На правах рукописи ГУЩАНСКАЯ Екатерина Сергеевна
advertisement
На правах рукописи ГУЩАНСКАЯ Екатерина Сергеевна МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ТРЕХМЕРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМА 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» и в группе пространственной организации генома в лаборатории Структурно-функциональной организации хромосом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена РАН. Научные руководители: член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Разин Сергей Владимирович кандидат биологических наук Гаврилов Алексей Александрович Официальные оппоненты: Карпов Вадим Львович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Молекулярной Биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук, заведующий лабораторией структуры и функции хроматина. Лагарькова Мария Андреевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Общей Генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, заведующая лабораторией генетических основ клеточных технологий. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук. Защита диссертации состоится 20 декабря 2013 года в ___ часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр.12, биологический факультет, ауд. 389. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций). Автореферат разослан ___ ноября 2013г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А.Крашенинников ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В последнее время появляется все больше наблюдений, свидетельствующих о тесной связи между пространственной организацией генома и его функционированием (Holwerda et al., 2012; de Wit et al., 2012; Palstra et al., 2009). Многочисленные цитологические (FISH) и биохимические (3C-методы) исследования позволили продемонстрировать, что для регуляции транскрипции важным является взаимное расположение генов и их регуляторных последовательностей внутри клеточного ядра. Так, модель активаторного хроматинового блока постулирует, что пространственное сближение удаленных регуляторных элементов с регулируемыми тканеспецифичными генами обеспечивает активацию экспрессии этих генов (de Laat et al., 2003). Результаты, на основании которых была предложена данная модель, были получены с использованием метода 3С при изучении α- и β-глобиновых генов позвоночных. Однако демонстрация пространственной сближенности удаленных элементов генома не решает вопроса о механизмах, которые обеспечивают это сближение. Наиболее популярное объяснение заключается в том, что удаленные регуляторные элементы генома удерживаются в составе единого комплекса посредством взаимодействий связанных с этими регуляторными элементами белков (модель активаторного хроматинового блока). Однако в настоящее время отсутствуют прямые доказательства данной гипотезы. Недостаточно изученными являются не только механизмы поддержания взаимодействий удаленных областей генома, но и собственно принципы функционально-зависимой пространственной организации протяженных протяженных областей генома. В последнее время значительную роль в установлении и поддержании трехмерной организации интерфазного генома приписывают так называемым «транскрипционным фабрикам» структурам, в которых концентрируются молекулы РНК-полимеразы и факторы транскрипции, и транскрипции. В куда привлекаются известном различные смысле, гены для транскрипционная осуществления фабрика может рассматриваться и как активаторный хроматиновый блок, так как в ее составе присутствуют промоторы и регуляторные элементы ряда генов (Osborne et al., 2004; Faro-Trindade et al., 2006; Carter et al., 2008). Несмотря на огромный интерес к проблеме, работ, количество экспериментальных 1 посвященных изучению транскрипционных фабрик, остается довольно ограниченным, и результаты этих работ нередко противоречат друг другу. Так как число транскрибирующихся генов существенно превышает число транскрипционных фабрик (Martin et al., 2004), то очевидным представляется то, что в составе одной транскрипционной фабрики должны присутствовать транскрибирующихся разные генов гены. между Случайно индивидуальными ли распределение транскрипционными фабриками? Некоторыми авторами было показано, что функционально связанные гены преимущественно привлекаются в общие транскрипционные фабрики. (Schoenfelder et al., 2010). Но существуют примеры транскрипционных фабрик, которые содержат как тканеспецифичные гены, так и гены домашнего хозяйства (Osborne et al., 2007; Philonenko et al., 2009; Zhao et al., 2006). В связи с этим интересно узнать, какова роль генов домашнего хозяйства в организации транскрипционных фабрик, ведь число генов домашнего хозяйства заметно превышает количество тканеспецифичных генов в любом типе клеток. Все вышесказанное определяет актуальность темы настоящей диссертационной работы, которая посвящена изучению закономерностей взаимного позиционирования удаленных элементов генома в клеточном ядре, а также механизмов опосредующих взаимодействия между этими элементами. Цели и задачи исследования Основными целями работы были выяснение роли генов домашнего хозяйства в трехмерной организации интерфазных хромосом и характеристика механизмов обеспечивающих удержание удаленных элементов генома в составе активаторного хроматинового блока. Для реализации этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи: - изучить спектр полногеномных взаимодействий гена домашнего хозяйства NPRL3 с использованием методики 4С - выяснить, насколько стабильными являются активаторные хроматиновые блоки вне хромосомного контекста. 2 Научная новизна и практическое значение работы В работе впервые продемонстрировано, что для осуществления лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК в процедуре 3С существенно сохранение ядерной локализации хромосомного домена. На основании этих результатов предложена новая модель активаторного хроматинового блока, постулирующая важную роль способа упаковки большого хромосомного домена в обеспечении сближения различных групп регуляторных элементов. В рамках данной модели активаторный хроматиновый блок рассматривается как хроматиновый домен или ядерный компартмент, пространственная структура которого поддерживается не только и не столько прямым взаимодействием между регуляторными элементами и промоторами транскрибируемых генов, но и всем способом упаковки хроматиновой фибриллы, трехмерная организация которой может стабилизироваться белками, не связанными непосредственно с регуляторными элементами генома, составляющими активаторный хроматиновый блок. Предложенная модель объясняет короткоживущие альтернативные взаимодействия регуляторных элементов с промоторами разных генов, которые входят в состав одного хроматинового блока. В работе было показано, что ассоциация CpG-островков, маркирующих промоторы генов домашнего хозяйства, является важной детерминантой в пространственной организации интерфазных хромосом. С функциональной точки зрения, кластеризация CpG-островков вносит существенный вклад в пространственную организацию как транскрипции, так и репликации эукариотической ДНК. В работе было показано, что ассоциация CpG-островков поддерживается такими факторами как Sp1 и CTCF. Кроме того, результаты работы позволяют утверждать, что активные и неактивные области генома пространственно разделены в интерфазном ядре. В целом, результаты работы вносят существенный вклад в современные представления о принципах пространственной организации генома и механизмах, поддерживающих эту организацию, а также позволяют внести поправки в интерпретацию данных, полученных методом 3С. 3 Апробация работы Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях и симпозиумах: FEBS Congress «Mechanisms in biology» (Санкт-Петербург, 2013), 23th Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus (Венгрия, 2013), Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology «Genomic Instability and DNA Repair» (Канада, 2013), XVIth Gliwice Scientific Meetings (Польша, 2012), международная конференция «Хромосома 2012» (Новосибирск, 2012), «Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies» of Transregional Collaborative Research Centre (Германия, 2011). Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них статей в рецензируемых научных изданиях – 3, материалов конференций – 7. Структура и объем работы Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 28 рисунков, 5 таблиц и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Постановка задачи и методические подходы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы» (165 цитированных работ). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Основные принципы метода 4С, планирование эксперимента и анализ данных. Одной из задач нашей работы было определение роли генов домашнего хозяйства и тканеспецифичных генов в организации транскрипционных фабрик. С этой целью был проведен анализ полного спектра пространственных взаимодействий гена домашнего хозяйства NPRL3 (Kowalczyk et al., 2012) с другими элементами генома в лимфоидных и эритроидных клетках кур. Для решения задачи был выбран метод 4С («Chromosome conformation capture-on chip») – полногеномный подход, который позволяет идентифицировать весь спектр последовательностей, которые могут контактировать (находиться в составе общего функционального комплекса) с изучаемой последовательностью ДНК, и установить соотносительные частоты 4 ассоциаций между изучаемой последовательностью ДНК и каждым из партнеров (Zhou et al., 2006). Метод базируется на процедуре 3С («Chromosome conformation capture»), которая основана на фиксации ДНК-белковых комплексов формальдегидом in vivo с последующим расщеплением ДНК эндонуклеазами рестрикции (в нашем случае была выбрана рестриктаза HindIII) и религированием полученных фрагментов при низкой концентрации ДНК. Секвенирование продуктов лигирования позволяет оценить пространственные взаимодействия фрагментов в масштабе всего генома. Мы охарактеризовали спектр пространственных взаимодействий фрагмента ДНК, который содержит гены домашнего хозяйства, лежащие в непосредственной близости от α - глобинового домена. В качестве изучаемого был выбран фрагмент, содержащий CpG-островок, включающий промотор гена NPRL3, который находится на расстоянии 4 т.п.н. перед кластером α-глобиновых генов (Flint et al., 2001; Klochkov et al., 2006). В этом же CpG островке находится участок начала репликации (Razin et al., 1986; Verbovaia et al., 1995). В эритроидных куриных клетках данный CpG островок является частью активаторного хроматинового блока, сборка которого осуществляется в процессе активации экспрессии α-глобиновых генов (Gavrilov et al., 2008). В этой связи данная область является хорошей моделью для изучения сборки транскрипционной фабрики, которая может включать как гены домашнего хозяйства, так и тканеспецифичные гены. Эксперименты проводили на эритроидных (HD3) и лимфоидных (DT40) клетках кур. Для каждой клеточной линии проводили два независимых эксперимента. 4С библиотеки анализировали с помощью массивного параллельного секвенирования (108 прочтений на один эксперимент, длина прочтения с одного конца фрагмента через HindIII- сайт составляла 100 нуклеотидов). Полученные прочтения картировали на куриный геном (сборка galGal4) на концы HindIII-фрагментов. Дальнейший анализ проводили как описано (Tolhuis et al., 2011). Кластеры взаимодействующих фрагментов определяли с помощью скользящего окна (окно размером 100 п.н.), что позволило улучшить соотношение сигнал/шум. На рисунке 1 показано распределение картированных фрагментов вдоль 14 хромосомы и p-значение для каждой геномной позиции. Статистически значимые взаимодействия фрагментов показаны на доменограмме красным и желтыми цветами. Распределение прочтений по хромосоме 14 демонстрирует наличие нескольких взаимодействующих областей. В эритроидных 5 клетках количество взаимодействующих кластеров больше, чем в лимфоидных, что свидетельствует о повышенной вероятности контактов этих частей хромосомы в пространстве. Рисунок 1. Распределение 4С-сигнала (для якорного фрагмента NPRL3), сайтов CTCF и CpG-островков на хромосоме 14. (А) Распределение 4C сигнала в пределах куриной хромосомы 14. Значки якорей и белые линии указывают местоположение якорных фрагментов. Прочтения картированы на концы HindIII–фрагментов (куриный геном сборки galGal4). (Б) P-значение для каждой геномной позиции на куриной хромосоме 14 рассчитанной с использованием окна размером 100 т.п.н., в котором значение сигнала максимально превышало фоновое значение. На оси Y изображен отрицательный десятичный логарифм (–log10) наиболее значимого pзначения для выбранного окна. (В) Доменограммы (Splinter et al., 2012). Уровень 4С сигнала в малом вариабельном окне (от 3 до 200 фрагментов) сравнивали с уровнем сигнала в большом окне постоянного размера (300 фрагментов). Достоверная разница отражена в градиенте цвета (желтый цвет отражает наиболее значимое превышение уровня сигнала над фоном, красный цвет – небольшое превышение, черный цвет – отсутствие превышения). На оси х обозначены геномные координаты, на оси y – размер малого вариабельного окна. (Г) Распределение сайтов CTCF на куриной хромосоме 14, полученное с помощью анализа данных ChIPseq. (Д) Распределение аннотированных CpG-островков на куриной хромосоме 14. Учитывая расположение изучаемого (якорного) фрагмента рядом с доменом αглобиновых генов, логичным (в рамках популярной модели специализированных транскрипционных фабрик) было бы предположение о том, что в эритроидных клетках данный фрагмент предпочтительно взаимодействует с участками хромосомы, содержащими другие эритроидные гены. Однако последующий анализ не подтвердил данного предположения. Стоит подчеркнуть, что распределение 4С сигнала сходно в двух биологических репликах (коэффицент Пирсона для HD3=0.9784944, DT40 6 =0.8778614). Поэтому в дальнейшем мы анализировали сумму прочтений, полученных в двух параллельных экспериментах. Интересно отметить, что распределение аннотированных CpG-островков и сайтов CTCF, полученное картированием данных ChIPseq анализа на хромосому 14, демонстрирует определенное сходство с распределением взаимодействующих областей (4С сигнала) (Рис. 1, Г, Д), что было более аккуратно подтверждено последующим анализом. 2. Взаимодействующие фрагменты демонстрируют корреляцию с функционально значимыми мотивами генома. Кластеризация CpG-островков играет важную роль в трехмерной организации интерфазных хромосом. Мы проанализировали корреляции между взаимодействующими ДНК фрагментами и различными функционально значимыми мотивами, такими как CpG-островки, Gквадруплексы, сайты связывания общих и тканеспецифичных факторов транскрипции. Наиболее значительные корреляции были обнаружены между 4С сигналом и плотностью СpG-островков (Рис. 2, А). Примечательно, что подобного рода корреляция наблюдалась как в лимфоидной, так и в эритроидной клеточных линиях. Принимая во внимание тот факт, что изучаемый фрагмент содержал CpG островок, маркирующий промотор гена домашнего хозяйства NPRL3, мы заключили, что CpG островки, расположенные как на одной, так и на разных хромосомах, имеют тенденцию кластеризоваться в интерфазном ядре. Наши наблюдения подтверждаются также положительной корреляцией между интенсивностью 4С сигнала и плотностью сайтов связывания фактора транскрипции Sp1 и фактора CTCF (которые (сайты связывания) часто находятся в CpG островках, рис.2, Б, В). В то же время, для эритроид-специфичных факторов (Рис. 2, Е, Ж, З) такой корреляции не наблюдалось. Любопытно, что как для эритроидных, так и для лимфоидных клеток наблюдалась корреляция между 4С сигналом и наличием сайтов связывания лимфоидспецифичного фактора Pax5 (Рис. 3, Д). Этот факт можно объяснить тем, что положительные и отрицательные корреляции с 4С сигналом зависят от GC состава консенсусных последовательностей сайтов связывания различных транскрипционных факторов. Поэтому можно сделать заключение, что 4С сигнал коррелирует, прежде всего, с кластеризованными CpG-островками. 7 Рисунок 2. Корреляция интенсивности 4С сигнала с плотностью различных функционально значимых мотивов. На оси у представлена интенсивность 4С сигнала, ось х отображает плотность CpGостровков и предсказанных участков связывания: общего транскрипционного фактора Sp1, фактора CTCF, лимфоидспецифичного фактора Pax5, эритроидспецифичных факторов EKLF, GATA1, MAF, G-квадруплексов. Каждая точка соответствует неперекрывающемуся интервалу размером 100 т.п.н. Точки, в которых 4С сигнал был выше, чем 2000 прочтений/интервал (для хромосомы 14 больше, чем 10000 прочтений/интервал), были исключены из анализа. Бокс-плоты содержат точки, собранные в пять групп в соответствии с их позицией по оси x. 8 Интересный результат был получен при анализе колокализации 4С сигнала с областями генома, содержащими последовательности, способные образовывать так называемые G-квадруплексы (использовали консенсусную последовательность из работы (Huppert et al., 2007) (Рис. 3, И). Была зарегистрирована положительная корреляция между 4С сигналом и мотивами G-квадруплексов. Известно, что Gквадруплексы представляют собой участки ДНК, обогащенные гуанином, которые образуют особые пространственные структуры и участвуют в регуляции транскрипции и репликации (Bochman et al., 2012). Положительная корреляция областей, обогащенных G-квадруплексами, с интенсивностью 4С-сигнала полностью согласуется с картиной взаимодействия CpG-островков, маркирующих регуляторные области генов домашнего хозяйства и наиболее активные ранние участки начала репликации. 3. Активные и неактивные хроматиновые домены разделены в пространстве. Для того, чтобы подтвердить наблюдения, полученные в экспериментах с якорным фрагментом, локализованным на промоторе гена NPRL3, мы провели несколько дополнительных 4С-экспериментов. Для трех экспериментов выбрали якорные фрагменты, которые содержали в своем составе CpG-островки генов домашнего хозяйства TSR3, TRAP1 и PPL и демонстрировали в основном эксперименте значительные взаимодействия с промотором гена NPRL3. Якорный фрагмент для четвертого эксперимента был выбран в области, не содержащей генов и не взаимодействующей с промотором гена NPRL3. Для исследования использовали эритроидные клетки HD3. Подготовка 4С образцов к секвенированию проводились в соответствии с описанным выше протоколом. При сравнении 4С результатов, полученных для якорных фрагментов, содержащих промоторы генов TSR3, TRAP1, PPL и NPRL3, мы убедились, что корреляции 4С сигнала с плотностью функционально значимых мотивов, прежде всего с плотностью CpG островков, сходны для всех четырех якорных фрагментов (Рис. 3). Результаты пермутационного анализа показывают, что, хотя GC-участков связывания вносит значительный вклад в наблюдаемые корреляции, правильные мотивы демонстрируют более высокий уровень корреляции с 4С сигналом (Рис. 3). 9 Рисунок 3. Корреляции 4С сигнала для эритроидных клеток с плотностью функционально значимых мотивов для разных якорных фрагментов. На карте интенсивности градиент цвета отражает степень корреляции: черный цвет – отсутствие корреляций, светло-зеленый – значительная положительная корреляции, светло – красный – значительная отрицательная корреляция. В качестве контроля колокализаций 4С сигнала с плотностью геномных элементов, исследовали также корреляции с теми же мотивами, в которых позиции нуклеотидов были перемешаны случайным образом. Важно отметить, что обсуждавшихся выше корреляций не наблюдалось в экспериментах с якорным фрагментом, лежащим в области, обедненной генами (Рис.3). Профиль дальних взаимодействий между регионами хромосомы 14 в этом случае был до известной степени противоположным профилю взаимодействий с другими якорными фрагментами (Рис. 4). Рисунок 4. Распределение 4С сигнала на хромосоме 14 для разных позиций якорных фрагментов. Прочтения картированы на концы HindIII–фрагментов. Профили распределения прочтений для якорных фрагментов, содержащих промоторы генов домашнего хозяйства (TSR3, NPRL3, TRAP1, PPL), сходны, в то время, как профиль распределения прочтений для якорного фрагмента в генной пустыне является противоположным. Значки якорей и белые линии указывают местоположение якорных фрагментов. Под профилями распределения 4С-сигнала показаны распределение сайтов CTCF на куриной хромосоме 14, полученное с помощью анализа данных ChIPseq и распределение аннотированных CpG-островков на куриной хромосоме 14. 10 4. Переосмысление процедуры 3С. В процессе работы мы столкнулись с некоторыми техническими особенностями процедуры 3С, исследование которых привело к переосмыслению результатов, полученных в первой части работы, а также позволило внести поправки в общепризнанную модель взаимодействия удаленных элементов генома (модель активаторного хроматинового блока). В процедуре 3С, стадия лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК (proximity ligation) является одной из решающих для получения специфических 3С– сигналов и их правильной трактовки. Принято считать, что лигируются преимущественно те фрагменты ДНК, которые при обработке клеток фомальдегидом оказываются сшиты белковыми мостиками. По логике процедуры, это как раз те фрагменты ДНК, которые контактируют в пространстве клеточного ядра. Другими словами – это те фрагменты, которые входят в состав функциональных комплексов, таких как транскрипционная фабрика или активаторный хроматиновый блок, который можно считать частью транскрипционной фабрики. В соответствии с классическим протоколом 3С, необходимым условием для предпочтительного лигирования сшитых белковыми мостиками фрагментов ДНК является их солюбилизация и проведение реакции лигирования в разведенном растворе. Понятно, что в этих условиях вероятность встречи (и последующего лигирования) не связанных друг с другом фрагментов ДНК является весьма низкой. Однако наши исследования показали, что дело обстоит иначе. Как будет показано ниже, в обычном протоколе 3С большая часть ДНК и ДНК белковых комплексов не солюбилизируется из клеточного ядра. Эти наблюдения заставляют по-новому оценить полученные результаты, а также ведут к переосмыслению ранее опубликованных данных, полученных с помощью 3С и производных полногеномных подходов (С-методов). 11 5. ДНК распределяется неравномерно между растворимой и нерастворимой фракциями после обработки SDS и эндонуклеазами рестрикции. В данной работе мы опирались на оригинальный 3С-протокол, который использовался для изучения взаимодействий удаленных регуляторных элементов β – глобинового домена в эритробластах из печени мышиных эмбрионов (de Laat et al., 2003). Для того, чтобы оценить взаимодействия между регуляторными элементами β –глобинового домена в разных типах тканей (экспрессирующей и неэкспрессирующей глобины, соответственно) и сравнить полученные данные с опубликованными ранее результатами (Tolhuis et al., 2002), мы параллельно анализировали клетки мозга и печени 14.5-дневных мышиных эмбрионов. Рисунок 5. Распределение ДНК и гистонов между нерастворимой и растворимой фракциями 3С материала и распределение фрагментов ДНК в зависимости от размеров. (А)Относительные количества ДНК в нерастворимой (осадок) и растворимой (супернатант) фракциях, измеренные с помощью флуоресцентного метода (Qubit, Invitrogen). В каждом эксперименте общее количество ДНК было принято за 100 единиц. (Б) Разделение ДНК из нерастворимой и растворимой фракций методом электрофореза в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. М – маркерная ДНК (Fermentas, SM0331). (В и Г) Распределение гистонов между нерастворимой (осадок) и растворимой (супернатант) фракциями 3С материала. Разделение белков, полученных из равных по объему фракций, проводили в полиакриламидном геле (PAAG) и детектировали, окрашивая кумаси (Г) или иммунологически антителами против гистона H3 (В). Для анализа интенсивности полос использовали программное обеспечение ImageJ. В каждом эксперименте общее количество гистонов было принято за 100. Планки погрешностей отражают стандартные отклонения для двух независимых экспериментов. 12 В первой серии экспериментов фиксированные формальдегидом ядра лизировали раствором додецил-сульфата натрия (в точном соответствии с оригинальным 3С протоколом) и обрабатывали рестриктазой HindIII. Для остановки реакции добавляли 1.6% SDS и инкубировали при 65°C 20 минут. Затем материал разделяли на растворимую и нерастворимую фракции центрифугированием (16 000g, 20 мин). При последующем анализе мы обнаружили, что в образцах, полученных из клеток печени и из клеток мозга, основная часть ДНК остается в нерастворимой фракции (85 и 70%, соответственно) (Рис. 5, А, столбцы «Hind»). В случае использования рестриктазы MboI, которая расщепляет ДНК на более короткие фрагменты, чем HindIII, количество ДНК в нерастворимой фракции, уменьшается, но, тем не менее, остается достаточно велико (∼25 и ∼60% в клетках мозга и печени, соответственно) (Рис. 5, A, столбцы «Mbo»). Электрофоретический анализ показал, что в супернатанте и в дебрисе присутствуют фрагменты ДНК всех размеров (Рис. 5, Б), которые лигируются с высокой эффективностью, как при обработке материала рестриктазой HindIII, так и в случае использования рестриктазы MboI, которая расщепляет ДНК на более короткие фрагменты (Рис. 5, Б, «Hind» ,«Mbo»). Низкий уровень солюбилизации ДНК (хроматина) при обработке фиксированных формальдегидом клеток додецилсульфатом натрия делает актуальным вопрос о том, на сколько эффективно в этих условиях солюбилизируются гистоны. Мы проанализировали содержание гистонов в каждой из фракций в процессе приготовления 3С образцов. Для этого препараты обрабатывали ультразвуком и, после расшивания формальдегидных сшивок, белки разделяли в 15% полиакриламидном геле и либо окрашивали кумаси бриллиантовым синим (Рис. 5, Г), либо переносили на мембрану, после чего иммунологически выявляли гистон H3 (Рис. 5, В). На рисунках 5, В и Г представлены результаты типовых экспериментов и результаты количественного анализа данных, полученных в трех независимых экспериментах. Очевидно, что распределение гистонов не повторяет картину распределения ДНК: в образцах клеток печени эмбрионов, обработанных рестриктазой HindIII, значительная часть гистонов (75– 80%) перемещается в растворимую фракцию, в то время как большая часть ДНК остается в нерастворимой фракции(∼85%). Это можно объяснить неполной сшивкой гистонов формальдегидом во время первого этапа процедуры 3С – фиксации хроматина. 13 6. Лигирование фрагментов, образующих активаторный хроматиновый блок, происходит преимущественно в нерастворимой фракции. Для продолжения исследования мы воспроизвели результаты экспериментов, в которых были показаны взаимодействия между регуляторными элементами домена β–глобиновых генов мыши (Tolhuis et al., 2002). В соответствие с ранее опубликованными результатами (Tolhuis et al., 2002), в клетках печени эмбрионов мыши (представленными, расположенный повышенную на в основном, промоторе частоту эритробластами), глобинового лигирования с гена якорный Hbb-b1, фрагментами, фрагмент, демонстрировал содержащими сайты гиперчувствительности к ДНКазе I: 4/5 (HS4/5) и HS-62/-60. В то же время частота лигирования с фрагментом, содержащим регион -42, была значительно ниже (Рис. 6, A, левая колонка). В клетках мозга не наблюдалось таких взаимодействий. Результаты, полученные в ходе 3С анализа с использованием HindIII, были подтверждены при использовании другой эндонуклеазы рестрикции MboI (Рис. 6, A, правая колонка). Учитывая наблюдения о неравномерном распределении ДНК и белков между растворимой и нерастворимой фракциями, мы решили выяснить, в какой из этих фракций генерируется 3С-сигнал. Для этого мы проанализировали частоты лигирования перечисленных выше фрагментов домена β–глобиновых генов мыши отдельно в растворимой и нерастворимой фракциях 3С материала. Результаты данных экспериментов демонстрируют, что фактически все сигналы 3С происходят из нерастворимой фракции (Рис. 6, Б) Полученные результаты не претерпели существенных изменений после нормирования частот лигирования на количество ДНК в разных образцах. Частоты лигирования, полученные при анализе только растворимой фракции, были также нормированы отдельно (для повышения уровня слабого сигнала), но характерные 3С кривые по-прежнему не детектировались. 14 Рисунок 6. Частоты лигирования фрагмента, содержащего промотор гена Hbb-b1 с фрагментами, содержащими регуляторные области β-глобинового домена, в растворимой и нерастворимой фракциях. (А) Результаты стандартного 3С анализа без разделения материала на фракции. (Б) Результаты 3С анализа, произведенного отдельно в растворимой (супер) и нерастворимой (осадок) фракциях. Над изображением 3С-кривых дана схема домена, на которой красными стрелками отмечены β-глобиновые гены, синими стрелками - гены обонятельных рецепторов и черным вертикальными линиями - сайты гиперчувствительности к ДНКазе I. На горизонтальной оси указаны позиции фрагментов, в т.п.о. (соответственно GenBank entry NT_039433), нулевая позиция соответствует началу гена Hbb-y. Черным прямоугольником на заднем плане обозначен якорный фрагмент, серыми прямоугольниками – тестируемые фрагменты. На вертикальной оси обозначены частоты лигирования с максимальным значением 100 в относительных единицах, что соответствует частоте лигирования якорного фрагмента с фрагментом, расположенным перед якорным. Красным цветом обозначены 3С профили для клеток печени, синим – для клеток мозга. Непрерывными линиями указаны результаты, полученные при анализе 3С материала, неразделенного на фракции (А), или при анализе нерастворимой фракции (Б). Пунктиром указаны результаты 3С анализа растворимой фракции. Частоты лигирования фрагментов, полученных после расщепления рестриктазами HindIII и MboI, представлены на левых и правых панелях, соответственно. Планки погрешностей отражают стандартные отклонения для двух независимых экспериментов. 15 7. Нерастворимая фракция состоит из нелизированных ядер. Из предыдущих экспериментов становится понятно, что стадия лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК, которая является определяющей в генерации 3С сигнала, происходит преимущественно в нерастворимой фракции. Представлялось важным понять, что представляет собой данная фракция. Можно было ожидать, что там находятся либо целые ядра, либо их достаточно крупные фрагменты, либо агрегированные хроматиновых фибриллы. Мы охарактеризовали нерастворимую фракцию 3С материала, используя флуоресцентную микроскопию. Нерастворимая фракция была окрашена DAPI для визуализации ДНК, а также инкубирована с антителами против типичных компонентов различных ядерных компартментов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что нерастворимая фракция 3С материала состоит из нелизированных ядер, которые сохраняют форму и определенные особенности внутренней структуры после обработки 0.3%-ным раствором SDS, следующей за ней обработки рестриктазой и, наконец, экстракции 1.6%-ным раствором SDS. Действительно, после выполнения всех этапов 3С процедуры в ядре удалось визуализировать ядрышко (используя антитела к нуклеолину), спеклы сплайсинга (с помощью антител против Sc35), ядерный матрикс (если судить о нем по локализации ДНК топоизомеразы II), домены конститутивного и факультативного гетерохроматина, территории хромосом (Рис.7). Таким образом, все вышеперечисленные компартменты сохраняются после достаточно жестких обработок фиксированных ядер. 8. Разрушение остаточного ядра приводит к уменьшению 3С-сигнала. Так как появление 3С сигналов свидетельствует о взаимодействии фрагментов в некотором комплексе, и эти сигналы генерируются только в неразрушенных ядрах, логично предположить, что сохранение целостности ядра существенно для обеспечения близкого расположения фрагментов, демонстрирующих взаимодействие в 3С процедуре. Для того чтобы проверить верность этого предположения мы обработали материал ультразвуком перед этапом лигирования, после чего попытались выявить 3С сигнал отдельно в растворимой и нерастворимой фракциях. 16 Рисунок 7. Визуализация ядерных компартментов и хроматиновых доменов в необработанных клетках печени мышиных эмбрионов (А) и в тех же клетках после проведения 3С процедуры до этапа лигирования (Б). После обработки нерастворимой фракции рестриктазой HindIII и 1.6%ным SDS ядерные компартменты визуализировали иммуноцитохимически (а-д) с использованием антител против нуклеолина(а), Sc35(б), топоизомеразы II(в), модифицированной формы гистона H3K9me3(г), модифицированной формы гистона H3K27me3(д). (е) Визуализация хромосомной территории номер 7 (флуоресцентная гибридизация in situ с набором специфичных проб к хромосоме 7). Верхний ряд каждой из секций демонстрирует иммуноокрашивание антителами (красным), второй ряд каждой секции демонстрирует окрашивание ДНК в ядре с помощью контрастирующего красителя DAPI (синий). В третьем ряду показано наложение изображений иммуноокрашивания антителами и окрашивания ДНК. Шкала 5 мкм. Изображения получены с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Eclipse Ti-E (Nikon, Japan) с последующей обработкой микрофотографий с помощью программного обеспечения NISElements 4.0 и ImageJ . 17 Как и предполагалось, даже короткая обработка ультразвуком (1-с пульс) вызывала выход большой порции хроматина из ядра (∼50% в случае расщепления рестриктазой Hind III и ∼80% в случае расщепления рестриктазой MboI). При более интенсивной обработке ультразвуком (3-с пульс) количество ДНК, выходящей из ядра, увеличивалось до ∼85% в случае использования рестриктазы HindIII. Переход значительной части хроматина в раствор привел к появлению 3С сигналов в растворимой фракции. Однако уровень этих сигналов был существенно ниже, чем в нерастворимой фракции. Что касается удельного (нормированного на количество ДНК) уровня 3С сигнала, то в нерастворимой фракции он был в десятки раз выше, чем в растворимой. Весьма показательно и то, что общий уровень 3С сигналов, детектированных в нефракционированном материале, снижался с увеличением числа фрагментов ДНК, переходящих в растворимую фракцию. Все это позволяет полагать, что сохранение ядерной локализации больших хромосомных доменов является необходимым для генерации 3С сигнала. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Оригинальная методика 3С основана на предположении, что после обработки SDS и расщепления рестриктазами фрагменты фиксированного формальдегидом хроматина могут быть солюбилизированы из ядра. Далее, постулируется, что решающая стадия процедуры – предпочтительное лигирование близкорасположенных фрагментов ДНК – происходит в растворе с низкой концентрацией ДНК (de Wit et al., 2012). В таких условиях должно обеспечиваться предпочтительное лигирование фрагментов ДНК, объединенных в стабилизированные формальдегидом комплексы (Dekker et al., 2002; Tolhuis et al., 2002). Результаты наших экспериментов позволяют утверждать обратное – 3С сигнал генерируется внутри ядер, которые частично декомпактизуются после обработки SDS и рестриктазами, но сохраняют форму и многие особенности внутренней организации. Большая часть ДНК остается внутри таких ядер. Так как появление 3С сигналов свидетельствует о взаимодействии фрагментов в некотором комплексе, логично предположить, что для сохранения структуры функционального комплекса необходимо сохранение целостности ядра. Результат, свидетельствующий о крайне низком уровне 3С-сигнала в растворимой фракции после разрушения ядра с помощью ультразвука, прямо показывает, что эффективное лигирование фрагментов 18 в 3С процедуре может происходить только внутри ядра, сохраняющего свою структуру. Вероятно, что в ядре, фиксированном формальдегидом, взаимные позиции регуляторных элементов, входящих в состав одного комплекса, поддерживаются прежде всего за счет определенного способа укладки хроматинового домена. Прямые взаимодействия между регуляторнымии белками, связанными с энхансерами и промоторами, могут существовать, но быть кратковременными. Известно, что формальдегид весьма эффективно сшивает гистоны друг с другом и с ДНК, в то время, как эффективность пришивки к ДНК различных негистоновых белков является достаточно низкой. Мы полагаем, что обработка клеток формальдегидом фиксирует взаимные положения регуляторных элементов генома именно потому, что она генерирует прошитую формальдегидом «хроматиновую сетку» (Рис. 8). По результатам 3С-исследований была предложена модель активаторного хроматинового блока, постулирующая сборку единого регуляторного комплекса, включающего промоторы работающих генов и контролирующие их работу энхансеры. Понятно, что условием сборки регуляторные такого элементы комплекса является фрагментов ДНК. выпетливание Наши разделяющих наблюдения требуют переосмысления и уточнения данной модели. Основная идея новой модели хроматинового блока состоит в том, что блок является не жестким комплексом, а хроматиновым доменом (ядерным компартментом), в рамках которого регуляторные последовательности сближены, но сохраняют возможность вступать в кратковременные альтернативные взаимодействия. Кроме того, сближенные позиции этих фрагментов могут поддерживаться и другими белками, которые не взаимодействуют с ними непосредственно, такими как: CTCF и когезин, взаимодействующие с инсуляторами (Hou et al., 2010; Mishiro et al., 2009; Sofueva et al., 2012) или SATB1/2, взаимодействующий с MAR-элементами (Zhou et al., 2012). Предложенная модель допускает короткоживущие взаимодействия регуляторных элементов с промоторами разных генов, которые входят в состав одного хроматинового блока. Так, поочередная активация транскрипции двух β- глобиновых генов, контролируемых одним регуляторным элементом (Gribnau et al., 1998; Wijgerde et al., 1995), может обеспечиваться посредством поочередных кратковременных взаимодействий этого регуляторного элемента с каждым из промоторов. 19 Рисунок 8. Модель активаторного хроматинового блока /компартмента. (А) На рисунке схематично изображен динамичный компартмент, состоящий из двух промоторов и удаленного энхансера, который контролирует их работу. Энхансер сближен в пространстве с промоторами за счет формирования хроматиновых петель, стабилизированных когезиновым кольцом (на схеме отмечено синим). Регуляторные белки (отмечены желтыми кружками) могут взаимодействовать с промоторами и энхансерами напрямую, так и опосредованно, стабилизируя структуру компартмента. После фиксации формальдегидом взаимное пространственное расположение элементов компартмента стабилизируется посредством образования сшивок между близкорасположенными хроматиновыми фибриллами. (Б) После обработки 1.6%SDS белки, соединяющие промоторы и энхансер разобщаются в связи с низкой эффективностью сшивания таких комплексов формальдегидом, в то время как сеть хроматиновых фибрилл остается скрепленной с помощью формальдегидных сшивок. После расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции образуются фрагменты с липкими концами, которые обладают некоторой подвижностью внутри сшитой формальдегидом хроматиновой сетки и поэтому подвергаются лигированию. Хроматиновый каркас формируется благодаря случайному сшиванию хроматиновых фибрилл. В нашем случае, функциональный комплекс стабилизирован за счет четырех сшивок между хроматиновыми фибриллами. Если одна или несколько сшивок будут отсутствовать, комплекс дестабилизируется, и отдельные фрагменты попадут в растворимую фракцию, где лигирование между ними будет крайне маловероятным, так как эти фрагменты больше не будут сближены в пространстве. Поэтому лигирование в растворимой фракции не будет специфичным и не даст характерного 3С сигнала. Учитывая ключевую роль макроупаковки хроматиновой фибриллы в позиционировании регуляторных элементов генома, особую важность приобретает вопрос о том, что направляет саму по себе макроупаковку хроматиновой фибриллы. Наши наблюдения дают основания полагать, что ассоциация CpG-островков играет существенную роль в определении характера укладки хроматиновой фибриллы в рамках больших доменов, включая целые хромосомы. Наши наблюдения хорошо 20 согласуются с выдвинутым ранее предположением о том, что активные и неактивные компартменты генома пространственно сегрегированы. CpG-островки преимущественно входят в состав промоторов генов домашнего хозяйства, которые в свою очередь составляют основную часть активно транскрибирующихся генов для каждого типа клеток (Deaton et al., 2011). Не исключено, что выявленная в наших экспериментах кластеризация CpG островков напрямую связана с организацией генов домашнего хозяйства в транскрипционные фабрики. Транскрипционные фабрики стали в последние годы объектом пристального внимания исследователей. Принципы объединения генов в транскрипционные фабрики активно изучаются, однако до сих пор остаются неясными. На наш взгляд, незаслуженно большое внимание уделяется идее существования специализированных транскрипционных фабрик, к которым привлекаются тканеспецифичные гены. Эксперментальных доказательств этой идеи не много, и они являются весьма спорными (Razin et al., 2011). В нашей работе не было получено никаких указаний на то, что в эритроидных клетках эритроидспецифичные гены предпочтительно взаимодействуют в пространстве. При всех условиях, следует помнить о том, что практически в любой клетке число работающих генов домашнего хозяйства существенно превышает число работающих тканеспецифичных генов. Учитывая вероятностный характер результатов, которые могут быть получены с использованием всех С-методов, можно ожидать, что эти методы прежде всего будут выявлять наиболее частые события. Если говорить об объединении генов в транскрипционные фабрики, то наиболее частыми событиями, выявляемыми с помощью C-методов, будут ассоциации между различными генами домашнего хозяйства. Это, собственно, и продемонстрировали наши эксперименты. Как в лимфоидных, так и в эритроидных клетках, мы наблюдали корреляцию 4С сигнала с плотностью CpG-островков и мотивов транскрипционного фактора Sp1 и не наблюдали таких закономерностей для эритроидных факторов транскрипции в эритроидных клетках. Это означает, что как в лимфоидных, так и в эритроидных клетках, основное влияние на формирование активных хроматиновых компартментов оказывает кластеризация СpG-островков, многие из которых включают, как хорошо известно, промоторы генов домашнего хозяйства. Отдельного рассмотрения заслуживает вопрос о роли кластеров CpG-островков в пространственной организации репликативных единиц. 21 По последним данным, большая часть CpG-островков содержит участки начала репликации ДНК (Cayrou et al., 2011), а самые активные участки начала репликации ДНК находятся в CpGостровках, содержащих также промоторы активных генов (Sequeira-Mendes et al., 2009). В нашем исследовании якорный фрагмент, содержащий CpG-островок, содержащий одновременно участок начала репликации ДНК (Razin et al., 1986) и промотор гена NPRL3 (Klochkov et al., 2006), демонстрировал удаленные взаимодействия с CpG-островками и регионами, содержащими G-квадруплексы, которые, согласно ряду данных, являются важными элементами эукариотических участков начала репликации ДНК. Давно известно, что репликоны организованы в репликативные фабрики. Таким образом, кластеризация CpG-островков может отражать пространственную организацию репликонов и репликативной машины. Одновременно можно говорить о взаимосвязи между пространственной организацией репликации и транскрипции в ядре эукариотической клетки. 22 ВЫВОДЫ 1. Продемонстрировано, что в процедуре 3С лигирование близкорасположенных фрагментов ДНК происходит внутри ядра, а не в растворе, как это предполагалось ранее. 2. Предложена новая модель организации так называемых активаторных хроматиновых комплексов, постулирующая, что ключевую роль в обеспечении пространственного позиционирования регуляторных элементов играет способ укладки хроматиновой фибриллы 3. Продемонстрировано, что одной из важных детерминант, обеспечивающих трехмерную организацию интерфазной хромосомы, является кластеризация CpGостровков, включающих промоторы активных генов и участки начала репликации ДНК. 23 СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК РФ: 1. Gavrilov A.A., Gushchanskaya E.S., Strelkova O., Zhironkina O., Kireev I.I., Iarovaia O.V., Razin S.V. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. // Nucleic Acids Research. 2013. V.41. P. 3563–75. 2. Гущанская Е. С., Маркова Е. Н, Разин С. В. , Кантидзе О. Л. Неметилированные CpGостровки кластеризуются в интерфазных ядрах клеток человека. // Доклады Академии Наук. 2012. Т. 443. №6. С. 743-746. 3. Разин С. В., Ульянов С. В., Юдинкова Е. С., Гущанская Е. C., Гаврилов А. А., Яровая О. В.. Домены α и β-глобиновых генов в контексте структурно-функциональной организации эукриотического генома. // Успехи биологической химии. 2012. Т. 52. С. 363–366. Тезисы российских и международных конференций: 1. Razin S.V., Gushchanskaya E.S., Golov A.K., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A. Elusive active chromatin hubs: nuclear compartments, folded chromatin domains or rigid complexes of regulatory elements? // 38th FEBS Congress “Mechanisms in biology”. Russia. Saint Petersburg. 2013. P. 3. 2. Gushchanskaya E.S., Artemov A., Gavrilov A.A. Characterization of long range interactions of the chicken house-keeping gene ggPRX. 38th FEBS Congress “Mechanisms in biology”. Russia. Saint Petersburg. 2013. P. 18. 3. Razin S.V., Gushchanskaya E.S., Golov A.K., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A. The role of eukaryotic genome spatial organization in the regulation of transcription.// 23th Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus. Hungary. Debrecen. 2013. P. 27. 4. Gavrilov A.A., Gushchanskay E.S., Kireev I.I., Iarovaia O.V., Razin S.V. Rethinking the 3C procedure: proximity ligation inside the nucleus.// Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology “Genomic Instability and DNA Repair”. Canada. Banff, Alberta. 2013. P. 143. 5. Razin S.V., Gushchanskaya E.S., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A. Folded chromatin domain instead of an active chromatin hub: a model based on reconsidered essentials of the chromosome conformation capture procedure.// XVIth Gliwice Scientific Meetings. Poland. Gliwice. 2012. P. 12. 6. Гаврилов А.А., Гущанская Е.С., Киреев И.И., Яровая О.В., Разин С.В. Переосмысление метода 3С: лигирование в ядре, а не в растворе.// Международная конференция «Хромосома 2012». Россия. Новосибирск. 2012. С. 73-74. 7. Gushchanskaya E.S., Gavrilov A.A., Razin S.V.. Characteristic features of structural and functional organization of transcription factories in the eukaryotic nucleus. International symposium "Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies" of Transregional Collaborative Research Centre 81.// Germany. Giessen. 2011. P. 59. 24
