ВЛИЯНИЕ АНТИИНСУЛЬТНОГО СРЕДСТВА ЦЕРЕБРАЛА НА

Актуальні проблеми сучасної медицини
УДК 61:577.1
Васильева И.Г, Олексенко Н.А., Пусь А.С., Макаренко А. Н.
ВЛИЯНИЕ АНТИИНСУЛЬТНОГО СРЕДСТВА ЦЕРЕБРАЛА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ
И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЮ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА
1. ГУ “Институт нейрохирургии НАМНУ им. акад. А.П.Рамаданова”
2. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко
Проведены исследования влияния антиинсультного средства Церебрал на мезенхемальные стволовые клетки (МСК), полученные из тканей костного мозга человека. Установлено, что молекулы,
входящие в состав средства Церебрал, достоверно влияют на процессы пролиферации и дифференциации клеточной линии МСК костного мозга. Обнаружено увеличение клеточных популяций и
направленный клеточный рост стволовых клеток костного мозга. Под действием Церебрала содержание CD 105+ клеток увеличилось в 40 раз, при этом они составляли 87% клеточной популяции. Плотность сформированного монослоя была меньше, но при этом он был структурированным – отростки клеток имели направленный рост, формируя сетевую структуру.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки (МСК), костный мозг, церебрал.
Введение
В настоящее время костный мозг является
общепризнанным источником получения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток
(МСК), выделение и количественное наращивание которых в условиях использования культуральных технологий является перспективным
современным направлением регенеративной
медицины. Кроме того, культура МСК может
быть использована в качестве тестовой и экспресс систем для оценки влияния тех или иных
веществ, известных и потенциальных лекарственных препаратов на процессы клеточной
трансформации и регенерации в организме.
Обьект и методы исследования
Эксперименты выполнялись на клеточном
материале, полученном из тканей костного мозга взрослых пациентов (больных) во время
выполнения плановой операции (по поводу
травмы кисти) в Институте травматологии и ортопедии АМН Украины (01601, ул. Воровского,
27) города Киева. Донорами клеточного материала стали пациенты в возрасте 45 и 57лет.
Выделение и культивирование МСК костного
мозга: 20-25 мл аспирата костного мозга отбирали в стерильных условиях в контейнер путем
пункции под местной анестезией (0,5% р-ра
бупивокаин Украина). Затем аспират смешивали
с 2 объемами раствора Хэнкса (РАА, Австрия) и
центрифугировали при 900g на протяжении 10
мин ( ОПН-8, Россия) [1,3,5].
Осадок разделяли в градиенте плотности
(1,073 г/мл) перколла (Sigma, Германия), клеточная плотность – 1-2 х 107 кл/мл. После этого
градиент центрифугировали 30 мин. Осажденные при 900g мононуклеарные клетки ресуспендировали в растворе Хэнкса и центрифугировали 10 мин при 460g [2,6,7].
Полученный клеточный осадок ресуспендировали в среде Игла в модификации Дульбекко
с низким содержанием глюкозы (РАА, Австрия),
обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой (РАА, Австрия) до концентрации 1 х 106 в
чашке Петри диаметром 100мм.. Полученную
Том 13, Випуск 2(42)
суспензию помещали в инкубатор при 37ºС, с
содержанием СО2 – 5%.
Через 24 ч в отбирали надосадок, а адгезированную фракцию клеток оставляли для дальнейшего культивирования. В опытные образцы
добавляли 0,2% раствор Церебрала. Культивирование проводили на протяжении 14 суток с
периодической заменой питательной среды каждіе 3-4 суток.
Иммуногистохимическое выявление СD 105+
клеток: По окончании культивирования культуральные образцы фиксировали в 4% растовре
параформальдегида (Sigma, Германия) при 4
ºС. Использовались первичные мышиные антитела к CD 105+ человека (Dako, Дания) в разведении 1:20. Визуализацию связывания проводили с помощью реактивов системы HRP/DAB Detection System (Dako, Дания).
Подсчет количества СD 105+ клеток проводился на каждом образце в 10 полях зрения в
световом микроскопе СМ – 15 (ЛОМО, Россия).
Оценка жизнеспособности клеточной популяции: перед посадкой оценка жизнеспособности клеточной популяции проводилась путем
подсчета содержания мертвых клеток в клеточной суспензии после окрашивания 0,2% раствором трипанового синего. К посадке и последующим исследованиямдопускались образцы с содержанием живых клеток не менее 70%.
Cтатистическая обработка полученных данных: количество СD 105+ клеток в образце получали, подсчитывая среднее значение и среднеквадратическое отклонение данных, собранных
в 10 полях зрения. Наличие статистически достоверной разницы устанавливали с помощью
критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
В исходном состоянии клеточная суспензия
костного мозга обоих пациентов содержала
очень высокий процент жизнеспособных клеток
(90-96%), которые активно росли и делились в
условиях in vitro, образуя монослой или более
плотные клеточные структуры.
Наши данные показали, что рост численности клеточной популяции стал результатом раз-
183
ВІСНИК ВДНЗУ «Українська медична стоматологічна академія»
множения МСК (Рис. 1, 2). В частности установлено, что численность СD105+ клеток возросла в
контрольных образцах соответственно в 120
(Таблица 1) и в 43 раза (Таблица 2).
На 14 сутки конфлюэнтность достигала 80-
90% (Рис. 1, 2). На этой стадии культуральные
образцы были зафиксированы для количественной оценки содержания МСК костного мозга.
Таблица 1.
Содержание МСК костного мозга в культуре (пациент А., 57 лет).
Группа
Контроль (исходный материал)
Контроль 14 суток
Церебрал 0,2% 14 суток
Содержание СD105+ клеток (в поле зрения)
6,7 ± 3,8
18%
810,0 ± 21,80*
81%
272,0 ± 13,00*
87%
Р< 0,05
Таблица 2.
Содержание МСК костного мозга в культуре (пациент С., 45 лет).
Группа
Контроль (исходный материал)
Контроль 14 суток
Церебрал 0,2% 14 суток
Содержание СD105+ клеток (в поле зрения)
20,8 ± 2,22
33%
912,5 ± 17,73*
92%
876,0 ± 18,18*
88%
* Р< 0,05
Рис. 1 СD105+ клетки костного мозга.
Контроль 1 сутки в культуре. Об. 20х10.
Рис. 2 СD105+ клетки костного мозга.
Контроль 14 сутки в культуре. Об. 20х10.
Рис. 3 СD105+ клетки костного мозга.
14 сутки в культуре.
С использованием 0.2% раствора Церебрал. Об. 20х10.
Рис. 4 СD105+ клетки костного мозга.
14 сутки в культуре. 10% церебрал. Об. 40х10.
184
Актуальні проблеми сучасної медицини
установлена во время экспериментов in vitro на
Заключение
клетках PC – 12 [4,8].
Полученные нами результаты свидетельЛитература
ствуют, что структура МСК монослоя была рав1.
Gerson S.L. Hematopoietic recovery after coinfusion of
номерной. Клетки небольшого размера, округautologous blood stem cells and culture-expanded marrow MSC
лой формы без отростков. Эти данные свидеin advanced breast cancer patients receiving high-dose
chemotherapy / S.L.Gerson, C B.W.ooper [et al.] // J. Clin.
тельствуют о преобладании пролиферативных
Oncol. – 2000. - V. 18. – № 2. – P. 307-316.
процессов в культивируемых клетках. За период
2.
Мусина Р.А. Сравнительная характеристика мезенхималькультивирования численность СD105+ клеток
ных стволовых клеток, полученных из разных тканей человека / Р.А.Мусина, Е.С.Бекчанова, Г.Т. Сухих // Клеточные
резко выросла в контрольных образцах, их протехнологии в биологии и медицине. – 2005. – № 2. – С. 89центное содержание в клеточной популяции
95.
3.
Матийцив Н.П. Влияние церебрала и митохондрина2 на жиувеличилось с 18 до 81%.
знеспособность и динамику развития дегенеративных
Под воздействием молекул средства Цереизменений в ткани мозга мутантов Drozophila metanogaster /
+
Н.П.Матийцив,
Я.И.Черник // Биофармацевтический журнал.
брал содержание СD105 клеток увеличилось в
– 2012. – Т. 4. – № 4. – С. 54-56.
40 раз, при этом они составили в среднем 87%
4.
Погорелая Н.Х. Влияние церебрала, верапамила и их комрастущей общей клеточной популяции. Плотбинаций на морфологическую дифференцировку клеток феохромоцитомы крыс / Н.Х.Погорелая, С.И.Савосько, Д.А. Ваность сформированного монослоя была меньсиленко // Нейрофизиология. – 2011. – Т. 43. - № 2. – С. 18ше, однако при этом он был структурирован –
28.
5.
Gu Weidong Bone mesenchymal stromal cells stimulate neurite
отростки клеток имели направленный рост, обoutgrowth of spinal neurons by secreting neurotrophic factors /
разующий ячеистую структуру, сетевую упоряGu Weidong // Neurological Research. – 2012. – V. 34, № 2. –
P. 172 – 180.
доченную мультиклеточную систему. Следует
6.
Jessian L. Munoz Feline bone marrow-derived mesenchymal
подчеркнуть, что растущие в культуре клетки
stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with
regards to neuronal differentiation as human MSCs / Jessian L.
имели большое количество отростков и по морMunoz, Steven J. Greco,// Differentiation. – 2012. – V. 84, №2. –
фологическим признакам напоминали созреваP. 214 – 222.
ющие и сформированные мезенхимальные
7.
Зубов Д.А. Цитокиновая регуляция репаративной регенерации костной ткани культивированными мезенхимальными
клетки. Таким образом, Церебрал оказывает
стволовыми клетками / Д.А.Зубов, В.М.Оксимец // Травма. –
выраженное влияние на рост и развитие мезен2008. – Т. 9, № 2 – С. 145 – 153.
8.
Зинькова Н.Н. Терапия ишемического инсульта головного
химальных клеток костного мозга, которое сомозга у крыс с помощью мезенхимных стволовых клеток /
стоит в существенном превалировании клеточН.Н. Зинькова, Е.Г. Гитлерович, И.Б. Соколова [и др.] // Цитология. – 2007. – Т. 49, № 7. - С. 566 – 575.
ной дифференциации над пролиферативными
процессами. Ранее эта закономерность была
Реферат
ВПЛИВ АНТИІНСУЛЬТНОГО ПРЕПАРАТА ЦЕРЕБРАЛ НА ПРОЛІФЕРАЦІЮ І ДИФЕРЕНЦІАЦІЮ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ
СТОВБУРОВИХ КЛІТИН КІСТКОВОГО МОЗКУ
Васильєва І.Г., Олексенко Н. О, Пусь А.С. , Макаренко О. М.
Ключові слова: мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), кістковий мозок, Церебрал.
Проведені дослідження впливу антиінсультного препарату Церебрал на мезенхімальні стовбурові
клітини (МСК), отримані із тканин кісткового мозку людини. Встановлено, що молекули, які входять до
складу препарату Церебрал, достовірно впливають на процеси проліферації і диференціації клітинної
лінії МСК кісткового мозку. Виявлено збільшення клітинних популяцій і направлений клітинний ріст
стовбурових клітин кісткового мозку. Під дією Церебралу вміст CD 105+ клітин збільшився в 40 разів,
при цьому вони становили 87% клітинної популяції. Щільність сформованого моношару була менша,
але при цьому він був структурований – відростки клітин мали направлений ріст, утворюючи лункоподібну структуру.
Summary
EFFECT OF ANTI-STROKE MEDICINE “CEREBRAL” ON PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF MESENCHYMAL CELLS
OF BONE MARROW
Vasylieva I., Oleksenko N., Pus’ A., Makarenko A.
Key words: mesenchymal stem cells (MSC), bone marrow, Cerebral.
This paper focuses on the studies of the impact produced by anti-stroke medicine “Cerebral” on mesenchymal cells taken from human bone marrow. It has been found that molecules of Cerebral definitely have an
impact on processes of proliferation and differentiation of cell line of mesenchymal stem cells (MSC) in human bone marrow. It results in the increase of this cell population and directed stem cell growth. Under the
cerebral influence CD105+ cells content has increased in 40 times, and they compose 87% of cell population.
The density of new-formed monolayer is less, but structured as the cell processes have directed growth
forming the socket-like structure.
Том 13, Випуск 2(42)
185