161 М.Г. Оганнисян, А.А. Дарбинян, А.В. Восканян ТАУРИН

ԳՅՈՒՄՐՈՒ Մ. ՆԱԼԲԱՆԴՅԱՆԻ ԱՆՎԱՆ ՊԵՏԱԿԱՆ ՄԱՆԿԱՎԱՐԺԱԿԱՆ ԻՆՍՏԻՏՈՒՏ
ГЮМРИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ. М. НАЛБАНДЯНА
GYUMRI STATE PEDAGOGICAL INSTITUTE AFTER M. NALBNDYAN
УЧЕН ЫЕ ЗАПИ СКИ
ԳԻՏԱԿԱՆ ՏԵՂԵԿԱԳԻՐ
SCIENTIFIC PROCEEDI NGS
Պրակ Ա
Выпуск A
Issue A
№1
2014
БИОХИМИЯ
УДК 615.099.092+08
М.Г. Оганнисян, А.А. Дарбинян, А.В. Восканян
ТАУРИН РЕГУЛИРУЕТ УРОВЕНЬ ЦИТОКИНОВ
ВОСПАЛЕНИЯ В КРОВИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЯДА КАВКАЗСКОЙ
ГЮРЗЫ (MACROVIPERA LEBETINA OBTUSA)
Ключевые слова: таурин, яд гюрзы, цитокины ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8, воспаление.
Keywords: taurine, Levantine viper venom, cytokines TNF-α, IL-6, IL-8,
inflammation.
Բանալի բառեր՝ տաուրին, գյուրզայի թույն, TNF-α, IL-6, IL-8 ցիտոկիններ,
բորբոքում:
В настоящей работе показана роль аминокислоты таурина в регуляции уровней
некоторых цитокинов воспаления при повреждающем действии яда Кавказской
гюрзы (Macrovipera lebetina obtusa). Результаты исследования показали, что таурин
в дозе 100 мг/кг достоверно понижает уровень таких провоспалительных цитокинов
в сыворотке крови крыс, как ФНО-α и ИЛ-8, однако приводит к повышению
количества ИЛ-6, который обладает как про- так и противовоспалительными
свойствами.
Введение: Цитокины являются биологически активными соединениями
пептидной природы, регулирующими широкий спектр протекающих в организме
процессов. Основными функциями цитокинов являются регуляция иммунного ответа и воспалительных процессов, а так же участие в ангиогенезе, апоптозе и эмбриогенезе (Dinarello, 2000). Цитокины играют важную роль в качестве сигнальных
молекул не только в здоровом организме, но так же и при развитии патологических
процессов. Показано их участие в развитии таких серьезных заболеваний, как рак,
аутоиммунные нарушения и т.д (Lippitz, 2013, O'Shea, et al., 2002).
Яды змей, которые являются сложной смесью токсических белков и пептидов, аминокислот, углеводов, ионов металлов и т.д., также приводят к развитию
воспалительных процессов после их проникновения в организм жертвы. Кавказская
Гюрза (Левантийская гадюка - Macrovipera lebetina obtusa, MLO) - одна из наиболее
распространенных и опасных видов гадюковых змей Армении. Клинические
симптомы, сопровождающие укусы MLO следующие: гипотензивный шок, боли в
161
месте инокуляции яда, распухание, геморрагии, образование волдырей, сильное
воспаление, некроз и отмирание тканей (Göçmen, et al., 2006). Основными компонентами яда, приводящими к столь выраженным локальным и системным эффектам,
являются металлопротеиназы, сериновые протеазы и фосфолипаза А2 (ФЛА2)
(Gutiérrez and Rucavado, 2000, Sanz, et al., 2008, Zychar, et al., 2010). Действие ядов
гадюковых и их отдельных компонентов приводит к повышению локального и
системного уровней таких про-воспалительных цитокинов, как фактор некроза
опухолей-α (ФНО-α), интерлейкина-1β (ИЛ-1β), интерлейкина-6 (ИЛ-6) (обладает
так же противовоспалительными свойствами), интерлейкина-8 (ИЛ-8) и противовоспалительного интерлейкина-10 (ИЛ-10) (Avila-Agüero, et al., 2001, Chacur, et al.,
2004, Rucavado, et al., 2002, Santhosh, et al., 2013, Setubal, et al., 2013). Показана роль
рецепторов ФНО-α и ИЛ-6 при развитии некротических и воспалительных процессов
опосредованных действием жарарагина (металлопротеиназа яда Bothrops jararaca),
которая непосредственно может стимулировать образование ФНО-α и других провоспалительных цитокинов макрофагами организма (Laing, et al., 2003, Moura-daSilva, et al., 1996). Продемонстрирована индукция образования ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ6 кислотной ФЛА2 яда Bothrops leucurus (Nunes, et al., 2011).
Эффективное лечение змеиных укусов реализуется при помощи антисывороточной терапии, однако осуществляют и дополнительные процедуры противоболевыми, противовоспалительными, гормональными и др. средствами (Ahmed, et
al., 2008, Seo, et al., 2014). Одним из потенциальных дополнений к терапии укусов
MLO может быть использование растворов β-аминокислоты таурина. Таурин (2аминоэтансульфоновая кислота) – одна из наиболее многочисленных аминокислот
организма млекопитающих, молюсков, рыб и т.д., не включающаяся в состав белков,
но обладающая множественными физиологическими свойствами (Ripps and Shen,
2012). Наши ранние исследования показали антитоксические и ангиопротекторные
свойства таурина при действии яда MLO. По нашим данным таурин повышает ЛД50
(летальная доза, при которой погибают 50% исследуемых животных) яда MLO 1,5
раза, а, следовательно, во столько же и ослабляет его действие. Ангиопротекторные
свойства таурина проявляются в улучшении состояния микроциркуляторного русла
головного мозга крыс (Восканян А.В. 2005, Восканян А.В. 2009, Восканян А.В.
2012). Аналогичные данные об антитоксических свойствах таурина имеются и для
других повреждающих соединений, например для ЦИКлофосфамида, который
вызывает цистит (Abd-Allah, et al., 2005). Таурина проявляет способность связывать
активные формы кислорода и понижать уровень таких провоспалительных
цитокинов, как ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8 и ряда других (Gupta, et al., 2006, Su, et al., 2014).
Нами недавно было показано, что таурин уменьшает и болетворный эффект яда MLO
в 2 раза, что также может быть связано с его антиоксидантными и
противовоспалительными свойствами (неопубликованные данные).
162
В данном исследовании мы задались целью выяснить связаны ли антитоксические, ангиопротекторные и анальгетические свойства таурина с регуляцией
уровня цитокинов в сыворотке крови крыс.
Материалы и методы
Животные: В экспериментах были использованы 18 половозрелых крыссамцов (альбиносы) массой 250-280 г. Все крысы содержались в вивариуме при
температуре 20-25 0C при изобилии пищи и питьевой воды. За 15-30 мин до начала
опыта, животных заносили в экспериментальную комнату для адаптации.
Реагенты: В экспериментах использовались высушенный яд MLO производства «ГЭБ&СС», таурин (Sigma-Aldrich, Germany) и набор реактивов для определения цитокинов (Diaclone, France).
Дозировки и приготовление растворов: Доза яда составляла 5 мг/кг (2,5
ЛД50) массы тела крыс, а таурина – 100 мг/кг. Яда и таурин растворялись в физиологическом растворе (0,9 % NaCl) и вводились внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл, а
контрольным животным вводили 0,9 % NaCl в том же объеме.
Процедуры: Через 60 мин после введения 0,9 % NaCl, яда или яда с таурином,
животные усыплялись при помощи хлороформа. Далее производилась декапитация
и получение крови. Пробирки с кровью помещались в термостат при 370С на 60 мин
для отделения сыворотки.
Определение цитокинов: Уровень цитокинов ФНО-α, ИЛ-6 и ИЛ-8 определяли в различных разведениях сыворотки крови при помощи метода ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) в соответствии с инструкциями производителя (Diaclone,
France).
Статистический анализ данных был проведен с помощью программы "
GraphPad Prism 3.03" software (GraphPad Software Inc, США) при использовании tтестa Стьюдента. Значения р<0,05 были приняты как статистически достоверные.
Результаты исследования: Результаты определения количества цитокинов в
сыворотке крови показали, что через 60 мин после внутрибрюшинного введения яда
MLO происходило достоверное повышение уровней цитокинов ФНО-α, ИЛ-6 и ИЛ8 (p<0,05). Одновременное введение таурина с ядом приводило к нормализации
уровня ФНО-α и многократному снижению уровня хемокина воспаления ИЛ-8
(p<0,05). Однако, что удивительно, в случае противовоспалительного цитокина ИЛ6 таурин приводил к достоверному повышению его количества в сыворотке крови
(p<0,05) (Таблица 1; Рис.1; Рис. 2; Рис. 3).
Цитокин
ФНО-α
ИЛ-6
ИЛ-8
Концентрация± SD
(Контроль) (пг/мл)
Концентрация± SD
(MLO) (пг/мл)
Концентрация± SD
(MLO+Таурин) (пг/мл)
49,15±5,7
3,7±0,55
133,2±15,3
75,9±7,6
8,5±0,88
404,3±30,7
54,2±5,8
13,4±1,5
35,1±10,9
Таблица 1. Концентрации провоспалительных цитокинов в сыворотке крови крыс в норме,
после введения яда MLO и MLO с таурином. SD – стандартное отклонение.
163
Рис. 1 Таурин при действии яда MLO достоверно понижает и нормализует уровень
провоспалительного цитокина ФНО-α в сыворотке крови крыс.
Рис. 2 Таурин при действии яда MLO достоверно повышает уровень
противовоспалительного цитокина ИЛ-6 в сыворотке крови крыс.
Рис. 3 Таурин при действии яда MLO достоверно понижает уровень
провоспалительного хемокина ИЛ-8 в сыворотке крови крыс.
164
Выводы: Исходя из выше приведенных данных, можно прийти к следующим
выводам:
1) Таурин, при действии яда MLO, понижает уровень таких широко известных
маркеров воспаления, как ФНО-α и ИЛ-8, что может быть опосредовано его
антиоксидантными свойствами.
2) Повышение уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-6 может играть определенную роль в антитоксическом эффекте таурина против яда MLO.
3) Сопоставляя полученные нами раннее данные об антитоксических, ангиопротекторных и анальгетических свойствах таурина при действии яда MLO, можно
предполагать, что эти свойства могут обеспечиваться его способностью регулировать уровень провоспалительных цитокинов.
4) Полученные данные свидетельствуют о том, что использование таурина, наряду
с антагонистами ФНО-α и ИЛ-8, может быть прекрасным дополнением к основной терапии при лечении укусов MLO.
Մ.Գ. Հովհաննիսյան, Ա.Ա. Դարբինյան, Ա.Վ. Ոսկանյան
Տաուրինը կարգավորում է արյան հարբորբոքային ցիտոկինների
մակարդակը Կովկասյան գյուրզայի (Macrovipera lebetina obtusa) թույնի
ազդեցության ժամանակ
Տվյալ աշխատանքում ցույց է տրված տաուրին ամինաթթվի դերը հարբորբոքային որոշ ցիտոկինների քանակի կարգավորման մեջ Կովկասյան գյուրզայի
(Macrovipera lebetina obtusa) թույնի քայքայիչ ազդեցության ժամանակ: Հետազոտությունների արդյունքները ցույց տվեցին, որ 100մգ/կգ չափաբաժնով
տաուրինը հավաստի նվազեցնում է առնետների արյան սիճուկի այնպիսի հարբորբոքային ցիտոկինների քանակը, ինչպիսին են TNF-α, IL-8-ը, սակայն բերում
է
IL-6-ի քանակի աճին, որը օժտված է ինչպես հար- այնպես էլ հակա-
բորբոքային հատկություններով:
M.G. Hovhannisyan, A.A. Darbinyan, A.V. Voskanyan
Amino Acid Taurine Regulates the Levels of Blood Pro-Inflammatory Cytokines
during Levantine Viper (Macrovipera lebetina obtusa) Venom Action
The role of amino acid taurine in regulation of inflammatory cytokines’ level was
demonstrated during damaging action of Levantine viper (Macrovipera lebetina obtusa)
venom. The results have shown that taurine at 100 mg/kg dose significantly decreased the
rats’ serum levels of such pro-inflammatory cytokines as TNF-α, IL-8. However, the level
of IL-6, which possesses both pro- and anti-inflammatory properties, was elevated.
165
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Abd-Allah, A. R., A. M. Gado, A. A. Al-Majed, A. A. Al-Yahya, and O. A. Al-Shabanah.
'Protective Effect of Taurine against Cyclophosphamide-Induced Urinary Bladder Toxicity
in Rats', Clin Exp Pharmacol Physiol Vol. 32, No. 3, 167-72, 2005.
Ahmed, S. M., M. Ahmed, A. Nadeem, J. Mahajan, A. Choudhary, and J. Pal. 'Emergency
Treatment of a Snake Bite: Pearls from Literature', J Emerg Trauma Shock Vol. 1, No. 2,
97-105, 2008.
Avila-Agüero, M. L., M. M. París, S. Hu, P. K. Peterson, J. M. Gutiérrez, B. Lomonte, I.
Faingezicht, and Snakebite Study Group. 'Systemic Cytokine Response in Children Bitten
by Snakes in Costa Rica', Pediatr Emerg Care Vol. 17, No. 6, 425-9, 2001.
Chacur, M., E. D. Milligan, E. M. Sloan, J. Wieseler-Frank, R. M. Barrientos, D. Martin,
S. Poole, B. Lomonte, J. M. Gutiérrez, S. F. Maier, Y. Cury, and L. R. Watkins. 'Snake
Venom Phospholipase A2s (Asp49 and Lys49) Induce Mechanical Allodynia Upon PeriSciatic Administration: Involvement of Spinal Cord Glia, Proinflammatory Cytokines and
Nitric Oxide', Pain Vol. 108, No. 1-2, 180-91, 2004.
Dinarello, C.A. 'Proinflammatory Cytokines', Chest Vol. 118, No. 2, 503-8, 2000.
Gupta, R. C., Y. Seki, and J. Yosida. 'Role of Taurine in Spinal Cord Injury', Curr
Neurovasc Res Vol. 3, No. 3, 225-35, 2006.
Gutiérrez, J. M., and A. Rucavado. 'Snake Venom Metalloproteinases: Their Role in the
Pathogenesis of Local Tissue Damage', Biochimie Vol. 82, No. 9-10, 841-50, 2000.
Göçmen, B., H. Arikan, Y. Ozbel, A. Mermer, and K. Ciçek. 'Clinical, Physiological and
Serological Observations of a Human Following a Venomous Bite by Macrovipera
Lebetina Lebetina (Reptilia: Serpentes)', Turkiye Parazitol Derg Vol. 30, No. 2, 158-62,
2006.
Laing, G. D., P. B. Clissa, R. D. Theakston, A. M. Moura-da-Silva, and M. J. Taylor.
'Inflammatory Pathogenesis of Snake Venom Metalloproteinase-Induced Skin Necrosis',
Eur J Immunol Vol. 33, No. 12, 3458-63, 2003.
Lippitz, B. E. 'Cytokine Patterns in Patients with Cancer: A Systematic Review', Lancet
Oncol Vol. 14, No. 6, e218-28, 2013.
Moura-da-Silva, A. M., G. D. Laing, M. J. Paine, J. M. Dennison, V. Politi, J. M. Crampton,
and R. D. Theakston. 'Processing of Pro-Tumor Necrosis Factor-Alpha by Venom
Metalloproteinases: A Hypothesis Explaining Local Tissue Damage Following Snake Bite',
Eur J Immunol Vol. 26, No. 9, 2000-5, 1996.
Nunes, D. C., R. S. Rodrigues, M. N. Lucena, C. T. Cologna, A. C. Oliveira, A. Hamaguchi,
M.I. Homsi-Brandeburgo, E.C. Arantes, D.N. Teixeira, C.Ueira-Vieira, and V. M.
Rodrigues. 'Isolation and Functional Characterization of Proinflammatory Acidic
Phospholipase A2 from Bothrops Leucurus Snake Venom', Comp Biochem Physiol C
Toxicol Pharmacol Vol.154, N 3, 226-33, 2011.
O'Shea, J. J., A. Ma, and P. Lipsky. 'Cytokines and Autoimmunity', Nat Rev Immunol Vol.
2, No. 1, 37-45, 2002.
Ripps, H., and W. Shen. 'Review: Taurine: A "Very Essential" Amino Acid', Mol Vis Vol.
18, 2673-86, 2012.
Rucavado, A., T. Escalante, C. F. Teixeira, C. M. Fernándes, C. Diaz, and J. M. Gutiérrez.
'Increments in Cytokines and Matrix Metalloproteinases in Skeletal Muscle after Injection
166
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
of Tissue-Damaging Toxins from the Venom of the Snake Bothrops Asper', Mediators
Inflamm Vol. 11, No. 2, 121-8, 2002.
Santhosh, M. S., M. S. Sundaram, K. Sunitha, K. Kemparaju, and K. S. Girish. 'Viper
Venom-Induced Oxidative Stress and Activation of Inflammatory Cytokines: A
Therapeutic Approach for Overlooked Issues of Snakebite Management', Inflamm Res Vol.
62, No. 7, 721-31, 2013.
Sanz, L., N. Ayvazyan, and J. J. Calvete. 'Snake Venomics of the Armenian Mountain
Vipers Macrovipera Lebetina Obtusa and Vipera Raddei', J Proteomics Vol. 71, No. 2,
198-209, 2008.
Seo, Y. H., M. R. Park, and S. H. Yoo. 'Development of Complex Regional Pain Syndrome
after a Snake Bite: A Case Report', Korean J Pain Vol. 27, No. 1, 68-71, 2014.
Setubal, S.a S, A. S. Pontes, N. M. Nery, J. S. Bastos, O. B. Castro, W. L. Pires, K. D.
Zaqueo, L.e A Calderon, R. G. Stábeli, A. M. Soares, and J. P. Zuliani. 'Effect of Bothrops
Bilineata Snake Venom on Neutrophil Function', Toxicon Vol. 76, 143-9, 2013.
Su, Y., W. Fan, Z. Ma, X. Wen, W. Wang, Q. Wu, and H. Huang. 'Taurine Improves
Functional and Histological Outcomes and Reduces Inflammation in Traumatic Brain
Injury', Neuroscience Vol. 266, 56-65, 2014.
Zychar, B. C., C. S. Dale, D. S. Demarchi, and L. R. Gonçalves. 'Contribution of
Metalloproteases, Serine Proteases and Phospholipases A2 to the Inflammatory Reaction
Induced by Bothrops Jararaca Crude Venom in Mice', Toxicon Vol. 55, No. 2-3, 227-34,
2010.
Восканян А.В., Антонян М.В. 'Влияние Таурина На Токсичность Яда Vipera Lebetina
Obtusa', Вестник МАНЭБ, том 10, № 5, стр. 214-215, 2005 г.
Восканян А.В., Антонян М.В., Геворгян С.С. 'Ангиопротекторный Эффект Таурина
Против Яда Кавказской Гюрзы', Вестник МАНЭБ, том 14, № 4, выпуск 1, стр. 150156, 2009 г.
Восканян А.В., Антонян М.В., Дарбинян А.А., Геворгян С.С. 'Действие Таурина
Против Геморрагии, Вызванной Металлопротеиназой Яда Гюрзы (Macrovipera
Lebetina Obtusa)', Биологический журнал Армении, 1(64), стр. 37-41, 2012 г.
Сведения об авторах
Оганнисян Мкртыч Гагикович- Институт физиологии им. акад.
Л.А. Орбели НАН РА, младший научный сотрудник, E-mail: mkrtichh@gmail.com
Дарбинян Анна Ашотовна - Институт физиологии им. акад. Л.А. Орбели НАН РА,
младший научный сотрудник, E-mail: anul85@rambler.ru
Восканян Армен Вагинакович - кандидат биологических наук, доцент, Институт
физиологии им. акад. Л.А. Орбели НАН РА, заведующий лабораторией,
E-mail: avvoskanyan@rambler.ru
Поступило в редакцию 09.09.2014
167