Физиологическое распределение эритроцитов на уровне дуги

УДК 612.1: 612.13
М.А. Медведев, Г.С. Коваль, Н.В. Рязанцева, М.А. Чурбанова, В.Д. Юрьева
ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ
НА УРОВНЕ ДУГИ АОРТЫ ПО ДАННЫМ ЦИТОМЕТРИЧЕСКОГО
И СПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспериментально установлено распределение эритроцитов на уровне дуги аорты по внешнему и внутреннему диаметру и
структурным свойствам; показано существование механизма сепарации более молодых и функционально-полноценных форм
эритроцитов в головной мозг для лучшего снабжения кислородом нервных клеток в головном мозге.
Известно, что эритроциты при движении в кровеносном русле обладают способностью к обратимой деформации в широких пределах [1]. Диаметр капилляров в головном мозге может достигать значений, в два раза
меньших, чем размеры красных кровяных клеток. Деформируемость эритроцитов во многом определяется
морфологическими свойствами клеток, стабильностью
ионного гомеостаза, сбалансированностью молекулярной
организации белковых и липидных компонентов мембраны эритроцита [1–3]. В связи с этим существует гипотеза
о наличии механизма сепарации эритроцитов по признаку
зрелости на уровне дуги аорты [4]. Это явление рассматривается как процесс, способствующий адекватному кислородному и энергетическому снабжению клеток головного мозга. Обеспечить соответствие кровотока кислородному запросу позволяет преимущественное поступление в головной мозг молодых, более эластичных и функционально полноценных эритроцитов.
В механизмах формирования гипоксии головного мозга при различных патологических изменениях дуги аорты
и аортального клапана сердца немаловажное значение
может играть нарушение гемодинамики в дуге аорты и
как следствие нарушение распределения эритроцитов по
качественному признаку между общей сонной артерией и
другими крупными сосудами, отходящими от дуги аорты.
Результатом этого может являться нарушение адекватного участия красных кровяных клеток в газообмене, обусловленного их уникальной способностью к деформации
в мелких сосудах головного мозга. Известно, что ключевую роль в определении структурной организации и
функционирования эритроцита играет его мембрана. При
старении красной кровяной клетки ее мембрана трансформируется, снижается активность мембранных ферментов, изменяется вязкость мембраны. Эти процессы
приводят к уменьшению размера эритроцита, его способности переносить кислород. В этой связи при изучении
механизмов сепарации эритроцитов очевидна необходимость детальной оценки состояния мембраны и ее компонентов, что позволит более полно и эффективно изучить
адаптационные механизмы, направленные на предотвращение гипоксических состояний мозга.
С целью изучения закономерностей перераспределения красных кровяных клеток в дуге аорты в настоящем исследовании проводилась оценка диаметра и
вязкости мембраны эритроцитов крови у кроликов,
полученной из кровеносных сосудов разного уровня
(аорты, общей сонной и бедренной артерий).
Материалы и методы исследования
Проводилась катетеризация общей сонной и бедренной артерий, восходящей части дуги аорты у
170
14 здоровых кроликов. Кровь стабилизировали гепарином (50 ЕД/мл крови). Все вмешательства осуществляли с соблюдением принципов Хельсинской декларации
Всемирной медицинской ассоциации (1989 г).
Диаметр эритроцитов исследовали методом сканирующей электронной микроскопии. Образцы готовили
по методике Г.И. Козинца c соавт. [2]. Для этого пробы
крови фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида. После отмывания эритроцитарной взвеси фосфатным буфером (рН=7,4) осуществляли постфиксацию материала 1% раствором четырехокиси осмия.
После повторного отмывания клеток фосфатным буфером проводили их обезвоживание в серии этанола возрастающей концентрации (от 30 до 100%) и в ацетоне.
Приготовленную суспензию наносили на алюминиевые
подложки, высушивали, напыляли ультратонким слоем
серебра. Готовые образцы изучали в электронном микроскопе «GEM-100» при ускоряющем напряжении
35 кВ, силе тока 0,63 А, под углом наклона 35°. Для
получения значений диаметра эритроцитов в каждом
препарате измеряли внешний и внутренний диаметр
100 клеток. Мембраны эритроцитов выделяли по методу [5] в модификации [6]. В качестве флюорофора использовали пирен. При изучении состояния мембран
эритроцитов с использованием флуоресцентного зонда
пирена определяли величины отношений интенсивностей флюоресценции I370/I470 при λв=285 и 340 нм и
I370/I390 λв=340 нм. Показатель величины миграции
энергии при индуктивно-резонансном ее переносе с
триптофановых остатков белков на пирен в мембранах
эритроцитов рассчитывали по формуле [7, 8]. Результаты анализировали статистически с проверкой показателей на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Достоверностью различий (p<0,05) определяли с использованием непараметрического критерия Вилкоксона.
Результаты исследования
Результаты цитометрического исследования красных клеток крови показали, что соотношение внутреннего и внешнего диаметров дискоцитов у эритроцитов
из сонной артерии (54,86±1,49%) достоверно превышает соответствующую величину у красных кровяных
клеток из аорты (52,71±0,71%) и бедренной артерии
(52,31±2,12%) при n=10 и p<0,05.
При определении степени эксимеризации неполярного зонда пирен, диффундирующего в гидрофобном
компартменте мембраны, было проведено исследование микровязкостных свойств липидной фазы мембран
как в области белок-липидных контактов (при длине
волны возбуждающего света (λв), равной 285 нм), так и
всего липидного бислоя мембран красных кровяных клеток (при λв=340 нм). Средние величины отношения интенсивностей флуоресценции димерной и мономерной
формы липотропного зонда пирена (I470/I340) при длине
волны возбуждающего света 340 нм в мембране эритроцитов из разных отделов артериальной системы отличались (p<0,01): в восходящей аорте – 0,347±0,062 усл. ед., в
сонной и бедренной артериях – 0,386±0,036 и 0,306±
±0,050 усл. ед. соответственно. Вместе с тем эксимеризация пирена в области анулярной липидной фракции осуществлялась с гораздо большими ограничениями, на что
указывало несколько сниженное среднее значение I470/I370
при λв=285 нм, в мембранах эритроцитов в восходящей
аорте составила 0,305±0,041 усл. ед., в сонной и бедренной артериях – 0,343±0,046 и 0,284±0,045 усл. ед. соответственно (отличия достоверны при p<0,01).
Соотношение интенсивностей флуоресценции мономеров пирена (I370/I390) при λв=340 нм, отражающее
полярность микроокружения зонда в интегральной
липидной фазе эритроцитарных мембран в восходящей аорте, оказалось равным 1,010±0,014 усл. ед. и не
отличалось от исследуемой величины в сонной артерии – 1,010±0,010, отличалось от соотношения I370/I390
в бедренной артерии – 0,995±0,080 (p<0,01). Наряду с
этим процент индуктивно-резонансного переноса
энергии с триптофана на пирен, позволяющий судить
о белково-липидных взаимодействиях в мембранах,
составил в восходящей аорте 69,16±1,37%, в сонной
артерии – 71,83±1,84%, в бедренной – 69,16±4,65%,
статистический анализ показал, что данный показатель в исследуемых выборках значимо не отличался
(таблица).
Показатели флюоресценции зонда пирена в мембранах эритроцитов крови кролика из разных уровней артериальной системы
Место забора крови
λв=285 нм
I370/I470
Параметры флюоресценции, усл. ед.
λв=340 нм
I370/I470
I370/I390
Величина
миграции
энергии, %
Аорта (n=14)
0,305±0,041
0,347±0,062
1,010±0,014
69,16±1,37
Сонная артерия (n=14)
0,343±0,046 (p1<0,01)
0,386±0,036 (p1<0,01)
1,010±0,010
71,83±1,84
Бедренная артерия
0,284±0,045 (p1, p2<0,01)
0,306±0,050 (p1, p2<0,01)
0,995±0,080
69,16±4,65
(n=14)
Примечание. p1 – достоверность различий выборки по сравнению с восходящей аортой; p2 – достоверность различий выборки по сравнению с
общей сонной артерией.
Таким образом, нами установлен факт физиологической сепарации эритроцитов на уровне дуги аорты, характеризующийся поступлением в сонную артерию более
молодых эритроцитов с лучшими структурными свойствами мембраны, способных переносить большее количе-
ство кислорода к клеткам головного мозга. В бедренную
артерию поступают эритроциты с увеличенной вязкостью
липидной фазы мембраны и большим диаметром. Биологическая значимость заключается в более выраженном
снабжении кислородом нервных клеток головного мозга.
ЛИТЕРАТУРА
1. Dao M., Li J., Suresh S. Molecularly based analysis of deformation of spectrin network and human erythrocyte // Materials Science and Engineering.
2006. № 26. P. 1232–1244.
2. Козинец Г.И., Симоварт Ю.А. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови.
Таллин: Валгус, 1984. 116 с.
3. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. 202 с.
4. Медведев М.А., Голосов О.С., Нестерова Т.П. Распределение эритроцитов в кровеносном русле на уровне дуги аорты по данным морфологических исследований // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. 1986. № 12. С. 648–649.
5. Dodge J.T., Mitchell С., Hanahan D.J. et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1963. Vol. 100, № 1. P. 119–130.
6. Петрова М.П., Сербшова Т.А., Васильев П.С. // Лаб. дело. 1978. № 8. С. 503.
7. Владимиров Ю.А., Добрецов Т.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М., 1980.
8. Добрецов Т.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М., 1989.
Статья поступила в редакцию журнала 5 декабря 2006 г., принята к печати 25 декабря 2006 г.
171