На правах рукописи Кривошапко Ольга Николаевна
реклама
На правах рукописи Кривошапко Ольга Николаевна Экспериментальные исследования биологической активности различных соединений из морских гидробионтов 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2012 -2- Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Попов Александр Михайлович Официальные оппоненты: Ковалев Николай Николаевич доктор биологических наук, Дальневосточный федеральный университет, профессор кафедры микробиологии, биохимии и биотехнологии Школы естественных наук Новгородцева Татьяна Павловна доктор биологических наук, профессор, Владивостокский филиал ФГБУ "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" СО РАМН - НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук, г. Москва Защита состоится «26» декабря 2012 г. в «1200» часов на заседании диссертационного Совета Д.005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (Владивосток-22, пр. 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан «___»_______ 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О.В. -3- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из актуальных задач современной биохимии в области биомедицинских исследований является поиск и изучение новых эффективных препаратов, используемых при лечении различных патологий человека. Известно, что около половины всех имеющихся на настоящий момент лекарственных средств разработаны на основе соединений, выделенных из наземных источников. Однако в недрах мирового океана имеется огромное количество биоресурсов, содержащих биологически активные вещества (БАВ). Тенденции современного мирового макроэкономического развития требуют проведения комплексной переработки биоресурсов моря. Разработка и получение новых полезных продуктов из морских гидробионтов (МГ) может стать одним из основных направлений развития научнотехнического прогресса в области медицины и биологии в третьем тысячелетии. В связи с вышесказанным, поиск и исследование медико-биологических свойств различных БАВ, выделенных из МГ, а также установление их механизмов действия является чрезвычайно актуальной задачей. На данном этапе можно выделить три наиболее важные направления исследований природных соединений и их аналогов: 1) поиск и изучение спектра биологической активности индивидуальных низкомолекулярных БАВ; 2) изучение механизма фармакологического действия с использованием экспериментальных моделей патологий, в том числе на клеточном и молекулярном уровне и 3) разработка новых лекарственных средств и биологически активных добавок (БАД) на основе природных веществ, выделенных из МГ. Эти направления исследований и явились предметом нашей работы. Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы состояла в изучении спектра медико-биологической активности и некоторых аспектов механизма действия БАВ, выделенных из МГ c использованием различных экспериментальных моделей как in vivo, так и in vitro. В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи: 1. Выделить комплексы фосфо- и гликолипидов из морских макрофитов Sargassum pallidum, Ulva fenestrata, Zostera marina и определить их жирно-кислотный состав; 2. Поставить экспериментальные модели патологий человека, а именно: аллоксановый диабет, гиперлипидемия, стресс-индуцированная кардиопаталогия, токсический гепатит, аллергический дерматит, каррагинановая модель воспаления и моделирование термических ран; 3. Определить уровень биологической активности in vivo указанных выше комплексов полярных липидов (ПЛ) и природных антиоксидантов эхинохрома А (ЭХА) плоского морского ежа Scaphechinus mirabilis, полифенольного комплекса (ПФК) морской травы Zostera marinа и его основных компонентов розмариновой кислоты (РК), лютеолина (ЛТ) и 7,3′-дисульфата лютеолина (ДСЛ), смеси каротиноидов (СК) (астаксантин – 46%, лютеин – 23%, зеаксантин – 23%) морской звезды Patiria pectinifera, пептидов коллагена (ПК) иглокожих (морской звезды P. pectinifera (ПКЗ), кукумарии Cucucmaria japonicа (ПКК), дальневосточной голотурии (трепанг) Apostichopus japonicus (ПКТ), плоского морского ежа S. mirabilis (ПКЕп) и игольчатого морского ежа Strongylocintrotus nudus (ПКЕи)) при экспериментальном моделировании различных патологических процессов в организме; 4. Произвести анализ полученных результатов и вероятных механизмов действия исследованных БАВ с использованием современных литературных данных. -4- Основные положения, выносимые на защиту: 1. ПЛ морских макрофитов S. pallidum, U. fenestrata, Z. marina, ПФК морской травы Z. marina и его индивидуальные компоненты РК, ЛТ и ДСЛ, а также ЭХА морского ежа S. mirabilis – корректоры нарушений липидного и углеводного обменов, вызванных развитием патологических процессов. 2. ДСЛ и ЛТ – потенциальные терапевтические агенты, проявляющие противодиабетическую, противогиперлипидемическую, гепатопротекторную, противоопухолевую, противовоспалительную и ранозаживляющую активность. 3. РК, ЛТ, ДСЛ, СК – потенциальные противоаллергические и гепатозащитные средства. 4. Пептиды коллагена иглокожих (ПКИ) – обладают полифункциональными биологическими свойствами, а именно: выраженным противоопухолевым, противодиабетическим, антиоксидантным и антикоагулянтным эффектом, высокой ранозаживляющей активностью, а также ингибирующей активностью в отношении ангиотензин-I-превращающего фермента (АПФ). Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые изучен спектр биологической активности ПЛ, ПФК, индивидуальных низкомолекулярных вторичных метаболитов (ЭХА, РК, ЛТ, ДСЛ), ПК и каротиноидов на экспериментальных моделях ряда болезней человека (сахарный диабет, сердечнососудистые, онкологические и аллергические заболевания, атеросклероз, токсический гепатит, воспаление и раневые процессы). Впервые определены оптимальные соотношения ПЛ, содержащих ω-3 и ω-6 жирные кислоты, и различных биоантиоксидантов (ЭХА, РК, ЛТ и ДСЛ), пероральное применение которых позволяет уменьшить признаки воспалительных процессов в организме и эффективно нейтрализовать токсичные активные формы кислорода (АФК), что является важной основой для наиболее рационального использования указанных выше соединений в будущем в качестве лечебно-профилактических средств. Впервые проведены сравнительные исследования биологических свойств ДСЛ морской травы Z. marina в сравнении с ЛТ. Показано, что ДСЛ во многих случаях имеет более высокую биологическую активность, чем ЛТ. Впервые сформулирована концепция, что ДСЛ – природная водорастворимая форма ЛТ абсорбируется и усваивается, проникая в плазму крови животных и человека через кишечник и минуя стадии модификации клетками кишечника и печени. ДСЛ обладает меньшим токсическим потенциалом, чем ЛТ, что повышает эффективность его физиологического действия. Впервые обнаружено, что ранозаживляющая активность 1%-ного мазевого препарата каротиноидов морской звезды P. pectinifera на модели аллергического контактного дерматита существенно превосходит коммерческий препарат «Синафлан». Проведенные впервые исследования биологических свойств ПК морской звезды P. pectinifera позволили установить, что они проявляют высокую противоопухолевую и противовоспалительную активность, а также обладают выраженным ингибирующим действием в отношении АПФ. Апробация работы. Результаты работы были представлены на 5-ом Международном научно-практическом конгрессе «Человек в экстремальных условиях: здоровье, надежность и реабилитация» (Владивосток, 2006), на II-ой региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2006), на 1st Far-Easten International Symposium on Life Sciences (Vladivostok, 2008), на II-ой и III-ей международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в -5- физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011, 2012), на конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2010), на международной научнопрактической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, Крым, Украина, 2009, 2011). Публикации. Всего опубликовано 36 работ: 27 – научных статей, 3 - патента, 6 тезисов докладов. Из них по теме диссертации 24 публикаций, в том числе 17 статей, из них опубликованных в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК – 15, тезисов и статей в материалах научных конференций – 8 и получен 1 патент. Работа выполнена в группе изучения биологически активных добавок ТИБОХ ДВО РАН. Личный вклад соискателя заключается в непосредственном участии в выполнении всех экспериментов и в постановке новых методик исследований, а также в статистической обработке результатов экспериментов. Анализ результатов, их теоретическое обоснование, разработка концептуальных представлений о медикобиологической активности и вероятных механизмах действия осуществлены автором совместно с сотрудниками группы изучения БАД ТИБОХ ДВО РАН. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 27 рисунков и 20 таблиц; диссертационный материал изложен на 153 странице. Список литературы включает 199 источника. Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.б.н. Попову А.М. за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы, за постоянное внимание к работе, ценные замечания и полезные советы на всех этапах исследования, к.х.н. Артюкову А.А. за любезное предоставление образцов веществ, используемых в работе, а также коллегам из лабораторий других институтов. Используемые сокращения. АБАП-ЛМ - гомогенная система, представляющая собой раствор азосоединения 2,2’-азобис(2-метилпропионамидин)дигидрохлорида и люминола, АОА – антиоксидантная активность, АПТВ –активированного парциального тромбопластинового времени, АПФ – ангиотензин-I-превращающий фермент, АлАт – аланинаминотрансфераза, АсАт – аспартатаминотрансфераза, АФК – активные формы кислорода, БАВ – биологически активные вещества, БАД – биологически активные добавки, ГТТ – глюкозо-толерантный тест, ДГК – дегидрокверцитин, ДСЛ - 7,3′дисульфата лютеолина, ИЛ-4 – интерлейкин-4, МДА – малоновый диальдегид, мф – макрофаги; ПВ – протромбинофое время, ПК – полипептидный комплекс; ПКЕи – ПК игольчатого морского ежа Strongylocintrotus nudus, ПКЕп – ПК плоского морского ежа Scaphechinus mirabilis, ПКЗ – ПК морской звезды Patiria pectinifera, ПКИ – полипептидный комплекс иглокожих, ПКК – ПК кукумарии Cucucmaria japonicа, ПКТ – ПК дальневосточной голотурии (трепанг) Apostichopus japonicus, ЛТ – лютеолин, МГ – морские гидробионты, ПЛ – комплекс полярных липидов, ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты, ПОЛ – перекисное окисление липидов, ПФК – полифенольный комплекс, РК – розмариновая кислота, РС – рецепторы скевенджеры; СК – смесь каратиноидов, СОД – супероксиддисмутаза, ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания, ТГ – триглицериды, ТРО – торможение роста опухоли, УПЖ – уровень продолжительности жизни, ХС – холестерин, ХС-ЛПНП – холестерин липопротеидов низкой плотности, ЦФ – циклофосфан, ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота, -6- ЭХА – эхинохром А, Hb-Н2О2-ЛМ – гомогенная система, состоящая из гемоглобина, пероксида водорода и люминола, S.p – бурая водоросль Sargassum pallidum, U.f. зеленая водоросль Ulva fenestrate, Z.m. – морская трава Zostera marina. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования 1.1 Экспериментальные животные. Изучение биологической активности БАВ проводили на мышах линий СВА, СД-1 и ВАLB/c, а также крысах линии Вистар. Эксперименты выполнены на животных, которые были получены из питомника лабораторных животных «Пущино» и разведены в виварии ТИБОХ ДВО РАН (сертификат имеется). Животных содержали в соответствии с международными правилами, утвержденными приказом № 267 МЗСР РФ от 19.06.2003 г, а также "Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (2005). 1.2 Объекты исследования. Все исследуемые образцы природных веществ, за исключением смесей фосфо- и гликолипидов, были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории биотехнологии. Структурные формулы идентифицированных соединений приведены на рис. 1. O SO O H 3 OH O 3S O O H O OH HO O O O H O A Б OH OH OH HO O HO OH Et OH O O HO OH COOH В O Г O OH HO O Д OH HO Е Рис. 1. Структурные формулы 7,3'-дисульфата лютеолина (А), лютеолина (Б), розмариновой кислоты, (В), эхинихрома А (Г), астаксантина (Д) и зеаксантина (Е). 1.3 Методы исследования. Смесь фосфо- и гликолипидов получали из морских макрофитов по методу Фольча (Folch et al., 1957). Для грубого разделения липидов использовали метод колоночной хроматографии. Состав жирных кислот анализировали методом газожидкостной хроматографии в виде метиловых эфиров (Sanina et al., 2004). Для приготовления наружных препаратов на основе РК, ЛТ, ДСЛ и смеси каротиноидов использовали ланолин и вазелин в соотношении 1:3, веществ которые доводили до жидкого состояния на водяной бане при 37°С, и затем при тщательном -7- перемешивании добавляли водные растворы из расчета 1 г исследуемого вещества на 100 г мазевой основы. В случае ПК в качестве основы использовали детский крем и добавляли вещества из расчета 10 мг на 1 г кремовой основы (1%-ный препарат) и 50 мг вещества на 1 г кремовой основы (5%-ный препарат). При тестировании противоопухолевой активности веществ использовали асцитный и/или солидный вариант опухоли Эрлиха, перевиваемой беспатогенной линии мышей СD-1, весом 21±2 г. Лечение животных с солидной опухолью начинали через сутки после трансплантации 5×106 кл./мл в объеме 0,2 мл. Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухоли (ТРО, %) относительно контроля. Лечение животных с асцитной опухолью начинали через сутки после трансплантации 3×106 кл./мл в объеме 0,2 мл. Противоопухолевый эффект оценивали по увеличению продолжительности жизни (УПЖ, %) относительно с контролем. В качестве положительного контроля использовали известный противоопухолевый препарат «Циклофосфан» (ЦФ) (Биохимия, Россия). Моделирование диабета проводили на мышах-самцах линии СВА массой 20-22 г с использованием аллоксана в дозе 200 мг/кг. После окончания эксперимента проводили заборы крови и определяли основные показатели изменений липидного и углеводного обмена. Моделирование стресс-индуцированной кардиопатологии проводили на крысахсамцах линии Вистар массой тела 200-220 г с использованием плавательной нагрузки в условиях нарушения гемодинамики, вызванной введением 1%-ного раствора мезатона в объеме 0,1 мл подкожно однократно, в течение 3-х дней при температуре воды 20±2°С. Препараты вводили перорально непосредственно после завершения плавательной нагрузки, в течение 7 последующих дней. Животных подвергали эвтаназии через 15 дней от даты начала эксперимента и проводили необходимые биохимические и гистологические исследования. При моделировании гиперлипидемии использовали препарат «Tyloxapol» в дозе 200 мг/кг. После окончания эксперимента определяли основные показатели липидного обмена, уровень общего билирубина, аминотрансфераз. Выраженность свободнорадикальных процессов в плазме крови определяли по содержанию в ней ТБКреактивных продуктов. Исследование гепатопротекторных свойств веществ проводили на модели токсического гепатита, индуцированного тетрахлорметаном. После окончания эксперимента животных подвергали эвтаназии и определяли уровень общего билирубина, аминотрансфераз в плазме крови животных, а также ТБК-реактивных продуктов. Неспецифические локальные воспаления индуцировали введением 1 мг дельтакаррагинана тип IV (Sigma, США) в физрастворе (100 мкл) в подушечку задней лапы мышам линии CВА массой 19-22 г. Моделирование термических ран проводили согласно (Билич, Колла, 1978). Стекла с нанесенными контурами ран оцифровывали с помощью сканера в графический файл формата «BMP». Площади ран определяли с помощью программы Adobe Photoshop CS (version 8.0). Экспериментальный дерматит воспроизводили согласно (Watanabe et al., 2002). В качестве облигатного аллергена использовался 2,4-динитрофторбензол. Антиоксидантные свойств исследуемых веществ in vitro изучали с помощью двух хемилюминесцентных модельных гомогенных систем окисления, состоящих из гемоглобина, пероксида водорода и люминола (Нb-Н2О2-ЛМ) и из 2,2’-азобис(2метилпропионамидин)дигидрохлорида и люминола (АБАП-ЛМ) (Хасанов и др., 2004). -8- Перекисное окисление линолиевой кислоты оценивали ферри-тиоцианатным методом (Kikuzaki, Nikatani, 1993). Бислойные липидные мембраны (БЛМ) формировали согласно Mueller et al., 1962. Действие препаратов на систему коагуляционного гемостаза оценивали in vitro по времени свертывания цельной нестабилизированной крови, в тестах определения протромбинового времени (ПВ) и активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ) в соответствии с рекомендацией фирмы изготовителя (ТехнологияСтандарт, Россия). Оценку ингибирующей активности в отношении ангиотензин-1превращающего фермента проводили согласно Cushman and Cheung, 1971. Статистическую и графическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием статистического пакета Microsoft Excel. Полученные значения выражали в виде среднее ± стандартное отклонение. Достоверность различий определяли с помощью параметрического критерия t-Стьюдента. За достоверные принимали различия при р<0,05. 2 Результаты исследования и их обсуждение В настоящее время установлено, что сахарный диабет, атеросклероз, метаболический синдром, токсический гепатит, аллергические и онкологические заболевания являются в значительной мере болезнями воспаления. Этиологию и патогенез этих заболеваний трактуют с точки зрения суммарного воздействия многочисленных факторов и, прежде всего, окислительного стресса, что приводит к дезадаптации, активации свободно-радикального окисления липидов и другим патологическим нарушениям метаболических процессов в организме. Очевидно поэтому, антиоксиданты приобрели большое значение при лечении заболеваний, вызванных с оксидативным стрессом. Они способны ингибировать перекисное окисление липидов (ПОЛ) мембран, стабилизировать структуру и функции мембран клеток и, тем самым, создавать оптимальные условия для гомеостаза клеток и тканей при самых разнообразных чрезвычайных воздействиях патогенных факторов на организм. 2.1 Антиоксидантная активность (АОА) исследованных полифенольных и хиноидных соединений in vitro. Определение АОА исследуемых веществ в модельных системах Hb-H2O2-ЛМ и ААРН-люминол показало, что РК является самым эффективным антиоксидантом превосходит в несколько раз действие эталонного антиоксиданта тролокса и проявляет более высокую АОА, чем известный антиоксидант дигидрокверцитин (ДГК). Как видно из данных, приведенных в табл. 1, исследуемые вещества по эффективности антиоксидантного действия можно расположить в следующем порядке: РК>ДГК>ЭХА>ЛТ>тролокс>АК в системе Hb-H2O2-ЛМ и РК>ДГК>ЛТ>ЭХА>тролокс в системе ААРН-люминол. Таблица 1. АОА исследуемых веществ в модельных системах Hb-H2O2-ЛМ и ААРН-ЛМ. Вещество Тролокс РК ЛТ ЭХА ДГК АК Модельная система Hb-H2O2-ЛМ KX (мкМ-1) АОА (усл. ед.) 3,2 (KT) 1,00 10,88 3,4 3,54 1,11 5,28 1,65 10,4 3,25 1,84 0,58 Модельная система AAPН-ЛМ KX (мкМ-1) АОА (усл. ед.) 1,76 (KT) 1,00 11,55 6,56 3,54 2,01 2,3 1,31 5,3 3,01 - -9- На рис. 2 приведены данные сравнительного изучения протекторной активности исследуемых веществ на перекисное окисление линолевой кислоты. Следует отметить, что РК и в этой тест-системе проявляет себя как самый эффективный антиоксидант, а ДСЛ и ЛТ не уступают по эффективности защитного действия ДГК. При сравнении с тролоксом исследуемые вещества по эффективности предотвращения окисления линолевой кислоты можно расположить в убывающий ряд: РК>ДГК>ДСЛ>ЛТ>тролокс. 100 1 мкМ 5 мкМ 10 мкМ 80 60 40 20 0 Тролокс ДГК ЛТ ДСЛ РК Рис. 2. Сравнительное изучение защитной активности исследуемых веществ при перекисном окислении линолевой кислоты. Концентрация исследуемых веществ (мкМ). По оси абсцисс – исследуемые вещества. По оси ординат – ингибирование перикисного окисления линолевой кислоты, выраженное в контролю. Среднее значение оптической плотности раствора в контроле составляло 0,242±0,016. При исследовании мембраннотропной активности было показано, что РК в широком диапазоне концентраций (от 0,5 до 10 мкг/мл) не оказывает достоверного влияния на проводимость плоских БЛМ. 2.2 Изучение протективной активности полярных липидов и биоантиоксидантов из МГ при моделировании патологий человека. Известно, что препараты морского генеза на основе ПЛ проявляют противовоспалительное, противодиабетическое, гиполиподемическое действие и рекомендуются для комплексной профилактики и вспомогательного лечения широкого круга заболеваний. Однако, лечебная роль ПЛ морских макрофитов, содержащих ω-3 и ω-6 полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), изучена недостаточно, и информация по этому вопросу весьма противоречива. Существует тесная взаимосвязь между содержанием эйкозаноидов - продуктов трансформации ПНЖК в тканях, и воспалением. Эйкозаноиды - производные арахидоновой кислоты, являются медиаторами и регуляторами воспаления. Другие ПНЖК как группы ω-3, так и ω-6 также образуют эти гормоноподобные субстанции. При этом существенным достоинством эйкозаноидов, образуемых из ω-3 ПНЖК, является то, что они часто проявляют ингибирующее действие при развитии воспалительной реакции. Поскольку продукты биотрансформации ω-3 жирных кислот подавляют выработку провоспалительных эйкозаноидов из ω-6 жирных кислот, их относят к противовоспалительным агентам (Calder, 2012). Мы выделили суммарные фракции полярных липидов из трех видов морских макрофитов: бурой водоросли S. pallidum (S.p), зеленой водоросли U. fenestrate (U.f.) и морской травы Z. marina (Z.m.) и определили особенности их жирно-кислотного состава. Как следует из результатов приведенных в табл. 2, соотношение ω-3/ω-6 ПНЖК в исследуемых препаратах суммарной фракции фосфо- и гликолипидов морских макрофитов представлено в следующих соотношениях: S.p – 1:1; U.f. – 3:1 и Z.m – 4:1. Дальнейшие биохимические исследования указывают на важную роль приведенных соотношений для корригирующей активности исследуемых смесей ПЛ. -10- Таблица 2. Состав жирных кислот суммарной фракции фосфо- и гликолипидов морских макрофитов, обладающих провоспалительными (n-6 ПНЖК) и противовоспалительными (n-3 ПНЖК) свойствами (% от суммы ЖК) ПНЖК n-3 Морские макрофиты S. pallidum U. fenestrata Z. marina αлиноленовая (18:3n-3) 11,46 19,42 44,82 ЭПК (20:5n-3) ДГК (22:6n3) Линолевая (18:2n-6) 3,92 1,78 1,62 2,48 2,82 0,96 5,69 5,73 9,41 ПНЖК n-6 γлиноленовая (18:3n-6) 0,95 1,13 0,19 АК (20:4n-6) 7,00 1,62 0,54 Примечание: ЭПК – эйкозопентаеновая кислота, ДГК – докозогексаеновая кислота, АК – арахидоновая кислота. 2.2.1 Аллоксановый диабет. Индукция экспериментального диабета аллоксаном в группе с отрицательным контролем вызывала увеличение уровня глюкозы в крови животных на 3,4 ммоль/л по сравнению с интактной группой животных. Наиболее эффективными агентами, обладающими нормализующим действием на уровень глюкозы, показали: ПФК, который снижал уровень глюкозы по сравнению с отрицательным контролем на 7,5 ммоль/л, и ЭХА – на 5,7 ммоль/л. Комбинированное применение липидного комплекса из U.f. и ЭХА снижало патологический уровень глюкозы на 4,5 ммоль/л. Комплекс ПЛ из Z.m. в сочетании с ЭХА, а также комплекс ПЛ из U.f. нормализовали содержание глюкозы в плазме крови опытных групп животных до уровня интактного контроля. Применение ПЛ из Z.m., а также использование его в сочетании с ПФК не оказывало существенного влияния на уровень глюкозы в плазме крови. Содержание малонового диальдегида (МДА) в группе отрицательного контроля возрастало в 16 раз по сравнению с группой интактных животных, что свидетельствовало об усилении образования свободных радикалов. В опытных группах наиболее эффективными корректорами уровня МДА были ПФК, ПЛ из Z.m. в сочетании с ПФК и ПЛ из U.f. в сочетании с ЭХА. Эти препараты нормализовали уровень МДА в плазме крови экспериментальных групп до показателей интактных животных. Менее выраженным нормализующим действием обладали ПЛ из Z.m. и ЭХА, которые снижали уровень МДА на 3,9 ммоль/л и 4,17 ммоль/л соответственно по сравнению с отрицательным контролем. Следует отметить, что применение ПЛ из Z.m. в сочетании с ЭХА приводило к снижению МДА только на 2,6 ммоль/л, а ПЛ из U.f. вообще не оказывало существенного влияние на уровень МДА в плазме крови. Полученные данные при исследовании активности аминотрансфераз в крови экспериментальных животных свидетельствовали о том, что наиболее эффективно нормализовали активность ферментов ЭХА и ПЛ из Z.m. в сочетании с ЭХА, которые снижали активность аланинаминотрансферазы (АлАт) на 0,8 ммоль/л×ч и 0,4 ммоль/л×ч соответственно, а аспартатаминотрансферазы (АсАт) - на 0,6 ммоль/л×ч и 1,1 ммоль/л×ч по сравнению с отрицательным контролем. Нормализации активности фермента также способствовали ПЛ из U.f. в сочетании с ЭХА: снижение уровня активности АлАт на 0,4 ммоль/л×ч. В опытной группе, проходившей лечебно-профилактический курс ПЛ из Z.m. в сочетании с ЭХА, уровень триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови снижался на 2,16 ммоль/л, а в группе ПФК - на 1,2 ммоль/л. В остальных опытных группах животных, которых использовали ПЛ из Z.m. в сочетании с ПФК, ПЛ из Z.m., U.f. в сочетании с ЭХА и в группе с ЭХА, не наблюдалось значимого влияния указанных выше препаратов на уровень ТГ в плазме крови по сравнению с отрицательным контролем. -11- Таким образом, наибольший противодиабетический эффект проявляли природные биоантиоксиданты ЭХА, ПФК, а также комплекс полярных липидов из U. fenestrane в сочетании с ЭХА. 2.2.2 Гиперлипидемия. Содержание ТГ в сыворотке крови мышей группы отрицательного контроля увеличивалось в несколько раз, достигая 4,2 ммоль/л, по сравнению с группой интактных мышей (0,03 ммоль/л). В группах, проходивших лечение ЭХА, U.f., U.f. в сочетании с ЭХА и S.p. в сочетании с ПФК наблюдалось значительное уменьшение уровня ТГ: на 4,1 ммоль/л, 4,0 ммоль/л, 4,1 ммоль/л и 3,9 ммоль/л соответственно по сравнению с отрицательным контролем. При моделировании гиперлипидемии уровень МДА в группе отрицательного контроля увеличивался в 19 раз по отношению к группе интактных животных. Лечебное применение ЭХА и природного комплекса ПЛ из U.f. вызывало значимый терапевтический эффект и сопровождалось снижением содержания продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови на 10,2 мкмоль/л и 11,6 мкмоль/л соответственно. В группах животных с профилактическим применением U.f. в сочетании с ЭХА, S.p. и S.p. в сочетании с ПФК наблюдалось также отчетливая тенденция к нормализации уровня МДА. Наибольшим корригирующим действием на активность аминотрансфераз обладал препарат ЭХА, который снижал активность АсАт в 5 раз по отношению к отрицательному контролю. Отчетливая тенденция к нормализации активности АсАт в плазме крови животных, получавших препарат ЭХА в профилактических целях, свидетельствовала о его кардиопротекторном действии. Положительный эффект также наблюдался при применении ПЛ из U.f. и ПЛ из S.p. в сочетании с ЭХА, которые уменьшали активность АсАт примерно в 3 раза. Падение уровней активности АлАт по сравнению с отрицательным контролем давали и остальные препараты: ПФК. Таким образом, наибольший противогиперлипидемический эффект оказывал комплекс ПЛ из U. fenestrane, а также вторичные метаболиты ЭХА и ПФК. Менее эффективным корректором показал себя комплекс ПЛ из S. pallidum как отдельно, так и в сочетании с ПФК 2.3 Сравнительное изучение лечебного действия ЛТ, РК и ЭХА при моделировании стресс-индуцированной кардиопатологии. Модель индукции кардиопатологии, использованная нами в эксперименте, может быть охарактеризована как модель экстремального стресса. По интегральному показателю действия – выживаемости животных в условиях стресса – эффективными протекторными препаратами оказались ЛТ и ЭХА (100% выживаемость), а РК не проявляла протекторной активности по сравнению с контрольной группой (группа «Стресс») (выживаемость в этих группах составила 60%). При изучении биохимических параметров, характеризующих липидный метаболизм у выживших животных, не было отмечено заметных изменений, которые бы выявили четкие тенденции. Учитывая важную роль гормональных механизмов регуляции реакций организма в ответ на действие стресса, представляла оценка в сыворотке крови уровня половых гормонов экспериментальных животных. Результаты изучения гормонального статуса, представленные в табл. 3. Установлено, что во всех экспериментальных группах результатом действия тяжелого длительного стресса является снижение уровня тестостерона в сыворотке крови животных и расчетного показателя, характеризующего отношение уровня тестостерона к уровню эстрадиола. Особенно заметное снижение относительного содержания тестостерона происходит в крови животных, получавших препараты РК и ЛТ. Возможно, это связано с активностью данных препаратов как селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов (Huang et al., 2010). -12- Таблица 3. Показатели половых гормонов в сыворотке крови через 15 дней после индукции сердечной недостаточности. Группы животных Интактные Стресс Стресс+РК Стресс+ЛТ Стресс+ЭХА Эстрадиол, нмоль/л 0,050±0,006 0,044±0,005 0,0635±0,007 0,08±0,01 0,0398±0,006 Тестостерон, нмоль/л 11,9±2,9 8,1±2,4 8,3±3,2 6,4±1,5 7,7±2,5 Отношение тестостерон/эстрадиол 238,4 186,2 130,6 80,0 193,4 Известно, что эстрогены проявляют сильный антиоксидантный эффект in vivo. Эстрадиол индуцирует синтез глутатионпероксидазы-1 и супероксиддисмутазы. Этот процесс требует участия эстрогенового рецептора и активации путей, которые обычно включаются в ответ на окислительный стресс (развивается в тесте принудительного плавания). Увеличение уровня указанных выше ферментов может предотвратить нарушения, вызываемые окислительным стрессом (Vina et al., 2006). Обычные последствия действия длительного стресса на организм – это развитие лейкопении, изменение лейкоформулы и транзиторная иммуносупрессия. Из установленных в нашем эксперименте изменений гемограммы при стрессе особенно значимой является тенденция к развитию лейкопении и нейтропении – изменения, характеризующие снижение общей резистентности организма (табл. 4). Таблица 4. Показатели гемограммы у крыс-самцов линии Вистар, через 15 дней после индукции сердечной недостаточности Группы животных Контроль Стресс РК ЛТ ЭХА Лейкоциты, ×109/л 7,8±1,2 6,4±1,6 6,6±0,9 8,6±1,1 7,3±1,3 Нейтрофилы, (в %) 26,4±2,3 21,2±1,8 22,4±1,7 28,1±2,8 27,8±2,1 Лилфоциты, (в %) 57,4±3,1 56,0±4,5 58,6±3,4 48,9±4,9 48,8±3,4 Mакрофаги, (в %) 6,5±1,2 9,1±1,6 9,2±1,4 10,2±1,4 7,7±0,7 В группах животных, получавших препараты ЛТ и ЭХА, наблюдается коррекция этих параметров крови до показателей интактного контроля. РК такого корригирующего эффекта не обеспечивала. Моноцитоз, обнаруженный у крыс, подвергшихся действию стресса, сохранялся во всех экспериментальных группах. Однако только применение ЭХА приводило к коррекции этого показателя крови. Итак, препараты ЛТ и ЭХА по-разному влияют на показатели этого важнейшего компонента клеточных механизмов неспецифической резистентности. Следует отметить, что ЛТ относится к сильным модуляторам микроглии (резидентальных макрофагов нервной системы), воздействуя на сигнальные пути, которые ведут к повышению противовосполительного и антиоксидантного потенциала защиты нервной системы и организма в целом (Dirscherl et al., 2010). При этом не было выявлено существенных различий между группами по уровню содержания ИФНгамма (данные не представлены). Различия в исследуемых группах по уровню ИЛ-4 оказались более заметными (рис. 3). -13- 0,12 О Ппри450нм 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 1 2 3 4 5 Рис. 3. Содержание ИЛ-4 в сывотке крови крыс линии Вистар через 15 дней после начала эксперимента с мезатондвигательной моделью стресса, выявляемое методом ИФА. По оси абсцисс: экспериментальные группы животных: 1 – контрольные животные, 2 – Стресс, 3 - Стресс+РК, 4 - Стресс+ЛТ, 5 – Стресс+ЭХА. По оси ординат – показатели оптической плотности при 450нм. Из рисунка 3 следует, что во всех группах животных, подвергшихся действию экспериментального стресса, выявляется однонаправленная тенденция – снижение содержания ИЛ-4 в сравнении с интактными животными. При этом ЛТ и ЭХА проявляют активность в плане восстановления содержания этого цитокина, важного для генерации механизмов В-клеточного иммунитета. Особенно эта восстановительная тенденция прослеживается в группе животных, получавших препарат ЭХА. Учитывая то обстоятельство, что используемая нами мезатоновая модель стресса в условиях повышенной нагрузки на сердце приводила к ухудшению трофики миокарда, особый интерес представляла морфологическая оценка состояния тканей миокарда и собственно кардиомиоцитов. Как показал анализ электронных снимков срезов сердца в группе интактных животных (рис. 4-А), в целом, кардиомиоциты имели нормальное строение: миофибриллы кардиомиоцитов были сокращены равномерно, канальцы саркоплазматического ретикулума не расширены, митохондрии распределены равномерно (отсутствовали обширные зоны, лишенные митохондрий), кристы по большей части были плотно упакованы и расположены параллельно. А С В Рис. 4. Электронные микрофотографии кардиомиоцитов А – интактных животных; В – животных, подвергшихся действию стресса; С – животных, подвергшихся действию стресса и получавших препараты ЛТ. В группе животных, подвергавшихся стрессу (рис. 4-В), кардиомиоциты имели целый комплекс патологических изменений на ультраструктурном уровне: сердечной мышце часто встречались участки с неравномерно сокращенными миофибриллами. Канальцы саркоплазматического ретикулума были сильно расширены. В миокарде имелись довольно протяженные участки, лишенные митохондрий, и последние характеризовались более мелкими размерами, чем митохондрии в группе интактных животных. Кристы у большинства митохондрий группы отрицательного контроля были непараллельными, неравномерно расширенными, с электронносветлым матриксом. Наблюдалось множество признаков проявления митоптоза. -14- В группе животных, подвергнутых стрессу и принимавших ЛТ (рис. 4-C), на электронных микрофотографиях кардиомиоцитов определяется чрезвычайно развитый митохондриальный аппарат. Митохондрии в подавляющем большинстве имеют плотно расположенные кристы. Проявления митоптоза были незначительны и, видимо, отражают восстановление кардиомиоцитов от окислительного стресса. Миофибриллы равномерно сокращены, саркоплазматические канальцы были умеренно расширены, а сосудистый эндотелий образовывал лишь единичные выросты в просвет сосудов. Такая же картина наблюдается на электронных снимках при действии ЭХА. Таким образом, на ультраструктурном уровне впервые было показано, что препараты ЛТ и ЭХА, по-видимому, обладают протективным действием при экспериментальном стрессе, что выражается в сохранении нормальной структуры миофибриллярного аппарата и митохондрий кардиомиоцитов у животных, получавших данные препараты перорально на фоне действия стрессового фактора. При этом, защитный эффект препаратов ЛТ и ЭХА выражен примерно в одинаковой степени и существенно превосходит протективную активность РК. 2.4 Предполагаемые механизмы действия ЭХА при нарушении липидного и углеводного обменов. В данной работе мы впервые исследовали протективный потенциал ЭХА, применявшегося перорально, при моделировании различных патологий человека. Этот полигидроксинафтахинон проявил себя, как высокоэффективный противовоспалительный агент. По нашему мнению, его противовоспалительный потенциал определяют следующие факторы: 1) ЭХА является мощным детоксикантом супероксид-аниона и перекисных радикалов, образуя с ними нейтральные нетоксичные комплексы; 2) ЭХА в результате аутоокисления и взаимодействия в организме с ДТ-диафоразой эндотелиальных клеток сосудов, продуцирует в физиологических концентрациях Н2О2, которая является сильным внутриклеточным медиатором синтеза ферментов АО защиты организма (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и др.); 3) Н2О2 связываясь с рецептором инсулина усиливает метаболизм глюкозы, снижая ее количество в крови; 4) Н2О2 обладает сосудорасширяющим действием, уменьшая проявления гипертонии; 5) в условиях ишемии и гипоксии Н2О2 – дополнительный источник получения кислорода клетками за счет разложения перекиси при действии каталазы; 6) Н2О2 выступает в роли плейотропной сигнальной молекулы и вызывает резкое усиление синтеза разных видов PPAR – главных регуляторов углеводного и липидного обмена. 2.5 Особенности противовоспалительного механизма действия РК. РК, содержание которой в морских травах рода Zostera сильно колеблется в зависимости от сезона в пределах от 0,4 до 19,2 мг на 1 г сухого веса травы, составляет основу водорастворимой части ПФК. Наши исследования показали, что РК обладает очень высокой АОА, однако не всегда эта активность коррелирует с протективным действием при моделировании различных патологий человека. Ранее было показано (Kim et al., 2004), что РК обеспечивает улавливание, стабилизацию и обезвреживание АФК, защищая белки, ферменты и ДНК от их прямого действия, а также проявляет противовоспалительную активность, действуя по разным внутриклеточным биохимическим путям, а именно: 1) ингибирует образование ферментов (фосфолипазы А2, циклооксигеназы, липоксигеназы), принимающих участие в синтезе эйкозаноидов. Вследствие этого уменьшает содержание провоспалительных молекул (простагландинов и лейкотриенов); 2) ингибирует факторы активации транскрипции, модулирующие экспрессию провоспалительных генов (циклооксигеназы-2, индуцибельной NO синтазы, фактора некроза опухоли-α, а также интерлейкинов-1β и 6). Кроме этого РК может ингибировать экспрессию генов, связанных с промотором фактора -15- транскрипции NF-kappaB (Lee et al., 2006). Таким образом, можно заключить, что РК обладает плейотропным характером биологического действия, в основе которого лежит, прежде всего, АО и противовоспалительный эффект. 2.6 Сравнительное изучение фармакологической активности ЛТ и ДСЛ при моделировании различных патологий. Сульфатирование – важный путь метаболизма ФЛ, в том числе и флавона ЛТ, в растениях. В морской траве Z. marina нами обнаружено значительное количество ДСЛ и разработан доступный способ его получения. Можно предположить, что ДСЛ – это природная водорастворимая форма ЛТ, которая абсорбируется и усваивается, проникая в плазму крови животных и человека через кишечник и минуя стадии модификации клетками кишечника и печени. ДСЛ обладает меньшим токсическим потенциалом, чем ЛТ, что повышает эффективность его физиологического действия. В связи с этим разработка лечебнопрофилактических средств на основе ДСЛ представляется более перспективной, чем на основе ЛТ, который уже сейчас широко применяется в лечебной практике. 2.6.1 Аллоксановый диабет. Наиболее эффективным в этом эксперименте показал себя ДСЛ в дозе 0,5 мг/кг (уменьшение на 30%). Введение аллоксана уменьшало вес поджелудочной железы не менее чем на 20%. ЛТ по своему защитному действию в отношении поджелудочной железы (если судить по ее весу) не уступал ДСЛ. При исследовании уровня глюкозы в ГТТ было выявлено, что ДСЛ наиболее эффективно проявляет себя в дозе 0,5 мг/кг, в то время как ЛТ показывает наилучший эффект в дозе 2 мг/кг (табл. 5). Концентрация билирубина в группе животных с индуцированным аллоксановым диабетом (отрицательный контроль) возрастала приблизительно на 20%. ДСЛ в дозе 0,2 мг/кг снижает его содержание до нормальных значений (группа интактных животных). Препарат ЛТ в исследуемом диапазоне не обладал нормализующим действием в отношении данного показателя. В группе животных (отрицательный контроль) наблюдалось приблизительно 50%-ное повышение содержания МДА. ДСЛ в дозе 0,1 и 0,2 мг/кг резко уменьшал уровень МДА в плазме крови, доводя его до нормальных значений (интактные животные). Аналогичное действие оказывал и ЛТ, но в дозах в 10 раз выше (1,0 и 2,0 мг/кг). То есть ДСЛ обладает более выраженным протективным действием, чем ЛТ, и препарат сравнения ГБК, который широко применяется при лечении СД 2-го типа (табл. 5). МДА мкмоль/л АлАт, мкмоль/л час АсАт, мкмоль/л час Билирубин, мкмоль/л 5 ГТТ моль/л 4 Относ. вес поджелуд очной железы (в %) 1 1 2 3 Группа животных № п/п Таблица 5. Биохимические показатели плазм крови экспериментальных животных при аллоксановом диабете 2 Интактные (-) контроль ДСЛ (0,1 мг/кг) ДСЛ (0,2 мг/кг) ДСЛ (0,5 мг/кг) 3 8,3±0,12 7,2±0,15 7,4±0,18 4 6,93±0,73 17,5±1,25 15,7±4,3 5 1,4±0,03 1,6±0,18 0,7±0,05 6 2,4±0,1 2,6±0 6,7±2,3 7 7,4±0,3 8,4±0,7 7,0±0,6 8 44,5±2,6 56,6±1,8 34,5±1,3 7,6±0,17 14,9±1,85 0,5±0 3,2±0,1 7,7±0,4 45,2±1,9 8,7±0,04 13,8±3,6 - 3,0±0,5 7,4±0 61,5±5,6 -16- Окончание таблицы 5 1 6 7 8 9 2 ЛТ (0,5 мг/кг) ЛТ (1 мг/кг) ЛТ (2 мг/кг) Глибенклами д (5 мг/кг) 3 8,7±0,10 4 15±5,6 5 - 6 4,6±0,3 7 7,8±0,8 8 - 8,2±0,09 7,7±0,15 1,0±0,13 13,5±1,9 12,9±5,2 14,6±0,57 1,2±0,02 0,6±0,03 0,5±0,01 3,2±0,6 6,2±1,1 3,3±0,2 7,8±0,1 7,5±0 6,9±1,6 55,8±2,2 53,2±1,0 47,9±2,1 2.6.2 Гиполипидемическая активность. При изучении гиполипидемической активности на модели экспериментальной гиперлипидемии было показано (табл. 6), что ДСЛ слабо влияет на уровень ТГ и общего ХС в плазме крови животных, в то время как действие ЛТ на эти параметры было более значимо. Следует особо отметить, что ДСЛ в дозе 1,0 мг/кг увеличивает примерно в 2 раза концентрацию липопротеидов высокой плотности в плазме крови животных. На уровень липопротеидов очень низкой плотности ЛТ оказывает более значимое действие, снижая этот показатель наиболее эффективно в дозе 0,1 мг/кг. ДСЛ слабо влияет на уровень ЛПОНП, проявляя себя только в дозе 1 мг/кг. Сравнительный анализ действия данных препаратов на активность трансаминаз крови показал, что ЛТ и ДСЛ оказывают слабое влияние на указанный показатель. 4,9±0,20 3,1±0,96 2,5±0,97 4,5±0,11 1,7±0,06 2,8±0,10 2,0±0,3 5,5±0,5 25,1±5,8 5,1±0,11 3,9±0,05 2,6±0,05 4,7±0,24 6,7±2,12 1,7±0,3 5,4±0,4 27,9±2,3 4,1±0,09 3,9±0,12 5,6±0,32 3,7±0,02 0,9±1,00 1,7±0,1 6,1±0,4 25,4±1,4 6,6±0,16 3,2±0,91 2,8±0,07 6,0±0,36 - - - - 3,3±0,21 2,9±0,08 0,2±0 3,0±1,20 0,1±0,97 1,7±0,3 5,4±0,2 30,7±2,2 3,8±0,12 3,2±0,15 1,9±0,09 3,5±0,55 1,8±0,12 1,7±0,6 6,4±0,1 23,0±2,8 4,3±1,03 3,7±0,77 2,09±0,01 4,0±0,98 1,3±0,03 1,6±0,1 5,5±0 19,9±1,1 ХСЛПВП моль/л Билирубин, мкмоль/л 8 АСТ, мкмоль/л час 7 АЛТ, мкмоль/л час 6 МДА мкмоль/л 5 ХСЛПОНП моль/л 4 ХС моль/л 3 Интактные (-) контроль ДСЛ (0,1 мг/кг) ДСЛ (1 мг/кг) ДСЛ (10 мг/кг) ЛТ (0,1 мг/кг) ЛТ (1 мг/кг) ЛТ (10 мг/кг) ТГ моль/л 1 2 Группа животных № п/п Таблица 6. Биохимические показатели при гиперлипидемии в плазме крови экспериментальных животных Таким образом, на модели экспериментальной гиперлипидимии было определено, что ДСЛ и ЛТ обладают протективной активностью в разных дозах, но с различной эффективностью. 2.6.3 Гепатопротекторная активность. При определении гепатопротекторной активности нами было зарегистрировано (табл. 7), что ДСЛ гораздо эффективнее защищает клетки печени от токсического действия сильного печеночного яда тетрахлорметана, чем ЛТ, который, как было показано ранее, является эффективным протективным средством при печеночных патологиях разной этиологии (Lima et al., -17- 2006; Oh et al., 2004). Следовательно, гепатозащитным агентом, чем ЛТ. ДСЛ является более эффективным Таблица 7. Биохимические показатели при гепатите в плазме крови экспериментальных животных № 1 2 4 5 Группы животных Интактные CCI4 (-) контроль ДСЛ ЛТ + МДА мкмоль/л 0,19±0,02 2±0,19 Билирубин, мкмоль/л 32,23±5,25 170,09±14,87 АлАт, моль/л×ч 0,9±0,02 3,37±0,19 АсАт, моль/л×ч 0,17±0,01 4,84±0,8 + + 0,64±0,01 1,2±0,18 70,18±2,21 112,93±18,04 2,82±0,1 4,58±1,06 3,77±1,1 4,58±1,2 CCI4 2.6.4 Противовоспалительная активность. Как показал эксперимент при тестировании противовоспалительной активности на каррагинановой модели, исследуемый препарат ДСЛ приблизительно в 2 раза был менее эффективен, чем препарат «Индомитоцин», взятый в качестве положительного контроля. Однако его противовоспалительное действие примерно в 1,5 раза было выше, чем у РК и более чем в 3 раза выше, чем у ЛТ. 2.6.5 Противоопухолевая активность. При изучении противоопухолевой активности с использованием асцитного варианта опухоли Эрлиха было показано, что ЦФ в дозе 100 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении увеличивал УПЖ на 6,2% по сравнению с контролем. ДСЛ и ЛТ при внутрибрюшинном введении в дозе 10 мг/кг и пятикратном лечении, как при монотерапии, так и в сочетании с ЦФ, противоопухолевой активности не проявили. Иная картина наблюдалась при исследовании противоопухолевой активности при подкожном введении данных препаратов на модели солидного варианта опухоли Эрлиха. Как показал эксперимент, наибольшей активностью (ТРО, %) обладал ЛТ (66,12%), который превосходил противоопухолевое действие ЦФ (58,69%) и ДСЛ (52,76%). Сочетанная терапия ЦФ, как с ЛТ, так и с ДСЛ не показала синергического эффекта. Таким образом, как ЛТ, так и ДСЛ обладают высокой противоопухолевой активностью, сравнимой с ЦФ, при подкожном введении на модели солидного варианта опухоли Эрлиха. 2.7 Сравнительная оценка биологической активности и механизма действия ЛТ и ДСЛ. Проведенная нами серия биологических испытаний сульфатированного конъюгата ЛТ – ДСЛ, наводит на мысль, что сульфатированный ЛТ, возможно, более эффективно всасывается эпителиальными клетками, чем чистый ЛТ. Хорошо известен тот факт (Sai et al., 2006), что органические анионы типа сульфатированных конъюгатов фенольных соединений при содействии специальных транспортеров и сильного градиента протонов обладают повышенной способностью синпортно проникать в эпителиальные клетки кишечника, а затем быстро транспортироваться в плазму крови. Эти специальные транспортеры входят в состав большого семейства транспортеров органических анионов и располагаются на апикальной части мембран эпителиальных клеток малого кишечника, а также других органов. Они ответственны за транспорт большого количества анионных органических молекул, структурно отличающихся друг от друга (Chen et al., 2007). Можно предположить, что ДСЛ способен проникать в плазму крови животных и человека через кишечник, минуя стадии модификации клетками кишечника и печени, что повышает его биоусвояемость и эффективность фармакологического действия. Мы предполагаем, что ДСЛ и ЛТ -18- могут взаимодействовать с одними и теми же рецепторами-мишенями и вызывать фармакологический эффект. Рис. 5. Предполагаемая схема протективного действия ЛТ и ДСЛ на примере макрофагальных клеток. Нельзя исключать и того, что в русле крови ДСЛ, подобно эстрон сульфату (Santner et al., 1984), выполняет роль неактивного пула ЛТ, и только при его гидролизе сульфатазами достигает рецепторов-мишеней внутри клеток. На рис. 5 представлены различные варианты взаимодействия ЛТ и ДСЛ с рецепторными белками-мишенями как на плазматической мембране макрофагальных клеток, так и внутри этих клеток. Принято считать, что флавоноиды (ФЛ) проявляют высокую биологическую активность в чистом виде, а их метаболиты гораздо менее активны и являются, главным образом, «депонированной» формой этих препаратов. Однако современные факты противоречат этой догме. Часто сульфатированные, гликозилированные и другие метаболиты не утрачивают активности немодифицированных ФЛ, в частности, антиоксидантный и противовоспалительный потенциал. Более того, иногда эффективность протективного действия конъюгированных форм ФЛ на некоторые молекулярные мишени в клетках и тканях заметно возрастает по сравнению с нативными, а цитотоксичность уменьшается (Hoshino et al., 2010; Al-Shalmani et al., 2011; Han et al., 2012). После проникновения в кровоток ФЛ начинают взаимодействовать с эндотелиальными клетками кровеносных сосудов, которые могут находиться как в нормальном, так в патологическом состоянии (рис. 6-а). На рис. 6-б представлены предполагаемые пути ингибирования эндоцитоза окс-ЛПНП, опосредованного рецепторами–скевенджерами (РС), в макрофагальные клетки в присутствие ЛТ и ДСЛ. Можно предположить, что взаимодействие ДСЛ с РС, локализованными на макрофагальной плазматической мембране, может селективно блокировать связывание окс-ЛПНП с этими рецепторами и их поступление в клетку. На ранней стадии развития атеросклероза РС считаются наиболее важными структурными компонентами, которые ответственны за поглощение окс-ЛПНП макрофагами, что в дальнейшем ведет к формированию пенных клеток (предшественников образования атеросклетотических бляшек). При этом ингибирующее действие ЛТ на этот процесс может происходить и внутри макрофагальной клетки. Следовательно, можно предложить следующий сценарий протективного действия ЛТ и ДСЛ в норме и при ССЗ и МС, разделив его на несколько стадий: (1) поврежденные стенки кровеносных сосудов эффективно пропускают метаболиты из циркулирующей крови; (2) ДСЛ безопасен во время абсорбции и последующей доставки к клеткам-мишеням; (3) ДСЛ взаимодействует с РС, расположенными на макрофагах, и оказывает противоатеросклеротическое действие (рис. 6). -19Рис. 6. Предполагаемые пути проникновения ЛТ и ДСЛ в сосудистые клетки и их ингибирующее действие на рецепторыскевенджеры окс-ЛПНП. а - проникновение ДСЛ через поврежденные эндотелиальные клетки в интиму, где располагаются макрофагальные клетки. б – ингибирующее действие ЛТ и ДСЛ на проникновение оксЛПНП в макрофагальные клетки. Сокращения: мф, макрофаги; РС, рецепторскевенджер; 2.8 Сравнительная оценка действия различных мазей на течение экспериментального аллергического контактного дерматита. Аллергия характеризуется повышенной воспалительной реакцией иммунной системы, что стимулирует ослабление сосудов крови, вызывает увеличение секреции через образующиеся разрывы и болезненную реакцию нервных окончаний. При аллергической реакции наблюдается повышение уровня Ig-E, который активирует Тхелперные клетки и эозинофилы, что вызывает высвобождение провоспалительных медиаторов в ответ на действие аллергенов. Аллергические и воспалительные реакции вовлекают в этот процесс также лейкотриены и простаноиды, которые продуцируются на пути активности таких ферментов, как 5-липоксигеназа и циклооксигеназа-2, и имеют сильное провоспалительное действие. Аллергические реакции регулируют введением глюкокортикоидов, антигистаминных препаратов, стабилизаторов тучных клеток и иммуносупрессоров. Эти лекарственные средства оказывают сильный противоаллергический эффект, но их длительное использование представляет большую проблему из-за выявленных серьезных побочных эффектов. В настоящее время среди БАВ из МГ все большее внимание привлекают природные соединения, которые наряду с противовоспалительной активностью эффективно ингибируют различные аллергические реакции как in vivo, так и in vitro. В этом отношении большой интерес представляют полифенольные соединения и каротиноиды. Нами были найдены новые перспективные источники получения потенциальных противовоспалительных препаратов, а именно: ЛТ, ДСЛ и РК морской травы Z. marina, а также СК морской звезды P. pectinifera. Противоаллергические свойства этих соединений до настоящего времени были исследованы очень слабо. Из табл. 8 видно, что мазевые препараты, которые были использованы для лечения контактного дерматита, индуцированного 2,4-динитрофторбензолом, содержащие ДСЛ, ЛТ, РК значительно превышают терапевтическую эффективность коммерческого препарата «Синафлан». Таблица 8. Лечебное действие исследуемых мазей на процесс заживления ран № п/п 1 1 2 Группы животных 2 Синафлан ДСЛ, 1% Кол-во животных в группе 3 3 2 Заживление, % (m ± σ) Режим применения 7 день 9 день 14 день 4 5 дней 5 дней 5 11,2±4,5 70,7±3,6 6 64,17±2,3 70,31±2,3 7 100±0 98,43±1,8 -20- Окончание таблицы 8. 1 3 4 5 2 ЛТ, 1% РК, 1% СК, 1% 3 5 5 3 4 5 дней 5 дней 5 дней 5 70,5±5,2 41,9±6,1 96,78±2,1 6 65,8±4,3 89,87±6,4 100±0 7 100±0 100±0 100±0 Следует отметить, что наибольшую эффективность в этом эксперименте проявил препарат из СК, который содержит астаксантин. 2.9 Полифункциональная активность ПКИ. Одним из перспективных направлений в области функционального питания является изучение различных сторон фармакологической активности ПК. Коллагеновые белки являются компонентами, обеспечивающими все характерные свойства и функции экстраклеточного матрикса. Они входят в состав стромы и межклеточного вещества всех органов и тканей организма (составляют до 25% массы всех экстраклеточных белков). Семейство коллагенов в настоящее время включает, по меньшей мере, 28 типов белков и более 30 генных продуктов. При этом многочисленные исследования продемонстрировали наличие мощного регуляторного потенциала практически у всех коллагеновых белков и зависимость функционирования практически всех видов клеток от их состава. Полученные в лаборатории биотехнологии ТИБОХ ДВО РАН по оригинальной технологии гидролизаты ПКИ представляет собой набор ПК с различной молекулярной массой. Среди крупных полипептидов следует отметить ПКТ с молекулярной массой 12 кДа и ПКЗ – 22-23 кДа. 2.9.1 Оценка ранозаживляющей активности мазей, содержащих ПКЗ, была проведена на беспатогенных мышах линии СВА, которым наносили термические раны. В качестве препарата сравнения использовали метилурациловую мазь. Следует отметить, что особенно четкие различия в ранозаживляющей активности между исследуемыми группами были отмечены на 7-й день после индукции термических ожогов. Как показал эксперимент, наибольшей эффективностью обладал 1%-ный препарат ПК на основе детского крема, который оказывал выраженное лечебное действие (82,9±10,1%) на заживление термических ожогов. При этом заживляющий эффект метилурациловой мази (73,4±23,2%) и 5%-ного препарата ПК (65,4±18,8%) были также заметно выше контроля (50,8±20,2%). 2.9.2 Исследование противоопухолевой активности ПКЗ было проведено в диапазоне доз от 2,5 – 10 мг/кг в сравнении с контролем (нелеченые животные) и известным противоопухолевым нуклеофильным соединением ЦФ. При комбинированном введении ПКЗ с ЦФ нами была использована средняя исследуемая доза ПК (5 мг/кг) с целью проверки их синергетического действия. Как показал эксперимент, ПКЗ обладал выраженной дозозависимой противоопухолевой активностью в отношении солидного варианта опухоли Эрлиха. Наибольший противоопухолевый эффект наблюдался в дозе 5 мг/кг (56,8±17,7%) при пятикратном ежедневном лечении, начиная со следующего дня после инокуляции опухоли. При монотерапии ЦФ достигался противоопухолевый эффект равный 40±14,5%. Комбинированное применение ПКЗ и ЦФ показало, что эти соединения при данной схеме применения не обладают синергетическим действием (44,5±8,6%). Следует отметить, что в дозе 2,5 мг/кг ПКЗ не проявлял достоверный противоопухолевый эффект. Таким образом, экспериментальные исследования противоопухолевой активности выявили наличие противоопухолевой активности у ПКЗ. 2.9.3 Гепатопротекторная активность. Цирротические изменения печени в отрицательном контроле (2,8±0,6 мкмоль/л) сопровождались резким изменением биохимических показателей плазмы крови, что проявлялось в возрастании содержания -21- ТБК-реактивных продуктов и МДА более чем в 2 раза по сравнению с группой интактных животных (1,03±0,1 мкмоль/л). ПКЗ, вводимый животным перорально, оказывал выраженное дозозависимое действие. Так, в дозе 25 мг/кг уровень ТБКреактивных продуктов практически не изменялся (3,01±0,9 мкмоль/л) по сравнению с отрицательным контролем. Однако в дозах 50 (0,06±0,001 мкмоль/л) и 100 мг/кг (0,1±0,02 мкмоль/л) наблюдалось резкое изменение содержания МДА в плазме крови экспериментальных животных в этих группах. По уровню антиоксидантной активности в дозах 50 и 100 мг/кг ПКЗ превзошел известный гепатозащитный препарат «Карсил» (1,5±0,1 мкмоль/л), который был использован в качестве положительного контроля. Динамика изменения остальных биохимических показателей плазмы крови, а именно: АлАт, билирубин, в группах животных, получавших лечебные дозы ПКЗ, также была положительной. Таким образом, профилактический прием животными различных доз ПКЗ приводит к нормализации клинико-диагностических показателей плазмы крови в группах животных с экспериментальным токсическим гепатитом, очевидно благодаря наличию выраженного антиоксидантного действия ПКЗ, который восстанавливает и/или активирует системы детоксикации АФК и продуктов ПОЛ в организме животных. Можно предположить, что сложный комплекс ароматических аминокислот в ПКЗ препятствует развитию радикальных процессов, которые индуцируются тетрахлорметаном, тем самым предотвращает разрушение клеточных мембран гепатоцитов. 2.9.4 Противовоспалительную активность ПКИ оценивали с применением каррагинановой модели отека лапы. Как показал эксперимент (табл. 9), при внутрибрюшинном введении ПКИ (10 и 20 мг/кг), все исследованные препараты обладали достаточно высокой противовоспалительной активностью: ингибировали развитие процесса отека лапы на 30 - 45%, а препарат сравнения индометацин (в дозе 10 мг/кг) на 52,0%, по сравнению с контролем. В дозе 10 мг/кг наибольшую активность проявили ПК S. mirabilis (43,1%) и C. japonica (46,2%). Следует отметить, что в некоторых случаях доза 20 мг/кг приводила к меньшему лечебному эффекту, чем доза 10 мг/кг, что предполагает необходимость дальнейшего изучения противовоспалительного потенциала тестируемых препаратов ПК, с использованием более низких лечебных доз. Таблица 9. Изучение противовоспалительной активности ПКИ Группы (кол-во животных) Контроль (4) Индометацин (4) ПКК (4) ПКК (4) ПКТ (4) ПКТ (4) ПКЕп (4) ПКЕп (4) ПКЕи (4) ПКЕи (4) ПКЗ (5) ПКЗ (5) Доза (мг/кг) 10 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 Вес лапы через 5 ч после индукции каррагинаном (×10-2г) 81,25 ± 1,70 39,02± 2,08 43,75 ± 1,0 55,25±5,01 48,78±3,20 53,25 ± 1,25 46,25±4,08 47,25± 0,06 53,03±1,19 35,75±1,11 34,29±4,10 37, 32± 3,24 Замедление воспаления, % 52,0±4,06 46,15±2,09 32,04±6,06 40,0±4,09 34,46±2,47 43,08±5,26 41,85±1,02 34,77±2,32 56,04±2,87 43,02±2,47 45,17±5,20 2.9.5 Антикоагулянтная активность ПКЗ в тесте по определению протромбинового времени проявляется при достаточно высоких (1,5 и 2,0 мг/ мл) -22- концентрациях, что указывает на относительно слабое воздействие ПКЗ на начальное звено системы свертывания крови, запускаемое по внешнему пути. В тесте определения активированного парциального тромбопластинового времени ПКЗ проявил достаточно сильное антикоагулянтное действие. Уже в дозе 0,1 и 0,3 мг/мл он увеличил в 1,5-2 раза время образования сгустка. Из полученных данных следует, что пептиды коллагена действуют как антикоагулянты на внутренний путь активации свертывания крови, и их действие сопоставимо с известными антикоагулянтами. Таким образом, ПКЗ оказывает антикоагулянтный эффект равный ПКТ, для которого этот эффект был зарегистрирован ранее. 2.9.6 Ингибирующая активность ПКЗ в отношении АПФ. Этот фермент является ключевым регулятором периферического кровяного давления. Ингибиторы АПФ пептидной природы широко используются для лечения постоянной гипертензии и сердечной недостаточности. Как показал эксперимент, ПКЗ в дозе около 1 мкг/мл ингибирует активность этого фермента на 60-70%. ПКЗ не обладает ингибирующей активностью в отношении АПФ, сравнимой с каптоприлом (ИК50=0,006 мкмоль/л). Однако, поскольку он получен из природного продукта, то не должен оказывать побочные эффекты, которые сопровождают действие синтетических лекарственных средств, и может быть использован как элемент функциональной пищи для профилактики гипертонических заболеваний. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Освоение биологических ресурсов суши и Мирового океана переживает сейчас период подъема. Полученные в данной работе результаты исследований различных БАВ, выделенных из МГ показали, что они обладают широким спектром медикобиологической активности. Высокая эффективность ПЛ, содержащих ω-3 ПНЖК, ЛТ, ДСЛ, ЭХА, СК и ПКИ, обнаруженная нами при моделировании различных патологий человека, позволяет надеяться, что они найдут применение, как в клинической практике, так и в качестве основных компонентов БАД и функциональной пищи. ВЫВОДЫ 1. На экспериментальных моделях человеческих патологий проведен скрининг различных БАВ, выделенных из МГ, который позволил выявить ряд перспективных соединений, обладающих высокой протективной активностью. 2. При изучении ПЛ морских макрофитов установлено, что соотношение 3:1 ω-3/ω-6 ПНЖК является наиболее оптимальным и обладает выраженным корригирующим действием на моделях аллоксанового диабета и гиперлипидемии. 3. Показано, что пероральное применение ПФК и ЭХА приводит к выраженной протективной активности при экспериментальном моделировании различных патологий человека, а их совместное применение с ПЛ в некоторых случаях (U. fenestrane в сочетании с ЭХА) приводит к синергическому эффекту. 4. Обнаружено, что активность исследуемых веществ по эффективности антиоксидантного действия in vitro можно расположить в следующем порядке: РК>ДГК>ЭХА>ЛТ>тролокс>АК в системе Hb-H2O2-ЛМ и РК>ДГК>ЛТ>ЭХА>тролокс в системе ААРН-люминол. 5. При моделировании кардиопатологии было установлено, что ЛТ и ЭХА в отличие от РК способны обеспечить повышение функциональных ресурсов кардиомиоцитов за счет усиления процессов митохондриогенеза и защиты митохондриального аппарата клеток миокарда, а также воздействия на функциональную активность иммунной и антиоксидатной системы защиты. Следует -23- отметить, что высокая прямая антирадикальная и антиоксидантная активность вещества не является гарантией его высокой эффективности при моделировании различных патологий in vivo 6. Показано, что биологическая активность ДСЛ во многих случаях выше, чем ЛТ. Можно предположить, что ДСЛ – это природная водорастворимая форма ЛТ, способная проникать в плазму крови животных и человека через кишечник, минуя стадии модификации клетками кишечника и печени, что повышает эффективность его биологического действия. 7. При экспериментальном моделировании человеческих патологий впервые показан высокий биологический потенциал ПКИ, особенно при лечении сердечнососудистых и опухолевых заболеваний, а также обнаружена высокая противоаллергическая, противовоспалительная и ранозаживляющая активность СК и компонентов ПФК (РК, ЛТ, ДСЛ). ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Попов А.М., Ли И.А., Кривошапко О.Н., Гончарова С.Н., Костецкий Э.Я. Влияние липидных экстрактов из морских макрофитов на метаболический контроль при аллоксановом диабете // 5-ый Международный научно-практический конгресс «Человек в экстремальных условиях: здоровье, надежность и реабилитация». 2006. С. 443-445. (статья) 2. Ли И.А., Попов А. М., Кривошапко О.Н., Гончарова С.Н., Костецкий Э.Я. Проективные свойства липидных экстрактов морских макрофитов на фоне аллоксанового диабета // II региональная научная конференция «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии». Владивосток. 2006. С. 121. (тезис) 3. Krivoshapko O.N., Popov A.M., Artyukov A.A., Kostetsky E.Y. The correction of lipid and carbohydrate metabolic using bioantioxidants and polar lipids from sea hydrobiontes // 1st Far-Easten International Symposium on Life Sciences. Vladivostok. 2008. P. 43. (тезис) 4. Кривошапко О.Н., Попов А. М., Артюков А. А. Применение биоантиоксидантов при нарушениях липидного и углеводного обмена // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2009. № 4-5. С. 85-88. 5. Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н., Петровичева С.Е., Цыбульский А.В., Козловская Э.П. Противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства препарата «Люромарин» при окислительном стрессе // Медицинская иммунология. 2009. Т. 11. № 4-5. С. 331-332. 6. Кривошапко О.Н., Попов А.М., Артюков А.А. Применение морских антиоксидантов при патологиях, связанных с метаболическим синдромом // Международная научно-практическая конференция «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». Новый Свет, Крым, Украина, 25-30 мая 2009 года С. 331-332. 7. Кривошапко О.Н., Попов А.М., Артюков А.А. Перспективы применения биоантиоксидантов при патологиях, связанных с метаболическим синдромом // Конференция «актуальные проблемы химии природных соединений». Ташкент. 2010. С. 242. 8. Попов А.М., Цыбульский А.В., Артюков А.А., Кривошапко О.Н. Влияние лютеолина, розмариновой кислоты и эхинохрома А на иммунитет при моделировании стресс-индуцированной кардиопатологии // Российский Аллергологический Журнал. 2010. № 5. С. 228-230. -24- 9. Krivoshapko O. N., Popov A. M., Artyukov A. A., Kostetsky E. Y. Peculiarities of the Corrective Effects of Polar Lipids and Bioantioxidants from Sea Hydrobionts in Impairments of Lipid and Carbohydrate Metabolism // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2011. V. 5, № 2. Р. 152–157. 10. Кривошапко О.Н., Попов А.М. Лечебно-профилактические свойства полярных липидов и антиоксидантов из морских гидробионтов // Вопросы питания. 2011. № 2. С. 4-8. 11. Попов А.М., Артюков А.А., Цыбульский А.В., Кривошапко О.Н. Оценка иммуномодулирующей активности эхинохрома А из морского ежа Scaphechinus mirabilis // Мед. иммунология. 2011. Т. 13. № 4-5. С. 329-330. 12. Цыбульский А.В., Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н., Козловская Э.П. Сравнительное изучение лечебного действия лютеолина, розмариновой кислоты и эхинохрома А при экспериментальной кардиопатологии, индуцированной стрессом // Биомедицинская химия. 2011. Т. 57. № 3. С. 314-325; 13. Кривошапко О.Н., Попов А. М. Лютеолин как природный корректор патологических процессов в организме // Международная научно-практическая конференция «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». Новый Свет, Крым, Украина, 25-28 мая 2011 года, С. 535-536 (тезис). 14. Кривошапко О.Н., Попов А. М. Протективные свойства лютеолина при нарушениях углеводного и липидного обмена // Международная научно-практическая конференция «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». Новый Свет, Крым, Украина, 25-25-28 мая 2011 года, С. 537-538 (тезис). 15. Патент РФ № 2010141686, приоритет 11.10.10. Средство, обладающее антиоксидантным, кардиопротекторным, противодиабетическим противовоспалительным, гепатопротекторным, противоопухолевым и противовирусным действием / Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н., Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Козловкая Э.П. 16. Popov A. M., Artyukov A. A., Glazunov V. P., Mandron E. V., Krivoshapko O. N., Kozlovskaya E. P. Antitumor and Anticoagulant Activities of Collagen Protein from the Holothurian Apostichopus japonicus Modified by Proteolytic Enzymes // Russian Journal of Marine Biology. 2011. V. 37, № 3. Р. 217–222. 17. Попов А.М., Кривошапко О.Н., Артюков А.А. Сравнительная оценка фармакологической активности лютелина и 7,3'-дисульфата лютеолина при моделировании разных патологий // Биофармацевтический журнал. 2011. Т. 3. № 4. С. 27-33. 18. Артюков А.А., Попов А.М., Цыбульский А.В., Кривошапко О.Н., Полякова Н.В. Фармакологическая активность эхинохрома А отдельно и в составе БАД «Тимарин» // Биомедицинская химия. 2012. Т. 59. № 3. С. 281-290. 19. Кривошапко О.Н., Попов А.М., Артюков А.А., Штода Ю.П. Ранозаживляющая активность различных природных соединений на модели аллергического контактного дерматита // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине. Т. 1: С.. Сборник статей Третьей международной научно-практической конференции “Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. 2012. С. 6668. 20. Попов А.М., Кривошапко О.Н., Штода Ю.П., Артюков А.А. Протективная активность новых БАД на основе эхинохрома А // Высокие технологии, -25- фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине. Т. 1: С.. Сборник статей Третьей международной научно-практической конференции “Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. 2012. С. 109-110. 21. Цыбульский А.В., Попов А.М., Артюков А.А., Мазейка А.Н., Костецкий Э.Я., Санина Н.М., Кривошапко О.Н. Разработка нового поколения вакцин на основе гемагглютинина вируса гриппа и липид-сапониновых ТИ-комплексов, модифицированных антиоксидантом эхинохромом А // Вопросы вирусологии. 2012. Т. 57, № 2. С. 23-27. 22. Попов А.М., Кривошапко О.Н., Артюков А.А. Механизмы протективной фармакологической активности флавоноидов // Биофармацевтический ж. 2012. Т. 4, № 4. С. 27-41. 23. Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н., Штода Ю.П., Глазунов В.П., Козловская Э.П. Полифункциональные фармакологические свойства пептидов коллагена из морских иглокожих // Биофармацевтический ж. 2012. № 5. 24. Цыбульский А.В., Артюков А.А., Попов А.М., Кривошапко О.Н. Оценка органных, гематологических и биохимических проявлений токсичности высоких доз эхинохрома А - 1,4-нафтохинонового препарата, полученного из морского ежа Scaphechinus mirabilis // Токсикологический вестник. 2012. № 5. -26- Кривошапко Ольга Николаевна Экспериментальные исследования биологической активности различных соединений из морских гидробионтов Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 17.11.12 г. Формат 60х84/16. Тираж 100 экз. усл. печ. л. 1.0. Заказ № 16998 Отпечатано в печатном салоне «Оперативная полография» ИП Матусевич Ю.И. 690013, г. Владивосток, ул. Трамвайная 14Б., тел. (242)2694987
