ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные методы
исследования
ПРИМЕНЕНИЕ ТОНКОСЛОЙНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ И ХРОМАТО-МАСССПЕКТРОМЕТРИИ ПРИ ОБНАРУЖЕНИИ
АЛКАЛОИДОВ В ПАТОЛОГИЧЕСКОМ
МАТЕРИАЛЕ ЖИВОТНЫХ
М.В. Бойченко, Г.А. Слащинин. Е.В. Суворова
г. Красноярск
В практике химико-токсикологического отдела любой
ветеринарной лаборатории определение алкалоидов стоит
на особом месте. Как известно алкалоиды способны вызвать отравление животных. Источником токсичных алкалоидов могут служить некачественные корма, в частности
сено и сенаж. При хранении алкалоиды практически не разрушаются, а, попав в организм животных, могут вызвать
расстройство гемодинамики и другие патологические изменения.
В то же время в ветеринарной практике применяется достаточно много лекарственных препаратов, которые либо
являются сами алкалоидами (кофеин), либо дают реакцию
на общие алкалоидные реактивы, например на реактив Драгендорфа.
В последнее время, ветеринарные врачи сталкиваются с
проблемой отравления мелких домашних животных некоторыми лекарственными препаратами, например тубазидом.
Тубазид (изониазид) – в химическом отношении гидразид изоникотиновой кислоты, является противотуберкулезным препаратом.
При появлении первых симптомов отравления у животных: отказ от корма, сильное возбуждение, сильные боли
в брюшной области - применяется симптоматическая терапия, в частности назначаются инъекции но-шпы, папавери177
на и др. Если лечение эффекта не дает и животное гибнет,
то возникает необходимость вскрытия животного для постановки диагноза.
При исследовании патологического материала на токсиканты, исследование на алкалоиды является обязательным.
При положительной реакции на алкалоиды перед врачом
токсикологом встает вопрос: на какое вещество сработал
реактив, на лекарственное, или на токсическое? Ответить
на этот вопрос во многих случаях окончательно не удается,
в заключении указывается, что обнаружены алкалоиды, что
и принимается за причину гибели животного.
Методика исследования на алкалоиды состоит в том, что
они извлекаются подкисленной водой, из которой впоследствии действующие начала экстрагируются хлороформом. Далее, водный раствор подщелачивается и проводится повторная
экстракция хлороформом. В объединенных хлороформных
экстрактах определяется наличие алкалоидов. Для этой цели
используются реактивы: Бушарда, Зонненштейна, Шейблера.
Но наибольшее значение имеет реактив Драгендорфа.
Целью данной работы явилось определение значения метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) и хромато-массспектрометрии (ГХ /МС) для обнаружения токсических и
лечебных компонентов в патологическом материале.
Задачи исследования:
1. Исследовать общую, цветную реакцию на алкалоиды
с тубазидом, папаверином, но-шпой.
2. Определить приемлемость определения различных
препаратов разными методами (ТСХ, ГЖХ МС, общеосадительные реактивы).
3. Провести дифференциацию различных препаратов,
выделяемых из патологического материала с помощью метода ТСХ и ГЖХ МС.
Объекты и методы исследования
Для опыта было сформировано четыре группы кроликов. Одна группа получала препарат тубазид (изониазид)
внутрь, животным второй группы вводился папаверин в
178
дозе 0,5мл 2% раствора 2 раза в день, третьей группе вводили препарат но-шпу в дозе 0,3 мл 2 раза в день. Четвертая
группа была контрольной. Для исключения влияния возможных алкалоидов в кормах, они были исследованы на
наличие алкалоидов.
После окончания опыта животные были подвергнуты
эвтаназии и вскрыты. Были отобраны внутренние органы:
почки, печень, стенка желудка. Алкалоиды изолировались
подкисленной водой, с последующим извлечением действующего начала в хлороформ. После выпаривания, остаток
подвергался очистке, растворялся в 200-500мкл хлороформа, исследовался на наличие алкалоидов с реактивом Драгендорфа, методом ТСХ, методом ГЖХ МС.
Методика проведения тонкослойной хроматографии:
50-100мкл извлечения наносили на хроматографическую
пластинку стеклянным капилляром или микропипеткой в
виде пятна 5-7мм. На расстоянии 1,5-2см. наносили растворы-свидетели по 5-10мкл в концентрации 1мг\мл (ношпа, папаверин, тубазид). После высушивания пластины
ее помещали в хроматографическую камеру с системой
растворителей – ацетон:хлороформ: 25% раствор аммиака
(24:12:1). После пробега растворителей на расстояние 1012см, пластинку вынимали и просушивали на воздухе до
удаления запаха растворителей. Пластинку детектировали
проявляющим реактивом, на основе азотнокислого висмута
и отмечали образовавшиеся пятна. Вычисляли Rf пятна. Наличие алкалоидов определяли по наличию пятен оранжевого цвета на желтом фоне.
Методика проведения ГХ МС - исследования: 1 мкл извлечения вводили в инжектор газового хроматографа фирмы Agilent Techologies, модель 6890N с масс-селективным
детектором 5973 Network (вручную или с помощью автосамплера). Условия анализа: Колонка кварцевая капиллярная HP-5MS 30м, температура инжектора 280°С, начальная,
конечная температура термостата колонки 60°С и 280°С
градусов соответственно. Температура колонки изменялась
179
со скоростью 15° в минуту. Выдержка колонки при начальной температуре 1мин. Газ носитель – гелий, скорость газа-носителя 1 мл/мин. Масс-селективный детектор работал
в режиме электронного удара (70эв). Обнаружение проводили в режиме регистрации по полному ионному току
(SCAN), по времени удерживания хроматографического
пика и характерным ионам (см. табл. 4), полученные массспектры сравнивали с библиотечными (NIST 02L, TOX3.L).
Обсуждение результатов.
На наличие алкалоидов исследовали следующие органы
и ткани: головной мозг, легочная ткань, сердечная мышца,
ткань печени, стенка желудка. Результаты группового определения алкалоидов реактивом Драгендорфа представлены
в таблице 1.
Таблица 1.
Результаты определения препаратов
в органах животных групповым методом
Наименование препарата
Тубазид
Контрольная
Но-шпа папаверин
(изониазид)
группа
Головной мозг
+
Легочная ткань
+
Сердечная мышца
+
Печень
+
Стенка желудка
+
Органы и ткани
Из таблицы видно, что все исследуемые органы животных, получавшие изониазид дали положительную реакцию
с реактивом Драгендорфа. Органы животных, групп, получавших спазмолитические препараты при исследовании
указанным реактивом не показали наличие алкалоидов. Это
свидетельствует о том, что лечебные концентрации спазмолитических препаратов не могут быть обнаружены с помощью группового реактива на алкалоиды, видимо из-за
недостаточной концентрации препаратов в организме или
метаболизма.
180
Таблица 2.
Результаты обнаружения препаратов методом
тонкослойной хроматографии
Органы и ткани
Наименование препарата
Но-шпа
Папаверин
Тубазид (изониазид)
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Головной мозг
Легочная ткань
Сердечная мышца
Печень
Стенка желудка
При определении величины Rf были получены следующие результаты:
Таблица 3.
Наименование препарата
Величина Rf
Но-шпа
Папаверина гидрохлорид
Тубазид (изониазид)
0,8
0,85
0,4
Чувствительность (мкг)
в пятне
1
1
5
Таблица 4.
Результаты обнаружения препаратов методом
Хромато-масс-спектрометрии
Препарат
Характерные ионы
Время уд
Но-шпа
Папаверин
Тубазид
(изониазид)
368(100),396(91),397(64)
339(100),324(90),338(80)
19,6-19,8
19,9-20
106(100),78(99),137(58)
10,8-10,87
Предел обнаружения мг/мл
SCAN
SIM
0,05
0.001
0,05
0.001
0,1
0.01
Как видно из таблиц 2-4 методы тонкослойной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии позволили определить наличие не только изониазида, но и таких препаратов,
как но-шпа, папаверин, которые не определяются групповым реактивом.
181
Выводы:
1. Метод группового определения алкалоидов с реактивом Драгендорфа способен выявить токсические концентрации алкалоидов, в частности тубазида.
2. Лечебные концентрации лекарственных препаратов,
таких как но-шпа и папаверин метод группового определения не выявляет.
3. Наименьшая концентрация препарата но-шпа при введении парэнтерально содержится в легочной ткани и стенке
желудка.
4. Методы тонкослойной хроматографии и хроматомасс-спектрометрии позволяет выявлять наличие в органах
не только токсические концентрации лекарственных препаратов, но и лечебные, что позволяет провести их дифференциацию.