Разработка эффективных систем для интеграции целевых генов

Разработка эффективных систем интеграции целевых генов в хромосому E. сoli
Мечев П.В. 1,2, Шульга А.А. 2
Московский физико-технический институт
2
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Pavelmt@yandex.ru
1
При разработке экспрессионных систем в биотехнологии обычно
предпочитают интегрировать целевой ген в состав хромосомной ДНК. В последнее
время процедура введения ДНК в хромосому E. сoli значительно упростилась за
счет разработки метода гомологичной рекомбинации, обеспечиваемой белками Red
локуса бактериофага λ . Данный метод рекомбиниринга имеет широкие области
применения в генной инженерии, позволяя проводить различные манипуляции на
бактериальной ДНК in vivo [1]. C его помощью можно осуществлять «нокаут» гена;
вставлять нуклеотидные последовательности в хромосомную ДНК, плазмидные
вектора или искусственные хромосомы бактерий (ВАС); проводить сайтнаправленный мутагенез и многое другое.
Необходимым условием рекомбиниринга является наличие белков Red
оперона фага ламбда в бактериальной клетке. В нашей лаборатории была собрана
экспрессионная конструкция на основе плазмидного вектора pTrc99A, содержащая
гены белков Exo, Beta и Gam, находящихся под контролем строго регулируемого trc
промотора. Наиболее простым и удобным способом детектирования присутствия
вставки в хромосоме является клонирование кассеты, содержащей ген устойчивости
к антибиотику. Для встраивания в хромосому нами был выбран ген устойчивости к
канамицину (Kan). В качестве хромосомного сайта, используемого для встраивания
чужеродного гена, взяли ген OmpF, который кодирует белок порин (36 кДа),
находящийся во внешней мембране E. coli. Для увеличения эффективности
рекомбинации [2], встраиваемый ген был фланкирован гомологичными хромосоме
участками, размером около 1000 нуклеотидных пар. Наши первые эксперименты по
интеграции фрагмента в хромосомную ДНК показали невысокую эффективность
процесса рекомбиниринга. Поэтому с помощью реакции ПЦР были изменены
последовательности ДНК, кодирующие белки Red оперона бактериофага λ [3]. В
новой системе количество клонов, содержащих рекомбинантную хромосомную
ДНК, оказалось значительно больше. Таким образом была разработана
высокоэффективная система для интеграции целевых генов в хромосому E. coli.
На данный момент в нашей лаборатории ведутся эксперименты по изучению
уровня экспрессии генов, находящихся в составе хромосомной ДНК бактерии.
1.
2.
3.
Литература
D.Court, J.Sawitzke, L.Thomason: Genetic Engineering Using Homologous
Recombination. Annu.Rev.Genet. (2002) 36:361-88.
D.Yu, H.Ellis, E.Lee, N.Jenkins, N.Copeland, D.Court: An efficient recombination
system for chromosome engineering in Escherichia coli. PNAS. (2000) 97:59785983.
M.Nakayama, O.Ohara: Improvement of recombination efficiency by mutation of
Red proteins. BioTechniques. (2005) 38:917-924.