Генодиагностика в современной лаборатории

Генодиагностика
в современной лаборатории
России
Копылов Владимир Михайлович, к.б.н.
Генодиагностика в России
Инфекции передающиеся половым путём
Инфекции передающиеся через кровь
Особо опасные инфекции
Наследственные заболевания
Факторы риска соматических заболеваний
Фармакогенетика
Гено-модифицированные продукты питания
Сочетание генодиагностики с другими методами
Выделение нуклеиновых кислот
1. Сорбентный метод на магнитных частицах
«ручной» и «автоматизированный» – ВБ и ИЛС.
2. Термо-коагуляционный метод, как экспресс
-метод – ЛИТЕХ, ДНК-технология, ВБ, ИЛС
«
-
«
»,
-
»-
Возможности технологий разных производителей при
выявлении РНК-ВГС на одном приборе
Тест фрмы
ЛИТЕХ
ДНКтехнололгия
Амплисенс
Прибор ПЦР-РВ Качественное,
Количественное
184 образца/ час , 176
образцов/час
iQ5
7
8
CFX96
6
7
ДТ-96
11
12
RG 3000
RG6000
15
16
Roche
Light Cycler 480
9
10
Abbott
Applied
Biosystems
7500, 7300
11
12
Методы регистрации
результатов ПЦР-амплификации
Электрофорез
Конечная точка
Амплификация (ПЦР)
Реальное
время
Масс-спектрометрия
ДНК-гибридизация
ТОЛЬКО БИОЧИПЫ
Сравнение аналитической чувствительности при
э/форетической
и флуоресцентной детекции ЦПР продуктов.
Шипулин Герман Александрович
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ЗА ЦИРКУЛЯЦИЕЙ
ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ
14.00.30 – эпидемиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук, Москва – 2008
).Впервые в России разработаны ПЦР тест-системы
для выявления и дифференциации штаммов вирусов А/H5N1 и
А/H7, обладающие высокой аналитической чувствительностью
(5*103 гэ/мл в варианте электрофоретической детекции, 1*103
гэ/мл в варианте флуоресцентной детекции) и 100%
специфичностьюl.
Приборная база ПЦР-РВ
В лабораториях России можно увидеть весь спектр современной
приборной базы зарубежного производства – BioRad, Applied Biosystems ,
Roche, QIAGEN/Rotor-Gene Q и отечественного производства –
«ДНК-технология» (ДТ-32, ДТ-96, ДТ-лайт) и «Синтол» (АНК-32М).
Все производители стремятся создать прибор быстрого
нагрева/охлаждения термоблока (5-6оС/2-3оС) с многоканальной
регистрацией флуоресцентной метки (5-6 каналов).
Зарубежные компании стали русифицировать действия прибора.
Некоторые важные моменты аналитического
этапа ПЦР-ВР
Потеря чувствительности выявления гена
«хит шока» HSP89
Контроль взятия материала
двумя гинекологами при анализе БВ
Пример комплексного анализа
Бактериальный вагиноз = ПЦР+Микроскопия
Пример комплексного анализа
Мужское бесплодие = ПЦР SNP + ПЦР УПМикрофлоры
для определения генетически и микробиологическиобусловленных причин мужского бесплодия:
Микроделеций – a,b,c - локуса AZF хромосомы Y
мутаций гена CFTR (связь с муковисцидозом)
полиморфизмов предрасположенности к бесплодию - PDE3A, PROK2
УПМикрофлора в предстательной железе - Escherichia coli, Proteus spp.,
Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Е.faecium, Serratia spp.,
Enterobacter spp., Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes
Streptococcus spp.,
ASBA Real-Time detection детекция «ASBA» РТ
Uses real-time reporter probes
called “molecular beacons”
Использование зондов для РТ названных
«молекулярные биконы»
sense
RNA
oligo P1
Reverse Transcriptase
RNase H
oligo P1
RT
RT
RNase H &
oligo P2
Reverse
Transcriptase
T7 RNA
polymerase
oligo P2
T7 RNAP
anti-sense
RNA
F
F
Q
Q
Molecular
beacon
hybridization
asba & Quantification –
ASBA/ количественная оценка
Performance Claims of HIV-1 viral load, product FDA-approved
ДИНАМИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ ВЫЯВЛЕНИЯ
Linear dynamic range from 50 – 3,000,000 IU / ml: 5 Log
4.4
3.9
N o r m a liz e d f lu o re s c e n c e
HIV-1 viral load values In International Units (IU) per ml
Sensitivity (sample 1 and 2 ml of human plasma ЧУСТВИТЕЛЬНОСТЬ
cut-off
25 IU/ml (1.0 ml) and 12.5 IU/ml (2.0 ml)
50% detection rate: 62 IU/ml (1.0 ml) and 36 IU/ml (2.0 ml)
95% detection rate: 357 IU/ml (1.0 ml) and 141 IU/ml (2.0 ml)
3.4
neg
100 M
10 M
1M
100 K
10 K
1000
100
10
2.9
2.4
1.9
1.4
СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Specificity 99.7% (95% confidence limit 98.5 – 100%)
HIV-1 subtype reactivity HIV-1 group M subtypes A to J
Accuracy - ТОЧНОСТЬ < 0.2 log deviation from 1st international
standard
Precision – ТОЧНОСТЬ В ДИНАМИЧЕСКОЙ ОБЛАСТИ
ВЫЯВЛЕНИЯ
0.12 log in the range 1,000 – 3,000,000 IU / ml
0.28 log in the range <= 1,000 IU / ml
0.9
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0
Amplification time (minutes)
bioMérieux &
AD
АмплиСенс Chlamydia trachomatis - РИБОТЕСТ
Количество тестов: 50
Метод детекции: FRT (ПЦР-РВ)
Комплектация: Полный набор реагентов
Фасовка: Флаконы с реагентами
Форма: NASBA в реальном времени
Срок изготовления: 15 суток
Срок хранения: 6 месяцев
Цена: 21 038 руб.
Для теста используют ферменты фирмы Biomerieux
Адаптирован под амплификатор: «Rotor-Gene» 3000/6000
(«Corbett Research», Австралия) или «iQ iCycler» («BioRad», США).
Чуствительность: 3х104 копий РНК/мл = 3х103 г-экв ДНК/мл
Новый базис медицины – генетика !
1) 2003г полностью отсеквенирован геном человека.
2) 9 из 10 естественных смертей американцев имеют
генетическое обоснование.
Последние 10 лет новые генетические технологии
позволили проводить скрининг и диагностику
заболеваний по сотням генетических маркёров.
Center for Disease Control and Prevention. Public Health Genomics. Genomics and Health.
http://www.cdc.gov/genomics/public/index.htm. Accessed on June 23, 2010.
Первостепенные задачи клинической
и лабораторной генетики
Онкология (особенно семейные случаи)
Сердечно-сосудистая патология
Диабет
Дипресии
Фармакогенетика
Профили наборов в США и ЕС
FDA
Наследственные моногенные заболевания (муковисцедоз)
FDA
Индивидуальное лекарство
FDA
Риск развития тромбозов (тромбофилии)
FDA
CE
Репродуктивное здоровье
Женское здоровье – привычное невынашивание беременности
Мужское здоровье – нарушение репродуктивной функции
FDA
– подбор дозы варфарина
– детоксикация
Онкология
Индивидуальное лекарство – химиотерапия
Женское здоровье – риск развития рака молочной железы, яичников
Риск развития заболеваний
_
Сердечно-сосудистых, воспалительных заболеваний кишечника, сахарного
диабета и ожирения, остеопороза, дегенерации сетчатки, нарушений иммунитета
Примеры фармакогенетической информации
в инструкции применения ЛП
Поиск оптимального
метода для рутинного
клинического тестирования
Мультицентровое “слепое” исследование методов тестирования мутаций KRAS для клинического применения
V. Whitehall et al, J Mol Diagnostics, 2009, 11, №6, 543-551
Метод
% обнаруженных
мутаций
Время исследования, час
37,5
5
35
5
Пиросеквенирование
27,5
3,5
HRM (кривые плавления
высокого разрешения)
33,8
2,5
Аллель-специфичная ПЦР +РВ
37,3
2,5
SSCP (конформационный полиморфизм однонитевых фрагментов)
Секвенирование (по Сэнгеру)
Результат анализа SNPs
при “слепом”исследовании различными методами
S.B.Vezenegho et al, Malaria Journal 2009, 8:282
Результат
AS - PCR
TaqMan
MCA
HRM
Правильный
90
89
84
88
Ошибка
0
0
8
6
Не определено
6
7
4
2
AS-PCR TaqMan MCA
–
HRM
-
Аллель-специфичная ПЦР
Аллель-специфичная ПЦР в одной пробирке - мультиплекс
Анализ кривых плавления
Анализ кривых плавления высокого разрешения
Форматы детекции результатов
Длительность,
включая
выделение - 2,5 ч
Аллель-специфичная ПЦР
Н
Нормальная
гомозигота
М
Аллель 1
Н
М
Мутантная
гомозигота
Аллель 2
Х
П2
П1
П1
Х
П3
П2
П3
Гетерозигота
Н
М
Аллель 1
Аллель 2
П1
П2
П3
П3
Наборы “SNP-экспресс” адаптированы для
разных приборов проведения ПЦР-РВ:
CFX96
iQ5
RG Q
ДТ-96
Масс-спектрометрическое
секвенирование ДНК
Наиболее
производительный
и точный метод
анализа
нуклеотидных
полиморфизмов
Аналитическая схема
Амплификация, дефосфорилирование,
минисеквенирование в микропланшетном
формате (96 или 384 образцов)
Масс-спектрометрический анализ
и интерпретация результатов
Профили определения SNP в
патологии
Системы свёртывания крови и фибринолиза:
гены - F5, F 2, MTHFR, MTRR, MTR, F7, ITGB3, ITGA2, GP1BA,
P2RY12, FGB, SERPINE1(PAI 1), EDN1, SELP, JAK2
Сердечно-сосудистые заболевания – Гипертензия:
гены – ACE, AGT, AGTR1, NOS3, AMPD1
Сердечно-сосудистые заболевания – Нарушения липидного
обмена: гены – LPL, APOE, PON1, POC3, LIPC, LIPC, GCCR
Сердечно-сосудистые заболевания – Инсульт, инфаркт:
гены - ITGA2, GP1BA, AGT, NOS3, APOE, SELE, SELP, GCLM
Что такое “SNP-экспресс”?
Это - универсальная система для
определения генетических полиморфизмов на основе метода
аллель-специфичной ПЦР
Более 150 тест-систем!
Современные методы анализа нуклеотидной
последовательности ДНК
• Секвенирование
по
Сенгеру
(метод
ферментативного
построения)
• Методы
высокопроизводительного
геномного
севенирования:
Пиросеквенирование. Технология 454 Life Science
«Мостиковая ПЦР». Технология Solexa
Секвенирование
лигированием.
Технология
SOLIDTM
System, Applied Biosystems
• "Секвенирование единичной молекулы" (single molecule
sequencing)
Высокопроизводительное параллельное
секвенирование популяций клонально
амплифицированных молекул ДНК
Genome Sequencer 20
System, Genome
Sequencer FLX System
(454 Life Science)
Illumina Genome Analyzer
DNA sequencing by ligation
по технологии Solexa
(SOLIDTM System, Applied
Biosystems)
Genome Analyzer
SOLiD™ Analyzer
Genome Sequencer FLX
Геномное секвенирование –
новые подходы
создание библиотеки ДНК - фрагментов
клонирование фрагментов ДНК в E. сoli
амплификация каждого фрагмента
создание (с помощью ПЦР) молекулярных колоний,
позволяющих обойтись без клонирования ДНК в
бактериальных клетках
последовательное секвенирование каждого фрагмента методом Сэнгера
одновременное секвенирование множества форагментов ДНК
• Один цикл секвенирования (run, "прогон") –
примерно 5 ч.
• Один цикл - 200,000 ÷ 350,000 реакций, а теперь
уже 1.6 млн. реакций!
• В каждой реакции изначально прочитывалось
около 100 оснований, потом 250, а теперь уже
около 400
• В 2005 году по технологии Life Sciences за один
раз (!!!) был расшифрован 600 000 нуклеотидный геном бактерии Mycoplasma
genitalium с точностью 99,4%. Весь процесс
занял примерно одни сутки
Пример подхода Минобороны США
В настоящее время американские военные являются самыми опытными
практиками по фармако-генетическому скринингу в большом популяционном
масштабе. Все военнослужащие проходят «Глюкозо-6- ФосфатДегидрогеназное»
тестирование, скрининг крови на серповидные клетки, скрининг цветового зрения,
с последующим экологическим и фармакологическим наблюдением, направленным
на предотвращение заболевания.
В дополнение к существующим генетическим программам тестирования,
МО обороны разработало комплексную программу лабораторного скрининга
новорожденных, который будет потенциально охватывать ежегодно 50 000
новорожденных годных к действительной службе и пенсионеров МО.
Курчатовский НБИК-Центр
как проект междисциплинарных
исследований и
разработок
Геномика человека в России
Лаборатория геномики была открыта в январе 2009 года в рамках
организации и создания Курчатовского НБИК-Центра и стала первым
биологическим подразделением в составе НБИК-Центра.
Первая стадия — полногеномное секвенирование ДНК здоровых
соматических клеток — прошла в 2009 году. «Русский геном» вошёл в
первую десятку отсеквенированных в мире геномов человека.
Выбор человека-донора биологического материала происходил на основе
результатов анализа данных полногеномного генотипирования этнических
групп Российской Федерации методом главных компонент. Был выбран
образец, расположенный на двумерной карте в координатах первой и
второй главных компонент (RS1-RS2) в области группы этнических русских.
При этом использовались две из представленных на современном рынке
технологий — циклическое лигазное секвенирование SOLiD™ (Applied
Biosystems) и технология секвенирования на молекулярных кластерах с
использованием флуоресцентномеченых предшественников на приборе
Genome Analyzer II (Illumina).
http://russiangenome.ru/categories О проекте «Русский геном»
Цель проекта «Русский геном»
Используемые методы, включающие диагностику путем
анализа однонуклеотидных полиморфизмов на микрочипах,
позволяют получить материал для создания генетической
базы данных этносов РФ, что может быть использовано не
только для определения этнической группы и последующей
идентификации личности, но и для тестирования новых
поколений зарубежных лекарственных средств, которые
были разработаны и клинически тестированы на других
мировых популяциях.
Последовательность ДНК генома отдельного человека
может быть использована для определения вероятности
возникновения генетических заболеваний у него, членов его
семьи и в его будущих поколениях.
Спасибо за внимание!
ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ОФИС
107023 г.Москва, ул. Малая
Семеновская, дом 3А, стр. 2
м. «Электрозаводская»
Телефон/факс (495) 258 39 47
www.lytech.ru