 и С-3 флавоноидной составляющей комплекса [130, 145]. Наиболее существенным для определения положения координации иона металла с флавоноидным лигандом является сопоставление сигналов протонов гидроксильных групп в ПМР спектрах исходного флавоноида и комплексных соединений [12]. Данные, представленные в табл. 2.12, демонстрируют, что в 1Н ЯМР спектре цинкового КС исчезает сигнал при δ 10,88 м.д., принадлежащий протону 7-ОН группы в молекуле ДКВ, что предполагает координацию флавоноидных лигандов к иону цинка через кислородный атом гидроксильной группы при С-7. Сигналы протонов четырех оставшихся гидроксильных групп цинкового комплекса ДКВ в спектре ПМР существенно не изменяют своего местоположения по сравнению с соответствующими сигналами в спектре флавоноида. 94 Таблица 2.12 – Данные ЯМР 13С и 1Н ДКВ и КС (5, 37) (ДМСО–d 6, δ, ХС, м.д., J, Гц) Атомы 2 3 ДКВ [130] C Н 83,10 4,973, д., 11.1 71,62 4,483, д.д., 6,1 и 11,1 4 4а 5 6 197,78 100,53 163,37 96,03 7 8 166,83 95,02 8а 1΄ 2΄ 3΄ 4΄ 5΄ 162,60 128,08 115,40 144,98 145,81 115,17 ДКВ С 83,1 71,6 5-ОН 5,898, д., 2 5,848, д., 2 6,868, с. 6,726,76, 2Н, АВсистема, 8,2 5,712, д., 6,1 11,87, с. 7-ОН 10,78, с. 3΄-ОН 8,98, с. 5,78, д., 6,0 11,90, с. 10,88, с. 9,08, с. 4΄-ОН 8,93, с. 9,03, с. 6΄ 3-ОН 119,41 197,7 100,5 163,3 96,0 Н 4,99, д., 11,3 4,52, д.д., 6,0 и 11,3 5,92, д., 2,2 5,87, д., 2,0 6,90, с. - 166,8 95,0 162,5 128,1 115,3 145,9 145,8 115,2 119,4 6,76, уш.с., 2Н (37) (5) С 83,1 71,6 197,6 100,4 163,4 96,1 167,2 95,1 162,6 128,1 115,4 145,0 145,8 115,1 119,4 Н 4,96, д., 11,0 4,47, д.д., 6,2 и 11,0 5,88, уш. с. 5,83, уш. с. 6,86, с. 6,73, уш. с., 2Н С 82,6 71,4 198,9 99,3 163,2 96,4 166,8 95,8 163,2 128,7 114,9 145,1 145,7 114,9 119,0 Н 4,70, д., 10,4 4,21, д., 10,4 5,41, д., 1,4 5,37, с. 6,80, с. 6,66, уш.с., 2Н 5,71, д., 6,2 11,89, с. - 5,09, уш.с. 12,10, с. - 8,99, уш.с. 8,99, уш.c. - Действительно, в 2D HMBC спектре 5 протон 5-ОН группы, синглетный сигнал которого находится в самом слабом поле (11,90 м.д.), дает кросс-пики с атомами С-4а, С-5, С-6 (рис. 2.13). 95 OH H H2O O Zn H O O A H2O OH B H H H OH H OH H O Рисунок 2.13 - Наличие гетеро- и гомоядерных корреляций в структурном фрагменте цинкового комплекса ДКВ 5 по данным спектроскопии HMBC и COSY В 2D COSY спектре КС наблюдается четкий кросс-пик протона ОН группы при С-3 с Н-3. Эти факты дополнительно доказывают, что координация металла при образовании цинкового комплекса ДКВ не затрагивает данные положения молекулы флавоноида. Протоны ОН групп при С-3' и С-4' в данных условиях 2D экспериментов не проявляли никаких взаимодействий. Совокупность данных, полученных с помощью ИК и ЯМР спектроскопии, элементного анализа, РСЭДМА и ТГ, позволяет предложить для цинкового комплекса ДКВ наиболее вероятную структуру [ZnL2(H2O)2] со стехиометрическим соотношением Met:L, равным 1:2. Оба флавоноидных лиганда координированы к иону цинка через кислородный атом гидроксильной группы при С-7 кольца А. В спектрах 1Н ЯМР кальциевого комплекса ДКВ 37 соответствие значений ХС и КССВ протонов Н-2 и Н-3 также свидетельствует о сохранении 2R,3R абсолютной конфигурации аномерных центров флавоноидной составляющей КС [130, 145]. В спектре присутствуют сигналы протонов только двух гидроксильных групп 3-ОН и 5-ОН, что указывает на отсутствие координации металла по этим положениям. В 2D HSQC спектре кросс-пики проявляются только для протона 3ОН, что также исключает связывание металла через атом кислорода при С-3 (рис. 2.14). 96 OH H H O B O H A H OH H OH OH H H O Рисунок 2.14 - Наличие гетероядерных корреляций в структурном фрагменте кальциевого комплекса ДКВ 37 по данным спектроскопии 2D HSQC Наблюдение сигналов протонов гидроксильных групп 3'-ОН и 4'-ОН в спектре ЯМР 1Н кальциевого комплекса ДКВ затруднено вследствие их сильного уширения из-за протонного обмена с остаточной водой, присутствующей в растворителе [149]. Таким образом, можно предположить, что связывание флавоноидного лиганда ионом кальция осуществляется с участием кислородного атома гидроксильной группы при С-7. На основании полученных данных и результатов ИК-спектроскопии, элементного анализа, РСЭДМА и ТГ для кальциевого КС предложена структура [СаL(ОН)(H 2O)] со стехиометрическим соотношением Met:L 1:1, в которой флавоноидный лиганд связан с ионом кальция через кислородный атом гидроксильной группы при С-7 в кольце А. 2.4.8 Спектроскопия ЭПР комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином Комплексы дигидрокверцетина с ионами меди (II) 18, 19, 20 и 21, выделенные из водно-спиртовой среды, и комплекс 16, выделенный из водного раствора, в твердом виде обнаруживают парамагнетизм и дают в спектре ЭПР (рис. 2.15) характерные сигналы, соответствующие аксиально-симметричному 97 окружению центрального иона двухвалентной меди с тетрагональным искажением (g>׀׀g┴) (табл. 2.13). Рисунок 2.15 – Спектр ЭПР КС меди (II) с ДКВ (образец 20) Электронная конфигурация 3d9, основное состояние 2D. В параллельной ориентации есть слабо разрешенная сверхтонкая структура от Сu2+. Отношение g׀׀/A ׀׀составляет 132-143 см, что попадает в диапазон значений 113-150 см, определенных для квадратно-плоскостной геометрии [150]. Таблица 2.13 – Данные спектроскопии ЭПР образцов комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином Образец 16 18 19 20 21 N, сп/г 1,3 х1019 3,8 х1019 6,8 х1019 3,4 х1019 5,3 х1019 g׀׀ 2,150 2,269 2,113 2,257 2,253 g┴ 2,049 2,024 2,031 2,024 2,021 A׀׀Cu, Гс 158 165 160 166 158 gцентр 2,100 2,146 2,072 2,140 2,137 Совокупность этих данных свидетельствует об образовании комплекса, в котором ион Сu2+ включен в координационную сферу комплекса Мet-L в качестве центрального иона, во вторую координационную сферу возможно включение молекул воды. Вторым лигандом, участвующим в образовании валентной связи, может быть группа ОН-, присутствие которой объясняется частичным гидролизом ацетата меди (II). 98 Согласно литературным данным, координация флавоноидов ионами Cu2+ при проведении реакции в различных средах, кроме щелочной, осуществляется преимущественно с участием карбонильной группы флавоноида и атома кислорода гидроксильной группы 3-ОН или 5-ОН. Вовлечение в комплексообразование атома кислорода группы 3-ОН молекулы ДКВ с ионом Cu2+ более вероятно по сравнению с атомом кислорода гидроксильной группы 5ОН, поскольку величина ионного радиуса Cu2+ (0,80 Å) [151] предполагает более легкое размещение иона металла в «полости» большего размера, сформированной карбонильной группой и атомом кислорода группы 3-ОН [36]. Таким образом, анализ данных, полученных с помощью комплекса современных физико-химических методов анализа синтезированных комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином, позволил предложить структуры комплексов, определить наиболее вероятные сайты связывания металлов с флавоноидным лигандом для прогнозирования искомой антиоксидантной активности новых соединений. Цинковый комплекс дигидрокверцетина представляет собой соединение, в котором с центральным ионом металла связаны два лиганда депротонированого дигидрокверцетина через атом кислорода 7-ОН и две молекулы воды: O OH OH HO H2O O O Zn OH O O HO OH H2O OH OH O Наиболее вероятная структура комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином представляет собой моногидрат, в котором координация центрального иона меди (II) с флавоноидным лигандом осуществляется через атом кислорода 3-ОН и карбонильную группу: 99 OH OH HO O O OH O Cu H2O OH Кальциевый комплекс дигидрокверцетина предположительно представлен соединением, в структуре которого ион кальция связан с флавоноидным лигандом через атом кислорода 7-ОН в кольце А. В составе комплекса присутствует одна молекула воды: OH OH HO O Ca O A (H2O) B C OH OH O В результате направленного синтеза комплексных соединений ионов двухвалентных металлов с флавоноидом древесины лиственницы (+)- дигидрокверцетином получены соединения со стехиометрическим соотношением Met:L 1:1 и 1:2 с различными сайтами связывания металла с флавоноидным лигандом. Различия в структурах комплексных соединений предполагают и различие их свойств. Поскольку за проявление антиоксидантных свойств в молекуле флавоноида отвечает катехольный фрагмент, цинковый комплекс ДКВ, содержащий в своем составе два флавоноидных лиганда со свободными офенольными группами в кольце В, должен как усиливать антиоксидантную активность свободного дигидрокверцетина, так и превосходить по активности медный и кальциевый комплексы. 100 На основе оптимизированных условий синтеза с учетом установленных структур соединений созданы лабораторные регламенты получения новых комплексных соединений в водной среде (Приложения Б, В, Г) с целью наработки экспериментальных партий для дальнейших исследований. 2.5 Изучение электрохимической активности комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином Методом циклической вольтамперометрии проведен сравнительный анализ электрохимического поведения синтезированных соединений с поведением дигидрокверцетина. В связи с недостаточной растворимостью в воде полученных комплексов рабочей средой для изучения их электрохимических свойств был выбран ДМСО. Предварительно была проведена оценка электрохимических свойств ацетатных солей металлов, используемых для синтеза комплексов (рис. 0,020 I, мА 2.16). 3 0,015 2 1 0,010 0,005 0,000 -0,005 -0,010 4 -0,015 -0,020 -0,025 -0,030 -400 E, мВ -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Рисунок 2.16 - Циклические вольтамперограммы, измеренные в ДМСО - растворах Cu(CH3COO)2 (1), Ca (CH3COO)2 (2) и Zn(CH3COO)2 (3) и в фоновом растворе 10-1 M LiClO4 (4), v 50 мВ/с. 101 Из представленных на рис. 2.16 циклических вольтамперограмм (кривые 1, 2 и 3) видно, что из ацетатных солей металлов-комплексообразователей в исследуемых условиях При Cu(CH 3COO)2. электрохимическую этом на циклической активность проявляет вольтамперограмме только последней присутствует пик окисления при Е ≈ 0 мВ, которому соответствует пик восстановления при Е ≈ -190 мВ. Однако сила тока в пике окисления в три раза ниже, чем в пике восстановления. Согласно [152], ионы меди в ДМСО растворах могут находиться в степени окисления +1, следовательно, пик восстановления может отвечать процессу Cu2+ + е- → Cu1+. А пик окисления - обратному процессу. Разница в высотах пиков окисления и восстановления обусловлена растворением Cu(CH3COO)2, полученного в водном растворе, где для ионов меди предпочтительна степень окисления +2. Циклические вольтамперограммы растворов ДКВ и синтезированных на его основе комплексов цинка (5), меди (II) (27) и кальция (37) в ДМСО представлены 0,06 I, мА на рис. 2.17 [143]. 0,05 0,04 1 2 3 4 0,03 0,02 0,01 0 -0,01 -0,02 -0,03 -400 E, мВ -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Рисунок 2.17 - Циклические вольтамперограммы, измеренные на графитовом электроде в ДМСО - растворах ДКВ (2) и комплексов цинка 5 (1), меди (II) 27 (4) и кальция 37 (3). Скорость развертки потенциала v 50 мВ/с, С = 5∙10-3 М 102 На циклической вольтамперограмме, полученной в ДМСО растворе ДКВ (рис. 2.17, кривая 2), видны два хорошо выраженных пика при Е ≈ 1070 и 120 мВ с значениями силы тока в пике 34 и -18,8 мкА, соответственно. Можно утверждать, что на анодном ходе кривой происходит процесс окисления ДКВ, а полученные продукты окисления подвергаются восстановлению на ее катодном ходе. Электрохимическое поведение комплексного соединения цинка с ДКВ (рис. 2.17, кривая 1) схоже с поведением ДКВ. На анодной части кривой присутствует пик окисления при Е ≈ 990 мВ со значением силы тока 49,1 мкА. А на катодной части кривой присутствуют два пика восстановления при Е ≈132 мВ -17,7 мкА и Е ≈ 3 мВ -21,4 мкА. В [153] показано, что в апротонном растворителе содержание воды существенно влияет на положение пика окисления. Для веществ, в процессе электроокисления которых участвуют протоны, увеличение содержания воды приводит к смещению потенциалов пиков окисления и восстановления в сторону менее положительных значений. Так как для экспериментов были использованы воздушно-сухие образцы дигидрокверцетина и комплексов на его основе, вероятно, что разница между потенциалами пиков окисления и восстановления связана с различным содержанием воды в исходных образцах. Электрохимическое поведение комплекса меди (II) с ДКВ (рис. 2.17, кривая 4) осложнено электрохимической активностью меди. Причем, если пик окисления, полученный при Е ≈ 190 мВ и 0,83 мкА, не мешает интерпретации пика окисления остатка ДКВ при Е ≈ 900 мВ и 5,6 мкА, то пик восстановления ионов меди (Е ≈ 220 мВ и -5,93 мкА) и пик восстановления окисленного остатка ДКВ (Е ≈ 120 мВ и -5,36 мкА) находятся на расстоянии 100 мВ друг от друга и примерно равны по высоте. На катодной ветви циклической вольтамперограммы, измеренной в ДМСО растворе КС кальция с ДКВ (рис. 2.17, кривая 3), находится пик восстановления (Е ≈ 0 мВ и -9,1 мкА), который отвечает процессу восстановления продуктов окисления остатка ДКВ в комплексе. На анодной ветви вольтамперограммы присутствуют два пика окисления: Е ≈ 550 мВ и 5,15 мкА и Е ≈ 910 мВ и 10,3 мкА. 103 С увеличением скорости развертки потенциала ожидаемо растёт величина тока в пиках окисления и восстановления ( I p ) [154, 155]. Известно, что характер этой зависимости определяется тем, контролируется процесс диффузией или проходит в приэлектродном пространстве. Если зависимость линеаризуется в координатах Ip ~ ν , превалирующим механизмом контроля является диффузия, линеаризация Ip ~ ν – зависимости должна указывать на преобладание в системе кинетических условий протекания окислительно-восстановительных превращений. На рис. 2.18 представлены значения силы тока в пиках окисления ДКВ и соответствующих пиков восстановления и пиков окисления комплексов ДКВ и соответствующих пиков восстановления, которые мы относим к электрохимическим превращениям, происходящим в кольце В флавоноидного лиганда. Рисунок 2.18 - Зависимость силы тока в пиках окисления и восстановления дигидрокверцетина (2) и комплексов цинка (1), меди (II) (4) и кальция (3) на его основе от ν Как видно из рис. 2.18, представленные зависимости Ip от ν как для ДКВ, так и для комплексов линейны. Это свидетельствует о диффузионном контроле электрохимических процессов для всех исследуемых соединений. 104 Приведенные данные свидетельствуют окислительно-восстановительного поведения о более исследуемых сложной природе комплексов по сравнению с поведением дигидрокверцетина. Цинковый комплекс в растворе ДМСО не только сохраняет электрохимическую активность, присущую ДКВ, но и превосходит ее. Электрохимическая активность комплексов меди (II) и кальция с ДКВ в растворе ДМСО несколько меньше, чем активность исходного ДКВ. Такое различное электрохимическое поведение комплексов в растворе ДМСО может быть связано как с различными структурами соединений, так и с различными способами взаимодействия комплексов с рабочей поверхностью графитового электрода. 2.6 Определение антиоксидантной активности комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином Пристальное внимание исследователей к изучению строения и свойств комплексных соединений металлов с различными флавоноидами во многих случаях сопряжено с определением антиоксидантной активности этих соединений. Для оценки антиокислительных свойств природных и синтетических соединений используют различные физико-химические методы, биохимические тест-системы и экспериментальные модели [3]. Изучение антиоксидантной активности комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином проводилось в экспериментах in vitro на сливной плазме крови здоровых доноров. Определяли влияние КС и ДКВ на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови. Для этого определяли в плазме крови содержание малонового диальдегида (МДА), возникающего в организме при деградации гидроперекисей липидов активными формами кислорода и служащего маркером ПОЛ и оксидативного стресса, диеновых и триеновых конъюгатов (ДК, ТК), которые представляют собой гидроперекиси липидов с сопряженными двойными связями, а также активность фермента каталазы. 105 Предварительно для всех комплексов были определены их действующие концентрации. 2.6.1 Выбор действующей концентрации комплексов Определение действующей концентрации проводили на основании изменения содержания МДА в плазме крови в присутствии КС и ДКВ по отношению к контрольному опыту [156]. Для экспериментов готовились 1%-ные суспензии исследуемых веществ в ДМСО, из которых были приготовлены растворы в диапазоне концентраций 0,001-0,1 % [142, 157, 158]. В качестве контрольного образца использовали раствор, содержащий плазму крови в ДМСО. Максимальное снижение содержания МДА в плазме крови по сравнению с контролем наблюдалось при использовании 0,005%-ного раствора КС цинка с ДКВ. КС меди (II) с ДКВ снижает содержание МДА только в концентрации 0,005%. Наибольшая активность КС кальция с ДКВ показана в концентрации 0,001%. Для сравнительной характеристики антиоксидантной активности полученных комплексов дальнейшие исследования проводились для растворов КС в одинаковой концентрации 0,005 %. 2.6.2 Определение влияния комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином на процессы перекисного окисления липидов в опытах in vitro Состояние ПОЛ оценивали по содержанию в плазме крови МДА и первичных продуктов ПОЛ - диеновых (ДК) и триеновых (ТК) конъюгатов. Определение ДК имеет преимущество для оценки ПОЛ по сравнению с другими продуктами, поскольку отражает раннюю стадию окисления. Содержание МДА в плазме крови определяли модифицированным методом в тесте ТБК [156]. Определение ДК и ТК проводили методом экстракции липидов 106 смесью гептана и изопропилового спирта в объемном соотношении 1:1 [159]. Результаты проведенных экспериментов представлены на рис. 2.19. 1 - Контроль, 2 – ДКВ, 3 - 5 4 - 27 5 - 37 Рисунок 2.19 - Влияние комплексных соединений цинка (5), меди (II) (27) и кальция (37) с ДКВ на показатели ПОЛ в плазме крови Анализ полученных данных демонстрирует, что цинковый комплекс снижает содержание МДА в плазме крови на 14,9 % по сравнению с контролем, что превосходит в 2 раза этот показатель для ДКВ (7,5 %). КС меди (II) и кальция с ДКВ снижают содержание МДА в плазме крови на 11,2 и 3,7 %, соответственно. Существенного влияния ДКВ и исследуемых комплексов на уровень первичных продуктов ПОЛ (ДК и ТК) в плазме крови не выявлено. Для оценки антиоксидантного статуса организма исследуют также активность антирадикальных и антиперекисных ферментов в плазме крови. Одним из таких ферментов, широко распространенных в организме человека и животных и сохраняющих свою высокую активность длительное время, является каталаза. Ее роль в организме заключается в предотвращении накопления пероксида водорода, который образуется при дисмутации супероксидного аниона и при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов. Для клинических и экспериментальных исследований широко используется спектрофотометрический метод определения активности каталазы, являющийся достаточно точным, чувствительным и простым в исполнении [160]. Проведенные эксперименты не выявили исследуемых соединений на активность каталазы. существенного влияния 107 Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать вывод, что синтезированные нами комплексные соединения цинка, меди (II) и кальция с ДКВ проявляют антиоксидантную активность, влияя на уровень ПОЛ в плазме крови. Наибольшую активность показал цинковый комплекс, что позволяет прогнозировать перспективность его использования в медицине. Результаты, полученные в экспериментах in vitro по исследованию антиоксидантной активности синтезированных комплексов, не противоречат выводам, поведения полученным при исследовании комплексов окислительно-восстановительного дигидрокверцетина методом циклической вольтамперометрии, где максимальную электрохимическую активность проявил цинковый комплекс дигидрокверцетина. 2.7 Перспективы использования комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином в качестве фармацевтической субстанции для лечения ожоговых ран Многокомпонентные препараты, содержащие биологически активные вещества, в частности антиоксиданты, эффективны при лечении ожогов, поскольку оказывают регулирующее влияние на восстановительные процессы в клетках. Важную роль в профилактике и лечении раневой инфекции у обожженных отводят антибактериальным препаратам, которые позволяют снизить инвазивный сепсис ожоговой раны и вызванные в этой связи осложнения [161, 162]. Дигидрокверцетин является одним из самых активных природных антиоксидантов, а его цинковый комплекс демонстрирует еще более высокую эксприментально подтвержденную антиоксидантную активность. Это дало основание для разработки оригинальной фармацевтической композиции для лечения ожоговых ран с использованием цинксодержащего комплекса в качестве действующего вещества. Еще одним компонентом этой композиции является лиственничный воск. 108 В ФГБНУ «ИНЦХТ» на базе научного отдела экспериментальной хирургии с виварием на модели термического ожога 2 и 3А степени в экспериментах in vivo была показана высокая положительное влияние ранозаживляющая на микрофлору активность ожоговой и раны выраженное разработанной композиции. В качестве препарата сравнения использовали Куриозин® (цинк гиалуронат, пр-во Gedeon Richter (Венгрия): гель 0,103%). Ранозаживляющую активность исследуемых фармацевтических композиций оценивали планиметрически по методу А.В. Черкасова [163]. Результаты представлены на рис. 2.20. 4,5 Площадь ожога, см 2 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 1 3 7 14 Продолжительность эксперимента, сут. контроль Куриозин Мазь с ДКВ на гидрофобной основе с лиственничным воском Мазь c КС Zn-ДКВ на гидрофобной основе с лиственничным воском Рисунок 2.20 - Динамика изменения площади ожоговой раны Площадь ожога, по сравнению с исходным значением (4 см2), к 3 суткам эксперимента уменьшилась практически в 2 раза во всех группах животных, на 7 сутки эксперимента у группы животных, подвергшихся обработке мазью с цинксодержащим комплексом дигидрокверцетина на гидрофобной основе с лиственничным воском, оказалась существенно меньшей по сравнению с контролем и препаратом сравнения, и к исходу эксперимента (14 сутки) наблюдалось практически полное заживление термического ожога в указанной группе животных, в то время как площадь ожога в группе животных, 109 подвергавшихся обработке препаратом сравнения, существенно не отличалась от контроля [161, 164]. Исследование микробиологической чистоты в эксперименте показало, что оригинальные фармацевтические композиции, представляющие собой мази дигидрокверцетина или его цинксодержащего комплекса на гидрофобной основе с лиственничным воском, обеспечивают “бактериологическую чистоту” ожоговых ран в исследуемых группах животных с 3-7 суток [161, 164]. Таким образом, разработанное на основе продукта комплексной переработки биомассы лиственницы сибирской новое средство для лечения ожогов, содержащее комплексное соединение цинка с ДКВ, обладает ранозаживляющей и противомикробной активностями и является перспективным препаратом для применения в комбустиологии [161, 164-166]. 110 Глава 3 Экспериментальная часть УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре СФ-26, в кюветах l=1,0 см. рН-Метрию спектральный проводили на энергодисперсионный приборе Эксперт-рН. микроскопический Рентгеновский анализ (РСЭДМА) выполнен с помощью электронного микроскопа фирмы Hitachi марки ТМ 3000, датчик: X-ray детектор SDD XFlash 430-H. ИК-спектры записывали на приборе Bruker Vertex 70 в таблетке с KBr (2.5 мг/300 мг KBr). Термогравиметрический анализ осуществляли на приборе синхронного термического анализа STA 449 F3 Jupiter фирмы Netzsch в динамическом режиме (скорость нагрева образца 5 град/мин) в токе азота (скорость подачи газа 30 мл/мин). Спектры ЯМР растворов соединений в ДМСО-d6 регистрировали при температуре 26 °С. Спектры ЯМР 13С образцов регистрировали на приборе Bruker DPX 400 с рабочей частотой 100,6 МГц. Использовали многократное накопление на полосе 28000 Гц при времени выборки данных 1,2 с и с релаксационной задержкой 7 с. Спектры 1Н и двумерные спектры ЯМР COSY, HSQC, HMBC регистрировали на приборе Bruker Avance с рабочей частотой 400,1 Гц. Для регистрации спектров 1Н использовали 16-кратное накопление сигналов на полосе 8012 Гц при времени выборки данных 2,04 с и с релаксационной задержкой 2 с. Двумерные спектры регистрировали с использованием импульсных градиентов поля с временем выборки данных 0,14 с и от 256 до 1024 прохождений по координате t1 с релаксационной задержкой 1,5 с; по координате t2 время выборки данных составляло 0,14 с (COSY), 0,03 c (HSQC) и 0,07 c (HMBC) и от 512 до 2048 прохождений. В эксперименте HSQC для наблюдения максимальных амплитуд кросс-пиков использовалась константа 1 JCH = 140 Гц, а для эксперимента HMBC использовалось значение константы nJCH = 4 Гц. Масс-спектрометрию MALDI проводили на масс-спектрометре Bruker autoflex speed, оснащенном твердотельным УФ-лазером с λ=355 нм и рефлектроном с использованием четырех матриц: 3-индолакриловая кислота (IAA), 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB), 1,8,9-антрацентриол (AT), 2-(4- 111 гидроксифенилазо)бензойная кислота (HABA). Навеску образца растворяли в ДМСО, отбирали 20 мкл раствора и добавляли 20 мкл раствора матрицы в ТГФ (30 мг/мл). 1 мкл смеси наносили на металлическую подложку, выжидали до момента улетучивания растворителя и регистрировали масс-спектры. Массспектрометрию DART проводили на времяпролетном масс-спектрометре JMST100LP AccuTOF в диапазоне 100-1000 Да в температурном диапазоне (от 150 до 300 °С) при скоростях газа от 0,5 до 3 л/мин. Наилучшего соотношения сигнал/шум удалось добиться в режиме регистрации отрицательных ионов при скорости потока 1 л/мин и температуре источника 300 °С, в режиме регистрации положительных ионов зарегистрировать масс-спектры комплексов не удалось. ЭПР спектры были сняты на импульсном спектрометре ELEXSYS E580 Bruker (Х-диапазон 9,7 GHz) в постоянном режиме при комнатной температуре. Амплитуда модуляции 1 и 10 G, усиление 60 dB, постоянная времени 0,02 с, время конверсии 0,06 с, микроволновая мощность 0,6325 mW. Точность измерения g-фактора составляет ±0,001 в диапазоне развертки поля 6000 G и ±0,0002 в диапазоне 100 G. В качестве стандарта для расчета спиновой концентрации использовался CuCl2. Исследование электрохимического поведения комплексов проводилось методом циклической вольтамперометрии. Для электрохимических измерений использовали установку на базе потенциостата IPC - pro M (Россия), включающую: трехэлектродную ячейку объемом 50 мл, графитовый рабочий электрод с площадью видимой поверхности 0,39 см2, хлорсеребряный электрод сравнения BAS RE-1, где внутренний раствор был заменен на насыщенный раствор AgCl и KCl согласно [152], платиновый вспомогательный электрод. Посуда, необходимая для приготовления растворов исследуемых веществ и электрохимических измерений, обрабатывалась смесью концентрированной серной кислоты и 30%-ого пероксида водорода, затем проточной горячей водой и ополаскивалась бидистиллированной водой, после чего помещалась в сушильный шкаф для удаления воды. Концентрации анализируемых растворов составляли 5∙10 -3 М. Перед измерением вольтамперограмм раствор в ячейке продували 112 аргоном в течение 10 мин. Все эксперименты выполнены при комнатной температуре. В качестве фонового электролита использовался 10-1 М раствор LiClO 4 в ДМСО. Порядок выполнения эксперимента был следующим: измерялись циклические вольтамперограммы в фоновом растворе при скорости развертки потенциала (v) 5, 20, 50 мВ/с, затем измерялись циклические вольтамперограммы в растворе комплекса или ацетата металла - комплексообразователя при v 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 и 500 мВ/с. Содержание ДКВ в растворах определяли спектрофотометрически с помощью градуировочного графика. 3.1 Спектрофотометрическое определение содержания дигидрокверцетина в анализируемом растворе Приготовление стандартного раствора №1. 0,10 г ДКВ стандартного образца (точная навеска) растворяли в 70 мл 96%-ного этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводили объем раствора этиловым спиртом 96% до метки и перемешивали. Концентрация полученного раствора ДКВ составляла 10-3 г/мл. Приготовление стандартных растворов №2. Из раствора №1 разведением готовили серию растворов с содержанием ДКВ 7,5∙10-4; 5,0∙10-4; 2,5∙10-4 и 1,0∙10 -4 г/мл. Приготовление стандартных растворов №3. Из растворов №2 готовили растворы для построения калибровочного графика следующим образом: 1 мл раствора переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем раствора до метки 96 %-ным этиловым спиртом и перемешивали. Концентрации полученных растворов составляли 1,5∙10-5; 1,0∙10-5; 5∙10-6 и 2∙10 -6 г/мл. Оптическую плотность А растворов №3 измеряли на спектрофотометре в максимуме поглощения при 290±2 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали 96 %-ный этиловый спирт. 113 По полученным значениям оптической плотности строили график зависимости: А=f(C). Уравнение зависимости имеет вид: y = 0,0609 х - 0,0069; R2 = 0,9992. Спектрофотометрическое определение содержания дигидрокверцетина в анализируемом растворе. В мерную колбу на 50 мл отбирали аликвоту 0,025 мл анализируемого раствора и доводили до метки 96 %-ным этиловым спиртом. Содержание ДКВ в исследуемом растворе рассчитывали по формуле, выведенной из градуировочного графика: m(ДКВ)=(А+0,0069)⋅Vобщ⋅0,82/Vал, где А - оптическая плотность, %, Vобщ - объем анализируемого раствора, мл, Vал объем аликвоты, мкл. 3.2 Условия синтезов комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином Для синтеза комплексных соединений на основе ДКВ в качестве исходных реагентов использовали дигидрокверцетин производства ИНПФ ООО «Химия древесины», выделенный из древесины Larix sibirica Ledeb. и L. gmelinii (Rupr.) Rupr. по технологии [128], и соли: Zn(CH3COO)2∙2Н2О, ZnCl2, ZnSO 4∙7Н2О, Cu(CH 3COO)2, Cu(CH3COO)2∙Н 2О, Ca(CH3COO)2∙Н2О, Ca(NO3)2∙4Н2О, CaCl2 (х.ч.). (+)-Дигидрокверцетин очищали перекристаллизацией из горячей воды, высушивали в сушильном шкафу при температуре 50 оС до влажности не более 7 %, а затем при температуре 105 оС до постоянной массы. Индивидуальность ДКВ подтверждали соответствием т. пл. 228 оС и данными ВЭЖХ (данные любезно предоставлены к.х.н. Остроуховой Л.А.). УФ-спектр ДКВ характеризуется наличием полосы поглощения с λmin 247 нм, λ max 292 нм и плечом в области 320327 нм. Согласно данным ТГ, дигидрокверцетин представляет собой гидрат с мольным соотношением ДКВ:Н 2О, равным 2:1 [4]. 114 3.2.1 Синтез и оптимизация комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином Цинковый комплекс дигидрокверцетина получали смешиванием водных растворов цинксодержащей соли и ДКВ в круглодонной колбе с обратным холодильником при 80 оС при постоянном перемешивании. После охлаждения полученный осадок отфильтровывали, промывали водой, затем чистым этанолом и высушивали в сушильном шкафу при 50 оС до влажности не более 7 %, а затем при 105 о С до постоянной массы. Полученный продукт представлял собой порошок от оливково-серого до желтовато-коричневого цвета, нерастворимый в воде, этаноле, ацетоне, малорастворимый в ДМСО. Образец 1. 1,36 г (0,0045 моль) ДКВ и 0,64 г (0,0045 моль, учитывая влажность 5 %) ZnCl2 смешивали в водном растворе, добавляли 2 мл 8 %-ного раствора NH 4OH до рН ≈ 5 и общий объем доводили до 50 мл. Время реакции 2 ч. Масса продукта 1,015 г. Выход 64,2 %. Найдено, %: С 44,7; Н 3,9; Zn 9,8. Вычислено для С30Н26О 16Zn здесь и далее в последующих четырнадцати опытах, %: С 50,9; Н 3,7; О 36,2; Zn 9,2. Образец 2. 1,62 г (0,0053 моль) ДКВ и 0,38 г (0,00265 моль, учитывая влажность 5 %) ZnCl2 смешивали в водном растворе, добавляли 8 %-ный раствор NH 4OH до рН ≈ 5 и общий объем доводили до 50 мл. Время реакции 2 ч. Масса продукта 1,165 г. Выход 62,0 %. Найдено, %: С 45,0; Н 3,4; Zn 7,8. Образец 3. 1,03 г (0,0034 моль) ДКВ и 0,97 г (0,0034 моль) ZnSO 4∙7H2O смешивали в водном растворе, добавляли 8 %-ный раствор NH4OH до рН ≈ 5 и общий объем доводили до 50 мл. Время реакции 2 ч. Масса продукта 0,78555 г. Выход 65,6 %. Найдено, %: С 41,5; Н 3,1; Zn 9,6. Образец 4. 1,36 г (0,0044 моль) ДКВ и 0,64 г (0,0022 моль) ZnSO 4∙7H2O смешивали в водном растворе, добавляли 8 %-ный раствор NH4OH до рН ≈ 5 и общий объем доводили до 50 мл. Время реакции 2 ч. Масса продукта 0,9517 г. Выход 60,2 %. Найдено, %: С 42,4; Н 2,9; Zn 8,3. Образец 5. Водный буферный раствор (рН 4,01) 1,0 г (0,0033 моль) ДКВ смешивали с водным раствором 1,05 г (0,0048 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О в общем 115 объеме 50 мл. Время реакции 3 ч. Масса продукта 0,28645 г. Выход 24,7 %. Найдено, %: С 49,7; Н 3,7; Zn 8,5. Масс-спектр (DART-MS), m/z (Iотн, %): 303 (ДКВ-H)-, 301 (ДКВ-2H-H)-, 285 (M-H-H2O)-, 259 (ион не идентифицирован (н.и.)), 177 (н.и.), 153 (н.и.). ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3402, 3229 (О-Н), 1613, 1593 (Ar), 1555 (С=О), 1442, 1348, 1277 (-С-О-С-), 613 (О-М). Образец 6. Водные растворы 1,0 г (0,0033 моль) ДКВ и 1,05 г (0,0048 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О смешивали в общем объеме 50 мл. Время реакции 2 ч. Масса продукта 0,637 г. Выход 54,8 %. Найдено, %: С 49,8; Н 4,4; Zn 7,8. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3429, 3288 (О-Н), 1612, 1594 (Ar), 1555 (С=О), 1442, 1349, 1277 (-СО-С-), 613 (О-М). Образец 7. Водный буферный раствор (рН 7,5) 1,0 г (0,0033 моль) ДКВ смешивали с водным раствором 1,05 г (0,0048 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О в общем объеме 50 мл. Время реакции 3 ч. Масса продукта 0,5088 г. Выход 43,9 %. Найдено, %: С 50,5; Н 3,4; Zn 10,8. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3400, 3230 (О-Н), 1614, 1593 (Ar), 1555 (С=О), 1442, 1348, 1277 (-С-О-С-), 612 (О-М). Образец 8. Водный буферный раствор (рН 9,18) 1,0 г (0,0033 моль) ДКВ смешивали с водным раствором 1,05 г (0,0048 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О в общем объеме 50 мл. Время реакции 3 ч. Масса продукта 0,404 г. Выход 34,8 %. Найдено, %: С 42,5; Н 3,0; Zn 11,4. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3402, 3214 (О-Н), 1613, 1593 (Ar), 1555 (С=О), 1442, 1348, 1277 (-С-О-С-), 613 (О-М). Образец 9. Водные растворы 0,10 г (0,00033 моль) ДКВ и 0,105 г (0,00048 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О смешивали в общем объеме 50 мл. Время реакции 5 ч. Масса продукта 0,01355 г. Выход 11,7 %. Найдено, %: С 50,6; Н 4,2; Zn 9,4. ИКспектр (KBr, ν, см-1): 3401, 3249 (О-Н), 1614, 1593 (Ar), 1554 (С=О), 1441, 1346, 1276 (-С-О-С-), 613 (О-М). Образец 10. Водные растворы 1,50 г (0,0049 моль) ДКВ и 1,58 г (0,0072 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О смешивали в общем объеме 150 мл. Время реакции 2,5 ч. Масса продукта 0,5716 г. Выход 32,8 %. Найдено, %: С 49,0; Н 3,0; Zn 10,3. ИКспектр (KBr, ν, см-1): 3416, 3214 (О-Н), 1614, 1593 (Ar), 1549 (С=О), 1443, 1349, 1255 (-С-О-С-), 611 (О-М). 116 Образец 11. Водные растворы 15,0 г (0,049 моль) ДКВ и 15,80 г (0,072 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О смешивали в общем объеме 430 мл. Время реакции 2,5 ч. Масса продукта 10,01 г. Выход 57,4 %. Найдено, %: С 52,2; Н 4,1; Zn 8,9. ИКспектр (KBr, ν, см-1): 3415, 3209 (О-Н), 1613, 1593 (Ar), 1554 (С=О), 1442, 1348, 1277 (-С-О-С-), 612 (О-М). Образец 12. Водные растворы 1,47 г (0,0048 моль) ДКВ и 0,53 г (0,0024 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О смешивали в общем объеме 50 мл. Время реакции 2 ч. Масса продукта 1,01800 г. Выход 59,6 %. Найдено, %: С 51,9; Н 3,4; Zn 10,2. ИКспектр (KBr, ν, см-1): 3423, 3239 (О-Н), 1616, 1596 (Ar), 1553 (С=О), 1446, 1352, 1280 (-С-О-С-), 605 (О-М). Образец 13. Водные растворы 1,16 г (0,0038 моль) ДКВ и 0,84 г (0,0038 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О смешивали в общем объеме 50 мл. Время реакции 2 ч. Масса продукта 0,81400 г. Выход 60,3 %. Найдено, %: С 46,8; Н 2,9; Zn 9,4. ИКспектр (KBr, ν, см-1): 3427, 3210 (О-Н), 1612, 1592 (Ar), 1554 (С=О), 1441, 1348, 1276 (-С-О-С-), 612 (О-М). Образец 14. Водные растворы 0,82 г (0,0027 моль) ДКВ и 1,18 г (0,054 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О смешивали в общем объеме 50 мл. Время реакции 2 ч. Масса продукта 0,687 г. Выход 72,1 %. Найдено, %: С 45,5; Н 3,0; Zn 10,0. ИКспектр (KBr, ν, см-1): 3424, 3242 (О-Н), 1619, 1592 (Ar), 1549 (С=О), 1443, 1363, 1260 (-С-О-С-), 608 (О-М). Образец 15. Водные растворы 0,63 г (0,0021 моль) ДКВ и 1,37 г (0,0063 моль) Zn(CH3COO)2∙2Н2О смешивали в общем объеме 50 мл. Время реакции 2 ч. Масса продукта 0,4996 г. Выход 68,2 %. Найдено, %: С 49,8; Н 2,9; Zn 10,7. ИКспектр (KBr, ν, см-1): 3412, 3244 (О-Н), 1613, 1593 (Ar), 1555 (С=О), 1442, 1348, 1277 (-С-О-С-), 613 (О-М). Соединения 5–15 характеризуются следующими данными спектроскопии ЯМР 1Н и 13С [142]: Спектр ЯМР 1Н [Zn(C15H11O 7)2(H2O)2] в ДМСО-d6 в области от 4 до 12 м.д. содержит следующие сигналы (δ, м.д.): 4,47 (1Н, дублет дублетов, J = 6,2 и 11,0 Гц, Н-3); 4,96 (1Н, дублет, J = 11,0 Гц, Н-2); 5,71 (1Н, дублет, J = 6,2 Гц, 3-ОН); 117 5,83 (1Н, уширенный синглет, Н-8); 5,88 (1Н, уширенный синглет, Н-6); 6,73 (2Н, синглет, Н-5´, Н-6´); 6,86 (1Н, синглет, Н-2΄); 8,99 (2Н, уширенный синглет, 3'-ОН и 4'-ОН); 11,89 (1Н, синглет, 5-ОН). Суммарная интенсивность всех указанных сигналов соответствует 11 протонам. Химические сдвиги ядер 13С [Zn(C15H 11O 7)2(H2O)2] в ДМСО-d6 (δ, м.д.): 71,6 (С-3); 83,1 (С-2); 95,1 (С-8); 96,1 (С-6); 100,4 (С-4а); 115,1 (С-5΄); 115,4 (С-2΄); 119,4 (С-6΄); 128,1 (С-1΄); 145,0 (С-3΄); 145,8 (С-4΄); 162,6 (С-8а); 163,4 (С-5); 167,2 (С-7); 197,6 (С-4). 3.2.2 Синтез и оптитмизация комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином Медный комплекс дигидрокверцетина синтезировали в течение 1 ч при постоянном перемешивании в водной среде при 80 оС (образцы 16, 17, 27) и при 70 оС (образцы 22-26), водно-спиртовой среде при 25 оС (образцы 18-21). После охлаждения полученный осадок отфильтровывали, промывали водой или водноспиртовой смесью в зависимости от среды проведения синтеза. Завершали промывание осадка чистым этанолом, после чего высушивали в сушильном шкафу при 50 оС до влажности не более 7 %, а затем при 105 оС до постоянной массы. Полученный продукт представлял собой порошок от зеленоватокоричневого до коричневого цвета, нерастворимый в воде, этаноле, ацетоне, малорастворимый в ДМСО. Образец 16. Эквимольные количества ДКВ (1,25 г, 0,0041 моль) и Cu(CH 3COO)2 (0,75 г, 0,0041 моль) смешивали в водном растворе общим объемом 50 мл. Масса продукта 1,1872 г. Выход 71,8 %. Найдено, %: С 49,5; Н 3,3; Сu 12,4. Вычислено для С15Н 14О9Сu здесь и далее в последующих одиннадцати опытах, %: С 44,8; Н 3,5; О 35,8; Сu 15,9. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3393, 3168 (О-Н), 1617, 1593 (Ar), 1562 (С=О), 1445, 1386, 1273 (-С-О-С-), 623 (О-М). Образец 17. Водные растворы 0,91 г (0,003 моль) ДКВ и 1,09 г (0,006 моль) Cu(CH 3COO)2 смешивали в общем объеме 50 мл. Масса продукта 0,9274 г. Выход 118 77,1 %. Найдено, %: С 43,7; Н 3,0; Сu 17,1. Масс-спектр (DART-MS), m/z (Iотн, %): 303 (ДКВ-H)-, 301 (ДКВ-2H-H)-, 285 (M-H-H2O)-, 259 (н.и.), 193 (н.и.), 179 (н.и.), 153 (н.и.). ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3399, 3094 (О-Н), 1617, 1593 (Ar), 1561 (С=О), 1445, 1383, 1270 (-С-О-С-), 625 (О-М). Образец 18. Водно-спиртовые растворы (50 % этанол) 1,52 г (0,005 моль) ДКВ и 2,0 г (0,01 моль) Cu(CH3COO)2∙Н 2О смешивали в общем объеме 50 мл. Масса продукта 1,597 г. Выход 79,5 %. Найдено, %: С 42,9; Н 2,7; Сu 17,1. ИКспектр (KBr, ν, см-1): 3399, 3242 (О-Н), 1616, 1573 (Ar), 1552 (С=О), 1441, 1383, 1270 (-С-О-С-), 618 (О-М). Образец 19. Водно-спиртовые растворы (50 % этанол) 1,52 г (0,005 моль) ДКВ и 1,0 г (0,005 моль) Cu(CH3COO)2∙Н2О смешивали в общем объеме 50 мл, исходное мольное соотношение Сu2+:ДКВ составляло 1:1. Масса продукта 1,436 г. Выход 71,4 %. Найдено, %: С 48,2; Н 3,1; Сu 12,5. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3380, 3242 (О-Н), 1615, 1575 (Ar), 1553 (С=О), 1444, 1377, 1273 (-С-О-С-), 620 (О-М). Образец 20. Водно-спиртовые растворы (70 % этанол) 1,52 г (0,005 моль) ДКВ и 2,0 г (0,01 моль) Cu(CH3COO)2∙Н 2О смешивали в общем объеме 50 мл, исходное мольное соотношение Сu2+:ДКВ составляло 2:1. Масса продукта 1,735 г. Выход 86,3 %. Найдено, %: С 42,6; Н 2,4; Сu 19,1. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3384, 3237 (О-Н), 1616, 1575 (Ar), 1553 (С=О), 1440, 1377, 1269 (-С-О-С-), 616 (О-М). Образец 21. Водно-спиртовые растворы (70 % этанол) 1,52 г (0,005 моль) ДКВ и 1,0 г (0,005 моль) Cu(CH3COO)2∙Н2О смешивали в общем объеме 50 мл, исходное мольное соотношение Сu2+:ДКВ составляло 1:1. Масса продукта 1,478 г. Выход 73,5 %. Найдено, %: С 46,1; Н 2,7; Сu 14,5. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3367, 3257 (О-Н), 1616, 1574 (Ar), 1549 (С=О), 1442, 1377, 1269 (-С-О-С-), 619 (О-М). Образец 22. Водные растворы 0,91 г (0,003 моль) ДКВ и 1,09 г (0,006 моль) Cu(CH 3COO)2 смешивали в общем объеме 50 мл, рН раствора доводили до 4,3 добавлением 0,1 н раствора НСl. Масса продукта 0,7999 г. Выход 66,5 %. Найдено, %: С 47,0; Н 4,3; Сu 11,5. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3381, 3262 (О-Н), 1616, 1574 (Ar), 1550 (С=О), 1444, 1377, 1272 (-С-О-С-), 620 (О-М). 119 Образец 23. Водные растворы 0,91 г (0,003 моль) ДКВ и 1,09 г (0,006 моль) Cu(CH 3COO)2 смешивали в общем объеме 50 мл. Масса продукта 1,0694 г. Выход 88,9 %. Найдено, %: С 40,9; Н 3,5; Сu 17,9. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3395, 3267 (ОН), 1614, 1574 (Ar), 1549 (С=О), 1444, 1379, 1274 (-С-О-С-), 619 (О-М). Образец 24. Водные растворы 0,91 г (0,003 моль) ДКВ и 1,09 г (0,006 моль) Cu(CH 3COO)2 смешивали в общем объеме 50 мл, рН раствора доводили до 6,0 добавлением 12 %-ного раствора NH 4OH. Масса продукта 1,076 г. Выход 89,4 %. Найдено, %: С 43,5; Н 3,5; Сu 17,1. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3424, 3271 (О-Н), 1617, 1574 (Ar), 1550 (С=О), 1459, 1375, 1270 (-С-О-С-), 626 (О-М). Образец 25. Водные растворы 0,91 г (0,003 моль) ДКВ и 1,09 г (0,006 моль) Cu(CH 3COO)2 смешивали в общем объеме 50 мл, рН раствора доводили до 7,2 добавлением 12 %-ного раствора NH 4OH. Масса продукта 1,044 г. Выход 86,8 %. Найдено, %: С 43,8; Н 3,6; Сu 17,0. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3339, 3267 (О-Н), 1617, 1575 (Ar), 1557 (С=О), 1458, 1377, 1268 (-С-О-С-), 625 (О-М). Образец 26. Водные растворы 0,91 г (0,003 моль) ДКВ и 1,09 г (0,006 моль) Cu(CH 3COO)2 смешивали в общем объеме 50 мл, рН раствора доводили до 8,0 добавлением 12 %-ного раствора NH 4OH. Масса продукта 1,037 г. Выход 86,2 %. Найдено, %: С 42,5; Н 3,5; Сu 16,9. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3347, 3266 (О-Н), 1616, 1575 (Ar), 1556 (С=О), 1462, 1381, 1269 (-С-О-С-), 625 (О-М). Образец 27. Водные растворы 1,82 г (0,006 моль) ДКВ и 2,18 г (0,012 моль) Cu(CH 3COO)2 смешивали в общем объеме 100 мл. Масса продукта 1,9473 г. Выход 80,9 %. Найдено, %: С 46,0; Н 3,7; Сu 15,9. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3401 (О-Н), 1618, 1575 (Ar), 1561 (С=О), 1445, 1384, 1271 (-С-О-С-), 625 (О-М). 3.2.3 Синтез и оптимизация комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином Кальциевый комплекс синтезировали в течение 1 ч при постоянном перемешивании в водной среде при 80 оС, водно-спиртовой и спиртовой средах при 25 оС, рН растворов доводили до 8,0 добавлением 6,5 %-ного раствора 120 NH 4OH. После охлаждения полученный осадок отфильтровывали, промывали водой или водно-спиртовой смесью или этанолом в зависимости от среды проведения синтеза. Завершали промывание осадка чистым этанолом. Затем высушивали в сушильном шкафу при 50 оС до влажности не более 7 %, а затем при 105 о С до постоянной массы. Полученный продукт представлял собой порошок от зеленовато-коричневого до коричневого цвета, нерастворимый в воде, этаноле, ацетоне, малорастворимый в ДМСО. Образец 28. Эквимольные количества ДКВ (1,52 г, 0,005 моль) и CaCl2 (0,555 г, 0,005 моль) смешивали в водно-этанольном растворе (70 % этанола) общим объемом 50 мл. Масса образовавшегося продукта 0,067 г. Выход 3,5 %. Найдено, %: С 39,4; Н 3,7; Са 9,7. Вычислено для С15Н14О9Са здесь и далее в последующих десяти опытах, %: С 47,6; Н 3,7; О 38,1; Са 10,6. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3428 (О-Н), 1636 (С=О), 1603, 1550 (Ar), 1445, 1379, 1282 (-С-О-С-), 597 (ОМ). Образец 29. Эквимольные количества ДКВ (1,52 г, 0,005 моль) и Ca(CH 3COO)2∙Н 2О (0,88 г, 0,005 моль) смешивали в водно-этанольном растворе (70 % этанола) общим объемом 50 мл. Масса продукта 0,250 г. Выход 13,2 %. Найдено, %: С 45,6; Н 3,6; Са 9,8. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3430 (О-Н), 1634 (С=О), 1607, 1550 (Ar), 1445, 1384, 1281 (-С-О-С-), 598 (О-М). Образец 30. Эквимольные количества ДКВ (1,52 г, 0,005 моль) и Ca(NO 3)2∙4Н2О (1,18 г, 0,005 моль) смешивали в водно-этанольном растворе (70 % этанола) общим объемом 50 мл. Масса продукта 0,251 г. Выход 13,3 %. Найдено, %: С 45,2; Н 3,9; Са 9,3. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3427 (О-Н), 1635 (С=О), 1615, 1550 (Ar), 1445, 1384, 1283 (-С-О-С-), 598 (О-М). Образец 31. Эквимольные количества ДКВ (1,52 г, 0,005 моль) и Ca(NO 3)2∙4Н2О (1,18 г, 0,005 моль) смешивали в этанольном растворе общим объемом 50 мл. Масса продукта 0,934 г. Выход 49,4 %. Найдено, %: С 42,5; Н 4,2; Са 10,7. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3427 (О-Н), 1636 (С=О), 1604, 1550 (Ar), 1445, 1384, 1262 (-С-О-С-), 597 (О-М). 121 Образец 32. Эквимольные количества ДКВ (1,52 г, 0,005 моль) и Ca(NO 3)2∙4Н2О (1,18 г, 0,005 моль) смешивали в водном растворе общим объемом 50 мл. Масса продукта 1,09 г. Выход 57,7 %. Найдено, %: С 45,3; Н 3,9; Са 10,8. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3347, 3273 (О-Н), 1609, 1596 (Ar), 1568 (С=О), 1446, 1352, 1259 (-С-О-С-), 603 (О-М). Образец 33. Эквимольные количества ДКВ (0,38 г, 0,00125 моль) и Ca(CH 3COO)2∙Н 2О (0,22 г, 0,00125 моль) смешивали в водном растворе общим объемом 50 мл. Масса продукта 0,031 г. Выход 6,6 %. Найдено, %: С 44,0; Н 3,7; Са 10,6. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3402, 3263 (О-Н), 1611, 1597 (Ar), 1569 (С=О), 1446, 1350, 1259 (-С-О-С-), 605 (О-М). Образец 34. Эквимольные количества ДКВ (0,76 г, 0,0025 моль) и Ca(CH 3COO)2∙Н 2О (0,44 г, 0,0025 моль) смешивали в водном растворе общим объемом 50 мл. Масса продукта 0,212 г. Выход 22,4 %. Найдено, %: С 39,3; Н 4,0; Са 10,7. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3359, 3292 (О-Н), 1610, 1597 (Ar), 1568 (С=О), 1447, 1354, 1260 (-С-О-С-), 604 (О-М). Образец 35. Эквимольные количества ДКВ (1,52 г, 0,005 моль) и Ca(CH 3COO)2∙Н 2О (0,88 г, 0,005 моль) смешивали в водном растворе общим объемом 50 мл. Масса продукта 1,022 г. Выход 54,1 %. Найдено, %: С 45,3; Н 5,1; Са 10,4. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3363, 3277 (О-Н), 1613, 1596 (Ar), 1569 (С=О), 1448, 1349, 1259 (-С-О-С-), 605 (О-М). Образец 36. Эквимольные количества ДКВ (3,04 г, 0,01 моль) и Ca(CH 3COO)2∙Н 2О (1,76 г, 0,01 моль) смешивали в водном растворе общим объемом 50 мл. Масса продукта 2,225 г. Выход 58,9 %. Найдено, %: С 43,4; Н 3,6; Са 9,3. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3351, 3270 (О-Н), 1613, 1593 (Ar), 1571 (С=О), 1446, 1351, 1258 (-С-О-С-), 605 (О-М). Образец 37. Водные растворы ДКВ (1,52 г, 0,005 моль) и Ca(CH 3COO)2∙Н2О (1,76 г, 0,01 моль) смешивали в общем объеме 50 мл. Масса продукта 1,103 г. Выход 58,4 %. Найдено, %: С 45,1; Н 4,1; Са 11,0. Масс-спектр (DART-MS), m/z (Iотн, %): 336 (н.и.), 303 (ДКВ-H)-, 301 (ДКВ-2H-H)-, 285 (M-H-H 2O)-, 255 (н.и.), 122 227 (н.и.), 219 (н.и.), 193 (н.и.), 179 (н.и.),153 (н.и.). ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3382, 3264 (О-Н), 1611, 1597 (Ar), 1569 (С=О), 1446, 1350, 1259 (-С-О-С-), 604 (О-М). Образец 38. Водные растворы ДКВ (1,52 г, 0,005 моль) и Ca(CH 3COO)2∙Н2О (2,64 г, 0,015 моль) смешивали в общем объеме 50 мл. Масса продукта 1,327 г. Выход 70,2 %. Найдено, %: С 44,9; Н 4,1; Са 10,6. ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3392, 3271 (О-Н), 1613, 1597 (Ar), 1570 (С=О), 1447, 1349, 1259 (-С-О-С-), 605 (О-М). Соединения 28-38 характеризуются следующими данными 1Н и 13 С ЯМР спектроскопии [142]: Спектр ЯМР 1Н [Ca(C15H11O 7)(OH)(H2O)] в ДМСО-d6 в области от 4 до 12,5 м.д. содержит следующие сигналы (δ, м.д.): 4,21 (1Н, дублет, J = 10,4 Гц, Н-3); 4,70 (1Н, дублет, J = 10,4 Гц, Н-2); 5,09 (1Н, уширенный синглет, 3-ОН); 5,37 (1Н, синглет, Н-8); 5,41 (1Н, дублет, J = 1,4 Гц, Н-6); 6,66 (2Н, уширенный синглет, Н5´, Н-6´); 6,80 (1Н, синглет, Н-2΄); 12,10 (1Н, синглет, 5-ОН). Химические сдвиги ядер 13 С [Ca(C15H 11O 7)(OH)(H2O)] в ДМСО-d6 (δ, м.д.): 71,4 (С-3); 82,6 (С-2); 95,8 (С-8); 96,4 (С-6); 99,3 (С-4а); 114,9 (С-5΄); 114,9 (С-2΄); 119,0 (С-6΄); 128,7 (С-1΄); 145,1 (С-3΄); 145,7 (С-4΄); 163,2 (С-8а); 163,2 (С-5); 166,8 (С-7); 198,9 (С-4). 3. 3 Определение ионов металлов в анализируемых растворах 3.3.1 Определение содержания ионов цинка Содержание ионов цинка в анализируемом растворе определяли комплексонометрическим титрованием трилоном Б (индикатор - кислотный хром черный специальный) по [141] m(Zn2+)=(N(ТрБ)⋅Mэ(Zn2+)⋅V(ТрБ)⋅Vобщ)/(Vал⋅1000), г, формуле где N(ТрБ) - эквивалентная концентрация трилона Б, моль-экв/л, Mэ(Zn2+) - эквивалентная масса иона цинка, г-экв/моль, V(ТрБ) - объем трилона Б, пошедшего на титрование, мл, Vобщ - объем анализируемого раствора, мл, Vал - объем аликвоты, мл. 123 Установление эквивалентной концентрации трилона Б. Из раствора ГСО, содержащего ионы Zn2+ 1 мг/мл, готовили водные растворы объемом 10 мл с содержанием иона цинка 1 и 2 мг, добавляли 2 мл аммиачного буферного раствора, 3-4 капли индикатора кислотный хром черный и титровали раствором трилона Б. Эквивалентную концентрацию трилона Б рассчитывали по формуле: N(ТрБ)=m(Zn2+)⋅1000/(V(ТрБ)⋅Мэ(Zn2+)). 3.3.2 Определение содержания ионов меди (II) Содержание ионов меди (II) в анализируемом растворе в виде аммиачного комплексного соединения определяли спектрофотометрическим методом. В мерную колбу емкостью 50 мл помещали аликвоту анализируемого раствора 1 мл, добавляли 10 мл раствора аммиака 1:1, доводили водой до метки и тщательно перемешивали. Оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектрофотометре в максимуме поглощения при 590 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см. По градуировочному графику определяли концентрацию иона меди (мг/ мл) и рассчитывали содержание (мг) меди в анализируемом растворе по формуле m(Cu2+)=С(Сu2+)∙Vобщ∙50/Vал∙1000, где С(Сu2+) - концентрация ионов меди, мг/мл, V общ - объем анализируемого раствора, мл, Vал - объем аликвоты, мл. Для построения калибровочного графика были приготовлены эталонные растворы, в которых значения концентраций ионов меди составляли 0,04; 0,08; 0,12; 0,16 и 0,20 мг/мл. Для этого в мерные колбы емкостью 50 мл помещали 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 и 10,0 мл стандартного раствора ионов меди, добавляли по 10 мл раствора аммиака (1:1), доводили до метки дистиллированной водой и перемешивали. Оптическую плотность приготовленных эталонных растворов измеряли через 5-7 мин после их приготовления в максимуме поглощения при 590 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см, начиная с минимальной концентрации. По полученным значениям строили график зависимости А=f(C). Уравнение зависимости имеет вид: у=2,0455 х; R2=0,9916. 124 3.3.3 Определение содержания ионов кальция Содержание ионов Са2+ в исследуемом растворе определяли методом комплексонометрического титрования трилоном Б с мурексидом [167]. В коническую колбу отмеряли 0,1 мл анализируемого раствора, доводили до 100 мл дистиллированной водой, добавляли 2 мл раствора NaOH 8 %, 0,1-0,2 г индикатора мурексида и титровали раствором трилона Б до перехода окраски из розовой в красно-фиолетовую. Титрование повторяли трижды и при отсутствии допустимых расхождений, предполагаемых [167], использовали среднее значение. 3.4 Расчет количества связанной воды в составе комплексов Расчет количества кристаллизационной воды в составе комплексов проводили, исходя из данных потери массы при термогравиметрии с учетом данных элементного анализа и РСЭДМА по следующему алгоритму: 1) по данным элементного анализа и РСЭДМА рассчитывали соотношение Zn2+:ДКВ- в составе комплексов; 2) представляли М(xДКВ yМеt nН2О) в виде a+18n, где a - М(xДКВ + yМет), n - число молекул Н 2О в составе комплексов; 3) по термограммам вычисляли ∆m(%) = ∆m1 + ∆ m2; 4) рассчитывали остаток массы образца после потери b(%) = 100% - ∆m; 5) рассчитывали n с помощью пропорции: a(г) - b(%) 18n(г) - ∆m(%). 125 3.5 Определение антиоксидантной активности комплексных соедиений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином in vitro 3.5.1 Приготовление растворов для выбора действующей концентрации Из 1% суспензий КС в ДМСО готовили растворы следующих концентраций – 0,1; 0,01; 0,005; 0,0025; 0,001% в ДМСО. Для приготовления анализируемых растворов к 0,5 мл каждого из полученных растворов добавляли по 2,5 мл плазмы крови. Контролем являлся раствор, содержащий 2,5 мл плазмы крови и 0,5 мл ДМСО. Контроль и каждый из анализируемых растворов исследовали в трех параллельных опытах. 3.5.2 Определение малонового диальдегида в плазме крови В пробирку с 0,3 мл анализируемого раствора вносили 2,4 мл 1/12 Н 2SO4 и 0,3 мл 10% фосфорно-вольфрамовой кислоты, перемешивали и инкубировали 10 мин. Далее центрифугировали в течение 10 мин при 3000 оборотов (об.)/мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок дважды промывали 1 мл дистиллированной воды. В отмытый осадок добавляли 3 мл воды и 1 мл свежеприготовленного раствора ТБК в уксусной кислоте. Закрытые пробирки кипятили на водяной бане при 96 оС в течение 1 ч, затем охлаждали в холодной воде и центрифугировали в течение 15 мин при скорости центрифугирования 3000 об./мин. Оптическую плотность исследуемого раствора измеряли при 532 нм в кювете 1 см против дистиллированной воды. Каждый из анализируемых растворов исследовали в шести параллельных опытах. Расчет количества МДА, нмоль/л, проводили с учетом разбавления для плазмы К=21,36 [156]. 3.5.3 Определение диеновых и триеновых конъюгатов в плазме крови Определение диеновых и триеновых конъюгатов в плазме крови проводили методом экстракции липидов смесью гептана и изопропилового спирта (1:1, 126 об./об.). Содержание ДК определяли по оптической плотности гептанового экстракта при λ=232 нм, ТК при λ=275 нм. В пробирку с 0,3 мл анализируемого раствора вносили 0,7 мл дистиллированной воды, 9 мл смеси гептан-изопропиловый спирт и интенсивно встряхивали в течение 5 мин, центрифугировали 5 мин при 3000 об./мин до расслоения фаз. Для верхнего гептанового слоя определяли оптическую плотность на фоне гептана. Каждый из анализируемых растворов исследовали в шести параллельных опытах. Количество ДК и ТК в условных единицах (у.е.) рассчитывали по формуле Х=(D∙4,5)/0,3, где Х – содержание ДК или ТК, D оптическая плотность гептанового слоя для анализируемого раствора [159]. 3.5.4 Определение активности каталазы Определение анализируемых активности растворов каталазы в плазме металлокомплексов крови и под ДКВ влиянием проводили спектрофотометрическим методом по цветной реакции с молибдатом аммония [160]. Интенсивность окраски соединения, образующегося в результате реакции пероксида водорода с молибденом, характеризует активность каталазы в анализируемой пробе, поскольку зависит от количества перекиси, неразрушенной каталазой [168]. Реакцию запускали добавлением 0,01 мл анализируемого раствора к 2 мл свежеприготовленного раствора перекиси водорода (0,05 мл 30% перекиси водорода доводили водой до 50 мл). В холостую пробу вместо анализируемого раствора вносили 0,01 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливали через 10 мин добавлением 1 мл 4%-ного молибдата аммония. Интенсивность развившейся окраски измеряли при λ=410 нм против контрольной пробы, в которую вместо перекиси водорода вносили 2 мл воды [160]. Каждый из анализируемых растворов исследовали в шести параллельных опытах. Активность каталазы (в %) рассчитывали по формуле Кат=100∙(Dx –Dоп)/ D x, где 127 Dx – оптическая плотность холостой пробы, Dоп - оптическая плотность анализируемой пробы. ВЫВОДЫ 1. Впервые изучены реакции образования комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с транс-(+)-2R3R дигидрокверцетином – продуктом глубокой переработки древесины лиственницы, в водной и водно-спиртовой средах, приводящие к образованию КС с сохранением конфигурации 2R3R аномерных центров и функциональных группировок молекулы флавоноида, отвечающих за проявление биологической активности. 2. Оптимизированы условия синтеза комплексных соединений по выходу целевых продуктов: 72 % КС цинка с ДКВ при двукратном избытке ионов Zn2+ в водной среде, рН 5,1; 89 % КС меди (II) с ДКВ при двукратном избытке ионов Cu2+ в водной среде, рН 5-6; 70 % КС кальция с ДКВ при трехкратном избытке ионов Са2+ в водной среде, рН 8. 3. Впервые установлены структуры комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с транс-(+)-2R3R дигидрокверцетином как [Zn(C15H 11O 7)2(H 2O)2], [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)] и [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)] с определением сайтов связывания иона металла с флавоноидным лигандом. 4. Методом циклической вольтамперометрии на графитовом электроде проведена оценка электрохимических свойств синтезированных комплексов. 5. Определена антиоксидантная активность комплексных соединений в экспериментах in vitro на сливной донорской плазме крови. Установлено, что комплексные соединения цинка, меди (II) и кальция с ДКВ снижают содержание МДА в плазме крови на 14,9 %, 11,2 % и 3,7 %, соответственно. 6. Показана ранозаживляющая активность и выраженное положительное влияние на микрофлору ожоговой раны фармацевтической композиции на основе комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином в эксперименте in vivo на модели термического ожога на белых крысах, что открывает перспективы для использования в медицине. 7. Разработаны лабораторные регламенты получения соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином. комплексных 129 Список литературы 1. Selvaraj, S. Flavonoid-Metal Ion Complexes: A Novel Class of Therapeutic Agents / S. Selvaraj, S. Krishnaswamy, V. Devashya, S. Sethuraman, U.M. Krishnan // Medicinal Research Reviews. - 2013. - V. 33 (5). - P. 1-26. 2. Решетников, В.Н. Производство фитопрепаратов - важная задача науки и производства / В.Н. Решетников // Труды БГУ. - 2010. - Т. 5. - Ч. 2. - С. 7-9. 3. Костюк, В.А. Биорадикалы и биоантиоксиданты. / В.А. Костюк, А.И. Потапович. – Минск, 2004. - 174 с. 4. Трофимова, Н.Н. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 1. Синтез и установление строения комплексов и солей дигидрокверцетина с цинком, медью (II) и кальцием в водных растворах / Н.Н. Трофимова, В.А. Бабкин, Т.И. Вакульская, Е.В. Чупарина // Химия растительного сырья. - 2012. - №2. - С. 51-62. 5. Блажей, А. Фенольные соединения растительного происхождения / А. Блажей, Л. Шутый. – Москва, «Мир». - 1977. - 239 с. 6. Макашев, Ю.А. Кинетика комплексообразования некоторых переходных металлов с кверцетином и морином / Ю.А. Макашев, В.П. Шаронов, С.А. Грачев, В.Е. Миронов, И.Е. Макашева // Изв. АН СССР, Сер. Химическая. - 1976. - № 4. C. 907-909. 7. Черная, Н.В. Экстракционно-фотометрическое определение алюминия в виде кверцетин-антипириновых комплексов / Н.В. Черная, В.Г. Матяшов // Журнал аналитической химии. - 1975. Т. ХХХ. - Вып.4. - C. 698-702. 8. Макашев, Ю.А. О скоростях образования кверцетиновых и мориновых комплексов переходных металлов / Ю.А. Макашев, В.П. Шаронов, В.Е. Миронов, И.Е. Макашева, В.В. Блохин // Журнал общей химии. - 1975. - Т. 45. - №12. - С. 2748. 9. Макашева, И.Е. Взаимодействие кверцетина с ионами меди (II) в водноспиртовых растворах / И.Е. Макашева, М.Т. Головкина // Журнал общей химии. 1973. - Т. 43. - №7. - С. 1640-1645. 129 130 10. Макашева, И.Е. Спектрофотометрическое исследование взаимодействия кверцетина с цинком (II) / И.Е. Макашева, Л.К. Мирзаева, М.Т. Головкина // Журнал общей химии. - 1974. - Т. 44. - №7. - С. 1570-1575. 11. Бабкин, В.А. Биомасса лиственницы: от химического состава до инновационных продуктов./ В.А. Бабкин, Л.А. Остроухова, Н.Н. Трофимова. – Новосибирск, 2011. - 232с. 12. Плотников, М.Б. Лекарственные препараты на основе диквертина / М.Б. Плотников, Н.А. Тюкавкина, Т.М. Плотникова // Томск: Изд-во Томского университета. - 2005. - 228 с. 13. Каррер, П. Курс органической химии / П. Каррер. – Ленинград, «Государственное научно-техническое изд-во химической литературы». – 1962. – 1216 с. 14. Argawal, P.K. Deprotonation-induced 13-C NMR shifts in phenols and flavonoids / P.K Argawal., H.J. Schneider // Tetrahedron Letters. - 1983. - V. 24. - P. 177-180. 15. Malesev, D. Investigation of metal-flavonoid chelates and the determination of flavonoids via flavonoid complexing reactions (rewiew) / D. Malesev, V. Kuntic // J. Serb. Chem. Soc.. - 2007. - Vol 72. - №10. - P. 921-939. 16. Pew, J. A flavanone from Douglas-fir heatwood / J. Pew // J. Am. Chem. Soc. – 1948. – V. 70. – P. 3031-3034. 17. Kurth, E.F. Dihydroquercetin as antioxidant / E.F. Kurth, F.L. Chan // J. Am. Oil Chem. Soc. – 1951. – V. 28, № 10. – P. 433-436. 18. Kurth, E.F. Extraction of tannin and dihydroquercetin from Douglas-fir bark / E.F. Kurth, F.L. Chan // J. Am. Leather Chem. Assoc. – 1953. – V. 48, № 1. – P. 20-32. 19. Тюкавкина, Н.А. Фенольные экстрактивные вещества рода Pinus / Н.А. Тюкавкина, В.И. Луцкий, Н.М. Бородина, А.С. Громова // Химия древесины. 1973. - № 14. – С. 3-18. 20. Тюкавкина, Н.А. Фенольные экстрактивные вещества рода Larix / Н.А. Тюкавкина, К.И. Лаптева, С.А. Медведева // Химия древесины. - 1973. - № 13. – С. 3-17. 130 131 21. Nowak, D. Magnetism of the lanthanides(III) complexes with some polihydroxyflavones / D. Nowak, E. Woznicka, A. Kuzniar, M. Kopacz // Journal of Alloys and Compounds. - 2006. - № 425. - P. 59-63. 22. Roshal, A.D. Structure, stability and spectral properties of complexes of flavones with metal ions of group II / A.D. Roshal, T.V. Sakhno, A.A. Verezubova, L.M. Ptiagina, V.I. Musatov, A. Wroblewska, J. Blazejowski // Functional Materials. – 2003. – V. 10. - № 3. – P. 419-426. 23. Ревина, А.А. Взаимодействие природного пигмента кверцетина с наночастицами серебра в обратных мицеллах / А.А. Ревина, Е.М. Егорова, А.Д. Каратаева // Журн. физ. химии. – 1999. – Т. 73, № 10. – С. 1897 – 1904. 24. De Souza, R.F.V. Synthesis, spectral and electrochemical properties of Al (III) and Zn (II) complexes with flavonoids / R.F.V. De Souza, W.F. De Giovani // Spectrochimica Acta Part A. - 2005. - P. 1985-1990. 25. Cornard, J.P. Spectroscopic and structural study of complexes of quercetin with Al (III) / J.P. Cornard, J.C. Merlin // Journal of Inorganic Biochemistry. - 2002. P. 19-27. 26. Мельникова, Н.Б. Взаимодействие биофлавоноидов с ацетатом меди (II) в водном растворе / Н.Б. Мельникова, И.Д. Иоффе, Л.А. Царева // Хим. прир. соед.. - 2002. - №1. - C. 26-31. 27. Оленович, И.Л. Взаимодействие олова (IV) с кверцетином и морином в присутствии антипирина / И.Л. Оленович, Г.И. Савенко // Журнал аналитической химии. - 1975. - Т. ХХХ. - C. 2158-2161. 28. Головкина, М.Т. Взаимодействие кверцетина с ионами Fe (II) и Fe (III) / М.Т. Головкина, С.В. Караван, М.В. Покровская // Журнал Органической Химии. 1974. - Т. XLIV. - Вып.11. - C. 2569-2572. 29. Черная, Н.В. Экстракционно-фотометрическое определение алюминия в виде кверцетин-антипириновых комплексов / Н.В. Черная, В.Г. Матяшов // Журнал аналитической химии. - 1975. Т. ХХХ. - Вып.4. - C. 698-702. 131 132 30. Moridani, M.Y. Dietary flavonoid iron complexes as cytoprotective superoxide radical scavengers / M.Y. Moridani, J. Pourahmad, H. Bui, A. Siraki, P.J. O'Brien // Free Radical Biology & Medicine. - 2003. - Vol. 34. - № 2. P. 243-253. 31. Leopoldini, M. Iron Chelation by the Powerful Antioxidant Flavonoid Quercetin / M. Leopoldini, N.Russo, S. Chiodo, M. Toscano // J. Agric. Food Chem. 2006. - № 54. P. 6343-6351. 32. Макашева, И.Е. Взаимодействие кверцетина с ионами меди (II) в водноспиртовых растворах / И.Е. Макашева, М.Т. Головкина // Журнал общей химии. 1973. - Т. 43. - №7. - С. 1640-1645. 33. Макашева, И.Е. Спектрофотометрическое исследование взаимодействия кверцетина с цинком (II) / И.Е. Макашева, Л.К. Мирзаева, М.Т. Головкина // Журнал общей химии. - 1974. - Т. 44. - №7. - С. 1570-1575. 34. Желтоухова, Е.П. Комплексные соединения некоторых металлов с кверцетином / Е.П. Желтоухова, О.В. Ковальчукова, Б.Е. Зайцев, С.Б. Страшнова // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: мат. IV Всерос. конф. - Барнаул. - 2009. - T. 2. - C. 217-218. 35. Kooter, I.M. EPR characterization of the mononuclear Cu-containing Aspergillus japonicus quercetin 2,3-dioxygenase reveals dramatic changes upon anaerobic binding of substrates / I.M. Kooter, R.A. Steiner, B.W. Dijkstra, N.P.I. Van, M.R. Egmond, M. Huber // Eur. J. Biochem.. - 2002. - № 269. - P. 2971-2979. 36. Рошаль, А.Д. Теоретический анализ структуры комплексов 5гидроксифлавонолов с ионами металлов и производными бора / А.Д. Рошаль, Т.В. Сахно // Вестник Харьковского национального университета. - 2001. - № 532. Химия. - Вып. 7(30). - С. 123-129. 37. Ren, J. Complexation of flavonoids with Iron: Structure and Optical Signatures / J. Ren, Sh. Meng, Ch.E. Lekka, E. Kaxiras // J. Phys. Chem. B. - 2008. - V. 112. - № 6. - P. 1845-1850. 38. Bodini, M.E. Iron complexes of quercetin in aprotic medium. Redox chemistry and interaction with superoxide anion radical / M.E. Bodini, G. Copia, R. Tapia, F. Leighton, L. Herrera // Polyhedron. - 1999. - № 18. - P. 2233-2239. 132 133 39. Lekka, Ch.E. Structural, Electronic and Optical properties of Representative Cu-Flavonoid Complexes / Ch.E. Lekka, J. Ren, Sh. Meng, E. Kaxiras // J. Phis. Chem. B. - 2009. - V. 113. - P. 6478-6483. 40. Torreggiani, A. Copper(II)-Quercetin complexes in aqueous solutions: spectroscopic and kinetic properties / A. Torreggiani, M. Tamba, A. Trinchero, S. Bonora // Journal of Molecular structure. - 2005. - V. 744-747. - P. 759-766. 41. Щекатихина, А.С. Спектрофотометрическая характеристика комплексов кверцетина, морина, таксифолина и силибинина с ионами меди (II) / А.С. Щекатихина, В.П. Курченко // Труды БГУ. - 2011. - Т. 6. - Ч. 1. - С. 76-85. 42. Ahmadi, S.M. Preparation, Characterization, and DNA Binding Studies of Water-Soluble Quercetin-Molybdenum(IV) Complex / S.M. Ahmadi, G. Dehghan, M.A. Hosseinpurfeizi, J. Ezzati, N. Dolatabadi, S. Kashanian // DNA and Cell Biology. 2011. - V. 30 (7). - P. 517-523. 43. Le Nest, G. Zn–polyphenol chelation: complexes with quercetin, (+)-catechin, and derivatives: II Electrochemical and EPR studies / G. Le Nest, O. Caille, M. Woudstra, S. Roche, B. Burlat, V. Belle, B. Guigliarelli, D. Lexa // Inorganica Chimica Acta. - 2004. – V. 357. – P. 2027–2037. 44. Kuntiс, V. Spectrophotometric Investigation of the Pd(II)-Quercetin Complex in 50% Ethanolic Solution / V. Kuntiс, S. Blagojevic, D. Malesev, Z. Radovic, M. Bogavac // Monatsh. Chem. - 1998. – V. 129. – P. 41-48. 45. Misiak, M. Interactions of flavonoids with transition metal ions / M. Misiak, E. Lodyga-Chruscinska // Pharmachem (Pharmaceuticals). - 2010. - November/December. - P. 39-42. 46. Panhwar, Q.K. Synthesis, characterization, spectroscopic and antioxidation studies of Cu(II)-morin complex / Q.K. Panhwar, Sh. Memon, M.I. Bhanger // Journal of Molecular Structure. - 2010. - V. 967. - P. 47-53. 47. Panhwar, Q.K. Synthesis and evaluation of antioxidant and antibacterial properties of morin complexes / Q.K. Panhwar, Sh. Memon // Journal of Coordination Chemistry. - 2011. - V. 64 (12). - P. 2117-2129. 133 134 48. Panhwar, Q.K. Synthesis, Spectral Characterization and Antioxidant Activity of Tin(II)-Morin Complex / Q.K. Panhwar, Sh. Memon // Pak. J. Anal. Environ. Chem. - 2012. - V. 13. - № 2. - P. 159-168. 49. Panhwar, Q.K. Synthesis and properties of zirconium(IV) and molybdate(II) morin complexes / Q.K. Panhwar, Sh. Memon // Journal of Coordination Chemistry. 2012. - V. 65 (7). - P. 1130-1143. 50. Satterfield, M. Enhanced Detection of Flavonoids by Metal Complexation and Electrospray Ionization Mass Spectrometry / M. Satterfield, J.S. Brodbelt // Anal. Chem.. - 2000. - P. 5898-5906. 51. Le Nest, G. Zn - polyphenol chelation: complexes with quercetin, (+)catechin, and derivatives: I optical and NMR studies / G. Le Nest, O. Caille, M. Woudstra, S. Roche, F. Guerlesquin, D. Lexa // Inorganica Chimica Acta. - 2004. - № 357. - P. 775-784. 52. Zhang, J. Characterization of flavonoids by aluminium complexation and collisionally activated dissociation / J. Zhang, J. Wang, J.S. Brodbelt // Journal of Mass Spectrometry. - 2005. - V. 40. - I. 3. - P. 350-363. 53. Medvidovic-Kosanovic, M. Electroanalytical Characterization of a Copper(II)-Rutin Complex / M. Medvidovic-Kosanovic, M. Samardzic, N. Malatesti, M. Sak-Bosnar // International Journal of Electrochemical Science. - 2011. - V. 6. - P. 1075-1084. 54. Panhwar, Q.K. Synthesis, characterization and antioxidant study of Tin(II)rutin complex: Exploration of tin packaging hazards / Q.K. Panhwar, Sh. Memon // Inorganica Chimica Acta. - 2013. - V. 407. - P. 252-260. 55. Kuntic, V. Effects of Rutin and Hesperidin and their Al(III) and Cu(II) Complexes on in Vitro Plasma Coagulation Assays / V. Kuntic, I. Filipovic, Z. Vujic // Molecules. – 2011. - № 16. – P. 1378-1388. 56. Kuntic, V.S. Spectrophotometric Investigation of Uranil(II)-Rutin Complex in 70% ethanol / V.S. Kuntic, D.L. Malesev, Z.V. Radoviс, M.M. Kosaniс, U.B. Mioс, V.B.Vukojeviс // J. Agric. Food Chem. - 1998. –V. 46. – P. 5139-5142. 134 135 57. Мельникова, Н.Б. Взаимодействие дигидрокверцетина с ионами металлов в водных растворах их солей и в изотонических медицинских средах / Н.Б. Мельникова, И.Д. Иоффе // Химия растительного сырья. - 2001. - № 4. - C. 25-33. 58. Pereira, R.M.S. Synthesis and Characterization of a Metal Complex Containing Naringin and Cu, and its Antioxidant, Antimicrobial, Antiinflammatory and Tumor Cell Cytotoxicity / R.M.S. Pereira, N.E.D. Andrades, N. Paulino, A.C.H.F. Sawaya, M.N. Eberlin, M.C. Marcucci, G.M. Favero, E.M. Novak, S.P. Bydlowski // Molecules. - 2007. - № 12. - P. 1352-1366. 59. Mello, L.D. Electrochemical and spectroscopic characterization of the interaction between DNA and Cu(II)-naringin complex / L.D. Mello, R.M.S. Pereira, A.C.H.F. Sawaya, M.N. Eberlin, L.T. Kubota // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2007. - № 45. - P. 706-713. 60. Fernandes, M.T. Iron and copper chelation by flavonoids: an electrospray mass spectrometry study / M.T. Fernandes, M.L. Mira, M.H. Florencio, K.R. Jennings // Journal of Inorganic Biochemistry. - 2002. - № 92. - P. 105-111. 61. El Amrani, F.B.A. Development of novel DNA cleavage systems based on copper complexes, synthesis and characterizations of Cu(II) complexes of hydroxyflavones / F.B.A. El Amrani, L. Perello, J. Borras, L. Torres // Metal Based Drugs. - 2000. - Vol. 7. - № 6. - P. 365-371. 62. Jungbluth, G. Oxidation of flavonols with Cu(II), Fe(III) in aqueus media / G. Jungbluth, I. Ruhling, W. Ternes // J. Chem. Soc., Perkin Trans. – 2000. - № 2. – P. 1946-1952. 63. Markovic, J.M.D. Comparative spectroscopic and mechanistic study of chelation properties of fisetin with iron in aqueous buffered solutions. Implications on in vitro antioxidant activity / J.M.D. Markovic, Z.S. Markovic, T.P. Brdaric, N.D. Filipovic // Dalton Trans.. - 2011. - № 40. - P. 4560-4571. 64. Elhabiri, M. Complexation of iron (III) by catecholate-type polyphenols / M. Elhabiri, Ch. Carrer, F. Marmolle, H. Nraboulsi // Inorganica Chimica Acta. - 2007. V. 360. - P. 353-359. 135 136 65. El Amrani, F.B.A. Oxidative DNA cleavage induced by an iron(III) flavonoid complex: Synthesis, crystal structure and characterization of chlorobis(flavonolato)(methanol)iron(III) complex / F.B.A. El Amrani, L. Perello, J.A. Real, M. Gonzalez-Alvarez, G. J. Alzuet, Borras, S. Garcia-Granda, J. MontejoBernando / J. Inorg. Biochem. – 2006. – V. 100. - № 7. – P. 1208-1218. 66. Cornard, J.P. Structural and spectroscopic investigation of 5-hydroxiflavone and its complex with aluminium / J.P. Cornard, J.C. Merlin // Journal of Molecular Structure. - 2001. - P. 129-138. 67. Cornard, J.P. Complexes of Al (III) with 3′4′-dihydroxiflavone: characterization, theoretical and spectroscopic study / J.P. Cornard, A.C. Boudet, J.C. Merlin // Spectrochimica Acta Part A. - 2001. - P. 591-602. 68. Zhang, J. Characterization of flavonoids by aluminium complexation and collisionally activated dissociation / J. Zhang, J. Wang, J.S. Brodbelt // Journal of Mass Spectrometry. - 2005. - V. 40. - I. 3. - P. 350-363. 69. Dangleterre, L., Cornard J., Lapouge Ch. Spectroscopic and theoretical investigation of the solvent effects on Al(III)-hydroxyflavone complexes / L. Dangleterre, J. Cornard, Ch. Lapouge // Polyhedron. – 2008. - № 27. – P. 1581-1590. 70. Uivarosi, V. Synthesis and Characterization of Some New Complexes of Magnesium (II) and Zinc (II) with the Natural Flavonoid Primuletin / V. Uivarosi, M. Badea, R. Olar, C. Draghici, S.F. Barbuceanu // Molecules. – 2013. - № 18. – P. 76317645. 71. Zhou, J. Synthesis, characterization, antioxidative and antitumor activities of solid quercetin rare earth(III) complexes. / J. Zhou, L.F. Wang, J.Y. Wang, N. Tang // J. Inorg. Biochem. – 2001. - V. 83. - P. 41-48. 72. Zhou, J. Antioxidative and anti-tumour activities of solid quercetin metal(II) complexes / J. Zhou, L.F. Wang, J.Y. Wang, N. Tang // Transition Metal Chemistry. – 2001. – V. 26. – P. 57-63. 73. Kopacz, M. Complexes of Pr3+, Nd3+, Eu3+, Gd3+, Dy3+, and Er3+ Ions with Quercetin-5′-Sulfonic Acid / M. Kopacz, D. Novak // Microchemical Journal. – 1993. – V. 47 (3). – P. 338-344. 136 137 74. Kopacz, M. New Complexes of Samarium(III), Terbium(III) and Holmium(III) with Quercetin-5'-sulfonic Acid / M. Kopacz, D. Novak // Polish Journal of Chemistry. – 2000. – V. 74, № 3. – P. 303-309. 75. Kopacz, M. New complexes of La(III), Ce(III), Tm(III), Yb(III) and Lu(III) with quercetin-5'-sulfonic acid / M. Kopacz, D. Novak, M.H. Umbreit, J. Klos // Polish Journal of Chemistry. – 2003. – V. 77, № 12. – P. 1787-1796. 76. Badea, M. Thermal behavior of some vanadyl complexes with flavone derivatives as potential insulin-mimetic agents / M. Badea, R. Olar, V. Uivarosi, D. Marinescu, V. Aldea, S.F. Barbuceanu, G.M. Nitulescu // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. - 2011. - V. 105. - P. 559-564. 77. Панченко, Л.Ф. Клиническая биохимия микроэлементов / Л.Ф. Панченко, И.В. Маев, К.Г. Гуревич. – М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2004. – 368 с. 78. Биохимия: учебник / Под ред. чл.-корр. РАН Е.С.Северина. – 5-е изд., испр. и доп. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 768 с., ил. 79. Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология. Пер. с англ. под ред. А.И. Арчакова, М.П. Кирпичникова, А.Е. Медведева, В.П. Скулачева / В. Эллиот, Д. Эллиот. М.: издательство НИИ биомедицинской химии РАМН, 1999. – 372 с., ил. 80. Теппермен, Дж. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс: Пер. с англ. / Дж. Теппермен, Х. Теппермен – М.: Мир, 1989. – 656 с., ил. 81. Марри, Р. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 2. Пер. с англ. / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. - М.: Мир, 1993. – 415 с., ил. 82. Авцын, А.П. Микроэлементозы человека (этиология, классификация, органопатология) / А.П. Авцын, А.А. Жаворонков, М.А. Риш, Л.С. Строчкова. М.: Медицина, 1991. – 496 с. 83. Бышевский, А.Ш. Биохимия для врача / А.Ш. Бышевский, О.А. Терсенов. – Екатеринбург: ИПП «Уральский рабочий», 1994. – 384 с., ил. 84. Лойко, О.П. Синтез и изучение биологической активности комплексных соединений кверцетина с некоторыми d-металлами / О.П. Лойко, Р.М. Маулетова, 137 138 А.А. Машенцева, А.И. Халитова, Б.И. Тулеуов // Химия и химическая технология: материалы I Международной Российско-Казахстанской конференции / Томский политехнический университет. – Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2011. – С. 313-316. 85. Булатов, М.И. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. – 5-е изд. / М.И. Булатов, И.П. Калинкин.– Ленинград: «Химия», Ленинградское отделение. – 1986. – 432 с. 86. Guo, M. Iron-binding properties of plant phenolics and cranberry,s bio-effects / M. Guo, C. Perez, Y. Wei, E. Rapoza, G. Su, F. Bou-Abdallah, N.D. Chasteen // Dalton Trans. - 2007. – № 21 (43) – P. 4951-4961. 87. Тарасевич, Б.Н. ИК спектры основных классов органических соединений. Справочные материалы / Б.Н. Тарасевич. – Москва. – 2012. – 54 с. 88. Васильев, А.В. Инфракрасная спектроскопия органических и природных соединений / А.В. Васильев, Е.В. Гриненко, А.О. Щукин, Т.Г.Федулина. – СПб, СПбГЛТА. – 2007. – 29 с. 89. Бови, Ф.А. ЯМР высокого разрешения макромолекул / Ф.А. Бови. Москва, «Химия». – 1977. – 456 с. 90. Писарев, Д.И. Масс-спектрометрия: история и перспективы использования / Д.И. Писарев, О.О. Новиков, Д.А. Фадеева, Е.Т. Жилякова, В.С. Казакова, Н.А. Писарева / Молодой ученый. — 2012. — №10. — С. 99-104. 91. Damnjanovic, B. Comparison of MALDI-TOF mass spectra of [PdCl(dien)]Cl and [Ru(en)2Cl2]Cl acquired with different matrices / B. Damnjanovic, B. Petrovic, J. Dimitric-Marcovic, M. Petkovic // Journal of the Serbian Chemical Society. - 2011. - V. 76, № 12. - P. 1687-1701. 92. Селиванова, И.А. Исследование кристаллической структуры дигидрокверцетина / И.А. Селиванова, Н.А. Тюкавкина, Ю.А. Колесник, В.Н. Нестеров, Л.Н. Кулешова, В.А. Хуторянский, Б.Н. Баженов, М.Ю. Сайботалов // Химико-фармацевтический журнал. - 1999. - Т. 73. - № 4. - С. 51-53. 138 139 93. Вязникова, М.Ю. Исследование связанной воды в кверцетине / М.Ю. Вязникова, С.С. Николаева, Л.П. Смирнова, В.А. Быков Химико- // фармацевтический журнал. - 1997. - Т. 31. - № 2. - С. 39-41. 94. Вязникова, М.Ю. Исследование состояния воды в стандартном образце дигидрокверцетина и в новом фитопрепарате диквертине / М.Ю. Вязникова, С.С. Николаева, В.А. Быков, Л.В. Яковлева, И.А. Руленко, Н.А. Тюкавкина, Ю.А. Колесник // Химико-фармацевтический журнал. - 1997. - Т. 31. - № 2. - С. 42-45. 95. Селифонова, Е.И. Термогравиметрическое изучение L-α-аминокислот / Е.И. Селифонова, Р.К. Чернова, О.Е. Коблова // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. - 2008. - Т. 8. - № 2. - С. 23-28. 96. Бойко, Б.Н. Дифференциальная сканирующая калориметрия в исследовании и контроле лекарственных веществ, новые приборы и методы / Б.Н. Бойко // Двойные технологии. - 2010. - №4. - С. 56-60. 97. Червяковский, Е.М. Роль флавоноидов в биологических реакциях с переносом электронов / Е.М. Червяковский, В.П. Курченко, В.А. Костюк // Труды БГУ. - 2009. - Т. 4. - Ч. 1. - С. 9-26. 98. Heim, K.E. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structureactivity relationships / K.E. Heim, A.R. Tagliaferro, D.J. Bobilya // J Nutr. Biochem. 2002. - V. 13. - P. 572-584. 99. Конкина, И.Г. Сравнительная оценка реакционной способности кверцетина и дигидрокверцетина по отношению к пероксильным радикалам / И.Г. Конкина, С.А. Грабовский, Ю.И. Муринов, Н.Н. Кабальнова // Химия растительного сырья. - 2011. - № 3. - С. 207-208. 100. Lodovici, M. Antioxidant and radical scavenging properties in vitro of polyphenolic extracts from red wine / M. Lodovici, F. Guglielmi, C. Casalini, M. Meoni, V. Cheynier, P. Dolara // European Journal of Nutrition. - 2001. - V. 40. - № 2. - P. 74-77. 101. Владимиров, Ю.А. Дигидрокверцетин (таксифолин) и другие флавоноиды как ингибиторы образования свободных радикалов на ключевых 139 140 стадиях апоптоза / Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурнина, Е.М. Демин, Н.С. Матвеева, О.Б. Любицкий, А.А. Новиков, Д.Ю. Измайлов, А.Н. Осипов, В.П. Тихонов, В.Е. Каган // Биохимия. - 2009. - Т. 74. - Вып. 3. - С. 372-379. 102. Долгодилина, Е.В. Антиоксидантные и прооксидантные свойства некоторых флавоноидов / Е.В. Долгодилина, Т.А. Кукулянская // Труды БГУ. 2009. - Т. 4. - Ч. 1. - С. 149-153. 103. Червяковский, Е.М. Спектральные свойства полифенольных соединений из наружных чешуй лука Allium Cera / Е.М. Червяковский // Труды БГУ. - 2007. - Т. 2. - Ч. 1. - С. 110-120. 104. Caltagirone, S. Flavonoids apigenin and quercetin inhibit melanoma growth and metastatic potential / S. Caltagirone, C. Rossi, A. Poggi, F.O. Ranelletti, P.G. Natali, M. Brunetti, F.B. Aiello, M. Piantelli // Int. J. Cancer. - 2000. - V. 87. - P. 595600. 105. Doc-Go, H. Neuroprotective effects of antioxidative flavonoids, quercetin, (+)-dihydroquercetin and quercetin 3-methyl ether, isolated from Opuntia ficus-indica var. saboten / H. Doc-Go, K.H. Lee, H.J. Kim, E.H. Lee, J. Lee, Y.S. Song, Y.-H. Lee, C. Jin, Y.S. Lee, J. Cho // Brain Research. - 2003. - № 965. - P. 130-136. 106. Мустафаев, О.Н. Зависимость антимутагенной активности флавоноидов от их структурных особенностей / О.Н. Мустафаев, С.К. Абилев, В.А. Мельник, В.А. Тарасов // Экологическая генетика. - 2005. - Т. 3. - № 4. - С. 11-18. 107. Цыдендамбаев, П.Б. Биологические эффекты флавоноидов / П.Б. Цыдендамбаев, Б.С. Хышиктуев, С.М. Николаев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2006. - № 6 (52). - С. 229-233. 108. Косарева, Д.И. О взаимодействии флавоноидов с клеточными мембранами / Д.И. Косарева, Р.Р. Шарафутдинова, М.Х. Зелеев, Г.Н. Загитов, Р.И. Галеева // Медицинский вестник Башкортостана. - 2008. - Т. 3. - № 6. - С. 45-47. 109. Савинцева, И.В. Исследование влияния дигидрокверцетина на стабильность коллагеновых фибрилл и активность клеток, культивируемых в 140 141 коллагеновых гелях / И.В. Савинцева, Т.В. Суханова, И.И. Селезнева / Биология клетки в культуре: Всерос. симп. – СПб. – 2006. – С. 796. 110. Тараховский, Ю.С. Ускорение фибриллообразования и температурная стабилизация фибрилл коллагена в присутствии таксифолина (дигидрокверцетина) / Ю.С. Тараховский, И.И. Селезнева, Н.А. Васильева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 12. – С. 640-643. 111. Карлина, М.В. Разработка микроэмульсии с дигидрокверцетином и ее биофармацевтическая оценка / М.В. Карлина, О.Н. Пожарицкая, А.Н. Шиков // Химико-фармацевтический журнал. - 2009. - Т. 43, № 6. – С. 46-48. 112. Тараховский, Ю.С. Фибриллы из таксифолина как основа наноизделий для биомедицины / Ю.С. Тараховский, Ю.А. Ким, Г.Р. Иваницкий // Доклады Академии наук. - 2008. - Т. 422. - № 2. - С. 262-264. 113. Symonowicz, M. Flavonoids and their properties to form chelate complexes / M. Symonowicz, M. Kolanek // Biotechnol Food Sci. - 2012. - V. 76 (1). - P. 35-41. 114. Tang, H. Synthesis, characterization and biological activities of Pt(II) and Pd(II) complexes with 2,3,4,5,7-pentahydroxyflavone / H. Tang, X. Wang, S. Yang, L. Wang // Rare Metals. – 2004. – V. 23. – P. 38-42. 115. De Souza, R.F. Antioxidant properties of complexes of flavonoids with metal ions / R.F. De Souza, W.F. De Giovani // Redox Rep. - 2004. - V. 9 (2). - P. 97104. 116. Пегова, И.А. Разработка минерало-биотических комплексов «дигидрокверцетин – аспарагинаты металлов»: автореф. дис. на соиск. уч. ст. канд. фарм. наук : 15.00.02 / И.А. Пегова. – Самара, 2007. – 24 с. 117. Durgo, K. Cytotoxic and genotoxic effects of the quercetin/lanthanum complex on human cervical carcinoma cells in vitro / K. Durgo, I. Halec, I. Sola, J. Franekic // Arh Hig Rada Toksicol. - 2011. - V. 62. - P. 221-227. 118. Bravo, A. Metal complexes of the flavonoid quercetin: antibacterial properties / A. Bravo, J.R. Anacona // Transition Metal Chemistry. - 2001. - V. 26. - P. 20-23. 141 142 119. Зиятдинова, Г.К. Вольтамперометрическое поведение соединений фенольного ряда, обладающих антиоксидантными свойствами / Г.К. Зиятдинова, Д.М. Гильметдинова, Г.К. Будников, Е.Н. Офицеров // Ученые записки Казанского государственного университета. - 2005. - Т. 147. - № 1. - С. 141-149. 120. Timbola, A.K. Electrochemical Oxidation of Quercetin in Hydro-Alcoholic Solution / A.K. Timbola, C.D. De Souza, C. A. Giacomelli, Spinelli // J. Braz. Chem. Soc. – 2006. – V. 17. - № 1. - P. 139-148. 121. Dangles, O. One-electron oxidation of quercetin and quercetin derivatives in protic and non protic media / O. Dangles, G. Fargeix, C. Dufour // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 - 1999. - P. 1387-1395. 122. Баженов, Б.Н. Антиоксидантные и электрохимические свойства моносукцината дигидрокверцетина – нового водорастворимого производного природного флавоноида / Б.Н. Баженов, Г.Д. Елисеева, Е.Е. Золотарев, А.В. Кашевский, А.Ю. Сафронов, Б.Л. Финкельштейн / Химия растительного сырья. 2013. - № 3. - C. 107-112. 123. Пат. 2088256 РФ. Средство для комплексной терапии заболеваний диквертин и способ его получения / Н.А. Тюкавкина, В.А. Хуторянский, Б.Н. Баженов // Б.И. – 1977. - № 24. 124. Пат. 2091076 РФ. Способ получения дигидрокверцетина / В.А. Хуторянский, Б.Н. Баженов, М.Ю. Сайботалов, Н.А. Тюкавкина // Б.И. – 1997. - № 27. 125. Пат. 2165416 РФ. Способ переработки древесины лиственницы и способ выделения нативных биофлавоноидов, полученных в процессе переработки / А.А. Уминский // Б.И. – 2001. - № 4. 126. Пат. 2000797 РФ. Способ выделения дигидрокверцетина / В.А. Бабкин, Н.А. Тюкавкина, Л.А. Остроухова, Ю.К. Святкин, С.Я. Соколов // Б.И. – 1993. - № 37. 127. Пат. 2082425 РФ. Способ получения дигидрокверцетина / В.А. Бабкин, Л.А. Остроухова, В.В. Глазырин, Ю.К. Святкин, Д.В. Бабкин, В.Г. Воробьев, Н.П. Селиванов // Б.И. – 1996. - № 13. 142 143 128. Пат. 2158598 РФ. Способ получения дигидрокверцетина / В.А. Бабкин, Л.А. Остроухова, Д.В. Бабкин, Ю.А. Малков // Б.И. – 2000. - № 31. 129. Пат. 2386624 РФ. Способ получения дигидрокверцетина из отходов лесозаготовки и лесопереработки лиственницы / Б.М. Кершенгольц, М.М. Шашурин, Е.С. Хлебный, А.А. Шеин, А.Н. Журавская, О.И. Ломовский, М.А. Жуков // Б.И. – 2010. - № 11. 130. Тюкавкина, Н.А. Физико-химическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца / Н.А. Тюкавкина, В.А. Чертков, Б.Н. Баженов, В.Л. Белобородов, И.А. Селиванова, А.М. Савватеев // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Х Международный съезд "Фитофарм 2006". - СПб. - 2006. - С. 338-342. 131. Зенкевич, стереоизомерия И.Г. Сравнительная дигидрокверцетина. характеристика Состав флавоноидного свойств и комплекса лиственницы / И.Г. Зенкевич, Ю.А. Ещенко, В.Г. Макаров, Ю.А. Колесник, Д.А. Шматков, В.П. Тихонов, В.М. Ташлицкий // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения. Фитофарм-2006: матер. Х междунар. Съезда. СПб. - 2006. - С. 93-109. 132. Ещенко, А.Ю. Особенности разделения энантиомеров дигидрокверцетина с использованием хирального модификатора подвижной фазы / А.Ю. Ещенко, И.Г. Зенкевич // Фитофарм-2006: матер. Х междунар. Съезда. – СПб, 2006. - С. 85-93. 133. Зенкевич, И.Г Особенности стереоизомерного состава и некоторые физико-химические свойства природного дигидрокверцетина / И.Г. Зенкевич, В.Г. Макаров, А.Ю. Ещенко // Растительные ресурсы. - 2006. - Т. 42. - № 3. - С. 81-92. 134. Трофимова, Н.Н. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 2. Оптимизация реакции комплексообразования цинка с дигидрокверцетином в водной среде / Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин // Химия растительного сырья. - 2013. - № 3. - С. 91-97. 143 144 135. Столповская, Е.В. Оптимизация реакций комплексообразования ионов Zn2+ и Cu2+ с (+)-дигидрокверцетином / Е.В. Столповская, Н.Н. Трофимова, В.А. Бабкин / Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии: мат. XXVII Международной научно-технической конф. "Реактив-2013". - Иркутск, 2125 октября 2013 г. - С. 31. 136. Трофимова, Н.Н. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 3. Изучение кинетики реакции комплексообразования меди с дигидрокверцетином / Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин // Химия растительного сырья. - 2013. - № 4. – С. 37-43. 137. Трофимова, Н.Н. Изучение реакции комплексообразования Cu2+ с дигидрокверцетином / Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин // Успехи синтеза и комплексообразования: тезисы докладов Всероссийской научной конференции (с международным участием).- Москва, РУДН, 21-25 апреля 2014. С. 301. 138. Пат. 2380100 РФ. Средство для профилактики и лечения гриппа А и В / О.И. Киселёв, В.А. Бабкин, В.В. Зарубаев, Л.А. Остроухова // Б.И. – 2010. - № 3. 139. Столповская, Е.В. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 4. Изучение реакции комплексообразования ионов Са2+ с дигидрокверцетином / Е.В. Столповская, Н.Н. Трофимова, В.А. Бабкин // Химия растительного сырья. - 2014. - № 3. – С. 125130. 140. Столповская, фармацевтической Е.В. субстанции Разработка с технологии противогриппозной получения активностью новой / Е.В. Столповская, Н.Н. Трофимова, В.А. Бабкин. // Инновационные технологии в фармации. – Иркутск, 2014. – С. 66-67. 141. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. – 400 с. 144 145 142. Пат. 2553428 РФ. Способ получения моно- и билигандных комплексных соединений ионов двухвалентных металлов - цинка, меди (II) и кальция, с дигидрокверцетином, обладающих усиленной антиоксидантной активностью / Н.Н. Трофимова, В.А. Бабкин, Е.В. Столповская. – Заявка № 2013121728, приоритет изобретения от 08.05.2013; опубл. 10.06.2015; Бюл. № 16. – 14 с. 143. Трофимова, Н.Н. Строение и электрохимические свойства комплексных соединений металлов с дигидрокверцетином / Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин, С.В. Федоров, Г.А. Калабин, С.В. Горяинов, Е.Е. Золотарев, А.Ю. Сафронов, А.В. Кашевский, Р.Г. Житов // Химия растительного сырья. - 2014. - № 3. – С. 121-131. 144. Trofimova, N.N. Dihydroquercetin metal complexes: synthesis, structure and properties / N.N. Trofimova, E.V. Stolpovskaya, V.A. Babkin, R.G. Zhitov // XVth Conference on Heterocycles in Bio-organic Chemistry. - Riga, Latvia, 2013. - P. 168. 145. Harborne, J.B. The Flavonoids. London: Chapman and Hall. / J.B. Harborne, T.J. Mabry, H. Mabry. - 1975. - 1204 p. 146. Барбалат, Ю.А. Новый справочник химика и технолога. Аналитическая химия, Ч.I. / Ю.А. Барбалат, Ю.Г. Власов, В.А. Демин, Ю.Е. Ермоленко, Ю.А. Золотов, В.М. Иванов, И.П. Калинкин. - С.-Пб.: АНО НПО Мир и Семья, 2002. 952 с. 147. Казицына, Л.А. Применение УФ, ИК, ЯМР и масс-спектроскопии в органической химии / Л.А. Казицына, Н.Б. Куплетская. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1979. - 240 с. 148. Сильверстейн, Р. Спектрометрическая идентификация органических соединений / Р. Сильверстейн, Г. Басслер, Т.Моррил. М.: Мир, 1977. - 590 с. 149. Калабин, Г.А. Количественная спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки // Г.А. Калабин, Л.В. Каницкая, Д.Ф. Кушнарев. М.: Химия, 2000. – 408 с. 150. Gonzalez-Alvarez, M. [Cu(sulfathiazolato)2benzimidazole)2]2MeOH. Nuclease Synthesis, activity properties and of crystal 145 146 structure / M. Gonzalez-Alvarez, G. Alzuet, J. Borras, B. Macýas, M. del Olmo, M. LiuGonzalez, F. Sanz // Journal of Inorganic Biochemistry. – 2002. - № 89. – P. 29–35. 151. Рабинович, В.А. Краткий химический справочник / В.А. Рабинович, З.Я. Хавин. – Ленинград: «Химия», 1978. – 392 с. 152. Агладзе, Т.Р. Электрохимия металлов в неводных растворах (перевод с англ.) под ред. Я.М. Колотырнина / Т.Р. Агладзе, Р.Д. Кацарава, Е.Г. Кузнецова. Москва, «Мир», 1974. - 440 с. 153. Tessensohn, M.E. Electrochemical Properties of Phenols and Quinones in Organic Solvents are Strongly Influenced by Hydrogen-Bonding with Water / M.E. Tessensohn, H. Hirao, R.D. Webster // The Journal of Physical Chemistry. – 2013. – V. 117 (2). - P. 1081-1090. 154. Compton, R.G., Understanding Voltammetry (2nd Edition) / R.G. Compton, C.E. Banks. - Imperial College Press, 2011. – 290 р. 155. Bard, A.J. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. 2nd Edition / A.J. Bard, L.R. Faulkner L.R. – John Wiley and Sons, 2001.- P. 591 – 596. 156. Гончаренко, М.С. Метод оценки перекисного окисления липидов / М.С. Гончаренко, А.М. Латинова // Лабораторное дело. – 1985. - № 1. – С. 60-61. 157. Столповская, Е.В. Биологическая активность комплексов дигидрокверцетина с ионами двухвалентных металлов / Е.В. Столповская, Н.Н. Трофимова, В.А. Бабкин, Я.А. Костыро // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: мат. V Всерос. конф. (с международным участием). - Барнаул, 2012. - С. 273. 158. Stolpovskaya, E.V. Research and development of new derivatives based on products of larch wood processing for use in medicine / E.V. Stolpovskaya, N.N. Trofimova, V.A. Babkin // Traditional medicine: ways of integration with modern health care: proceedings of the VI international scientific conference. - Ulan-Ude, 2013. - P. 51. 159. Арутюнян, А.В. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. Методические рекомендации. Под 146 147 редакцией чл-корр. РАМН, проф., д.м.н. В.Х. Хавинсона / А.В. Арутюнян, Е.Е. Дубинина, Н.Н. Зыбина. СПб: ИКФ "Фолиант". - 2000. -104 с. 160. Королюк, М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова, В.Е. Токарев // Лабораторное дело. – 1988. - № 1. – С. 16-19. 161. Гоголь, Е.С. Новые средства для лечения ожогов / Е.С. Гоголь, В.В. Даваа, Я.А. Костыро, С.А. Лепехова, Е.В. Коваль, Н.Н. Трофимова, Н.В. Иванова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин. // Экологическая безопасность и перспективы развития аграрного производства Евразии. - Ч. 1. - Иркутск, 2013. - С. 161-166. 162. Парамонов, Б.А. Ожоги: Руководство для врачей / Б.А. Парамонов, Я.О. Порембский, В.Г. Яблонский. М: СпецЛит, 2000. – 488 с. 163. Пат. SU 1675657 РФ. Способ измерения площадей ран по А.В. Черкасову / А.В. Черкасов // БИ. - 1991. 164. Gogol, E.S. Research and development of pharmacological activity of unique and natural pharmacological compositions for combustiology / E.S. Gogol, V.V. Davaa, Ya.A. Kostyro, S.A. Lepekhova, E.V. Koval, N.N. Trophimova, E.V. Stolpovskaya, N.V. Ivanova, V.A. Babkin // Traditional medicine: ways of integration with modern health care: proceedings of the VI international scientific conference. Ulan-Ude, 2013. - P. 76. 165. Гоголь, Е.С. Исследование ранозаживляющей активности оригинальных препаратов для комбустиологии / Е.С. Гоголь, В.В. Даваа, Я.А. Костыро, С.А. Лепехова, Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская, Н.В. Иванова, В.А. Бабкин // IX Всеросс. конф. “Химия и медицина” с мол. научн. школой: материалы. - Уфа, 2013. – С. 163. 166. Коваль, Е.В. Исследование влияния оригинальных фармацевтических композиций на микробиологическую чистоту ожоговых ран в эксперименте / Е.В. Коваль, Е.С. Гоголь, В.В. Даваа, Я.А. Костыро, С.А. Лепехова, Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская, Н.В. Иванова, В.А. Бабкин // Биологически активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения: 147 148 материалы. IV Междисциплин. конф. – Новый Свет (Крым, Украина), 2013. – Т.2. – С. 181. 167. ПНД Ф 14.1; 2.95-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений массовой концентрации кальция в пробах природных и очищенных сточных вод титриметрическим методом. М.: Госстандарт России, 2004. - 17 с. 168. Галактионова, Л.П. Состояние перекисного окисления у больных с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки / Л.П. Галактионова, А.В. Молчанов, С.А. Ельчанинова, Б.Я. Варшавский // Клиническая лабораторная диагностика. – 1998. - № 6. – С. 10-14. 148 149 ПРИЛОЖЕНИЕ 149 150 Приложение А Расчет средних значений содержания элементов в комплексных соединениях цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином по данным элементного анализа 1. Содержание элементов в составе комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином. Содержание углерода: С (%) = 48,9±2,0 µ 1 49,7 42,5 50,5 50,6 49 49,8 52,2 51,9 46,8 45,5 49,8 f 2 11 2 s xср 3 4 48,93636 8,452545 s 5 2,91 P 6 0,95 t(P,f) 7 1,8 Δx 8 2,0 ε 9 3,93% 4,60% 3,87% 3,86% 3,99% 3,92% 3,74% 3,76% 4,17% 4,29% 3,92% δ 10 1,54% 15,14% 3,10% 3,29% 0,13% 1,73% 6,25% 5,71% 4,56% 7,55% 1,73% P 6 0,95 t(P,f) 7 1,8 Δx 8 0,4 ε 9 10,22% 12,60% 11,12% 9,00% 12,60% 8,59% 9,22% 11,12% 13,04% 12,60% 13,04% δ 10 6,63% 15,15% 1,60% 17,75% 15,15% 21,49% 15,74% 1,60% 19,12% 15,15% 19,12% P 6 0,95 t(P,f) 7 1,8 Δx 8 0,7 ε 9 8,52% 6,35% 6,71% 7,71% 7,03% 9,29% 8,14% 7,10% 7,71% 7,24% 6,77% δ 10 14,87% 14,35% 9,60% 3,87% 5,21% 25,17% 9,70% 4,28% 3,87% 2,36% 8,75% Содержание водорода: Н (%) = 3,5±0,4 µ 1 3,7 3 3,4 4,2 3 4,4 4,1 3,4 2,9 3 2,9 f 2 11 2 s xср 3 4 3,454545 0,316727 s 5 0,56 Содержание цинка: Zn (%) = 9,8±0,7 µ 1 8,5 11,4 10,8 9,4 10,3 7,8 8,9 10,2 9,4 10 10,7 f 2 11 2 s xср 3 4 9,763636 1,162545 s 5 1,08 150 151 2. Содержание элементов в составе комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином. Содержание углерода: С (%) = 44,9±1,8 µ 1 49,5 43,7 42,9 48,2 42,6 46,1 46 40,9 47 43,5 43,8 42,5 f 2 11 2 s xср 3 4 44,92727 6,900182 s 5 2,63 P 6 0,95 t(P,f) 7 1,8 Δx 8 1,8 ε δ 9 10 3,57% 9,24% 4,04% 2,81% 4,11% 4,73% 3,66% 6,79% 4,14% 5,46% 3,83% 2,54% 3,84% 2,33% 4,31% 9,85% 3,75% 4,41% 4,06% 3,28% 4,03% 2,57% 0,041523 0,057112 P 6 0,95 t(P,f) 7 1,8 Δx 8 0,4 ε 9 11,09% 12,20% 13,55% 11,80% 15,25% 13,55% 9,89% 10,46% 8,51% 10,46% 10,17% 0,104558 t(P,f) 7 1,8 Δx 8 1,7 ε δ 9 10 13,73% 26,17% 9,95% 8,51% 9,95% 8,51% 13,62% 25,16% 8,91% 18,09% 11,74% 7,90% 10,70% 1,60% 9,51% 12,60% 14,80% 36,05% 9,95% 8,51% 10,01% 7,97% 0,100713 0,074233 Содержание водорода: Н (%) = 3,3±0,4 µ 1 3,3 3 2,7 3,1 2,4 2,7 3,7 3,5 4,3 3,5 3,6 3,5 f 2 11 2 s xср 3 4 3,254545 0,296727 s 5 0,54 δ 10 1,38% 8,48% 20,54% 4,99% 35,61% 20,54% 12,04% 7,01% 24,31% 7,01% 9,60% 0,07013 Содержание меди (II): Cu(II) (%) = 15,6±1,7 µ 1 12,4 17,1 17,1 12,5 19,1 14,5 15,9 17,9 11,5 17,1 17 16,9 f 2 11 2 s xср 3 4 15,64545 6,418727 s 5 2,53 P 6 0,95 151 152 3. Содержание элементов в составе комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином. Содержание углерода: С (%) = 43,6±1,6 µ 1 39,4 45,6 45,2 42,5 45,3 44 39,3 45,3 43,4 45,1 44,9 f 2 11 2 s xср 3 4 43,63636 5,380545 s 5 2,32 P 6 0,95 t(P,f) 7 1,8 Δx 8 1,6 ε 9 3,96% 3,42% 3,45% 3,67% 3,44% 3,54% 3,97% 3,44% 3,59% 3,46% 3,47% δ 10 10,75% 4,31% 3,46% 2,67% 3,67% 0,83% 11,03% 3,67% 0,54% 3,25% 2,81% P 6 0,95 t(P,f) 7 1,8 Δx 8 0,3 ε 9 7,68% 7,89% 7,29% 6,77% 7,29% 7,68% 7,10% 5,57% 7,89% 6,93% 6,93% δ 10 7,86% 10,86% 2,33% 4,98% 2,33% 7,86% 0,23% 21,75% 10,86% 2,66% 2,66% P 6 0,95 t(P,f) 7 1,8 Δx 8 0,4 ε 9 4,29% 4,25% 4,48% 3,89% 3,86% 3,93% 3,89% 4,01% 4,48% 3,79% 3,93% δ 10 5,81% 4,73% 10,36% 4,08% 4,97% 3,17% 4,08% 1,31% 10,36% 6,69% 3,17% Содержание водорода: Н (%) = 4,0±0,3 µ 1 3,7 3,6 3,9 4,2 3,9 3,7 4 5,1 3,6 4,1 4,1 f 2 11 2 s xср 3 4 3,990909 0,178909 s 5 0,42 Содержание кальция: Са (%) = 10,3±0,4 µ 1 9,7 9,8 9,3 10,7 10,8 10,6 10,7 10,4 9,3 11 10,6 f 2 11 2 s xср 3 4 10,26364 0,384545 s 5 0,62 152 153 Приложение Б 153 1. Введение Данный лабораторный регламент предназначен для наработки экспериментальных партий (образцов) продукта для исследовательских целей. 2. Характеристика конечной продукции Конечный продукт представляет собой комплексное соединение цинка с природным флавоноидом дигидрокверцетином, 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)4H-1-бензопиран-4-оном (ДКВ), брутто-формула C30H26O16Zn, состав комплекса о [Zn(C15H11O7)2(H2O)2], М (707), т. пл. 200±5 С. Внешние характеристики: порошок от оливково-серого до желтовато-коричневого цвета. Растворимость: нерастворим в воде, этаноле, ацетоне, мало растворим в ДМСО [1]. Структурная формула представлена на рис. 1. O OH OH HO H2O O O Zn OH O O HO OH H2O OH OH O Рисунок 1 - Структурная формула комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином Методы контроля: элементный анализ, ИК, 1Н и 13С ЯМР-спектроскопия. Данные элементного анализа должны соответствовать показателям, приведенным в табл. 1. Таблица 1 Наименование элемента Углерод - С Водород - Н Кислород - О Цинк - Zn Допустимый показатель, % 48,9±3,6 3,5±0,7 9,8±1,3 Теоретический показатель, % 50,9 3,7 36,2 9,2 Получаемый продукт характеризуется следующими данными ИК-спектроскопии [2]: ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3402, 3229 (О-Н), 1613, 1593 (Ar), 1555 (С=О), 1442, 1348, 1277 (-С-О-С-), 613 (О-М). Получаемый продукт характеризуется следующими данными 1Н ЯМР спектроскопии [2]: Спектр ЯМР 1Н [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] в ДМСО-d6 в области от 4 до 12 м.д. содержит следующие сигналы (δ, м.д.): 4,47 (1Н, дублет дублетов, J = 6,2 и 11,0 Гц, Н-3); 4,96 (1Н, дублет, 155 J = 11,0 Гц, Н-2); 5,71 (1Н, дублет, J = 6,2 Гц, 3-ОН); 5,83 (1Н, уширенный синглет, Н-8); 5,88 (1Н, уширенный синглет, Н-6); 6,73 (2Н, синглет, Н-5´, Н-6´); 6,86 (1Н, синглет, Н-2΄); 8,99 (2Н, уширенный синглет, 3'-ОН и 4'-ОН); 11,89 (1Н, синглет, 5-ОН). Суммарная интенсивность всех указанных сигналов соответствует 11 протонам. Получаемый продукт характеризуется следующими данными 13 С ЯМР спектроскопии [2]: Химические сдвиги ядер 13 С [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] в ДМСО-d 6 (δ, м.д.): 71,6 (С-3); 83,1 (С-2); 95,1 (С-8); 96,1 (С-6); 100,4 (С-4а); 115,1 (С-5΄); 115,4 (С-2΄); 119,4 (С-6΄); 128,1 (С-1΄); 145,0 (С-3΄); 145,8 (С-4΄); 162,6 (С-8а); 163,4 (С-5); 167,2 (С-7); 197,6 (С-4). 3. Химическая схема процесса Цинковый комплекс [Zn(C15 H11O7)2(H2O)2] образуется в результате взаимодействия в водном растворе ДКВ и ацетата цинка двухводного при нагревании до 80 оС в течение 15 минут. Реакция начинается при смешивании нагретого до 80 оС раствора ДКВ с раствором цинковой соли. Исходное мольное соотношение Zn2+:ДКВ 2:1, концентрации ДКВ 0,05 моль/л и (CH3COO)2Zn∙2H2O 0,1 моль/л, рН раствора 5,0-5,1 [3]. Схема реакции: 2C15H12O7 + (CH3COO)2Zn∙2H2O → [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] + 2CH3COOH. 4. Характеристика исходных реагентов Дигидрокверцетин, 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4H-1- бензопиран-4-он, брутто-формула С15Н12О7, М (304). Структурная формула представлена на рис. 2. OH HO O OH OH OH O Рисунок 2 - Структурная формула дигидрокверцетина Дигидрокверцетин должен соответствовать техническим требованиям ТУ 9354-04064843061-12 [4]. Содержание ДКВ в субстанции должно быть не менее 90% в пересчете на сухое вещество, субстанция дигидрокверцетин по показателям качества должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в табл. 2 [4]. 155 156 Таблица 2 № п.п. 1 Наименование показателей Описание Визуально 2 Растворимость ГФ ХI, вып. 1, с. 175 3 Подлинность Качественная реакция, Методы анализа ВЭЖХ Мелкокристаллический порошок от светложелтого до желтого цвета, без запаха Растворим в спирте, очень мало растворим в воде, практически нерастворим в хлороформе Качественная реакция: малиновое окрашивание спиртового раствора препарата в присутствии HCl и Zn. УФ-спектр: максимум при 290±2нм, минимум при 250±2 нм. На хроматограмме ВЭЖХ содержится пик дигидрокверцетина не более 10% ГФ ХI, вып. 1, с. 176 не более 8 % ГФ ХI, вып. 2, с. 25 ГФ ХI, вып. 2, с. 165 ВЭЖХ не более 0,3% не более 0,001% не менее 90% УФ-спектроскопия, ВЭЖХ 4 5 6 7 8 Родственные примеси Потери в массе при высушивании Сульфатная зола Тяжёлые металлы Содержание дигидрокверцетина Нормы Подлинность ДКВ характеризуется также спектрами ИК и ЯМР (1Н и 13С) [5]. ИК спектр ДКВ в вазелиновом масле содержит полосы поглощения, обусловленные валентными колебаниями ОН-связей – свободных (3550 см-1), связанных внутримолекулярной водородной связью (3406 см-1) и межмолекулярной водородной связью (широкая полоса с максимумом при 3250 см-1). Проявляются валентные колебания связей С-Н в ароматическом кольце (3080 см-1), валентные колебания ароматического кольца (1615 см-1, 1588 см-1) и валентные колебания карбонильной группы (1644 см-1) [5]. Спектр ЯМР 1Н ДКВ в ДМСО-d6 в области от 0,5 до 12 м.д. содержит следующие сигналы (δ, м.д.): 4,483 (1Н, дублет дублетов, J = 6,1 и 11,1 Гц, Н-3); 4,973 (1Н, дублет, J = 11,1 Гц, Н-2); 5,712 (1Н, дублет, J = 6,1 Гц, 3-ОН); 5,848 (1Н, дублет, J = 2,0 Гц, Н-8); 5,898 (1Н, дублет, J = 2,0 Гц, Н-6); 6,72-6,76 (2Н, АВ-система, J = 8,2 Гц, Н-5´, Н-6´); 6,868 (1Н, синглет, Н2΄); 8,93 (1Н, синглет, 4'-ОН); 8,98 (1Н, синглет, 3'-ОН); 10,78 (1Н, синглет, 5-ОН) и 11,87 (1Н, синглет, 5-ОН). Суммарная интенсивность всех указанных сигналов соответствует 12 протонам молекулы ДКВ С15Н12О7 [5]. Химические сдвиги ядер 13С ДКВ в ДМСО-d6 (δ, м.д.): 71,62 (С-3); 83,10 (С-2); 95,02 (С8); 96,03 (С-6); 100,53 (С-4а); 115,17 (С-5΄); 115,40 (С-2΄); 119,41 (С-6΄); 128,08 (С-1΄); 144,98 (С3΄); 145,81 (С-4΄); 162,6 (С-8а); 163,37 (С-5); 166,83 (С-7); 197,78 (С-4) [5]. 156 157 Цинк уксуснокислый 2-водный Zn(CH3COO)2∙2Н2О (х.ч.), представляющий собой белые кристаллы со слабым запахом уксусной кислоты, хорошо растворимые в воде, должен соответствовать техническим требованиям ГОСТ 5823-78 [6]. Количественно содержание цинка определяют в водном растворе ацетата цинка комплексонометрическим титрованием трилоном Б (индикатор - кислотный хром черный специальный) [1]. Вода дистиллированная, используемая в качестве среды проведения реакции, должна соответствовать техническим условиям ГОСТ 6709-72 [7]. Вода, используемая для промывания продукта реакции с целью удаления непрореагировавшей цинковой соли, также должна соответствовать техническим условиям ГОСТ 6709-72 [7]. Этанол, используемый для промывания продукта реакции с целью удаления следов непрореагировавшего ДКВ, должен соответствовать техническим условиям ГОСТ Р 51652-2000 [8]. 5. Изложение технологического процесса 1,52 г ДКВ (0,005 моль) растворяют в 70 мл подогретой до 80 оС воды в термостойком стакане объемом 100 мл. 2,19 г Zn(CH3COO)2∙2H2O (0,01 моль) растворяют в 30 мл воды в химическом стакане объемом 50 мл. Водные растворы ДКВ и Zn(CH3COO)2∙2Н2О смешивают в круглодонной трехгорлой колбе объемом 250 мл с обратным холодильником и нагревают на водяной бане до 80 оС при постоянном перемешивании в течение 15 мин. В результате реакции образуется выпадающий в осадок продукт, представляющий собой порошок от оливково-серого до желтовато-коричневого цвета. После охлаждения полученный осадок отфильтровывают с использованием стеклянного пористого фильтра, промывают 5 раз по 20 мл водой для удаления избытка соли, затем 3 раза по 15 мл 96 %-ным этанолом для удаления следов непрореагировавшего ДКВ и высушивают в сушильном шкафу при 50 оС до влажности не более 7 %, а затем при 105 о С до постоянной массы. В результате получается комплекс [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] в количестве 1,2744 г. Схема получения комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином представлена на рис. 3. 157 158 Раствор цинковой соли Раствор ДКВ Синтез Фильтрование Вода Промывка водой Фильтрат водный Спирт Промывка спиртом Фильтрат спиртовой Сушка Цинковый комплекс ДКВ Рисунок 3 – Схема получения комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином 6. Теоретический выход комплекса [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] 1,52 г 2,19 г Х 2C15H12O7 + (CH3COO)2Zn∙2H2O → [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] + 2CH3COOH 304 г/моль 219 г/моль 707 г/моль n (ДКВ) = 1,52 : 304 = 0,005 (моль) n ((CH3COO)2Zn∙2H2O) = 2,19 : 219 = 0,01 (моль) Избыток (CH3COO)2Zn∙2H2O составляет 0,0075 моль. Теоретический выход комплекса определяем по ДКВ: n (ДКВ) : n([Zn(C15 H11O7)2(H2O)2]) = 2 : 1 158 159 n ([Zn(C15H11O7)2(H2O)2]) = 0,005 : 2 = 0,0025 (моль) m ([Zn(C15H11O7)2(H2O)2]) = 0,0025 ∙ 707 = 1,7675 (г) 7. Практический выход [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] Исходя из приведенного в пункте 5 полученного продукта в количестве 1,2744 г, практический выход [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] составляет: В = 1, 2744 / 1,7675 ∙ 100 % = 72,1 % 8. Материальный баланс Материальный баланс получения комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином представлен в табл. 3. Таблица 3 Приход Наименование Расход Кол-во, г Наименование Синтез комплекса [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] Депротонированный Дигидрокверцетин 1,52 дигидрокверцетин в составе комплекса Цинк в виде Zn2+ в составе Ацетат цинка двухводный 2,19 комплекса Связанная вода в составе Вода дистиллированная 100,00 комплекса Промывание осадка для удаления следов соли Водный раствор, содержащий Вода дистиллированная 100,00 остатки непрореагировавшей соли и побочный продукт реакции Промывание осадка для удаления следов ДКВ Спиртовый раствор, содержащий непрореагировавшего Этанол 96 %-ный 36,00* следы дигидрокверцетина ИТОГО 239,71 ИТОГО Кол-во, г 1,09 0,12 0,07 202,00 36,43 239,71 *m (C2H5OH) = ρ ∙ V = 0,80 г/см3 ∙ 45 см3 = 36 г Расчет материального баланса: 1) Расчет массы депротонированного дигидрокверцетина в составе комплекса: m = 1,2744 ∙ 606 / 707 = 1,09 г 2) Расчет массы цинка в виде Zn2+ в составе комплекса: m = 1,2744 ∙ 65 / 707 = 0,12 г 3) Расчет массы связанной воды в составе комплекса: m = 1,2744 ∙ 36 / 707 = 0,065 г ≈ 0,07 г 159 160 4) Расчет массы водного раствора, содержащего остатки непрореагировавшей соли и побочный продукт реакции: m = 100 + 100 + (2,19 - 0,12) – 0,07 = 202 г 5) Расчет массы спиртового раствора, содержащего следы непрореагировавшего дигидрокверцетина: m = 36 + (1,52 – 1,09) = 36,43 г. 9. Норма расхода на получение 1 г продукта Массы дигидрокверцетина и ацетата цинка двухводного для получения 1 г цинкового комплекса [Zn(C15 H11O7)2(H2O)2], а также массы воды и этанола, необходимые для проведения синтеза и промывания продукта, представлены в табл. 4. Таблица 4 Наименование Дигидрокверцетин Ацетат цинка двухводный Вода дистиллированная для проведения синтеза Вода дистиллированная для промывания осадка Этанол 96 %-ный раствор для промывания осадка Норма расхода, г 1,19 1,72 78,5 78,5 28,2 Расчет норм расхода на получение 1 г цинкового комплекса [Zn(C15H11O7)2(H2O)2]: 1) Расчет массы дигидрокверцетина: m = 1,52 / 1,2744 = 1,19 г 2) Расчет массы ацетата цинка двухводного: m = 2,19 / 1,2744 = 1,72 г 3) Расчет массы воды дистиллированной для проведения синтеза: m = 100 / 1,2744 = 78,5 г 4) Расчет массы воды дистиллированной для промывания осадка: m = 100 / 1,2744 = 78,5 г 5) Расчет массы этанола 96 %-ного раствора для промывания осадка: m = 36 / 1,2744 = 28,2 г 10. Аппаратурная схема процесса и спецификация оборудования Аппаратурная схема лабораторного способа получения цинкового комплекса дигидрокверцетина представлена на рис. 4. 160 161 Рисунок 4 - Аппаратурная схема получения комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином: 1 - стакан термостойкий для приготовления раствора дигидрокверцетина; 2 – стакан для приготовления раствора цинковой соли; 3 - колба для проведения синтеза; 4 термометр; 5 – холодильник обратный; 6 – мешалка; 7 – фильтр; 8 – шкаф сушильный; 9 – водяная баня. Оборудование, необходимое для получения цинкового комплекса ДКВ [Zn(C15H11O7)2(H2O)2], представлено в табл. 5. Таблица 5 Наименование оборудования Колба круглодонная трехгорлая Стакан мерный термостойкий Стакан мерный Стакан мерный Термометр ртутный Холодильник обратный шариковый Мешалка верхнеприводная Количество 1 1 1 2 1 1 1 Насадка для мешалки двухлопастная 1 Фильтр стеклянный пористый Шкаф сушильный Водяная баня 1 1 1 Характеристика 250 мл 100 мл 100 мл 50 мл 0-100ºС Тип ХШ 10-50 об/мин Ширина 40 мм, фторопласт Размер пор 16-40 мкм V=20 л, t=40-120ºC GFL 1023 161 162 Список литературы 1. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400с. 2. Трофимова Н.Н., Столповская Е.В., Бабкин В.А., Федоров С.В., Калабин Г.А., Горяинов С.В., Золотарев Е.Е., Сафронов А.Ю., Кашевский А.В., Житов Р.Г. Строение и электрохимические свойства комплексных соединений металлов с дигидрокверцетином // Химия растительного сырья. - 2014. - № 3. – С. 121-131. 3. Трофимова Н.Н., Столповская Е.В., Бабкин В.А. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 2. Оптимизация реакции комплексообразования цинка с дигидрокверцетином в водной среде // Химия растительного сырья. - 2013. - № 3. - С. 73-79. 4. ТУ 9354-040-64843061-12 Дигидрокверцетин 5. Тюкавкина Н.А., Чертков В.А., Баженов Б.Н., Белобородов В.Л., Селиванова И.А., Савватеев А.М. Физико-химическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Х Международный съезд "Фитофарм 2006". СПб. - 2006. - С. 338-342. 6. ГОСТ 5823-78 Реактивы. Цинк уксуснокислый 2-водный. Технические условия. 7. ГОСТ 6709-72 Реактивы. Вода дистиллированная. Технические условия. 8. ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия. 162 163 Приложение В 163 164 1. Введение Данный лабораторный регламент предназначен для наработки экспериментальных партий (образцов) продукта для исследовательских целей. 2. Характеристика конечной продукции Конечный продукт представляет дигидрокверцетином, бензопиран-4-оном собой комплексное соединение меди (II) с 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4H-1(ДКВ), брутто-формула C15H14O9Cu, состав комплекса [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)], М (402), т. пл. 241±7 оС. Внешние характеристики: порошок от зеленовато-коричневого до коричневого цвета. Растворимость: нерастворим в воде, этаноле, ацетоне, очень мало растворим в ДМСО [1]. Структурная формула представлена на рис. 1. OH OH HO O O OH O Cu H2O OH Рисунок 1 - Структурная формула комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином Методы контроля: элементный анализ, ИК-спектроскопия. Данные элементного анализа должны соответствовать показателям, приведенным в табл. 1. Таблица 1 Наименование элемента Углерод - С Водород - Н Кислород - О Медь - Cu Допустимый показатель, % 45,6±3,3 3,0±0,5 15,5±3,1 Теоретический показатель, % 44,8 3,5 35,8 15,9 Получаемый продукт характеризуется следующими данными ИК-спектроскопии [2]: ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3401 (О-Н), 1618, 1575 (Ar), 1561 (С=О), 1445, 1384, 1271 (-С-ОС-), 625(О-М). 164 165 3. Химическая схема процесса Медный комплекс [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)] образуется в результате взаимодействия в водном растворе ДКВ и ацетата меди (II) при нагревании до 70 оС в течение 60 минут. Реакция начинается при смешивании нагретого до 70 оС раствора ДКВ с раствором соли меди (II). Исходное мольное соотношение Cu2+:ДКВ 2:1, концентрации ДКВ 0,05 моль/л и (CH3COO)2Cu 0,1 моль/л, рН раствора 5,0 [3]. Схема реакции: C15H12O7 + (CH3COO)2Cu·H2O→ [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)] + 2CH3COOH. 4. Характеристика исходных реагентов Дигидрокверцетин, 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4H-1- бензопиран-4-он, брутто-формула С15Н12О7, М (304). Структурная формула представлена на рис. 2. OH HO O OH OH OH O Рисунок 2 - Структурная формула дигидрокверцетина Дигидрокверцетин должен соответствовать техническим требованиям ТУ 9354-04064843061-12 [4]. Содержание ДКВ в субстанции должно быть не менее 90% в пересчете на сухое вещество, субстанция дигидрокверцетин по показателям качества должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в табл. 2 [4]. 165 166 Таблица 2 № п.п. 1 Наименование показателей Описание Визуально 2 Растворимость ГФ ХI, вып. 1, с. 175 3 Подлинность Качественная реакция, Методы анализа ВЭЖХ Мелкокристаллический порошок от светложелтого до желтого цвета, без запаха Растворим в спирте, очень мало растворим в воде, практически нерастворим в хлороформе Качественная реакция: малиновое окрашивание спиртового раствора препарата в присутствии HCl и Zn. УФ-спектр: максимум при 290±2нм, минимум при 250±2 нм. На хроматограмме ВЭЖХ содержится пик дигидрокверцетина не более 10% ГФ ХI, вып. 1, с. 176 не более 8 % ГФ ХI, вып. 2, с. 25 ГФ ХI, вып. 2, с. 165 ВЭЖХ не более 0,3% не более 0,001% не менее 90% УФ-спектроскопия, ВЭЖХ 4 5 6 7 8 Родственные примеси Потери в массе при высушивании Сульфатная зола Тяжёлые металлы Содержание дигидрокверцетина Нормы Подлинность ДКВ характеризуется также спектрами ИК и ЯМР (1Н и 13С) [5]. ИК спектр ДКВ в вазелиновом масле содержит полосы поглощения, обусловленные валентными колебаниями ОН-связей – свободных (3550 см-1), связанных внутримолекулярной водородной связью (3406 см-1) и межмолекулярной водородной связью (широкая полоса с максимумом при 3250 см-1). Проявляются валентные колебания связей С-Н в ароматическом кольце (3080 см-1), валентные колебания ароматического кольца (1615 см-1, 1588 см-1) и валентные колебания карбонильной группы (1644 см-1) [5]. Спектр ЯМР 1Н ДКВ в ДМСО-d6 в области от 0,5 до 12 м.д. содержит следующие сигналы (δ, м.д.): 4,483 (1Н, дублет дублетов, J = 6,1 и 11,1 Гц, Н-3); 4,973 (1Н, дублет, J = 11,1 Гц, Н-2); 5,712 (1Н, дублет, J = 6,1 Гц, 3-ОН); 5,848 (1Н, дублет, J = 2,0 Гц, Н-8); 5,898 (1Н, дублет, J = 2,0 Гц, Н-6); 6,72-6,76 (2Н, АВ-система, J = 8,2 Гц, Н-5´, Н-6´); 6,868 (1Н, синглет, Н2΄); 8,93 (1Н, синглет, 4'-ОН); 8,98 (1Н, синглет, 3'-ОН); 10,78 (1Н, синглет, 5-ОН) и 11,89 (1Н, синглет, 5-ОН). Суммарная интенсивность всех указанных сигналов соответствует 12 протонам молекулы ДКВ С15Н12О7 [5]. Химические сдвиги ядер 13С ДКВ в ДМСО-d6 (δ, м.д.): 71,62 (С-3); 83,10 (С-2); 95,02 (С8); 96,03 (С-6); 100,53 (С-4а); 115,17 (С-5΄); 115,40 (С-2΄); 119,41 (С-6΄); 128,08 (С-1΄); 144,98 (С3΄); 145,81 (С-4΄); 162,6 (С-8а); 163,37 (С-5); 166,83 (С-7); 197,78 (С-4) [5]. 166 167 Медь уксуснокислая 1-водная Cu(CH3COO)2∙Н2О (х.ч.), представляющая собой темные сине-зеленые кристаллы или порошок, растворимые в воде и слаборастворимые в спирте, должна соответствовать техническим требованиям ГОСТ 5852-79 [6]. Количественно содержание меди (II) определяют в водном растворе в виде аммиачного комплексного соединения спектрофотометрическим методом [1]. Вода дистиллированная, используемая в качестве среды проведения реакции, должна соответствовать техническим условиям ГОСТ 6709-72 [7]. Вода, используемая для промывания продукта реакции с целью удаления непрореагировавшей цинковой соли, также должна соответствовать техническим условиям ГОСТ 6709-72 [7]. Этанол, используемый для промывания продукта реакции с целью удаления следов непрореагировавшего ДКВ, должен соответствовать техническим условиям ГОСТ Р 51652-2000 [8]. 5. Изложение технологического процесса 1,52 г ДКВ (0,005 моль) растворяют в 70 мл подогретой до 70 оС воды в термостойком стакане объемом 100 мл. 2,00 г Cu(CH3COO)2∙H2O (0,01 моль) растворяют в 30 мл воды в химическом стакане объемом 50 мл. Водные растворы ДКВ и Cu(CH3COO)2∙Н2О смешивают в круглодонной трехгорлой колбе объемом 250 мл с обратным холодильником и нагревают на водяной бане до 70 оС при постоянном перемешивании в течение 60 мин. В результате реакции образуется выпадающий в осадок продукт, представляющий собой порошок от зеленоватокоричневого до коричневого цвета. После охлаждения полученный осадок отфильтровывают с использованием стеклянного пористого фильтра, промывают 5 раз по 20 мл водой для удаления избытка соли, затем 3 раза по 15 мл 96 %-ным этанолом для удаления следов непрореагировавшего ДКВ и высушивают в сушильном шкафу при 50 оС до влажности не более 7 %, а затем при 105 о С до постоянной массы. В результате получается комплекс [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)] в количестве 1,7869 г. Схема получения комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином представлена на рис. 3. 167 168 Раствор соли меди (II) Раствор ДКВ Синтез Фильтрование Вода Промывка водой Фильтрат водный Спирт Промывка спиртом Фильтрат спиртовой Сушка Медный комплекс ДКВ Рисунок 3 – Схема получения комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином 6. Теоретический выход комплекса [Cu(C 15H11O7)(OH)(H2O)] 1,52 г 2,00 г Х C15H12O7 + (CH3COO)2Zn∙H2O → [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)] + 2CH3COOH 304 г/моль 200 г/моль 402 г/моль n (ДКВ) = 1,52 : 304 = 0,005 (моль) n ((CH3COO)2Cu∙H2O) = 2,00 : 200 = 0,01 (моль) Избыток (CH3COO)2Cu∙H2O составляет 0,005 моль. Теоретический выход комплекса определяем по ДКВ: 168 169 n (ДКВ) : n([Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)]) = 1 : 1 n ([Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)]) = 0,005 (моль) m ([Zn(C15H11O7)2(H2O)2]) = 0,005 ∙ 402 = 2,01 (г) 7. Практический выход [Zn(C15H11O7)2(H2O)2] Исходя из приведенного в пункте 5 полученного продукта в количестве 1,7869 г, практический выход [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)] составляет: В = 1,7869 / 2,01 ∙ 100 % = 88,9 % 8. Материальный баланс Материальный баланс получения комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином представлен в табл. 3. Таблица 3 Приход Расход Наименование Кол-во, г Наименование Синтез комплекса [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)] Депротонированный Дигидрокверцетин 1,52 дигидрокверцетин в составе комплекса Медь в виде Cu2+ в составе Медь (II) уксуснокислая 1-водная 2,00 комплекса Связанная вода и гидроксильная Вода дистиллированная 100,00 группа в составе комплекса Промывание осадка для удаления следов соли Водный раствор, содержащий Вода дистиллированная 100,00 остатки непрореагировавшей соли и побочный продукт реакции Промывание осадка для удаления следов ДКВ Спиртовый раствор, содержащий Этанол 96 %-ный 36,00* следы непрореагировавшего дигидрокверцетина ИТОГО 239,52 ИТОГО Кол-во, г 1,35 0,28 0,16 201,56 36,17 239,52 *m (C2H5OH) = ρ ∙ V = 0,80 г/см3 ∙ 45 см3 = 36 г Расчет материального баланса: 1) Расчет массы депротонированного дигидрокверцетина в составе комплекса: m = 1,7869 ∙ 303 / 402 = 1,35 г 2) Расчет массы меди в виде Cu2+ в составе комплекса: m = 1,7869 ∙ 64 / 402 = 0,28 г 3) Расчет массы связанной воды и гидроксильной группы в составе комплекса: m = 1,7869 ∙ 18 / 402 + 1,7869 ∙ 17 / 402 = 0,08 + 0,08 = 0,16 г 169 170 4) Расчет массы водного раствора, содержащего остатки непрореагировавшей соли и побочный продукт реакции: m = 100 + 100 + (2,00 - 0,28) – 0,16 = 201,56 г 5) Расчет массы спиртового раствора, содержащего следы непрореагировавшего дигидрокверцетина: m = 36 + (1,52 – 1,35) = 36,17 г. 9. Норма расхода на получение 1 г продукта Массы дигидрокверцетина и меди (II) уксуснокислой 1-водной для получения 1 г медного комплекса [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)], а также массы воды и этанола, необходимые для проведения синтеза и промывания продукта, представлены в табл. 4. Таблица 4 Наименование Дигидрокверцетин Ацетат цинка двухводный Вода дистиллированная для проведения синтеза Вода дистиллированная для промывания осадка Этанол 96 %-ный раствор для промывания осадка Норма расхода, г 0,85 1,12 56,0 56,0 20,1 Расчет норм расхода на получение 1 г медного комплекса [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)]: 1) Расчет массы дигидрокверцетина: m = 1,52 / 1,7869 = 0,85 г 2) Расчет массы меди (II) уксуснокислой 1-водной: m = 2,00 / 1,7869 = 1,12 г 3) Расчет массы воды дистиллированной для проведения синтеза: m = 100 / 1,7869 = 56,0 г 4) Расчет массы воды дистиллированной для промывания осадка: m = 100 / 1,7869 = 56,0 г 5) Расчет массы этанола 96 %-ного раствора для промывания осадка: m = 36 / 1,7869 = 20,1 г 170 171 10. Аппаратурная схема процесса и спецификация оборудования Аппаратурная схема лабораторного способа получения медного комплекса дигидрокверцетина представлена на рис. 4. Рисунок 4 - Аппаратурная схема получения комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином: 1 - стакан термостойкий для приготовления раствора дигидрокверцетина; 2 – стакан для приготовления раствора соли, содержащей ионы Cu 2+; 3 - колба для проведения синтеза; 4 - термометр; 5 – холодильник обратный; 6 – мешалка; 7 – фильтр; 8 – шкаф сушильный; 9 – водяная баня Оборудование, необходимое для получения комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином [Cu(C15H11O7)(OH)(H2O)], представлено в табл. 5. Таблица 5 Наименование оборудования Колба круглодонная трехгорлая Стакан мерный термостойкий Стакан мерный Стакан мерный Термометр ртутный Холодильник обратный шариковый Мешалка верхнеприводная Количество 1 1 1 2 1 1 1 Насадка для мешалки двухлопастная 1 Фильтр стеклянный пористый Шкаф сушильный Водяная баня 1 1 1 Характеристика 250 мл 100 мл 100 мл 50 мл 0-100ºС Тип ХШ 10-50 об/мин Ширина 40 мм, фторопласт Размер пор 16-40 мкм V=20 л, t=40-120ºC GFL 1023 171 172 Список литературы 1. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400с. 2. Трофимова Н.Н., Столповская Е.В., Бабкин В.А., Федоров С.В., Калабин Г.А., Горяинов С.В., Золотарев Е.Е., Сафронов А.Ю., Кашевский А.В., Житов Р.Г. Строение и электрохимические свойства комплексных соединений металлов с дигидрокверцетином // Химия растительного сырья. - 2014. - № 3. – С. 121-131. 3. Трофимова Н.Н., Столповская Е.В., Бабкин В.А. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 3. Изучение кинетики реакции комплексообразования меди с дигидрокверцетином // Химия растительного сырья. - 2013. - № 4. – С. 37-43. 4. ТУ 9354-040-64843061-12 Дигидрокверцетин 5. Тюкавкина Н.А., Чертков В.А., Баженов Б.Н., Белобородов В.Л., Селиванова И.А., Савватеев А.М. Физико-химическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Х Международный съезд "Фитофарм 2006". СПб. - 2006. - С. 338-342. 6. ГОСТ 5852-79 Реактивы. Медь (II) уксуснокислая 1-водная. Технические условия. 7. ГОСТ 6709-72 Реактивы. Вода дистиллированная. Технические условия. 8. ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия. 172 173 Приложение Г 173 174 1. Введение Данный лабораторный регламент предназначен для наработки экспериментальных партий (образцов) продукта для исследовательских целей. 2. Характеристика конечной продукции Конечный продукт представляет собой кальцийсодержащий металлокомплекс на основе природного флавоноида дигидрокверцетина, дигидроксифенил)-4H-1-бензопиран-4-она (ДКВ), 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4брутто-формула C15H14O9Ca, состав комплекса [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)], М (378), т. пл. 243±5 оС. Внешние характеристики: порошок от зеленовато-коричневого до коричневого цвета. Растворимость: нерастворим в воде, этаноле, ацетоне, мало растворим в ДМСО [1]. Структурная формула представлена на рис. 1. OH OH HO Ca (H2O) O O A C OH O B OH Рисунок 1 - Структурная формула комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином Методы контроля: элементный анализ, ИК, 1Н и 13С ЯМР-спектроскопия. Данные элементного анализа должны соответствовать показателям, приведенным в табл. 1. Таблица 1 Наименование элемента Углерод - С Водород - Н Кислород - О Кальций - Са Допустимый показатель, % 43,6±2,9 4,0±0,5 10,3±0,8 Теоретический показатель, % 47,6 3,7 38,1 10,6 Получаемый продукт характеризуется следующими данными ИК спектроскопии [2]: ИК-спектр (KBr, ν, см-1): 3382, 3264 (О-Н), 1611, 1596 (Ar), 1569 (С=О), 1446, 1350, 1259 (-С-О-С-), 604 (О-М). Получаемый продукт характеризуется следующими данными 1Н ЯМР спектроскопии [2]: 174 175 1 Спектр ЯМР Н [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)] в ДМСО-d6 в области от 4 до 12,5 м.д. содержит следующие сигналы (δ, м.д.): 4,21 (1Н, дублет, J = 10,4 Гц, Н-3); 4,70 (1Н, дублет, J = 10,4 Гц, Н-2); 5,09 (1Н, дублет, уширенный синглет, 3-ОН); 5,37 (1Н, синглет, Н-8); 5,41 (1Н, дублет, J = 1,4 Гц, Н-6); 6,66 (2Н, уширенный синглет, Н-5´, Н-6´); 6,80 (1Н, синглет, Н-2΄); 12,10 (1Н, синглет, 5-ОН). Получаемый продукт характеризуется следующими данными 13 С ЯМР спектроскопии [2]: Химические сдвиги ядер 13 С [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)] в ДМСО-d6 (δ, м.д.): 71,4 (С-3); 82,6 (С-2); 95,8 (С-8); 96,4 (С-6); 99,3 (С-4а); 114,9 (С-5΄); 114,9 (С-2΄); 119,0 (С-6΄); 128,7 (С-1΄); 145,1 (С-3΄); 145,7 (С-4΄); 163,2 (С-8а); 163,2 (С-5); 166,8 (С-7); 198,9 (С-4). 3. Химическая схема процесса Кальциевый комплекс [Ca(C15 H11O7)(OH)(H2O)] образуется в результате взаимодействия в нагретом до 80 оС водном растворе ДКВ и ацетата кальция моногидрата в течение 60 минут при рН 8. Реакция начинается при смешивании нагретого до 80 оС раствора ДКВ с раствором кальциевой соли после добавления в реакционную смесь 6,5 %-ного раствора NH4OH до рН 8. Исходное мольное соотношение Ca2+:ДКВ 3:1, концентрации ДКВ 0,1 моль/л и (CH3COO)2Ca∙H2O 0,3 моль/л, рН раствора 8,0 [3]. Схема реакции: C15H12O7+(CH3COO)2Са∙H2O+NH4OH→[Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)]+CH3COOH+CH3COONH4 4. Характеристика исходных реагентов Дигидрокверцетин, 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4H-1- бензопиран-4-он, брутто-формула С15Н12О7, М (304). Структурная формула представлена на рис. 2. OH HO O OH OH OH O Рисунок 2 - Структурная формула дигидрокверцетина Дигидрокверцетин должен соответствовать техническим требованиям ТУ 9354-04064843061-12 [4]. Содержание ДКВ в субстанции должно быть не менее 90% в пересчете на сухое вещество, субстанция дигидрокверцетин по показателям качества должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в табл. 2. 175 176 Таблица 2 № п.п. 1 Наименование показателей Описание Визуально 2 Растворимость ГФ ХI, вып. 1, с. 175 3 Подлинность Качественная реакция, Методы анализа ВЭЖХ Мелкокристаллический порошок от светложелтого до желтого цвета, без запаха Растворим в спирте, очень мало растворим в воде, практически нерастворим в хлороформе Качественная реакция: малиновое окрашивание спиртового раствора препарата в присутствии HCl и Zn. УФ-спектр: максимум при 290±2нм, минимум при 250±2 нм. На хроматограмме ВЭЖХ содержится пик дигидрокверцетина не более 10% ГФ ХI, вып. 1, с. 176 не более 8 % ГФ ХI, вып. 2, с. 25 ГФ ХI, вып. 2, с. 165 ВЭЖХ не более 0,3% не более 0,001% не менее 90% УФ-спектроскопия, ВЭЖХ 4 5 6 7 8 Родственные примеси Потери в массе при высушивании Сульфатная зола Тяжёлые металлы Содержание дигидрокверцетина Нормы Подлинность ДКВ характеризуется также спектрами ИК и ЯМР (1Н и 13С) [5]. ИК спектр ДКВ в вазелиновом масле содержит полосы поглощения, обусловленные валентными колебаниями ОН-связей – свободных (3550 см-1), связанных внутримолекулярной водородной связью (3406 см-1) и межмолекулярной водородной связью (широкая полоса с максимумом при 3250 см-1). Проявляются валентные колебания связей С-Н в ароматическом кольце (3080 см-1), валентные колебания ароматического кольца (1615 см-1, 1588 см-1) и валентные колебания карбонильной группы (1644 см-1) [5]. Спектр ЯМР 1Н ДКВ в ДМСО-d6 в области от 0,5 до 12 м.д. содержит следующие сигналы (δ, м.д.): 4,483 (1Н, дублет дублетов, J = 6,1 и 11,1 Гц, Н-3); 4,973 (1Н, дублет, J = 11,1 Гц, Н-2); 5,712 (1Н, дублет, J = 6,1 Гц, 3-ОН); 5,848 (1Н, дублет, J = 2,0 Гц, Н-8); 5,898 (1Н, дублет, J = 2,0 Гц, Н-6); 6,72-6,76 (2Н, АВ-система, J = 8,2 Гц, Н-5´, Н-6´); 6,868 (1Н, синглет, Н2΄); 8,93 (1Н, синглет, 4'-ОН); 8,98 (1Н, синглет, 3'-ОН); 10,78 (1Н, синглет, 5-ОН) и 11,89 (1Н, синглет, 5-ОН). Суммарная интенсивность всех указанных сигналов соответствует 12 протонам молекулы ДКВ С15Н12О7 [5]. Химические сдвиги ядер 13С ДКВ в ДМСО-d6 (δ, м.д.): 71,62 (С-3); 83,10 (С-2); 95,02 (С8); 96,03 (С-6); 100,53 (С-4а); 115,17 (С-5΄); 115,40 (С-2΄); 119,41 (С-6΄); 128,08 (С-1΄); 144,98 (С3΄); 145,81 (С-4΄); 162,6 (С-8а); 163,37 (С-5); 166,83 (С-7); 197,78 (С-4) [5]. 176 177 Кальций уксуснокислый 1-водный Са(CH3COO)2∙Н2О (х.ч.), представляющий собой белый порошок со слабым запахом уксусной кислоты, легко растворимый в воде, должен соответствовать техническим требованиям ГОСТ 3159-76 [6]. Количественно содержание кальция определяют в водном растворе ацетата кальция комплексонометрическим титрованием трилоном Б с индикатором мурексидом [7]. Вода дистиллированная, используемая в качестве среды проведения реакции, должна соответствовать техническим условиям ГОСТ 6709-72 [8]. Вода, используемая для промывания продукта реакции с целью удаления непрореагировавшей цинковой соли, также должна соответствовать техническим условиям ГОСТ 6709-72 [8]. Водный раствор аммиака для создания необходимой рН среды должен соответствовать техническим условиям ГОСТ 3760-79 [9]. Этанол, используемый для промывания продукта реакции с целью удаления следов непрореагировавшего ДКВ, должен соответствовать техническим условиям ГОСТ Р 51652-2000 [10]. 5. Изложение технологического процесса 3,04 г ДКВ (0,01 моль) растворяют в 70 мл подогретой до 80 оС воды в термостойком стакане объемом 100 мл. 5,28 г Са(CH3COO)2∙H2O (0,03 моль) растворяют в 30 мл воды в химическом стакане объемом 50 мл. Водные растворы ДКВ и Са(CH3COO)2∙Н2О смешивают в круглодонной трехгорлой колбе объемом 250 мл с обратным холодильником, добавляют 6,5 %ный раствор NH4OH до рН 8 и нагревают на водяной бане до 80 оС при постоянном перемешивании в течение 60 мин. В результате реакции образуется выпадающий в осадок продукт, представляющий собой порошок от зеленовато-коричневого до коричневого цвета. После охлаждения полученный осадок отфильтровывают с использованием стеклянного пористого фильтра, промывают 5 раз по 20 мл водой для удаления избытка соли, затем 3 раза по 15 мл 96 %-ным раствором этанола для удаления следов непрореагировавшего ДКВ и высушивают в сушильном шкафу при 50 оС до влажности не более 7 %, а затем при 105 оС до постоянной массы. В результате получается комплекс [Са(C15H11O7)(ОН)(H2O)] в количестве 2,654 г. Схема получения комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином представлена на рис. 3. 177 178 Раствор соли кальция и аммиака Раствор ДКВ Синтез Фильтрование Вода Промывка водой Фильтрат водный Спирт Промывка спиртом Фильтрат спиртовой Сушка Кальциевый комплекс ДКВ Рисунок 3 – Схема получения комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином 6. Теоретический выход комплекса [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)] 3,04 г 5,28 г Х C15H12O7+(CH3COO)2Са∙2H2O+NH4OH→[Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)]+CH3COOH+CH3COONH4 304 г/моль 176 г/моль 378 г/моль n (ДКВ) = 3,04 : 304 = 0,01 (моль) n ((CH3COO)2Са∙H2O) = 5,28 : 176 = 0,03 (моль) Избыток (CH3COO)2Са∙H2O составляет 0,02 моль. Теоретический выход комплекса определяем по ДКВ: n (ДКВ) : n([Ca(C15 H11O7)(OH)(H2O)]) = 1 : 1 178 179 n ([Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)]) = 0,01 (моль) m ([Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)]) = 0,01 ∙ 378 = 3,78 (г) 7. Практический выход [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)] Исходя из приведенного в пункте 5 практически полученного продукта в количестве 2,654 г, практический выход [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)] составляет: В = 2,654 / 3,78 ∙ 100 % = 70,2 % 8. Материальный баланс Материальный баланс получения комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином представлен в табл. 3. Таблица 3 Приход Расход Наименование Кол-во, г Наименование Синтез комплекса [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)] Депротонированный Дигидрокверцетин 3,04 дигидрокверцетин в составе комплекса Кальций в виде Са2+ в составе Ацетат кальция моногидрат 5,28 комплекса Связанная вода в составе Вода дистиллированная 100,00 комплекса Гидроксильные группы ОН- в Водный раствор аммиака 1,26* составе комплекса Промывание осадка для удаления следов соли Водный раствор, содержащий Вода дистиллированная 100,00 остатки непрореагировавшей соли и побочный продукт реакции Промывание осадка для удаления следов ДКВ Спиртовый раствор, содержащий Этанол 96 %-ный раствор 36,00** следы непрореагировавшего дигидрокверцетина ИТОГО 245,58 ИТОГО *m (NH4OH) = ρ ∙ V = 0,97 г/см3 ∙ 1,3 см3 = 1,26 г Кол-во, г 2,13 0,28 0,13 0,12 206,01 36,91 245,58 **m (C2H5OH) = ρ ∙ V = 0,80 г/см3 ∙ 45 см3 = 36 г Расчет материального баланса: 1) Расчет массы депротонированного дигидрокверцетина в составе комплекса: m = 2,654 ∙ 303 / 378 = 2,13 г 2) Расчет массы кальция в виде Са2+ в составе комплекса: m = 2,654 ∙ 40 / 378 = 0,28 г 3) Расчет массы связанной воды в составе комплекса: 179 180 m = 2,654 ∙ 18 / 378 = 0,13 г 4) Расчет массы гидроксильных групп в составе комплекса: m = 2,654 ∙ 17 / 378 = 0,12 г 5) Расчет массы водного раствора, содержащего остатки непрореагировавшей соли и побочные продукты реакции: m = 100 + 100 + (5,28 - 0,28) + (1,26 - 0,12) – 0,13 = 206,01 г 6) Расчет массы спиртового раствора, содержащего следы непрореагировавшего дигидрокверцетина: m = 36 + (3,04 – 2,13) = 36,91 г. 9. Норма расхода на получение 1 г продукта Массы дигидрокверцетина, ацетата кальция моногидрата, раствора аммиака для получения 1 г кальциевого комплекса [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)], а также массы воды и этанола, необходимые для проведения синтеза и промывания продукта, представлены в табл. 4. Таблица 4 Наименование Дигидрокверцетин Ацетат кальция моногидрат Вода дистиллированная для проведения синтеза Водный раствор аммиака 6,5 %-ный Вода дистиллированная для промывания осадка Этанол 96 %-ный раствор для промывания осадка Норма расхода, г 1,15 1,99 37,68 0,47 37,68 13,56 Расчет норм расхода на получение 1 г кальциевого комплекса [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)]: 1) Расчет массы дигидрокверцетина: m = 3,04 / 2,654 = 1,15 г 2) Расчет массы ацетата цинка двухводного: m = 5,28 / 2,654 = 1,99 г 3) Расчет массы воды дистиллированной для проведения синтеза: m = 100 / 2,654 = 37,68 г 4) Расчет массы водного раствора аммиака 6,5 %-ного: m = 1,26 / 2,654 = 0,47 г 5) Расчет массы воды дистиллированной для промывания осадка: m = 100 / 2,654 = 37,68 г 6) Расчет массы этанола 96 %-ного раствора для промывания осадка: m = 36 / 2,654 = 13,56 г 180 181 10. Аппаратурная схема процесса и спецификация оборудования Аппаратурная схема лабораторного способа получения комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином представлена на рис. 4. Рисунок 4 - Аппаратурная схема получения комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином: 1 - стакан термостойкий для приготовления раствора дигидрокверцетина; 2 – стакан для приготовления раствора кальциевой соли; 3 - колба для проведения синтеза; 4 термометр; 5 – холодильник обратный; 6 – мешалка; 7 – фильтр; 8 – шкаф сушильный; 9 – водяная баня. Оборудование, необходимое для получения кальциевого комплекса ДКВ [Ca(C15H11O7)(OH)(H2O)], представлено в табл. 5. Таблица 5 Наименование оборудования Колба круглодонная трехгорлая Стакан мерный термостойкий Стакан мерный Стакан мерный Термометр ртутный Холодильник обратный шариковый Мешалка верхнеприводная Количество 1 1 1 2 1 1 1 Насадка для мешалки двухлопастная 1 Фильтр стеклянный пористый Шкаф сушильный Водяная баня Пипетка стеклянная 1 1 1 1 Характеристика 250 мл 100 мл 100 мл 50 мл 0-100ºС Тип ХШ 10-50 об/мин Ширина 40 мм, фторопласт Размер пор 16-40 мкм V=20 л, t=40-120ºC GFL 1023 2 мл 181 182 рН-метр в комплекте с комбинированным рН-электродом и температурным датчиком Электрод стеклянный комбинированный 1 Эксперт-рН 1 ЭСК-10601 Список литературы 1. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400с. 2. Трофимова Н.Н., Столповская Е.В., Бабкин В.А., Федоров С.В., Калабин Г.А., Горяинов С.В., Золотарев Е.Е., Сафронов А.Ю., Кашевский А.В., Житов Р.Г. Строение и электрохимические свойства комплексных соединений металлов с дигидрокверцетином // Химия растительного сырья. - 2014. - № 3. – С. 121-131. 3. Столповская Е.В., Трофимова Н.Н., Бабкин В.А. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 4. Изучение реакции комплексообразования ионов Са2+ с дигидрокверцетином // Химия растительного сырья. - 2014. - № 4. – С. 145-151. 4. ТУ 9354-040-64843061-12 Дигидрокверцетин 5. Тюкавкина Н.А., Чертков В.А., Баженов Б.Н., Белобородов В.Л., Селиванова И.А., Савватеев А.М. Физико-химическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Х Международный съезд "Фитофарм 2006". - СПб. - 2006. - С. 338-342. 6. ГОСТ 3159-76 Кальций уксуснокислый 1-водный. Технические условия. 7. ПНД Ф 14.1; 2.95-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений массовой концентрации кальция в пробах природных и очищенных сточных вод титриметрическим методом. М.: Госстандарт России, 2004. 17 с. 8. ГОСТ 6709-72 Реактивы. Вода дистиллированная. Технические условия. 9. ГОСТ 3760-79 Реактивы. Аммиак водный. Технические условия. 10. ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия. 182 183 Приложение Д 183
