РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. ГЕНЕТИКА

Вестник Челябинского государственного университета. 2013. № 7 (298).
Биология. Вып. 2. С. 72–74.
РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. ГЕНЕТИКА
Г. А. Тряпицына, Е. А. Пряхин, Г. П. Димов, А. В. Аклеев
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА
ВЛИЯНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА ГЕМОПОЭЗ
Приводится методика получения и трансплантации стволовых эмбриональных клеток у мышей.
Описаны результаты эксперимента по оценке влияния введения эмбриональных стволовых клеток
на гемопоэз у мышей линии С57Bl/6 на фоне нормального физиологического состояния и на фоне постлучевого восстановления.
Ключевые слова: стволовые клетки, гемопоэз, мыши, гамма-облучение.
Введение. В практической медицине весьма эффективно применяется трансплантация костного
мозга [1]. Этот метод во многих случаях является
единственным методом лечения, позволяющим
продлить жизнь больного пациента. Стволовые
клетки взрослых организмов и стволовые клетки
спинного мозга используются для терапии различных заболеваний. Некоторые заболевания
крови и иммунной системы (в том числе генетические) могут быть вылечены неэмбриональными стволовыми клетками. Разрабатываются методы лечения с помощью стволовых клеток онкологических заболеваний, юношеского диабета, синдрома Паркинсона, слепоты и нарушений
работы спинного мозга [2]. Использование клеточных биотехнологий особенно актуально при
коррекции несостоятельности гемопоэза, которая
может приводить к развитию таких заболеваний,
как лейкопения и апластическая анемия [3].
Существенное значение для развития методов заместительной терапии имеет использование в качестве трансплантационного материала эмбриональных стволовых клеток человека, полученных из бластоцист, стволовых клеток и клеток-предшественников, выделенных
из тканей эмбрионов, плодов и взрослых людей.
Эмбриональные стволовые клетки, характеризующиеся высоким пролиферативным потенциалом, обладают способностью дифференцироваться практически в любые клетки органов и тканей человека. Эмбриональные стволовые клетки
в связи с неограниченным потенциалом самообновления имеют перспективы применения в регенеративной медицине и замещении повреждённых тканей [4].
Несмотря на то что в последнее время активно
проводятся исследования, посвящённые использованию стволовых клеток для лечения и коррек-
ции различных патологических состояний, в области методологии, эффективности и побочного
действия клеточных технологий много непрояснённых вопросов. Ответы на эти вопросы могут
быть получены в экспериментальных исследованиях.
Цель. Оценка эффективности применения эмб­
риональных стволовых гемопоэтических клеток
в коррекции радиационных цитопений.
Материалы и методы. Была разработана методика получения и трансплантации эмбриональных клеток в эксперименте. Настоящая методика описывает алгоритм получения фетальных
стволовых клеток из печени эмбрионов мышей и
способ введения их в организм животных. В качестве материала для получения эмбриональных
стволовых клеток (СК) используется печень эмб­
рионов мышей линии C57Bl/6. Достаточным количеством для репопуляции кроветворения у мышей при высокой степени угнетения стволовых
кроветворных клеток (в модели острой лучевой
болезни при облучении в дозе ЛД50/30) является
введение 0,5 · 106 клеток печени 17-дневных эмб­
рионов, что приводит к формированию в селезёнке 10–20 экзоколоний. Для оценки влияния
инфузии эмбриональных стволовых клеток на
гемо­поэз реципиенту вводят внутривенно 0,5 · 106
ядросодержащих клеток печени 17-дневного эмб­
риона в объёме 0,1 см3 клеточной суспензии на
основе среды 199.
С использованием этой методики выполнены
эксперименты по оценке влияния введения эмб­
риональных стволовых клеток на гемопоэз у мышей линии С57BL/6 при введении их на фоне нормального физиологического состояния и на фоне
постлучевого восстановления. Были сформированы 4 экспериментальные группы: 1-я — биологический контроль (группа «БК»); 2-я — интактные
Экспериментальная оценка влияния эмбриональных стволовых клеток на гемопоэз
животные, которым введены стволовые клетки
печени эмбрионов (группа «БК+СК»); 3-я — гамма-облучённые животные в суммарной дозе 10
Гр: 5 фракций с мощностью дозы 0,7 Гр/мин по
2 Гр с интервалом 7 сут (группа «облучённые»);
4-я — гамма-облучённые животные, которым
ввели эмб­риональные стволовые клетки (группа «облучённые + СК»). Первое исследование гемопоэза проводили перед облучением, затем на
следующие сутки после завершающей фракции
облучения и в сроки через 1, 2 (перед введением
животным 2-й и 4-й групп СК), 3, 5 и 8 месяцев
после завершения облучения (последние три обследования соответствуют 1, 2 и 6 месяцам после
введения СК).
Фракционированное облучение мышей в суммарной дозе 10 Гр привело к снижению общего количества ядерных клеток в костном мозге,
в большей степени обусловленное гибелью клеток гранулоцитарного ростка, чем эритроидного; перераспределению кроветворения вначале
в сторону гранулоцитарного ростка, а затем эритроидного. Несмотря на то что через 2 мес после
завершения облучения (на момент введения СК)
численность ЯСК в костном мозге мышей восстановилась, показатели соотношения различных
ростков кроветворения, соотношения делящихся
и созревающих клеток отличалось от показателей
биологического контроля.
Результаты и обсуждение. Наши исследования показали, что однократное введение эмбриональных СК как на фоне нормального физиологического состояния, так и в условиях постлучевого восстановления повышает количество пролиферирующих КОЕс в костном мозге у мышей.
Эффективное биологическое действие фетальных
СК при введении их облучённым животным можно объяснить тем, что в этом случае при несостоятельности гемопоэзиндуцирующего микроокружения и собственных СК донорские неповреждённые СК в раннем периоде берут на себя роль
воспроизводства клеток крови, а через определённый промежуток времени происходит восстановление популяции собственных СК, и в более
отдалённые периоды обеспеченность организма
функциональными клетками может происходить
за счёт собственных СК.
Введение эмбриональных СК облучённым животным способствовало более быстрому восстановлению состояния костномозгового кроветворения. В этом случае по сравнению с группой
гамма-облучённых животных наблюдалось более
73
гармоничное восстановление состояния костномозгового кроветворения до показателей физиологической нормы. Введение эмбриональных СК
интактным животным приводит к стимуляции
гемопоэза во всех ростках, но менее выраженному, чем у облучённых животных.
Фракционированное облучение животных
в суммарной дозе 10 Гр приводит к снижению
количества лейкоцитов в периферической крови, обусловленное в большей степени гибелью
лимфоцитов. Введение облучённым животным
эмб­риональных СК в целом ускоряет восстановление численности лейкоцитов в периферической крови в большей степени за счёт стимуляции лимфопоэза; при этом динамика изменения
нейт­рофилов в периферической крови у животных мало отличается от динамики в группе облучённых животных. Введение интактным мышам эмбриональных СК приводит к снижению
абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови.
Лимфоциты, в отличие от других клеток крови, могут формироваться как в костном мозге
(В-лимфоциты), так и в тканях иммунной системы: вилочковой железе (тимусе) (Т-лимфоциты),
селезёнке, лимфатических узлах, других лимфоидных органах. В связи с изложенным была выполнена оценка состояния лимфоидных органов
(тимуса и селёзенки). Реакция на введение СК
была более выражена в тимусе, чем в селезёнке.
Введение СК облучённым мышам в целом способствует восстановлению общего количества
ядерных клеток в лимфоидных органах. У интактных животных реакция на введение СК регистрируется в течение 1–2 мес после введения, затем численность тимоцитов и спленоцитов в органах устанавливается на уровне биологического
контроля.
Выводы и заключение. Полученные результаты позволяют заключить, что эмбриональные
стволовые клетки могут быть использованы как
в коррекции радиационно-индуцированных нарушений кроветворения, так и при цитопениях
другой этиологии, поскольку в этом случае нормализуется состояние пула стволовых клеток и
эта нормализация носит длительный характер.
То есть можно ожидать, что однократное введение эмбриональных стволовых клеток лицам с
цитопенией приведёт к тому, что кроветворение
в целом и состояние периферической крови в отдалённые периоды после воздействия будут в той
или иной степени скорректированы.
74
Г. А. Тряпицына, Е. А. Пряхин, Г. П. Димов, А. В. Аклеев
Список литературы
1. Трапезников, Н. Н. Трансплантация костного
мозга в онкологии / Н. Н. Трапезников, К. Л. Чимишкян, В. В. Птушкин // Трансплантология и искусст. органы. 1994. № 1. С. 45–49.
2. Кокорев, О. В. Теоретические и практические аспекты трансплантации стволовых клеток
в онкологии / О. В. Кокорев, Н. В. Чердынцева,
К. В. Зайцев, С. В. Волгушев // Сиб. онколог. журн.
2005. № 4. С. 53–61.
3. Смирнов, А. Н. Болезни крови. М., 2008.
464 с.
4. Bradley, A. Formation ofgerm-line chimeras
from embryo-derived teratocarcinoma cell lines /
A. Bradley, M. Evans, M. H. Kaufman, E. Robertson
// Nature. 1984. Vol. 309. Р. 255.