УДК 577.213/.217:575 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАЗЛИЧНЫХ

УДК 577.213/.217:575
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК
А.С. Шафорост
ГНУ «Институт радиобиологии НАН Беларуси
Введение
Жизнедеятельность современного человека происходит в условиях постоянного
воздействия факторов окружающей среды. Результатами многочисленных исследований
показано,
что
неионизирующего
поступление
тяжелых
излучения
оказывает
металлов,
воздействие
генотоксическое
ионизирующего
действие
и
(повреждение
генетического материала) на организм [1]. Существуют сведения о генотоксическом эффекте
действия шумового и светового загрязнения, а также длительного психо-эмоционального
стресса [2]. В настоящее время представляет интерес совместное действие этих факторов и
молекулярные механизмы патологических процессов, которые эти факторы инициируют.
Существует множество методов выявления повреждения ДНК – иммунофлуорисцентные,
цитогенетические, молекулярно-генетические и др. Во всем этом разнообразии сложно
выделить наиболее универсальные. Нет и единого мнения об информативности,
применимости и возможности сопоставления результатов полученных с помощью различных
методов.
Целью настоящей работы является анализ наиболее распространенных методов
выявления повреждений генетического материала.
Материалы и методы
Проведен
анализ
литературы
посвященной
сравнению
различных
методов
определения генотоксических повреждений в различных областях науки. Выделены
основные критерии оценки анализируемых методов. Проведена оценка методов выявления
генотоксического
действия
различных
факторов
и
приведена
их
сравнительная
характеристика.
Результаты и обсуждение
Одним из основополагающих в вопросе оценки любого вида воздействия является
понятие биомаркера. Биомаркер – это критерий, который отражает взаимодействие между
биологической системой и воздействующим на нее фактором. Выделяют биомаркеры
воздействия, восприимчивости, ранних и отдаленных эффектов [3]. Признаками «хорошего»
биомаркера являются чувствительность, специфичность, воспроизводимость и наличие
данных о характере распределения его значений в генеральной совокупности.
Биомаркерами являются дицентрики, транслокации, ацентрические хромосомы,
длинна теломер, модификация гистонов, метилирование ДНК, реактивные формы кислорода,
двойные и одиночные разрывы ДНК, потеря или замена оснований, γH2AX и др.
Методология настоящего исследования основана на анализе данных о наличии
биомаркеров
повреждения ДНК в
экспериментах in vitro и эпидемиологических
исследованиях.
1. Цитогенетические биомаркеры
Наиболее распространенными методами оценки повреждения ДНК, основанными на
определении наличия цитогенетических маркеров, являются ана-телофазный анализ и
микроядерный тест
1.1 Ана-телофазный анализ
Ана-телофазный анализ — генетический тест, основанный на визуальном учёте
наличия следующих цитогенетических маркеров (ацентрические фрагменты, дицентрики,
отставшие хромосомы, транслокации, комплекс хромосомных перестроек) на стадии
анафазы и телофазы митотического цикла клетки [3]. Указанные биомаркеры называют
хромосомными аберрациями. Их возникновение связано с повреждением ДНК, которые
приводят к разрыву двойной спирали. Неправильная репарация первичных повреждений
ДНК приводит к возникновению генных мутаций, хромосомных аберраций [4].
Техника проведения анализа включает анализ под микроскопом препарата клеток,
зафиксированных и окрашенных на стадии пролиферации. Существует ряд вариаций анателофазного анализа. Согласно оригинальному варианту анализа, описанному Fiskesjo (1985
г.) на препарате подсчитываются первые 100 анафазных и телофазных клеток, из которых
отмечаются аберрантные. Позднее стал применяться иной вариант И.М. Прохорова и соавт.
(2003), который учитывает все анафазы и телофазы на препарате, среди которых отмечаются
аберрантные. Пригодными для учёта хромосомных аберраций являются не очень ранние
анафазы и ранние телофазы [5].
Ана-телофазный анализ является классическим методом выявления повреждений
ДНК, который не требует знания кариотипа и идентификации хромосом. Он позволяет
выявить лишь определенные типы хромосомных аберраций, предел его чувствительности
лежит в области доз 25–50 сГр [3, 9].
1.2 Микроядерный тест
Микроядерный тест — метод определения генотоксичности (кластогенности)
факторов внешней среды. Сущность метода заключается в определении числа микроядер в
интерфазных клетках (чаще всего в клетках циркулирующей крови или костного мозга).
Микроядра представляют собой фрагменты генетического материала не вошедшие в состав
ядра в результате нарушения веретена деления [6].
Техника проведения анализа представляет собой анализ под микроскопом препарата
зафиксированных и окрашенных клеток. В подавляющем числе исследований анализируется
2000 клеток на препарат. К настоящему времени учет микроядер стал возможен в
большинстве популяций делящихся клеток.
К преимуществам микроядерного теста следует отнести быстроту выполнения
анализа, надежность полученных результатов, универсальность объектов исследования, а
также то, что тестирование можно проводить в тканях с низкой митотической активностью.
Недостатки метода заключаются в отсутствии его унификации, что обусловлено отсутствием
общепринятого представления о пределах изменчивости спонтанно возникающих микроядер
в группах людей одного возраста, и различии результатов в зависимости от применяемых
методов
фиксации,
окраски
и
методических
приемов
микроскопического
анализа
стандартного мазка крови, в полихроматофильных и нормохромных эритроцитах крови и в
ядросодержащих клетках организма (гепатоцитах, энтероцитах, сперматогониях).
По сравнению с хромосомным анализом подсчет микроядер более прост, легче
автоматизируется и по чувствительности не уступает метафазному анализу [10]. Так, по
результатам многочисленных радиобиологических исследований зависимости выхода
микроядер от полученной объектом дозы получены кривые зависимостей доза–эффект в
диапазоне доз 5–300 сГр [4]. В настоящее время ана-телофазный анализ и микроядерный тест
являются общепринятыми цитогенетическими методами оценки мутагенного действия
агентов различной природы
2. Биомаркеры комплексного повреждения оснований или повреждения ДНК
2.1 Метод ДНК-комет (Comet Assay)
В качестве биомаркера в данном методе используется учет количества одно- и
двунитевых разрывов. Метод гель-электрофореза изолированных клеток или метод «ДНКкомет» основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле
ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель.
При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий
«хвост кометы», параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК
[7].
Общая схема метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение
микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию,
окрашивание и микроскопический анализ. Использование компьютерного анализа цифровых
изображений расширяет исследовательские возможности метода за счет определения общего
содержания ДНК в комете, доли материала в голове кометы, доли материала в хвосте кометы.
Метод ДНК-комет широко используется для измерения ряда генетических повреждений и
восстановления в ответ на различные мутагены или канцерогены (ионизирующее излучение,
химические вещества, фармакологические препараты и др.).
2.2 Метод оценки окислительно индуцированных кластерных повреждений ДНК
В основе метода OCDL (Oxidative induced cluster DNA lesions), т.е. окислительно
индуцированных кластерных повреждений ДНК, лежит представление о комплексном
характере
повреждения
ДНК.
Т.е.
рассматриваются
не
отдельные
окислительные
повреждения молекулы ДНК, а их комплекс (одно-, двунитевых разрывов, повреждения
оснований и др.) образовавшийся в результате воздействия генотоксического агента. Для их
выявления
используются
ферменты-эндонуклеазы
–
OGG1
и
EndoIII
(являются
специфичными для пуриновых и пиримидиновых оснований соответственно), АРЕ1 (для
выявления повреждений не связанных с основаниями) [8]. Идентификация различных видов
повреждений
ДНК
осуществляется
за
счет
сравнения
образцов
подвергшихся
ферментативной обработке и образцов, в которые ферменты не добавлялись.
По простоте Comet Assay уступает метафазному анализу и микроядерному тесту,
однако выгодно отличается от метода определения кластерных повреждений ДНК.
Достоинства данного метода заключаются в его совместимости с другими, высокой
чувствительность, небольшом количестве материала для анализа, применимости к любым
ДНК-содержащим клеткам, большое количество вариантов метода (нейтральный, щелочной,
энзиматический, FISH-комет и др.), обуславливает широту его использования для решения
разнообразных задач в различных областях науки (медицина, экологический мониторинг и
др.) [7].
Методы ДНК-комет и OCDL по сравнению с двумя вышепроанализированными
обладают гораздо большей чувствительностью. Предел чувствительности метода ДНК-комет
лежит в области 1 мГр [12], для метода OCDL – 10-3 – 10-4 Гр, что 1-2 порядка ниже, чем у
других рассмотренных методов. Следует отметить и тот факт, что и стоимость выполнения
анализа
прямо
пропорциональна
точности
этих
методов.
Обладая
наибольшей
чувствительностью, метод OCDL находит применение в медицине в качестве высокоточного
клинического метода. Следует также отметить, что данный метод был разработан недавно и в
настоящее время активно развивается.
Заключение и выводы
1. В силу своей относительно невысокой чувствительности и дешевизны анателофазный метод и микроядерный тест наиболее применимы при проведении скрининговых
или предварительных исследований.
2. Метод определения кластерных окислительных повреждений ДНК является
наиболее чувствительным среди проанализированных методов. Метод OCDL является одним
из динамично развивающихся методов, которые применяются в клинической практике.
3. Метод ДНК-комет сочетает в себе достоинства вышеописанных методов:
относительно низкая стоимость, простота, высокая чувствительность и универсальность
применения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. P. K. M. Nagarathna; M. Johnson Wesley; P. Sriram Reddy; K. Reena Review on
Genotoxicity, its Molecular Mechanisms and Prevention International Journal of Pharmaceutical
Sciences Review & Resear;Sep/Oct2013, Vol. 22 Issue 1, p. 236
2. Fischman H.K., Pero R.W., Kelly D.D. Psychogenic stress induces chromosomal and
DNA damage. Int J Neurosci. 1996 Feb; 84 (1-4): p.219-227.
3. Pernot E., Hall J., Baatout S., Benotmane R., Blanchardon E., Bouffler S., e.a. Ionizing
radiation biomarkers for potential use in epidemiological studies. In: Mutation Research/Reviews in
Mutation Research, 751:2(2012), p. 258-286.
4.
Ковалева
О.
А.
Цитогенетические
аномалии
в
соматических
клетках
млекопитающих // Цитология и генетика. – 2008. – том 42, № 1. – С. 58-72
5. Калаев В. Н., Карпова С. С. Цитогенетический мониторинг: методы оценки
загрязнения окружающей среды и состояния генетического аппарата организма. — ВГУ,
2004. — 80 с.
6. Использование микроядерного
теста
для
оценки
эффективности лечения
аллергии у детей: метод. рекомендации / сост.: Колмакова Т.С., Белик С.Н., Моргуль Е.В.,
Севрюков А.В.. – Ростов н/Д: Изд-во РостГМУ, 2013. - 31 с.
7. Collins A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Molecular Biotechnology,
March 2004, Volume 26, Issue 3, pp 249-261
8. Georgakilas, A. G., O’Neill, P., Stewart R. D. Induction and Repair of Clustered DNA
Lesions:What Do We Know So Far?, Radiat. Res. 180, 100-109 (2013).
9. Лебедева Л. И., Скорова С. В., Ахмаметьева Е. М. Возможные механизмы
возникновения перестроек хромосом. VI. Задержка митоза как протекторный механизм
происхождения спонтанных разрывов хромосом // Генетика. – 1993. – 29, № 4. – С. 1826–
1831.
10. Горовая А. И., Климкина И. И. Использование цитогенетического тестирования
для оценки экологической ситуации и эффективности оздоровления детей и взрослых
природными адаптогенами // Цитология и генетика. – 2002. – 36, № 5. – C. 21–25.
11. Günter Obe, Vijayalaxmi. Chromosomal Alterations: Methods, Results and Importance
in Human Health 2007, XXIV, 515 p.