новое в типировании гена каппа-казеина крупного рогатого скота

УДК 636.082: 636.034: 577.2
НОВОЕ В ТИПИРОВАНИИ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Р.Р. Шайдуллин1, А.С. Ганиев2, Т.Х. Фаизов3, Г.С. Шарафутдинов4, К.В. Усольцев5, Н.И. Хаммадов6,
Ф.С. Сибагатуллин7
1
кандидат сельскохозяйственных наук, доцент; 2 аспирант; 3 доктор ветеринарных наук, профессор,
заведующий лабораторией; 4 доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заведующий кафедрой; 5 кандидат
ветеринарных наук; 6 кандидат биологических наук; 7 доктор ветеринарных наук, профессор
Казанский государственный аграрный университет,
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (Казань), Россия
Аннотация. Целью настоящей работы явился изучение полиморфизма локусов генетических маркеров
белковомолочности молочных коров на основе полимеразной цепной реакции. Было проведено конструирование
специфичных праймеров к генетическим маркерам продуктивности и разработаны лабораторные образцы
ПЦР тест-систем для генотипирования по генам белкомолочности.
Ключевые слова. Каппа-казеин, белок, полимиразно цепная реакция, праймер, аллель, ген, ДНК.
Введение. Основными признаками, характеризирующими биологические и продуктивные качества
крупного рогатого скота являются жир и белок молока.
В молоке имеются ряд белков, основным из которых является каппа-казеин. Казеин находится в соединении с кальциевыми солями, образуя казеинатокальцийфосфатный комплекс.
Среди казеиновых генов наиболее изучен ген κаппа-казеина (CSNЗ), для которого известна полная
нуклеотидная последовательность. Ген κаппа-казеина имеет размер 13000 п.о. и состоит из 5 экзонов общей
длиной 850 п.о. и 4 интронов. Длина цепи белка κаппа-казеина составляет около 169 аминокислот.
Генетические варианты А и В наиболее распространены. Они присутствуют у всех пород скота с различной частотой, а остальные аллели являются редкими. Варианты каппа-казеина А и В различаются двумя
аминокислотными заменами (Thr 136 → Iso и Asp 148 → Ala) и вызваны соответствующими точковыми мутациями в позициях 5309 (С→Т) и 5345 (А→С) в нуклеотидной последовательности гена.
Ген каппа-казеина имеет генотипы CSN3АА, CSN3АВ, CSN3ВВ. По данным различных исследователей,
В-аллель гена каппа-казеина указывает на более высокое содержание белка в молоке, более высокий выход
творога и сыра, а также лучшие коагуляционные свойства молока [1, 2].
Молочные белки в большей степени являются породными и индивидуально-генетическими признаками
крупного рогатого скота, поэтому выявление маркеров белковомолочности (каппа-казеина) в геноме животных
существенно ускоряет ведение селекции и создание стада коров с высоким содержанием в молоке белков, важных при приготовлении сыров и творога [3].
Материал и методика исследований. Исследования проводились в условиях племенного репродуктора крупного рогатого скота ООО «Дусым» Атнинского района Республики Татарстан, на базе «Межкафедральной лаборатории биотехнологии и молекулярной генетики животных и растений» Казанского государственного
аграрного университета и ООО НПФ «Биогентехнология-форте».
Поиск нуклеотидных последовательностей генов каппа-казеина (CSN3) осуществлялся по базам данных нуклеотидных последовательностей генов NCBI на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Анализ найденных нуклеотидных последовательностей генов CSN3 с целью определения специфичных
пар праймеров к вышеуказанным генам осуществлялся с помощью пакета программного обеспечения Vector
NTI 9.0. В частности, с помощью данного программного пакета установлены нуклеотидный состав, особенности третичной структуры (наличие димеров, «шпилек» и палиндромов) и термодинамические свойства вышеуказанных праймеров.
Разработанные праймеры для определения генетического полиморфизма генов белковомолочности
(CSN3) были заказаны в ЗАО «Синтол» со следующими характеристиками: очистка праймеров в ПААГе, концентрация синтезированных праймеров 2 ОЕ/мл.
Для исследований использовали цельную кровь коров, отобранную из хвостовой или яремной вен в
пробирки с 3%-ным ЭДТА (трилон Б).
Для выделения ДНК вирусов использовали комплект реагентов «ДНК-сорб» (Интерлабсервис). Выделение ДНК осуществляли согласно инструкции к набору.
Полимеразную цепную реакцию выполняли на детектирующем амплификаторе ДТ-96 (ДНКтехнология, Россия).
С полученными ампликонами (продукты ПЦР) проведен рестрикционный анализ с использованием
различных эндонуклеаз рестрикции (EaeI, HinfI, HaeIII, TaiI).
Детекцию результатов осуществляли с помощью горизонтального электрофореза в 1,8/2,5-% агарозном
геле.
© Шайдуллин Р.Р., Ганиев А.С., Фаизов Т.Х., Шарафутдинов Г.С., Усольцев К.В., Хаммадов Н.И., Сибагатуллин Ф.С. /
Shaidullin R.R., Ganiev A.S., Faizov T.Kh., Sharafutdinov G.S., Usoltsev K.V., Hammadov N.I., Sibagatullin F.S., 2014
Результаты собственных исследований. Нами был разработан лабораторный образец ПЦР тестсистемы для генотипирования по гену молочного белка каппа-казеина.
Данная тест-система состоит из 3 наборов реагентов:
1.
набор для выделения ДНК;
2.
набор для проведения амплификации;
3.
набор для детекции результатов.
1. Набор для выделения ДНК. Выделение ДНК основан на сорбентном методе. Имеет в своем составе
лизирующий раствор, 2 отмывочных раствора, буфер для элюции, универсальный сорбент (оксид кремния).
2. Набор для проведения амплификации представляет собой набор реактивов для проведения полимеразной цепной реакции. Включает в свой состав пару праймеров для амплификации участка гена по гену молочного белка каппа-казеина, смесь нуклеозид трифосфатов (2,5мМ), хлорид магния (25мМ), 10-кратный буфер
для проведения ПЦР, Taq полимераза. ПЦР представляет одностадийную реакцию с использованием специфичных праймеров.
3. Набор для детекции результатов представляет собой набор реактивов для проведения вертикального
электрофореза в 12% полиакримадном геле (ПААГ).
Интерпретацию результатов ПЦР-ПДРФ начинают с анализа дорожек геля, содержащих контрольные
образцы.
В дорожке с отрицательным контролем светящаяся полоска должна отсутствовать.
В дорожке с положительным контролем ПЦР должна выявляться светящаяся полоска размером 453 пар
нуклеотидов.
При наличии аллельных мутаций на треке появляются полосы с различными молекулярными массами
(рис.1).
Дифференциацию аллельных вариаций осуществляют с помощью таблицы 1.
Выводы. Таким образом, были синтезированы уникальные специфические праймеры к гену каппаказеина. С использованием данных праймеров мы разработали ПЦР-тест-систему для определения генетического потенциала молочного скота по белковомолочности. Основной диагностический метод в этих тестсистемах является ПЦР-ПДРФ-анализ.
Таблица 1
Определение аллельных вариаций гена каппа-казеина с помощью
эндонуклеаз рестрикции Hinfl, Hae III, TaiI
Генотипы
Hinfl
AA
AB
BB
AE
BE
—
426
426
—
426
326
326
—
326
326
100
100
—
100
100
27
27
27
27
27
230
230
230
230
230
Рестриктазы
Hae III
223
—
223
—
223
—
223
145
223
145
—
—
—
78
78
—
—
—
—
—
TaiI
254
254
254
254
254
199
199
199
199
199
EE
AC
BC
—
426
426
326
326
—
100
100
—
27
27
27
230
230
230
—
223
223
145
—
—
78
—
—
—
453
453
254
254
254
199
199
199
Рис. 1. Определение аллельных вариантов гена каппа-казеина (2,5 % агарозный гель, эндонуклеаза рестрикции Hinf I)
Примечание: 1 – 3 трэки – генотип АА, 4 трэк – генотип АВ, 5, 6, 8 трэки – генотип ВВ, 7 трэк – ОКО.
1. Наличие единичного паттерна размером в 426 п.о. характерно для аллельного варианта ВВ;
2. 2 паттерна размером 100 и 326 п.о – аллель АА;
3. 3 паттерна размером в 100, 326 и 426 п.о. – аллель АВ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Alexander, L.J. Isolation and characterization of the bovine k-kazeine gene / L.J Alexander, A.F Stewart, A.G Mackinlay, T.V Kapelynskaya, T.M Tkach, S.I Gorodetsky // European Journal of biochemistry, 1988. – V. 178. – P. 395-401.
2. Денисенко, Е.А., Калашникова, Л.А. Белковомолочность и технологические свойства молока коров с различными генотипами каппа-казеин / Е.А. Денисенко // Сб. докл. сиб. науч.- практ. конф. – Красноярск, 2006. – С. 64-70.
3. Ахметов, Т.М. Использование методов маркер-вспомогательной селекции в молочном скотоводстве Республики
Татарстан / диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук / Т.М. Ахметов // – Казань, 2009. – 277 с.
Материал поступил в редакцию 27.01.14.
NEW IN THE TYPING OF KAPPA CASEIN GENE OF DAIRY CATTLE
R.R. Shaidullin1, A.S. Ganiev2, T.Kh. Faizov3, G.S. Sharafutdinov4, K.V. Usoltsev5,
N.I. Hammadov6, F.S. Sibagatullin7
1
Candidate of Agricultural Sciences, Associate Professor; 2 Postgraduate;3 Doctor of Veterinary Sciences, Professor,
Laboratory Chief; 4 Doctor of Agricultural Sciences, Professor, Department Chairman; 5 Candidate of Veterinary
Sciences; 6 Candidate of Biology; 7 Doctor of Veterinary Sciences, Professor.
Kazan State Agrarian University,
Federal Center of Toxicological, Radiation and Biological Safety (Kazan) Russia
Abstract. The aim of the work is study of polymorphism of protein-based milking capacity genetic markers locus based on PCR. The construction of specific primers to the genetic markers of productivity was conducted, and laboratory samples of PCR test systems for genotyping of protein-based milking capacity genes were worked out.
Keywords: Kappa casein, protein, polymerase chain reaction, primer, allele, gene, DNA.