ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

УДК 636.22/.28.082.4
ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПУТЕМ
ДОЗРЕВАНИЯ И ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ООЦИТОВ IN VITRO
В.Н.Cтолярова (ВНИИ физиологии,биохимии и питания с.-х.
животных),
А.А.
Леонтьев
(Великолукская
государственная
сельскохозяйственная академия)
Получение большого числа зигот и ранних эмбрионов крупного
рогатого скота путем дозревания и оплодотворения ооцитов in vitro
крайне важно для создания обширного банка эмбрионов и проведения
работ по клеточной и генной инженерии,в частности для пересадки ядер
и генов, а также для получения стволовых клеток в терапевтических
целях.
Несмотря на то, что созревание и оплодотворение ооцитов in vitro
стало рутинным, низкая эффективность развития эмбрионов крупного
рогатого скота in vitro обусловливает необходимость глубокого изучения
и дальнейшего совершенствования всех этапов данной технологии.
В настоящее время для культивирования эмбрионов крупного
рогатого скота в разных лабораториях за рубежом широко используют
такие среды,как KSOM,CR1 и SOF с изучением экспрессии генов при
развитии эмбрионов от зиготы до стадии бластоцисты ( Sagirkaya H. et
al., 2006) . Оказывается, экспрессия эмбриональных генов может
изменяться в зависимости от культуральных условий . Такого рода
исследования направлены на оптимизацию культуральных сред,
способных снизить смертность эмбрионов, особенно на поздних
стадиях, - предимплантации и утробного развития .
Многие компоненты,входящие в состав культуральных сред на
разных этапах развития эмбрионов от зиготы до стадии бластоцисты,
ведут себя по-разному и могут оказывать как стимулирующее, так и
ингибирующее действие в зависимости от времени их введения на
начальном этапе развития (дроблении), стадии 8-16 клеток, морулы,
бластоцисты, то есть у эмбрионов крупного рогатого скота потребность в
питательных веществах меняется в зависимости от периода развития.
Целью настоящих исследований являлось создание эффективной
системы получения эмбрионов крупного рогатого скота путем
созревания, оплодотворения ооцитов и развития эмбрионов in vitro.
В задачи исследований входило:
1. Получение созревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в
среде с гормонами и эстральной сыворотки.
2. Получение подвижной фракции сперматозоидов методом
всплывания ( Swim-up).
3. Проведение капацитации сперматозоидов in vitro с помощью
длительного воздействия на них гепарина.
4.Проведение оплодотворения созревших in vitro ооцитов крупного
рогатого скота в среде со сперматозоидами и наличием одного
компонента гепарина.
5.Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота in vitro в
культуральной среде KSOM.
Материалы и методы исследований.
Яичники коров получали на мясокомбинате и доставляли в
лабораторию в фосфатном буфере Дюльбекко или в 0,9 %-ном растворе
NaCl при t=+28-35 .
Ооциты выделяли из антральных фолликулов размером 2- 8 мм
методом рассечения поверхности яичника лезвием. Для отмывания
ооцитов использовали раствор Дюльбекко с 5 % фетальной сыворотки с
добавлением антибиотика-гентамицина в концентрации 40 мкг / мл.
Для экспериментов отбирали ооциты средней величины с
мелкозернистой ооплазмой,окруженные компактным многослойным
кумулюсом.
Для дозревания ооцитов использовали среду 199 (Medium
199,Hepes modification with Earle salt,25mM Hepes-Sigma) с добавлением
10 % эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота ( ЭСК); 0,66
mM Na- пирувата; 1.0 ЕД / мл гонадотропина хорионического; 10 ME/мл
фоллигона( Intervet Boxmeer - Holland) ; 1,0мкг / мл эстрадиола 17
(спиртовой раствор) и 40 мкг / мл гентамицина.
Ооциты помещали в среду созревания в микрокапли объемом 50
мкл под минеральным маслом (“Sigma”, США ) и культивировали в
течение 20-24 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере 5 % CO2 в
воздухе.
Получение подвижной фракции сперматозоидов проводили
методом всплывания ( Swim-up) по методу Parrish I. et al. (1986).
Визуальная оценка показала,что большая часть сперматозоидов
остается в осадке (нижний слой в пробирке),меньшая часть всплывает
.Инкубации в течение 1 часа было достаточно для того,чтобы
подвижные сперматозоиды могли подняться в верхний слой среды SPTALP, оставив на дне пробирки мертвые сперматозоиды.
Капацитация
подвижных
сперматозоидов проходила под
длительным
воздействием гепарина
(в
течение
4 часов)
в
концентрации 20 мкг/мл при температуре 38,5-39 с 5 % CO2 в воздухе.
Все
подвижные
сперматозоиды
,полученные
после
размораживания 2 гранул ,обработанные Swim-up - методом и
прошедшие капацитацию гепарином, в объеме 250мкл SP-TALP
распределялись по 20-30 мкл в капли Fert-TALP объемом 50 мкл при
конечной концентрации 1х10-6 подвижных сперматозоидов / мл.Число
ооцитов в капле варьировало в пределах 5-10.
Предварительно ооциты крупного рогатого скота,прошедшие
созревание in vitro в течение 20-24 часов и имеющие расширенный
кумулюс, освобождали частично от клеток кумулюса с помощью 0,1 %ного раствора гиалуронидазы ( Sigma) при мягком пипетировании.Затем
ооциты отмывали от примесей гиалуронидазы в нескольких каплях (5-6)
раствора TL-Hepes. В качестве среды оплодотворения использовали
Fert-TALP, дополненную 10 мкг / мл гепарина. Оплодотворение ооцитов
проходило в течение 18 часов после введения капацитированных
сперматозоидов в капли среды для оплодотворения.Оплодотворенные
ооциты определяли по дроблению от 2 - до 4- 8-клеточной стадии через
48 часов после контакта сперматозоидов с ооцитами.
Развитие эмбрионов крупного рогатого скота.
Для развития эмбрионов крупного рогатого скота была
использована культуральная среда KSOM (potassium simplex optimization
medium)- синтетическая среда, аналогичная по минеральному составу
яйцеводной
жидкости
мышей
(Lawitts
J,Biggers
J.,
1993).
Культивирование предположительно зигот крупного рогатого скота,
полученных путем созревания и оплодотворения ооцитов in vitro ,
проводили в простой солевой среде KSOM c постоянным присутствием
заменимых и незаменимых аминокислот на протяжении всего периода
культивирования.Однако доза вводимых аминокислот, заменимых и
незаменимых, была уменьшена и колебалась в пределах ½ от
стандартной концентрации ( 1% x 100 раствора заменимых аминокислот
по рецептуре среды MEM и x 50 раствора незаменимых аминокислот по
рецептуре среды BME). Культивирование эмбрионов проводили в
микрокаплях объемом 20 µ l ( 20 эмбрионов на 1 каплю ) под слоем
минерального масла (« Sigma » , США) при температуре 38,5º С в
увлажненной атмосфере под газовой фазой (по 5% CO2 и O 2 и 90 %
N2) в течение 7-8 суток.
В культуральной среде KSOM aa на протяжении всего периода
культивирования присутствовал глютамин в количестве 1 mM и BSA в
концентрации 1мг / мл.
Несмотря на минимальное количество глюкозы (0,2mM) в
стандартной среде KSOM , в предлагаемой нами системе
культивирования глюкоза отсутствовала в течение 4 суток, и только на 5
сутки вводили 1,5 mM глюкозы, данная концентрация глюкозы
сохранялась на протяжении последующих суток культивирования.
Через 2 суток культивирования к эмбрионам, находящимся на
стадии 4-8 клеток, добавляли 10%-ную фетальную сыворотку.
Существуют противоречивые мнения о целесообразности
включения глюкозы в питательные среды для культивирования
эмбрионов крупного рогатого скота. По данным некоторых
исследователей (Ellington J.E., 1990), глюкоза на ранних стадиях
развития эмбрионов оказывает ингибирующее действие и стимулирует
развитие эмбрионов на более поздних стадиях- от морулы до
бластоцисты.
Таблица. - Развитие эмбрионов крупного рогатого скота в среде
RSOMaa
Эксперимент
Всего
Ооцитов,
Дробилось
(через 2 суток )
Развилось до стадии
n
2кл.n%
Морулы /
Бластоцисты
n%
от 4-8кл.
8-16кл
n%
от 4-8кл
4.-8кл.
n%
1
58
13
22,4
32
55,1% 2 1
65 ,6
11
34,3
2
65
15
23
26
40
20
76,9
15
57,6
3
87
19
21,8
42
48,2
30
71,4
22
52,3
Всего
210
47
22.3
10 0
47,6
71
71
48
48
Эффективность оплодотворения оценивали по количеству
продробившихся эмбрионов (через 2 суток),в экспериментах 1-3 она
составляла 77,5%, 63 и 70%, в среднем - 69,9%.
Для дальнейшего культивирования были отобраны только
эмбрионы, достигшие к этому времени стадии 4-8 клеток. Работать с 2 –
клеточными эмбрионами считали нецелесообразным, так как в
предварительных опытах нами была отмечена неспособность 2клеточных эмбрионов к дальнейшему развитию.
По данным Ulloa C.M. et al. (2008), эмбрионы крупного рогатого
скота, достигшие стадии 5-8 клеток через 2 суток культивирования, были
лучшего качества,имели больший потенциал развития до стадии
бластоцисты с большим количеством клеток и низким уровнем
хромосомных аномалий.
После дозревания и оплодотворения ооцитов крупного рогатого
скота in vitro на культивирование в среде KSOMaa- в 3 экспериментах
было
поставлено
всего
210
одноклеточных
эмбрионов,
предположительно, зигот, 100 дробились до 4-8 клеток с
эффективностью 47 ,6 %, до стадии 8-16 клеток развились 71%(71 /100)
эмбрионов и стадии компактной морулы / бластоцисты достигли 48% (48
/100) эмбрионов от дробившихся 4-8 - клеточных эмбрионов (таблица)
Сравнивая полученные нами данные по развитию эмбрионов крупного
рогатого скота in vitro с данными других исследователей ( Sagirkaya H. et
al., 2006), можно отметить,что не существует больших различий в
эффективности созревания,оплодотворения ооцитов in vitro, а также
развития эмбрионов до стадии морулы-бластоцисты.