ГНУ Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева РАСХН
реклама
ГНУ Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева РАСХН На правах рукописи КОМИССАРОВ Андрей Владимирович Совершенствование метода получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании в качестве доноров ядер соматических клеток 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук Маленко п. Родники, Московская обл. – 2010 Г.П. 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.................................................................................. 4 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................. 10 1.1. Современное состояние технологии трансплантации ядер ............. 10 1.2. Клеточный цикл эукариот и его регуляция.................................. 13 1.3. Культивирование и криоконсервация соматических клеток ........... 17 1.4. Развитие и созревание яйцеклетки ............................................ 20 1.5. Дозревание ооцитов in vitro ..................................................... 22 1.6. Энуклеация ооцитов ............................................................... 24 1.7. Репрограммирование трансплантированного ядра соматической клетки ........................................................................................... 27 1.8. Влияние фазы клеточного цикла клетки-донора ядра на эффективность клонирования ............................................................ 29 1.9. Подготовка клеток-доноров ядер к трансплантации ...................... 30 1.10. Значение продолжительности пребывания ядра соматической клетки в неактивированной цитоплазме ......................................................... 33 1.11. Активирование реконструированных эмбрионов ........................ 35 1.12. Культивирование эмбрионов млекопитающих in vitro ................. 39 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ........................................... 49 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .......................... 49 2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ........................................... 65 2.2.1. Дозревание in vitro ооцитов крупного рогатого скота и свиней ..... 65 2.2.2. Эффективность «слепой» энуклеации ооцитов крупного рогатого скота и свиней без zona pellucida ........................................................ 66 2.2.3. Получение и криоконсервация линий фетальных фибробластов и фибробластоподобных клеток кожи взрослого животного ....................... 78 2.2.4. Получение фетальных фибробластов крупного рогатого скота в G1 фазе клеточного цикла ...................................................................... 83 3 2.2.5. Подготовка пар цитопласт-соматическая клетка к электрослиянию .................................................................................................... 85 2.2.6. Воздействие электроимпульса на ооциты крупного рогатого скота в зависимости от наличия кальция в среде .............................................. 87 2.2.7. Изучение эффективности электрослияния пар цитопластсоматическая клетка в среде без кальция ............................................. 90 2.2.8. Активирование реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida химическим методом ....................................... 91 2.2.9. Приготовление питательных сред и метод культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida .................................................................................................... 92 2.2.10. Использование криоконсервированных соматических клеток в качестве доноров ядер сразу после оттаивания и после дополнительного культивирования ............................................................................. 93 2.2.11. Влияние длительности пребывания ядра соматической клетки в неактивированном цитопласте на эффективность развития реконструированных эмбрионов in vitro............................................... 95 3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ......................... 99 4. ВЫВОДЫ ............................................................................. 125 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ............................................................................ 127 6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ .................................................................................................. 128 7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ......................... 129 ПРИЛОЖЕНИЯ ........................................................................ 164 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Научные разработки в области клонирования животных имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. С помощью метода клонирования можно получить ответы на некоторые фундаментальные вопросы биологии развития, ядерно-цитоплазматического взаимодействия, репрограммирования ядра. Путем клонирования можно увеличить поголовье животных с высоким генетическим потенциалом, в частности, элитных быков-производителей (Wilmut et al., 2000), а так же решить проблему сохранения видов животных, находящихся под угрозой исчезновения, и даже восстановления уже исчезнувших (Lanza et al., 2000; Loi et al., 2001). Метод клонирования позволяет существенно увеличить эффективность получения трансгенных животных, что особенно важно в отношении крупного рогатого скота и свиней (Polejaeva, Campbell, 2000; McCreath et al., 2000; Melo et al., 2005). Идея клонирования воплощена в методе переноса ядра (nuclear transfer, NT) клетки-донора в энуклеированную неоплодотворенную яйцеклетку, находящуюся в метафазе второго деления мейоза (Wilmut et al., 1997). Изначально источниками ядер для подобных исследований служили бластомеры (Willadsen, 1986). В настоящее время достигнуты успехи при переносе ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) при клонировании овец (Wilmut et al., 1997), крупного рогатого скота (Cibelli et al., 1998; Kato et al., 1998), мышей (Wakayama et al., 1998), коз (Baguisi et al., 1999), свиней (Betthauser et al., 2000; Polejaeva et al., 2000), кроликов (Chesné et al., 2002), лошадей (Galli et al., 2003), крыс (Zhou et al., 2003) и других видов. Сущность технологии SCNT заключается в том, что в предварительно энуклеированную яйцеклетку (цитопласт) вводится ядро соматической клетки. Классическая технология получения клонированных животных, предложенная 25 лет назад (Willadsen, 1986) и применяемая до настоящего времени, остается сложной. Альтернативой 5 традиционному методу является zona-free метод, когда ооциты перед энуклеацией освобождаются от zona pellucida, что значительно упрощает большинство последующих этапов (Peura et al., 1998). Одно из центральных мест в SCNT занимает получение культур клеток, их соответствующая подготовка, а так же культивирование реконструированных эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты, что позволяет проводить трансплантацию эмбрионов крупного рогатого скота реципиентам нехирургическим способом. Большой интерес метод клонирования представляет для получения генетически модифицированных свиней для целей ксенотрансплантации. Поэтому часть этапов технологии клонирования мы провели с ооцитами свиней. Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований – совершенствование метода получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота путем реконструкции ооцитов без zona pellucida при использовании в качестве доноров ядер соматических клеток и последующего культивирования их in vitro до стадии бластоцисты. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Подготовить качественные цитопласты на основе ооцитов крупного рогатого скота, дозревших in vitro. 2. Получить линии фетальных фибробластов и линии фибробластоподобных клеток кожи от взрослых животных. 3. Разработать метод подготовки соматических клеток для использования их в качестве доноров ядер. 4. Изучить влияние сроков активирования на эффективность развития реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. 5. Усовершенствовать условия культивирования in vitro реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida. 6. Отработанные методы подготовки цитопластов апробировать на 6 ооцитах свиней. Научная новизна. Впервые было показано, что первое полярное тельце на поверхности ооцитов свиней без zona pellucida является точным указателем расположения материнских хромосом. Показано, что при использовании среды электрослияния без солей кальция снижается вероятность преждевременного активирования ооцитов крупного рогатого скота под воздействием электроимпульса. При этом эффективность электрослияния конструкций цитопласт-соматическая клетка, подготовленных с применением фитогемагглютинина, составляет 95%. Показано, что увеличение продолжительности пребывания трансплантированного ядра соматической клетки в неактивированной цитоплазме энуклеированного ооцита до 4–5 ч не снижает уровень развития реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro до стадии бластоцисты. Практическая значимость. Энуклеация ооцитов без zona pellucida путем апсирации PBI с небольшим участком прилегающей цитоплазмы позволяет получить качественные цитопласты без применения ядерных красителей и УФ лучей. Применение в качестве криоконсервированных дополнительного по доноров достижении культивирования ядер соматических 80–100%-ного после клеток, монослоя, размораживания без позволяет использовать однородную популяцию соматических клеток на протяжении серии экспериментов. Система WOW может быть использована для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida, совмещая в себе достоинства как индивидуального, так и группового культивирования. Полученные результаты могут найти применение в эксперименатальной эмбриологии, в изучении процессов раннего эмбриогенеза млекопитающих, при практической работе с эмбрионами крупного рогатого скота. 7 Результаты проведенных исследований вошли в состав 5 отчетов о научно исследовательской работе лаборатории клонирования животных отдела «Биотехцентр» по теме: «Разработать эффективные способы, направленные на создание новых типов животных, тканей и культур клеток на основе методов клеточной инженерии» и были утверждены на заседаниях ученого совета ГНУ НИИПЗК в период с 2006 по 2010 г., а также в состав готовящихся методических рекомендаций: «Методические положения по получению клонированных эмбрионов крупнго рогатого скота и их кульитивированию in vitro, обеспечивающие выход бластоцист на уровне 40– 45%», предназначенных аспирантов и для студентов научных сотрудников, преподавателей, научно-исследовательских институтов, ветеринарных и биологических факультетов ВУЗов. Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах работы, в т.ч. при приготовлении инструментов и микроинструментов для выделения ооцитов, для работы с ооцитами, цитопластами и реконструированными эмбрионами, при приготовлении питательных сред и рабочих растворов, эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота (ЭСК). Автор обеспечивал получение и доставку яичников животных в лабораторию, проводил выделение ооцитов, их дозревание, освобождение от клеток кумулюса и zona pellucida, энуклеацию, приготовление пар цитопласт-соматическая клетка, электрослияние, активирование и культивирование реконструированных эмбрионов in vitro. Осуществлял выделение линий соматических клеток от взрослого животного и плода, их культивирование и криоконсервацию. Автор участвовал при проведении анализа и обобщении полученных результатов исследований, написании статей, отчетов и докладов. В работе использованы материалы, полученные автором лично, а также в соавторстве с зав. отделом «Биотехцентр», д.б.н. Маленко Г.П., научным сотрудником отдела «Биотехцентр» Степановым О.И. и другими 8 сотрудниками отдела, которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку. Апробация результатов диссертации. Основные материалы диссертации вошли в состав 5 научных отчетов, которые доложены и обсуждены на ежегодных отчётных сессиях ГНУ НИИПЗК в период с 2006 по 2010 гг., а также на международных научных конференциях: IV Международная конференция "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (г. Боровск, 2006); The 33rd Annual Conference of the International Embryo Transfer Society (Kyoto, Japan, 2007); 7-я Международная научная конференция-школа "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии" (п. Дубровицы, 2008); 2-й Международный конгресс-партнеринг и выставка по биотехнологии и биоэнергетике "ЕвразияБио-2010" (г. Москва, 2010); V Международная научная конференция "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (г. Боровск, 2010). Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, в т.ч. 3 – в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК (Сельскохозяйственная биология, Доклады РАСХН, Известия РАН. Серия биологическая) и 1 статья в международном журнале (Cloning and Stem Cells). Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 164 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, практическое использование полученных научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (333 источника, в т.ч. 326 – иностранных авторов). Работа содержит 13 таблиц, 8 рисунков и 9 страниц приложений. 9 На защиту вносятся следующие положения и результаты: 1. Первое полярное тельце на поверхности ооцитов свиней без zona pellucida является точным указателем расположения материнских хромосом. Энуклеация ооцитов свиней без zona pellucida путем аспирации PBI с небольшим количеством прилегающей цитоплазмы позволяет эффективно удалять материнский хроматин при минимальном снижении объема цитопласта, без применения ядерных красителей и воздействия УФ светом. 2. Пары цитопласт-соматическая клетка, приготовленные с использованием фитогемагглютинина, могут быть эффективно слиты под воздействием электрического импульса в среде без солей кальция. Отсутствие солей кальция в среде снижает вероятность преждевременного активирования цитопластов на этапе электрослияния. 10 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Современное состояние технологии трансплантации ядер Первыми клетками, применявшимися при клонировании млекопитающих, были бластомеры (Willadsen, 1986). Бластомеры в эмбрионах млекопитающих до 8-клеточной стадии тотипотентны и эквивалентны по фенотипу (Tarkowski, Wroblewska, 1967). Различие между клетками появляется с началом компактизации (8-клеточная стадия для мыши, 32-клеточная стадия для рогатого скота), это выражается в поляризации бластомеров, приводит к обособлению трофэктодермы и внутренней клеточной массы. Таким образом, после компактизации бластомеры разделяются на две морфологически и биохимически до бластоцисты отличающиеся клеточные популяции. Способность развиваться стадии у реконструированных эмбрионов при использовании в качестве доноров ядер клеток внутренней клеточной массы не высока – от 3 до 15% у крупного рогатого скота (Collas, Barners, 1994; Zakhartchenko et al., 1996), 8.7% у кроликов (Qi et al., 1997). Кроме того, из одного эмбриона можно получить небольшое количество клеток-доноров ядер. Разработка условий культивирования клеток внутренней клеточной массы дала возможность получать неограниченное число клеток с одинаковым генотипом (Evans, Kaufman, 1981). Из внутренней клеточной массы 9–10-суточных эмбрионов крупного рогатого скота были получены клетки, способные пролиферировать в культуре. Морфологически эти клетки были идентичны эмбриональным стволовым клеткам мыши (Sims, First, 1994; First et al., 1994). При использовании этих клеток в качестве доноров ядер было получено 34 11 бластоцисты, из них 27 были перенесены реципиентам, в результате 13-ти беременностей родилось 4 здоровых теленка (Sims, First, 1994). После сообщения Wilmut et al. (1997) о рождении ягнят, полученных в результате трансплантации ядер фетальных фибробластов и дифференцированных клеток эпителия молочной железы, вся работа в этой области была направлена на исследование возможности использования дифференцированных клеток плода и взрослого организма в качестве доноров ядер при клонировании. В настоящее время показано, что к репрограммированию и обеспечению развития до стадии бластоцисты способны ядра многих типов клеток взрослого организма, таких как кумулюс (Kato et al., 2000), гранулеза (Arat et al., 2001), фибробластоподобные клетки кожи (Arat et al., 2002), миобласты (Gao et al., 2003), нейроны (Zawada et al., 1998), клетки Сертоли (Inoue et al., 2003). Независимо от типа соматических клеток, используемых в качестве доноров ядер, только небольшой процент реконструированных эмбрионов сельскохозяйственных животных (1–3%) развивается до рождения (Hill, 2002), из них менее половины достигают стадии половозрелости. У значительной части реконструированных эмбрионов при развитии обнаруживают ряд нарушений, возникающих из-за несоответствующего репрограммирования генома. Суть проблемы в том, что развитие клонированного животного происходит за счет реализации генетической информации, заключенной в хромосомах дифференцированной соматической клетки, используемой в качестве донора ядра. При этом состояние активности разных генов в соматических клетках и клетках внутренней клеточной массы значительно отличается. В соматических клетках в активном состоянии находятся гены, характерные для соответствующей дифференцированной ткани и ответственные за синтез специфических белков. В то же время для развития эмбриона на ранних 12 стадиях требуется, чтобы синтезировались белки, информация о которых закодирована в генах раннего развития. Возникает вопрос, имеет ли вообще место нормальная регуляция взаимодействия генов у клонированных животных. Появились сообщения о генетических аномалиях, возникающих при развитии клонированного эмбриона (Simerly et al., 2003). Клонирование млекопитающих это сложный многоступенчатый процесс. Процедура клонирования крупного рогатого скота включает в себя следующие основные этапы: 1. Подготовка соматических клеток-доноров ядра: Получение первичной культуры соматических клеток-доноров ядер; Культивирование соматических клеток; Криоконсервация соматических клеток; Подготовка клеток к использованию в качестве доноров ядер. 2. Получение ооцитов и подготовка цитопластов: Получение комплексов ооцит – cumulus oophorus (кумулюс, КОК) из яичников убитых животных; Созревание ооцитов in vitro до стадии MII; Освобождение ооцитов от клеток кумулюса; При работе по zona-free методу – ферментативное растворение zona pellucida; Удаление материнского хроматина (энуклеация ооцитов). 3. Реконструкция ооцитов: Подготовка пар цитопласт – соматическая клетка; Слияние цитопласта с соматической клеткой или инъекция донорского ядра в цитопласт. 4. Активирование конструкций. 5. Культивирование эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты. 13 6. Подсадка эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисты в полость матки самке-реципиенту. 1.2.Клеточный цикл эукариот и его регуляция Обычный клеточный цикл у эукариот состоит из четырех временных отрезков – фаз: митоза (Mitosis, M), предсинтетической (Gap, G1), синтетической (Synthesis, S) и постсинтетической (G2). Известно, что продолжительность как всего клеточного цикла, так и отдельных его фаз, значительно варьирует не только у разных организмов, но и у клеток разных тканей и органов одного организма. Универсальная теория клеточного цикла предполагает, что клетка как целое в течение клеточного цикла проходит через ряд состояний (Hartwell, 1995). В каждом состоянии регуляторные белки претерпевают фосфорилирование или дефосфорилирование, определяющие переход этих белков в активное или неактивное состояние, их взаимосвязи и клеточную локализацию. Изменения состояний клетки в определенных точках цикла организует особый класс протеинкиназ – циклинзависимые киназы (Cyclin-dependent kinases, CDK). CDK переходят в активное состояние, образуя комплексы со специфическими короткоживущими белками – циклинами. Центральным событием клеточного цикла является репликация ДНК, которая происходит в S фазу клеточного цикла. Репликация ДНК требует присутствия достаточно большого набора ферментов и белковых факторов. Упаковка вновь синтезированной ДНК в хроматин нуждается также в синтезе гистонов. Экспрессия генов, кодирующих перечисленные белки, специфична для S фазы (Farnham, Schimke, 1985; Heintz, 1991; Farnham et al., 1993; Lee et al., 1995; Miltenberger et al., 1995; Wells et al., 1996; Dou, Pardee, 1996). 14 Необходимым условием для вступления клетки в S фазу является синтез циклина E и его взаимодействие с CDK2 в конце фазы G1. Этот комплекс активирует синтез ДНК через фосфорилирование белков в областях начала репликации. Хотя циклин E связывается преимущественно с CDK2, он может образовывать комплекс и с CDK1 (Koff et al., 1991; Dulic et al., 1992). Максимальную активность комплекс циклин E-CDK2 проявляет при переходе G1-S, его активность резко снижается, когда клетки проходят среднюю и позднюю S фазу (Dulic et al., 1992). При микроинъекции антител к циклину E в клетки млекопитающих происходит подавление синтеза ДНК. При гиперэкспрессии циклина E клетки быстрее проходят G1 фазу и вступают в S, таким клеткам требуется меньшее количество факторов роста (Ohtsubo, Roberts, 1993) После того, как клетки млекопитающих вступают в S фазу, циклин E разрушается, а CDK2 связывается с циклином A. Синтез циклина A начинается в момент, когда клетки приближаются к границе G1-S. Нарушение синтеза циклина A ингибирует синтез ДНК (Lodish et al., 1995). Таким образом, комплекс циклин A-CDK2 является критическим для перехода через S фазу. Сигналом к завершению S фазы и переходу клетки к фазе G2 является активация циклином A другой киназы CDK1 с одновременным прекращением активации CDK2. После завершения репликации, когда генетический материал удвоен, клетка входит в постсинтетическую фазу (G2), которая используется клеткой для контроля полноты и точности произошедшей репликации хромосом. Последовательность событий в этот период точно не известна. Сигнал к началу деления клетки исходит от фактора MPF (maturation promoting factor), стимулирующего начало M фазы клеточного цикла. MPF представляет собой комплекс киназы CDK1 с активирующими ее циклинами A или B. 15 В постоянно циклирующих клетках циклин B начинает синтезироваться в S фазе, его уровень возрастает по мере прохождения клетками G2, достигает пика в метафазе и резко падает в анафазе. Циклин B первоначально аккумулируется в цитоплазме, после чего поступает в ядро непосредственно перед разрушением ядерной оболочки в профазе митоза. MPF необходим для разрушения ядерной оболочки и нормальной конденсации хромосом. Инактивация MPF вызывает выход из митоза в G1 фазу клеточного цикла. Во время G1 в клетке происходят интенсивные процессы биосинтеза, образование митохондрий, эндоплазматического ретикулума, лизосом, аппарата Гольджи, вакуолей и пузырьков. Ядрышко продуцирует рРНК, мРНК синтезирует структурные и и тРНК; образуются функциональные рибосомы; белки. клетка Происходит интенсивный клеточный метаболизм, контролируемый ферментами, рост клетки. Различия в длительности клеточного цикла у разных клеток определяются в основном длиной фазы G1. В поздней фазе G1 существует точка рестрикции, в которой может быть безопасно остановлен клеточный цикл. Она связана с началом периода покоя. Клетки некоторых типов на определенных стадиях дифференцировки могут прекращать свое деление, полностью сохраняя свою жизнеспособность. Переход клеток в состояние покоя становится возможным благодаря функционированию высокоспецифических ингибиторов клеточного цикла. При участии этих ингибиторов в неблагоприятных условиях окружающей среды, при повреждении ДНК или появлении грубых ошибок ее репликации клетки могут прекращать свою пролиферацию. Такие паузы используются клетками для репарации возникших повреждений. Обычно выделяют два критических перехода между фазами: G1-S и G2-M, так называемые точки рестрикции (Lewin, 1990; Hartwell, Kastan, 1994; Hartwell, 1995). 16 Клетки позвоночных в стандартной культуральной среде, лишенной сыворотки, в большинстве случаев не вступают в S фазу, хотя среда содержит все необходимые питательные вещества. По достижении сомкнутого монослоя клетки, способные к контактному торможению, выходят из клеточного цикла даже в присутствии сыворотки крови. Клетки, которые вышли из митотического цикла на неопределенное время, сохраняя жизнеспособность и пролиферативный потенциал, называют покоящимися клетками (Епифанова и др., 1983). Это состояние клеток называют пролиферативным покоем или G0 фазой. Клетки, достигшие состояния терминальной дифференцировки, как правило, уже не могут выйти из этого состояния. В ядрах клеток, находящихся в пролиферативном покое, также как и в клетках, находящихся в G1 фазе, содержится неудвоенное количество ДНК. Однако между клетками в этих двух состояниях имеются существенные различия. Известно, что продолжительность G1 фазы у делящихся клеток значительно короче, чем время перехода G0-S. В многочисленных работах по слиянию покоящихся и пролиферирующих клеток и при микроинъекции мРНК показано, что клетки в G0 фазе содержат ингибиторы пролиферации, препятствующие вступлению в S фазу (Smith et al., 1985; Spiering et al., 1988). Анализируя эти факты можно предположить, что клетка должна осуществлять специальную программу для выхода из G0 фазы. Необходимо также отметить, что в покоящихся клетках не экспрессируются CDK2 и CDK4, а также циклины D и E типов. Их синтез индуцируется факторами роста (Lodish et al., 1995). В постоянно циклирующих клетках уровень D и E циклинов остается высоким на протяжении всего цикла, и продолжительность G1 фазы по сравнению с предрепликативным периодом уменьшается. Таким образом, в клетках, находящихся в G0 фазе, отсутствуют белки, разрешающие проход через точки рестрикции и позволяющие вступать в S 17 фазу. Для перехода покоящихся клеток в S фазу факторы роста должны индуцировать в них синтез этих белков (Lodish et al., 1995). При стимуляции факторами роста клеток млекопитающих, находящихся в состоянии пролиферативного покоя, циклины D типа появляются раньше, чем циклин E (Matsushime et al., 1991; Won et al., 1992). При культивировании клеток в среде, лишенной факторов роста, уровень циклинов D типа стремительно падает, так как D циклины и их РНК не стабильны. Циклин D1 ассоциируется с CDK4 непосредственно перед началом синтеза ДНК. Уровень содержания комплекса достигает пика в ранней S фазе, прежде чем снизиться в поздней S и в G2 фазе (Matsushime et al., 1992). По-видимому, циклины D2 и D3 действуют в G1 периоде несколько позже, чем циклин D1. Гиперэкспрессия циклинов типа D (пятикратная по отношению к нормальной) проявляется снижением потребности клеток в факторах роста и укорочением G1 фазы, что приводит к уменьшению размеров клетки (Quelle et al., 1993). Таким образом, клеточная пролиферация контролируется сложной системой внеклеточных и внутриклеточных событий, приводящих либо к инициации и поддержанию клеточного цикла, либо к выходу клеток в фазу покоя. Понимание процессов, происходящих в животной клетке, является необходимым условием для создания и поддержания клеточной линии, а также для разработки методов синхронизации клеточной популяции на определенных фазах клеточного цикла. 1.3. Культивирование и криоконсервация соматических клеток Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на 18 базе концепции Клода Бернара. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в окружающей среде, клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. Если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления приводит к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма. Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом методик: 1. Методиками получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и грибов; 2. Методиками разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется; 3. Методиками наблюдения за клетками в динамике их развития; 4. Методиками непрерывного культивирования клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов. Работе с культурами клеток животных in vitro посвящено множество исследований и обзоров. Детали работы хорошо освещены в фундаментальных руководствах по культуре клеток животных (Cell biology…, 1998; Животная клетка в культуре…, 2000; Freshney, 2005). На первом этапе получения культуры клеток проводят стерильное получение фрагмента ткани путем биопсии, либо из органов убитого животного. Ткань измельчают и готовят суспензию клеток механической или ферментативной дезагрегацией. Для ферментативной дезагрегации ткани используют трипсин, коллагеназу или смесь разных ферментов. Суспензию с максимальным количеством живых клеток получают предварительным выдерживанием ткани в растворе трипсина при 4ºС в течение нескольких часов, а затем в течение нескольких минут при 37ºС (Freshney, 2005). Кроме 19 того, первичные культуры могут быть получены из кусочков ткани, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря собственной адгезивности. Постепенно из фрагментов ткани выселяются клетки, давая начало линии клеток. Многие клетки млекопитающих, прежде чем приступить к пролиферации и образовать клеточный монослой, должны прикрепиться к субстрату и распластаться на нем. Для выращивания клеток требуется специальным образом подготовленная поверхность, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения прикрепления, и для стимулирования роста и дифференцирования клеток. Выбор линии соматических клеток для использования в качестве доноров ядер это первый этап в клонировании, и он же одно из главных условий успешного выполнения технологии клонирования в целом, хотя в ряде работ по клонированию этот этап не подвергается жесткому контролю (Oback, Wells, 2003). Одним из способов избежать нестабильности характеристик используемых линий клеток является их низкотемпературная консервация. Благодаря низкотемпературной консервации можно использовать одну линию клеток на всем протяжении цикла экспериментов в лаборатории. Процесс низкотемпературной консервации суспензии клеток схематически можно представить в виде нескольких последовательных стадий: 1. Замещение физиологической среды, которая в норме окружает клетки, криозащитным раствором; 2. Охлаждение взвеси клеток в криозащитном растворе по определенной программе; 3. Длительное хранение биологического материала при постоянной низкой температуре (в холодильнике, непосредственно в жидком азоте); парах жидкого азота или 20 4. Отогрев объекта до положительной температуры; 5. Замещение криозащитного раствора физиологической средой. Все существующие способы замораживания базируются на 2-х основных методах: методы замораживания без регулирования снижения температуры и методы с регулируемым понижением температуры. Hayes et al. (2005) показали, что эффективность электрослияния цитопластов с клетками, замороженными по методу регулируемого понижения температуры, почти в 2 раза выше, чем у клеток, замороженных без регулирования температуры. Такое же соотношение было отмечено по показателю развития реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты. Авторы делают предположение, что повреждения мембраны клетки в результате замораживания негативно влияют на последующие этапы клонирования. Повреждения клеток, происходящие при замораживании и оттаивании культуры, обусловлены, по-видимому, образованием внутриклеточных кристаллов льда и осмотическими эффектами. Добавление криопротекторов, а также подбор оптимальных скоростей замораживания и оттаивания сводят повреждение клеток к минимуму. 1.4. Развитие и созревание яйцеклетки У млекопитающих в эмбриональный период деление оогониев приводит к образованию ограниченного числа клеток – предшественников яйцеклеток (Masui, Clarke, 1979). Ближе к рождению самки большая часть оогониев погибает, а оставшиеся вступают в профазу первого деления мейоза (МI; Pinkerton et al., 1961). Эти клетки, называемые первичными ооцитами, проходят профазу первого деления мейоза до стадии диплотены и на время прекращают свое развитие. Возможность завершения первичными ооцитами стадии МI появляется с наступлением половой зрелости, когда в крови появляются гонадотропины. Эти гормоны стимулируют вспомогательные 21 клетки яичника, побуждая их к выделению вторичного медиатора, который в свою очередь воздействует на ооциты и индуцирует процесс их созревания. Ядро первичного ооцита, именуемое зародышевым пузырьком (Germinal Vesicle, GV), разрушается, хроматин конденсируется в хромосомы, которые мигрируют на периферию клетки. Во время телофазы одна из дочерних клеток практически не содержит цитоплазмы (первое полярное тельце, polar body I, PBI), тогда как другая получает почти все компоненты клетки (зрелый ооцит, яйцеклетка). На этой стадии яйцеклетка остается до оплодотворения. Оплодотворение позволяет ооцитам завершить второе деление мейоза и вместе с последовательными сериями активации и инактивации MPF, определяющими прохождение клеток через повторяющиеся митотические деления, запускает процесс развития эмбриона (Ford, 1985; Kirschner et al., 1985; Maller, 1985; Cyert, Kirschner, 1988; Lohka et al., 1988). Во время второго мейотического деления происходит такой же неравный цитокинез, и большая часть цитоплазмы остается в яйцеклетке. Таким образом, оогенный мейоз служит сохранению объема цитоплазмы ооцита в единственной клетке, не допуская ее равного распределения между четырьмя клетками при уменьшении количества ДНК. Профаза МI, несмотря на свое традиционное название, очень похожа на G2 фазу обычного клеточного цикла: ДНК уже реплицировалась и является активной в отношении транскрипции, имеется ядерная оболочка, а митотическое веретено деления еще не сформировалось. Более того, подобно переходу из G-2 в М-фазу обычной делящейся клетки, переход от профазы I к М-фазе мейоза также запускается MPF (Nurse, 1990). При созревании ооцитов активность MPF претерпевает циклические изменения. Повышение активности MPF сначала запускает прохождение ооцита через профазу и вступление его в метафазу первого деления мейоза. Затем следует инактивация MPF, позволяющая ооцитам завершить деление 22 ядра. Новая активация MPF инициирует переход клетки в МII (Campbell et al., 1993). 1.5. Дозревание ооцитов in vitro Для получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота требуется значительное число зрелых ооцитов. Обеспечить это можно с помощью методов дозревания ооцитов из яичников, получаемых в убойном цехе мясокомбината. Первые работы по культивированию ооцитов млекопитающих in vitro появились в 1935 г (Pincus, Enzmann, 1935). В настоящее время накоплен значительный опыт по дозреванию ооцитов различных млекопитающих in vitro. Целью этих исследований является, с одной стороны, изучение закономерностей процессов, происходящих в ооцитах при их созревании, с другой стороны, использование дозревших in vitro ооцитов для получения эмбрионов. Продолжительность дозревания ооцитов в условиях in vitro обычно считается от момента переноса ооцитов в среду культивирования. Началом ядерного созревания ооцита принято считать разрушение зародышевого пузырька (Germinale Vesicle Breakdown, GVBD). На этой стадии, называемой диакинез, конденсируется хроматин, разрушаются ядрышки и оболочка ядра. Это происходит у ооцитов свиней через 16 ч (McGaughey, Polge, 1971; Motlik, Fulka, 1976), у ооцитов коров через 5–6 ч (Hafez, Ishibashi, 1964; Motlik et al., 1978), у ооцитов кролика через 3 ч (Thibault, 1972) после начала дозревания. MI в ооцитах свиней наблюдают через 20–24 ч после начала дозревания (McGaughey, Polge, 1971; Motlik, Fulka, 1976), в то время как ооциты коровы достигают этой стадии уже через 12 ч (Motlik et al., 1978). О завершении ядерного созревания ооцита in vivo и in vitro судят по появлению метафазной пластики и выделению PBI, что происходит у 80% 23 ооцитов свиньи через 40 ч культивирования (Motlik, 1972), и у 80% ооцитов крупного рогатого скота в пределах 20–24 ч культивирования (Motlik et al., 1978). Время достижения MII различается в разных работах и зависит, видимо, от применяющихся условий культивирования. Эту же стадию наблюдали в ооцитах свиней и коров через 24 и 18 ч культивирования, соответственно (Sato et al., 1982). Для дозревания до MII ооцитам кролика требуется 9 ч культивирования (Thibault, 1972), ооцитам лошади 40 ч (Fulka, Okolski, 1981). Для того, что бы получить созревшие полноценные ооциты in vitro, был усовершенствован состав культуральных сред. Для этого были использованы сведения об изменениях в предовуляторных фолликулах, происходящие у крупного рогатого скота (Ireland, Roche, 1983), и предприняты попытки смоделировать эти условия. Модифицированная среда 199 или среда Ham’s F-10 поддерживает дозревание почти 100% ооцитов мышей (Donahue, 1968) и почти 80% ооцитов овец, свиней и коров (Motlik, 1972; Moor, Trounson, 1977; Newcomb et al., 1978). Сочетание ФСГ и хорионического гонадотропина способствовало лучшему созреванию ооцитов. Сыворотка, полученная от коров на стадии эструса, увеличивала число полноценных ооцитов (Fukui, Ono, 1989). При созревании ооцитов в организме большую роль играют флуктуации гомонов в предовуляторный период. Культивирование ооцитов крупного рогатого скота в среде с эстрадиолом, а затем с ФСГ и ЛГ способствовало лучшему созреванию клеток, их оплодотворению и увеличению числа эмбрионов, развившихся до стадии морулы (Younis et al., 1989). 24 1.6. Энуклеация ооцитов Энуклеация это очень важный этап в процессе клонирования животных. При энуклеации должен быть полностью удалён материнский хроматин при минимальной потере цитоплазмы и содержащихся в ней органелл. Энуклеация не должна оказывать отрицательного влияния на способность ооцита поддерживать дальнейшее развитие. Влияние механического удаления веретена деления и связанных с ним компонентов на процессы, происходящие в цитопласте, до сих пор точно не ясны. Возможно, что низкая эффективность процесса SCNT частично зависит от энуклеации (Kato et al., 1998; Wakayama et al., 1998; Polejaeva et al., 2000; Chesne et al., 2002; Galli et al., 2003). Зона ядра ооцитов мышей и крыс могут быть легко визуализированы и удалены при использовании светового микроскопа. Однако в ооцитах кроликов, овец, коз, крупного рогатого скота, лошадей генетический материал может быть визуализирована и свиней только после окрашивания ДНК. Чтобы улучшить процедуру энуклеации и тем самым повысить эффективность клонирования в целом были предложены различные методы. McGrath, Solter (1983) в опытах на мышах установили, что хромосомы MII ооцита либо прикреплены к PBI, либо находятся в непосредственной близости от него. Поэтому метафазарную пластику можно удалить путем аспирации PBI с небольшим участком прилегающей к нему цитоплазмы без окрашивания ДНК («слепая» энуклеация). Для эффективной энуклеации таким способом необходимо удалять больше 30% цитоплазмы ооцита мышей (Cheong et al., 1993). При удалении клеток кумулюса пипетированием либо с помощью Vortex PBI может смещаться в результате разрушения нитей веретена деления. Как результат 10% цитопластов мышей (Cheong et al., 1993), 25% цитопластов свиней 25 (Prather et al., 1989) и 40% цитопластов крупного рогатого скота (Bordignon, Smith, 1998) содержат ДНК после «слепой» энуклеации. В связи с этим PBI не считается точным маркером локализации материнских хромосом (Li et al., 2004). Были произведены попытки энуклеации ооцитов под УФ после окрашивания хроматина флуоресцентными красителями (Heyman et al., 1994). В этом случае появляется возможность визуального контроля удаления материнского хроматина. При таком методе энуклеации удаляется незначительное количество цитоплазмы, что сохраняет начальный объем ооцита. Однако нужно учитывать вредоносное действие УФ лучей на живые организмы. Так, облучение ооцитов крупного рогатого скота в течение 10 сек не дает видимых снижений эффективности развития клонированных телят (Westhusin et al., 1992), хотя экспозиция свыше 30 сек вызывает необратимые изменения в обменных процессах (Smith, 1993) и снижает жизнеспособность ооцитов кролика (Yang et al., 1990). УФ лучи и краситель оказывают повреждающее действие на ДНК митохондрий. Это воздействие остается незамеченным в период предымплантационого развития, но может проявиться в последующем (Dominko et al., 2000). Тем не менее, факт получения живого потомства в результате широкого использования УФ лучей и ядерного красителя Hoechst 33342 при энуклеации доказывает устойчивость ооцитов коров и свиней к кратковременному действию УФ лучей (Onishi et al., 2000; Kubota et al., 2000; Forsberg et al., 2002). Существует метод, позволяющий контролировать качество энуклеации, но при этом избежать воздействия УФ лучей на цитопласт. При помощи микроманипулятора в zona pellucida делается щель тонкой стеклянной иглой над PBI. Затем через отверстие в zona pellucida выдавливается PBI с участком прилегающей цитоплазмы. Выдавленный фрагмент легко отделяется от ооцита осторожным пипетированием. Предполагаемые цитопласты раскладывают по одному в пронумерованные капли среды под минеральным 26 маслом. Выдавленные фрагменты раскладывают в другой чашке, также по одному, в соответствующе пронумерованные капли среды. Именно эти фрагменты используют для оценки качества проведенной энуклеации путем окрашивания Hoechst 33342 с последующим просмотром в УФ свете (Kubota et al., 1998; Dinnyes et al., 2000). Как альтернатива методам с использованием микроманипулятора служит метод, в основе которого лежит рассечение ооцита на две части, одна из которых содержит материнский хроматин, а другая нет. Метод впервые опробован при слиянии целых бластомеров (8–16-клеточная стадия) с энуклеированными и не энуклеированными половинками ооцита (Willadsen, 1986). В результате такой энуклеации значительно снижается объем цитоплазмы, что приводит к низкому уровню развития эмбрионов (Zakhartchenko et al., 1997; Greising, Jonas, 1999) и малому количеству клеток у бластоцист (Westhusin et al., 1996). В последствии данный метод был усовершенствован (Booth et al., 2001; Vajta et al., 2001). Ооциты крупного рогатого скота без zona pellucida микрохирургическим лезвием разрезали на две части в среде, содержащей цитохалазин B, в присутствии (или без) Hoechst 33342. Отбирали половинки без хроматина. Недостаток цитоплазмы компенсировали электрослиянием двух не содержащих хроматин половинок ооцитов (Peura et al., 1998). Вначале одну половинку ооцита без хроматина сливали с соматической клеткой, фиксированной на ее поверхности фитогемагглютинином, а затем для восстановления объема проводили второй этап электрослияния со второй половинкой без хроматина (Vajta et al., 2001, 2003). Все описанные выше методы энуклеации сопровождаются, в той или иной мере, повреждением цитолазматической мембраны. Благодаря высокой способности цитоплазматической мембраны к регенерации происходит быстрое восстановление её целостности и предотвращается вытекание цитоплазмы (Фрей-Вислинг, 1976). 27 Целостность мембраны является так же необходимым условием для введения донорских ядер в цитопласт посредством электрослияния. После электрослияния донорское ядро попадает внутрь цитопласта и подвергается непосредственному воздействию цитоплазматических факторов яйцеклетки. 1.7. Репрограммирование трансплантированного ядра соматической клетки Первые успешные опыты по клонированию показали, что соматическое ядро в цитопласте подвергается репрограммированию – процессу переориентирования донорского генома на синтез белков, соответствующих эмбриональному развитию. В результате репрограммирования становятся активными те участки хромосом, которые усиленно работают у раннего зародыша, и ядро приобретает способность инициировать развитие целого организма (Moens et 1996). al., Молекулярные механизмы репрограммирования ядра очень сложны и до сих пор остаются неясными (Latham, 2004). Наблюдения последних лет показывают, что репрограммирование начинается сразу же после введения донорского ядра в цитопласт и продолжается после дробления, возможно до гаструляции (Latham, 2005). Многочисленные исследования показали, что ооциты во время второго мейотического деления имеют в своей цитоплазме факторы, вызывающие репрограммирование ядра. Природа этих факторов в клетках млекопитающих до сих пор точно не определена. У донорских ядер, перенесенных в цитопласты, происходит разрушение ядерной оболочки и преждевременная конденсация хромосом (premature chromosome condensation, PCC; Czolowska et al., 1984; Barnes et al., 1993; Campbell et репрограммированию al., ядра 1996a). и PCC экспрессии способствует генов, эффективному ответственных за 28 эмбриональное и постэмбриональное развитие (Wells et al., 1998, 1999; Wakayama, Yanagimachi, 2001a). Эти события вызывает MPF, активность которого в ооците во время второго мейотического деления высока (Wakayama, Yanagimachi, 2001b; Lee, Campbell, 2006). Предполагается, что в клетке MPF связан с веретеном деления (Kubiak et al., 1993; Fulka et al., 1995). Поэтому при энуклеации вместе метафазарной пластинкой из яйцеклетки удаляется значительное количество MPF (Fulka et al., 1995). Это может объяснить различия в поведении донорских ядер после введения их в цитопласт, даже если цитопласты получены из ооцитов одного животного. Снижение активности MPF после энуклеации зависит и от вида животных. Так в цитопластах свиней какого либо снижения активности MPF после энуклеации не наблюдалось (Goto et al., 2002). Gonda et al. (2003) установили, что белок FRGY2 из ооцитов Xenopus может вызывать обратимое разрушение оболочки ядра, но становится ли ядро соматической клетки тотипотентным под влиянием FRGY2 не известно. Таким образом, события, происходящие сразу после переноса ядра, являются предпосылкой для всего дальнейшего развития эмбриона. Определив эти параметры, можно улучшить процесс репрограммирования и, как следствие, улучшить эффективность клонирования в целом. 29 1.8. Влияние фазы клеточного цикла клетки-донора ядра на эффективность клонирования Нормальное развитие клонированных эмбрионов возможно только в случае получения цитопластом нормального для данного вида животных набора хромосом. Это достигается путем координации клеточного цикла ооцита-донора цитоплазмы и соматической клетки-донора ядра (Campbell et al., 1996а). На сегодняшний день предложены три стратегии получения реконструированных эмбрионов с нормальным набором хромосом: 1. Получение цитопластов из ооцитов, дозревших до стадии МII, и использование в качестве кариопластов соматических клеток, подготовленных к удвоению набора ДНК (фаза G1 и G0 клеточного цикла); 2. Перенос кариопластов в G2 или М фазе в энуклеированные ооциты на стадии МII, с последующих выдерживанием в среде без добавления веществ, препятствующих выделению РВI. В результате происходит завершение мейоза и выделятся РВI (Ono et al., 2001); 3. Донорское ядро на любой стадии клеточного цикла вводится в цитопласт, который перед энуклеацией активировали оплодотворением или искусственно. Очевидно что, первые две стратегии основаны на использовании не активированных цитопластов, находящихся на стадии МII клеточного цикла и имеющих высокий уровень MPF в цитоплазме. Последняя стратегия предполагает использование цитопластов, находящихся в интерфазе и имеющих низкий уровень активности MPF в цитоплазме (Campbell et al., 1996b; Kono et al., 1997). У ядра соматической клетки, помещенного в активированный цитопласт, продолжаются процессы, к которым ядро было подготовлено пред трансплантацией. Если был начат синтез ДНК, то он завершается. Поэтому в 30 активированный цитопласт ядро соматической клетки можно трансплантировать на любой фазе его цикла (Collas et al., 1992). Ядро соматической клетки, перенесенное в неактивированный цитопласт, после активирования видоизменяется и становится похожим на пронуклеус (Collas, Robl, 1991). Если синтез ДНК начался до разрушения ядерной оболочки, то количество ДНК удваивается вторично и эмбрион не развивается. Так же если ядро клетки-донора было в начале S-фазы, и ДНК не успела удвоиться, то из-за высокого содержания MPF произойдет разделение неудвоенного количества ДНК и такой зародыш тоже не сможет развиваться (Collas et al., 1992; Campbell et al., 1996b). Таким образом, неактивированный цитопласт совместим только с донором ядра, находящимся в G0 и G1 фазе (Collas et al., 1991). Активированный цитопласт является универсальным реципиентом для ядра соматической клетки. Тем не менее, из-за снижающейся сразу после активирования активности MPF значительно снижается эффективность репрограмирования ядра таким цитопластом (Wakayama et al., 2001a). Поэтому в большинстве исследований по клонированию животных ядро дифференцированных соматических клеток переносят в цитоплазму неактивированного находящегося на стадии МII ооцита (Wilmut et al., 1997; Wakayama, Yanagimachi, 1999a; Tani et al., 2001; Tani et al., 2003). 1.9. Подготовка клеток-доноров ядер к трансплантации До сих пор остается нерешенным вопрос о значении фазы клеточного цикла клетки-донора ядра для обеспечения наиболее эффективного репрограммирования после введения в цитопласт и можно ли повысить эффективность клонирования, используя клетки-доноры ядер на определенной стадии клеточного цикла (Kasinathan et al., 2001a, b; Oback, Wells, 2002; Urakawa et al., 2004). 31 Для получения популяции клеток на определённой стадии клеточного цикла применяют специальные методы синхронизации. Синхронизация достигается использованием метаболических блоков. Метаболический блок должен отвечать следующим требованиям: 1. Вызывать остановку на определенной фазе клеточного цикла; 2. Развитие клеток должно происходить нормально до достижения фазы, на которой происходит остановка; 3. Остановка в развитии должна быть обратима с минимальным побочным эффектом для клеток (Krek, DeCaprio, 1995; Stein et al., 1998). Ни один из синхронизации находящихся не в разработанных позволяет нужной на сегодняшний получать фазе чистую клеточного день популяцию цикла. способов клеток, Эффективность синхронизации оценивают методом поточной цитометрии, либо используя специфические молекулярные маркеры (Darzynkiewicz, Trananos, 1990). Очень важно также, чтобы синхронизированная популяция оставалась в желаемой стадии клеточного цикла на всем протяжении процесса трансплантации, вплоть до самого последнего момента, когда ядро попадет в цитопласт. Клетки, взятые из пролиферирующей несинхронизированной популяции, будут в большинстве в S фазе клеточного цикла. Использование клеток-доноров ядер в этой фазе для клонирования имеет наименьшую эффективность (Oback, Wells, 2002). В настоящее время наиболее распространенными методами синхронизации клеток-доноров ядер на стадии G0 являются сывороточное голодание (Campbell et al., 1996a) и контактное ингибирование по достижению монослоя (Campbell et al., 1996b). В первом сообщении о клонированном животном, происходящем из ядра соматической клетки, Wilmut et al. (1997) высказали предположение, 32 что сывороточное голодание является необходимым этапом в подготовке соматических клеток для обеспечения развития клонированного эмбриона. В последующем Cibelli et al. (1998) показали, что G0 фаза цикла клетки донора ядра не является необходимым условием для получения клонированных животных, а клонированные телята могут быть получены при использовании активно делящихся фибробластов. Сывороточное голодание может отрицательно сказываться на жизнеспособности клеток, способствовать увеличению фрагментированности ДНК и апоптозу фетальных фибробластов свиней (Kues et al., 2002). Клетки монослоя, рост которых остановился в результате контактного ингибирования, рассматриваются как более эффективные для клонирования, чем в результате сывороточного голодания (Kasinathan et al., 2001a). Вместе с тем эмбрионы, реконструированные с использование ядер клеток как после сывороточного голодания, так и после контактного ингибирования, не показывали различий в уровне развития до бластоцисты при культивировании in vitro (Liu et al., 2001). В виду того, что яйцеклетка после оплодотворения или активирования довольно быстро переходит в G1 фазу клеточного цикла, то предполагается, что клетки-доноры ядер на G1 фазе более предпочтительны для использования в качестве карипластов с целью повышения эффективности клонирования. Клетки, находящиеся в G0 фазе, имеют много общего с клетками находящимися в G1 фазе. Но имеется одно существенное различие, G1 клетки находятся в клеточном цикле и готовы к переходу к новой фазе, а G0 клетки находятся в состоянии относительного покоя. В опытах по сравнению эффективности применения для клонирования клеток в G0 фазе и в G1 фазе не выявлено разницы в уровне развития до стадии бластоцисты in vitro (22% и 25% соответственно), а после переноса бластоцист 50-ти коровам было получено 0 и 5 телят, соответственно (Kasinathan et al., 2001а, b). Вместе с тем, после переноса 10-ти телкам- 33 реципиентам 10 эмбрионов на стадии бластоцисты, полученных в результате реконструкции цитопласта клетками в G1 фазе, было получено 9 живых телят (Urakawa et al., 2004). Для получения клеток в фазе G1 клеточного цикла отбирают клетки в М фазе вручную под микроскопом в тот момент, когда они представляют собой две некрупные клетки, соединенные цитоплазматическим мостиком. Их помещают в ростовую среду и позволяют разделиться, после чего незамедлительно используют для клонирования (Wells et al., 2003). Другим подходом является отбор только что разделившихся клеток, имеющих наименьший диаметр, около 20 мкм (Urakawa et al., 2004). Кроме того, применяют обработку монослоя ингибиторами киназ, например стауроспорином или бутиролактоном в низкой концентрации, которые блокируют клетки в ранней или поздней G1 фазе клеточного цикла, соответственно (Gadbois et al., 1992; Kues et al., 2000). Ингибитором синтеза ДНК – афидиколином микротрубочек вызывают совместно с ингибиторами обратимую остановку на образования переходе G1-S клеточного цикла (Collas et al., 1992). 1.10. Значение продолжительности пребывания ядра соматической клетки в неактивированной цитоплазме У ядер соматических клеток (G0 или G1 фаза), перенесенных в неактивированный цитопласт, в течение 1–2 ч происходит NEBD и PCC (Czolowska et al., 1984; Collas et al., 1991; Barnes et al., 1993; Campbell et al., 1996a), формируются микротрубочки веретена деления (Pinto-Correia et al., 1993). Затем ядерная оболочка формируется вновь и начинается синтез ДНК (Campbell et al., 1993). В опытах, проведенных на мышах (Wakayama et al., 1998) и свиньях (Yin et al., 2003), уровень развития эмбрионов значительно увеличивался, 34 если наблюдали PCC. Степень выраженности PCC различна и зависит от активности MPF и продолжительности нахождения донорского ядра в цитопласте (Campbell et al., 1996a; Tani et al., 2001). В большинстве работ, посвященных клонированию мышей (Wakayama et al., 1998; Wakayama et al., 1999a, b) и крупного рогатого скота (Cibelli et al., 1998; Kato et al., 1998; Wells et al., 1999), активирование проводилось через 1–4 ч после NT. Предполагается, что продолжительная экспозиция донорского ядра в не активированной цитоплазме может способствовать PCC. Это в свою очередь способствует эффективному репрограммированию ядра и экспрессии генов, ответственных за эмбриональное развитие и тем самым оказывает положительное влияние на последующее развитие эмбриона (Wells et al., 1998; Wells et al., 1999; Wakayama, Yanagimachi, 2001b). Liu et al. (2001) показали, что развитие до стадии бластоцисты было лучше, если активирование реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота проводилось более чем через 2 ч после электрослияния (41% бластоцист) по сравнению с активированием в течение получаса после слияния (28% бластоцист). Вместе с тем, было показано, что уровень развития до 30–40% бластоцист крупного рогатого скота может быть достигнут, если конструкции активировались непосредственно сразу после слияния (Kubota et al., 2000; Du et al., 2002). Choi et al. (2004) сообщили, что уровень развития у реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота, активированных в течение 2 ч после слияния, значительно выше, чем у тех, которые активировали через 3–5 ч. Реконструированные ооциты крупного рогатого скота, активированные ранее 2,5 ч после слияния, имели более высокий уровень выхода бластоцист, чем активированные позже. По количеству беременностей после переноса бластоцист, полученных из эмбрионов, активированных ранее или позднее 2,5 ч после слияния (27% и 29% соответственно), существенной разницы выявлено не было (Aston et al., 2006). 35 1.11. Активирование реконструированных эмбрионов Высвобождение связанного кальция вызывает инозитол-1,4,5- трисфосфат (ИТФ), который синтезируется в ответ на прикрепление спермия к плазматической мембране яйцеклетки (Berridge, 1985; Swann, Whitaker, 1986). Мейоз ооцитов большинства видов млекопитающих перед овуляцией ингибируется на стадии MII за счет высокой активности MPF в зрелых ооцитах. Оплодотворение позволяет ооцитам завершить второе деление мейоза и вместе с последовательными сериями активации и инактивации MPF, определяющими прохождение клеток через повторяющиеся митотические деления, запускает процесс развития эмбриона (Ford, 1985; Kirschner et al., 1985; Maller, 1985; Lohka et al., 1988; Cyert, Kirschner, 1988). После проникновения спермия в яйцеклетку происходят повышение внутриклеточного рН, циклические возрастания концентрации внутриклеточного кальция, экзоцитоз кортикальных гранул (Epel, 1990). Из всех реакций яйцеклетки на проникновение спермия именно подъем концентрации внутриклеточного кальция считается тем условием, которое активирует каскад клеточных изменений, необходимых для завершения мейоза (Jaffe, 1983). Подъем концентрации внутриклеточного кальция ингибирует дефосфорилирование CDK2, что, в свою очередь, снижает активность MPF и активирует ооциты (Shen et al., 2008). Дальнейшая реакция ооцитов крупного рогатого скота на подъем концентрации внутриклеточного кальция зависит от их возраста. Завершение мейоза и выделение перевого полярного тельца (Polar Body I, PBI) происходило у дозревших in vitro ооцитов в возрасте 24 ч от начала дозревания на уровне 66–88% (Susko-Parrish et al., 1994; Soloy et al., 1997; Liu 36 et al., 1998). Таким образом, в результате однократного резкого подъема концентрации внутриклеточного кальция в цитоплазме большинства молодых ооцитов создаются условия для завершения мейоза. Но после завершения MII вместо образования пронуклеусов у большинства этих ооцитов хромосомы реконденсировались, переходя в стадию MIII (SuskoParrish et al., 1994). Предполагается, что у зрелых ооцитов млекопитающих в цитоплазме постоянно синтезируется группа временных высоколабильных белков, таких как цитостатический фактор CSF, или c-mos протеинов, которые поддерживают стабильно высокий уровень активности MPF. Всплеск концентрации внутриклеточного свободного кальция разрушает имеющийся CSF, что, в свою очередь, вызывает деградацию циклина B, и таким образом инактивирует MPF и позволяет завершить мейоз. Так как синтез CSF постоянно идет у молодых, но не у стареющих ооцитов, всплеска концентрации свободного кальция достаточно для полного активирования стареющих ооцитов. Но у молодых ооцитов CSF может быстро восстановиться за счет нового синтеза. В результате развитие молодых ооцитов после возобновления активности MPF останавливается на стадии MIII (Presicce, Yang, 1994). При клонировании донорское ядро, перенесенное в цитопласт, не способно вызвать его активацию. Кратковременный импульс постоянного тока высокого напряжения вызывает обратимый пробой в плазматической мембране. В результате этого пробоя в плазматической мембране формируются поры, которые позволяют проникать ионам против градиента концентрации внутрь цитоплазмы. Приток ионов зависит от продолжительности импульса, концентрации ионов в среде и типа клеток (Zimmermann, Vienken, 1982). В присутствии очень низкой концентрации ионов в окружающей среде, ооциты устойчивы к постоянному току и менее устойчивы к переменному (Ozil, 1990). 37 Электрический импульс сам по себе, видимо, не способен вызвать активирование. Только присутствие кальция в среде при проведении электроимпульса может вызвать активирование ооцитов некоторых видов животных (Schultz, Kopf, 1995). Ионофор А23187 способен переносить ионы кальция через мембраны. Было показано, что микромолярные количества кальциевого ионофора А23187 вызывают у большинства яйцеклеток реакции, характерные для оплодотворения (Steinhardt et al., 1974). А23187 вызывает высвобождение ионов кальция, уже присутствующих в связанном состоянии в органеллах яйцеклетки (Chambers et al., 1974; Steinhardt et al., 1974). Но в ооцитах мышей и свиней подъем уровня кальция был значительно ниже при его отсутствии в среде культивирования (Shiina et al., 1993; Wang et al., 1999). Это говорит о том, что А23187 главным образом является транспортером ионов кальция из окружающей среды. Иономицин более мощный переносчик кальция, чем А23187. Для активирования достаточно выдержать ооциты в течение короткого периода времени в растворе с 5 мкМ иономицина, хотя используются более высокие концентрации. Клонированные эмбрионы крупного рогатого скота развились до рождения после активирования иономицином (Sims, First, 1994). В большинстве опытов ионофоры кальция используют в комбинации с протеинкиназами или ингибиторами синтеза протеинов. Также на некоторых типах клеток была показана возможность подъема концентрации внутриклеточного кальция за счет высвобождения его из внутренних резервов клеток, а не переноса через плазмолемму (Morgan, Jacob, 1994). Стронций – двухвалентный катион, и во многих типах клеток ведет себя как кальций. В мышечных клетках он способен стимулировать высвобождение кальция из сакроплазматического ретикулюма (Endo, 1977). Показана его способность вызывать активирование ооцитов многих видов животных, включая мышь, хомяка (Whittingham, Siracusa, 1978; Lasserre et 38 al., 1999). Стронций более эффективен при отсутствии внеклеточного кальция, он, вероятно, индуцирует высвобождение кальция из клеточных депо. Выдерживание ооцитов мышей в среде со стронцием, при условии отсутствия ионов кальция и магния, вызывало многократные подъемы концентрации внутриклеточного кальция (Kline, Kline, 1992). Этанол может активировать ооциты многих видов, включая мышь, крупный рогатый скот и свиней (Machaty, Prather, 1998). Этанол стимулирует образование ИТФ, и тем самым способствует высвобождению ионов кальция из внутриклеточных депо (Ilyin, Parker, 1992). Инкубирование ооцитов на стадии МII в присутствии 7–8% этанола в течение 5–7 мин, как правило, стимулирует образование пронуклеусов и во многих случаях дальнейшее эмбриональное развитие. Во многих опытах этанол используется в комбинации с протеинкиназами или ингибиторами синтеза протеинов. В норме после активирования яйцеклетки происходит завершение мейоза и выделяется второе полярное тельце (PBII). При реконструкции клетка-донор ядра обычно используется на стадии перед удвоением ДНК (G0 или G1). Таким образом, выделение PBII может привести к потере хромосом. Чтобы избежать этого, предложены разные методы, в частности обработка 6dimethylaminopurine (6-DMAP) сразу после подъема уровня внутриклеточного кальция, что приводит к разрушению нитей веретена второго мейотического деления и к переходу напрямую в интерфазу, когда формируется один пронулеус (Navara et al., 1994). При последовательной обработке ооцитов крупного рогатого скота иономицином или кальцием ионофором, а затем 6-DMAP было активировано свыше 80% ооцитов. Не было признаков кариокинеза (анафаза – телофаза II) или цитокинеза (выделение PBII). Образование пронуклеусов отмечалось через 2–3 ч. Все активированные ооциты имели по одному пронуклеусу и содержали только одно полярное тельце (Susko-Parrish et al., 1994; Liu et al., 39 1998). Дальше ооциты возобновляют клеточный цикл, и развитие происходит по типу митоза. Роль 6-DMAP может заключаться в непрямом ингибировании активности MPF, позволяя ооциту избежать завершения мейоза и начать митоз. 6-DMAP может также ингибировать фосфорилирование, необходимое для аппаратов веретена или микрофиламентов, ингибируя, таким образом, и кариокинез и цитокинез второго мейотического деления (Susko-Parrish et al., 1994). В случае культивирования ооцитов после обработки А23187 в среде, содержащей ингибитор синтеза протеина циклогексимид, у 96% ооцитов происходило образование пронуклеусов. При этом у большинства ооцитов, образовавших пронуклеусы (97%), выделялось PBII и формировался один пронуклеус (Soloy et al., 1997). Результаты работы Liu et al. (1998) также показали, что высокий уровень активирования молодых ооцитов может быть достигнут при использовании комбинированного активирования этанол – циклогексимид и цитохалазин В. 1.12. Культивирование эмбрионов млекопитающих in vitro Культивирование предымплантационных зародышей млекопитающих вне организма является необходимым экспериментально-эмбриологических звеном исследований, при проведении а также эмбриотехнологических работ по клонированию и получению трансгенных животных. Эмбрионы крупного рогатого скота могут успешно развиваться в яйцеводе временного реципиента. Однако использование временного реципиента сопряжено с большими недостатками – большая трудоемкость и высокая стоимость метода, опасность заражения эмбрионов от временных реципиентов, высокий процент потери эмбрионов. 40 Наиболее целесообразно культивирование предымплантационных эмбрионов in vitro в специально приготовленных питательных средах. Хотя сам метод существует уже давно, потребности культивируемых эмбрионов и оптимальные условия для их развития in vitro окончательно не определены. Эмбрионы при культивировании in vitro предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Первые среды для эмбрионов млекопитающих были двух типов: среды для долгосрочного культивирования (дни) и среды для краткосрочного культивирования (часы) – в которых эмбрионы могли находиться от вымывания до подсадки реципиентам. Питательная среда должна быть максимально приближена по своим параметрам к жидкостям яйцеводов и матки, в которых ооциты и эмбрионы находятся в естественных условиях. Из биологических млекопитающих, фолликулярная были жидкостей, для использованы жидкость. Robinson культивирования сыворотка (1950) и сообщил эмбрионов плазма об крови, успешном культивировании овечьих эмбрионов в сыворотке крови овцы при 37ºС. При культивировании 8–16-клеточных эмбрионов крупного рогатого скота в сыворотке крови развитие было ограничено от 0,8 до 1,2 деления на эмбрион, остановка в развитии наблюдалась после 48 ч культивирования (Pincus, 1951; Brock, Rowson, 1952; Wintenberger et al., 1953). Sreenan et al. (1968) культивировали эмбрионы крупного рогатого скота в водяной бане при 37ºС от одно- до восьмиклеточной стадии в тубах объемом 1 мл, содержащих фолликулярную жидкость, смесь сыворотки крови и изотонического раствора NaCl (1:1), среду Игла (Eagle, 1955), фетальную сыворотку крови крупного рогатого скота и куриный эмбриональный экстракт (Harnden, Brunton, 1965). Ограниченное развитие, 41 меньше чем одно деление на один эмбрион, наблюдалось при использовании фолликулярной жидкости и среды Игла. Основной сложностью в культивировании предымплантационных эмбрионов был так называемый блок развития, который возникает во время активации генома эмбриона. Эта активация у различных видов млекопитающих происходит на разных стадиях развития. Так, у эмбрионов мышей геном активируется на первом дроблении (Golbus et al., 1973; Braude et al., 1979), у кролика на четырехклеточной стадии (Manes, 1973; Schultz et al., 1973), у человека на четырех–восьмиклеточной стадии (Braude et al., 1988), на 8–16-клеточной стадии у овец (Crosby et al., 1988) и крупного рогатого скота (Frei et al., 1989). По этой причине в условиях in vitro развитие эмбрионов крупного рогатого скота останавливалось на стадии 8–16-ти клеток, а развитие до стадии бластоцисты было возможно только для восьмиклеточных эмбрионов, полученных in vivo. Tervit, Rowson (1974) сообщили о рождении ягнят после трансплантации эмбрионов на стадии морулы, культивированных в течение 6 дней по методу Tervit et al. (1972). Когда культивировались одноклеточные эмбрионы овцы, развитие происходило in vitro, но беременностей в результате последующей трансплантации не было. Беременности были получены, когда эмбрионы овцы на начало культивирования были четырехили восьмиклеточными. Авторы предположили, что низкая жизнеспособность эмбрионов, культивируемых со стадии 1–4 клетки, по сравнению с восьмиклеточными эмбрионами, зависит от увеличения продолжительности культивирования, но не от начальной стадии культивирования. Прогресс в культивировании эмбрионов появился при совместном культивировании одноклеточных эмбрионов с соматическими клетками (Camous et al., 1984; Eyestone et al., 1987; Kajihara et al.,1987) или в 42 кондиционированной среде (Eyestone, First, 1989). Соматические клетки продуцируют неизвестные факторы роста, а также ингибируют токсические факторы в среде культивирования (Eyestone, First, 1989). Имеется предположение, что высокая концентрация глюкозы (5,56 мМ) в среде культивирования эмбрионов является одним из важных факторов, вызывающих 8–16-клеточный блок у эмбрионов крупного рогатого скота, культивируемых in vitro (Nakao, Nakatsuji, 1990; Wang et al., 1990; Takahashi, Fist, 1992; Kim et al., 1993). Wang et al. (1990) исследовали влияние кондиционированной среды и концентрации глюкозы на развитие эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. Было показано, что среда культивирования, кондиционированная клетками яйцевода, настолько же эффективна, как и совместное культивирование эмбрионов с этими клетками. Большая концентрация глюкозы негативно влияет на развитие эмбрионов. При концентрации глюкозы 1 мг на 1 мл среды до стадии морулы и бластоцисты развились 37,1% эмбрионов, при 2 мг на 1 мл среды – 4,5%, при 4 мг/мл – 1,4%, при 8 мг/мл – 0%. Соматические клетки в системе совместного культивирования позволяют снизить высокий исходный уровень глюкозы и тем самым способствуют развитию эмбрионов (Van Soom et al., 1996). Однако, несмотря на то, что система совместного культивирования значительно улучшает количественные и качественные характеристики предымплантационного развития эмбрионов, она имеет и ряд недостатков – технологические сложности применения, опасность контаминации и невозможность точного учета потребностей эмбрионов в питательных веществах и факторах роста. Поэтому имеется устойчивая тенденция к замене данной системы простыми питательными средами (Bavister, McKiernan, 1993; Gardner, Lane, 1993). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет 43 буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН среды является одним из главных требований условий культивирования. Среды, широко используемые для культивирования эмбрионов млекопитающих, имеют рН от 7,1 до 7,4 (Wright, Bondioli, 1981). Эмбрионы мышей (Brinster, 1965) и кроликов (Kane, 1974) способны развиваться в диапазоне рН от 6,0 до 7,8. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность). В разбавленных водных растворах эти величины близки. Осмоляльность раствора (осмоль/кг) = S mixi, где mi концентрация i-го растворенного вещества (моль/кг), xi количество частиц, на которые диссоциировала его молекула. Двухклеточные мышиные эмбрионы способны развиваться до стадии бластоцисты в средах с осмолярностью от 200 до 354 мОсмоль/л (Brinster, 1965), а двуклеточные эмбрионы кролика развиваются до бластоцисты в средах с осмолярностью от 230 до 339 мОсмоль/л (Naglee et al., 1969). Bowen et al. (1975) культивировали эмбрионы крупного рогатого скота, собранные на 3 и 6 день после течки, в средах SOF, Ham F-10 и SOF с добавлением аминокислот при осмотическом давлении 270 и 300 мОсмоль/л. Развитие и 3- и 6-дневных эмбрионов было выше во всех средах с 270 мОсмоль/л, чем при 300 мОсмоль/л (24 эмбриона из 29 и 13 из 23, соответственно). Однако, разницы в развитии эмбрионов в зависимости от используемых сред и состава атмосферы культивирования (5% СО2 в воздухе и 5% СО2, 5% О2, 90% N2) не наблюдалось. Ионный состав сред может сильно варьировать. Первые среды для культивирования эмбрионов млекопитающих представляли собой модифицированный раствор Кребса. Они содержали ионы, необходимые для 44 поддержания жизни клеток: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, PO43– и Cl–, растворенные в бикарбонатном буфере. Основная функция NaCl – регуляция осмолярности в среде культивирования. Restall, Wales (1966) обнаружили, что концентрация K+ в репродуктивном тракте овец выше, чем в плазме крови. Wales (1970) установил, что развитие эмбрионов мышей происходит при концентрации K+ от 0,6 до 48 мМ, но полностью ингибируется при отсутствии K+. Отсутствие ионов K+ в среде ингибирует дробление и исключает компактизацию мышиных морул. Однако, нормальное развитие возможно при довольно широком диапазоне концентрации K+ в среде от 0,4 до 10 мМ (Whitten, 1971; Ducibella, Anderson, 1975). Полное отсутствие ионов PO43-, Mg2+ и SO42– в среде оказывает малый эффект на развитие мышиных эмбрионов до стадии бластоцисты (Wales, 1970). Главная роль иона HCO3– в среде культивирования – регуляция рН. Удаление HCO3– и CO2 из среды культивирования привело к снижению уровня развития эмбрионов мышей (Brinster, 1972). Энергетическими субстратами в среде для культивирования эмбрионов млекопитающих служат пируват, лактат и глюкоза. В средах для культивирования клеток млекопитающих, которые пытались использовать для культивирования эмбрионов, глюкоза содержится в концентрации 5,56 мМ, т.к. такова концентрация глюкозы в фетальной сыворотке крови крупного рогатого скота. Примерно такой же уровень глюкозы в жидкости яйцевода мышей (5,2 мМ; Gardner, Leese, 1990). В жидкости яйцевода коров содержание глюкозы колеблется от 0,05 до 0,2 мМ (Carlson et al., 1970; Parrish et al., 1989). Эмбрионы крупного рогатого скота могут развиваться до стадии морулы и бластоцисты в яйцеводах кроликов (Boland, 1984) и овец (Eyestone et al., 1987), где концентрация глюкозы порядка 1,5 мМ (Leese, 1988). 45 Присутствие 5,56 мМ глюкозы, в среде культивирования, ингибировало развитие эмбрионов крупного рогатого скота до стадии морулы (Takahashi, First, 1992). Ингибирующий эффект глюкозы был обнаружен у эмбрионов хомяка (Schini, Bavister, 1988; Seshagiri, Bavister, 1989a, b) и мышей (Chatot et al., 1989). Механизм ингибирующего действия глюкозы не ясен. Предполагается, что глюкоза вызывает подавление дыхательной активности в присутствии фосфата (Schini, Bavister, 1988). Добавление глюкозы в культуральную среду через 72 ч после in vitro оплодотворения увеличивает уровень развития эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты (Robl et al., 1991). Добавление 5,56 мМ глюкозы на 5 день культивирования не имело ни положительного, ни отрицательного эффекта на развитие эмбрионов крупного рогатого скота in vitro (Takahashi, First, 1992). Javed, Wright (1991) показали, что общая утилизация глюкозы в эмбрионах крупного рогатого скота низкая на стадии от 6 до 16 клеток. Значительное возрастание утилизации глюкозы происходит на стадии морулы. Rosenkrans et al. (1990) сообщили, что лактат является более предпочтительным энергетическим субстратом для развития ранних эмбрионов крупного рогатого скота, чем глюкоза. Концентрация лактата в жидкости яйцевода овец и кролика, по разным сообщениям, колеблется от 2 до 4 мМ (Iritani et al., 1961; Restall, Wales, 1966; Leese, 1988). Эмбрионы крупного рогатого скота могут развиваться с одноклеточной стадии до бластоцисты при 3,3 мМ лактата и 0,3 мМ пирувата в среде культивирования при отсутствии глюкозы (Rosenkrans et al., 1990; Takahashi, First, 1992). Удачное соотношение лактата/пирувата необходимо для баланса окислительно-восстановительного потенциала эмбриона (Brinster, 1965; Cross, Brinster, 1973). Удаление лактата из среды, содержащей 0,56 мМ глюкозы, привело к снижению способности эмбрионов крупного рогатого скота к первому 46 дроблению (Takahashi, First, 1992) и ухудшало эмбриональное развитие in vitro у мышей (Spindle, 1990). В жидкости яйцевода найдено 20 свободных аминокислот (Stanke et al., 1974), в маточной жидкости 25 свободных аминокислот (Fahning et al., 1967). Добавление 20 аминокислот значительно увеличивает уровень развития одноклеточных эмбрионов крупного рогатого скота до стадии морулы (Takahashi, First, 1992). Добавка аминокислот необходима для раннего развития эмбрионов кроликов (Kane, Foote, 1970), хомяков (Bavister et al., 1983), крыс (Zhang, Armstrong, 1990) и свиней (Rosenkrans et al., 1989). Точно не ясно, как аминокислоты влияют на развитие эмбриона, но, например, глутамин может утилизироваться бластоцистой крупного рогатого скота как энергетический субстрат (Rieger, Guay, 1988). Добавление аминокислот к культуральной среде может увеличивать общее количество эндогенных аминокислот, необходимых для синтеза белка (Zhang, Armstrong, 1990). При культивировании эмбрионов млекопитающих широко используются два состава атмосферы 5% СО2 в воздухе и смесь из 5% СО2, 5% О2 и 90% N2. 5% СО2 в сочетании с 25 мM HCO3– в среде культивирования обеспечивает pH порядка 7,4. Было установлено, что эмбрионы крупного рогатого скота (Tervit et al., 1972), овец (Tervit et al., 1972; Trounson, Moore, 1974; Wright et al., 1976b) и свиней (Wright, 1977) развиваются лучше при 5, чем при 20% О2 в атмосфере. Исследования на мышах показывают, что благоприятный эффект от 5% О2 в атмосфере очень незначительный и более заметен между одно- и двуклеточными стадиями (Whitten, 197I). Развитие эмбрионов млекопитающих проходит более успешно, если они культивируются в больших группах (Wiley et al., 1986; Canseco et al., 1992). Эффект взаимной стимуляции при культивировании эмбрионов в группе очевидно обусловлен факторами, продуцируемыми самими 47 эмбрионами (Watson et al., 1992; Donnay et al., 1997). Крошечный объем жидкости, окружающий эмбрион в репродуктивных путях, сохраняет эти факторы в очень высокой концентрации (Kane et al., 1992; Moessner, Dodson, 1995). Групповое культивирование при использовании соответствующих сред и методов инкубирования дает уровень выхода эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисты выше 50% (Schmidt et al., 1998). Однако при культивировании эмбрионов группой возможно вредное влияние от неразвивающихся и погибших эмбрионов (Salahuddin et al., 1995; Jones et al., 1998), а также исключена возможность наблюдения индивидуального развития каждого эмбриона на протяжении инкубации (Moessner, Dodson, 1995). Этих недостатков лишены методы индивидуального культивирования эмбрионов. эмбрионы Кроме с того, индивидуального поврежденной или культивирования отсутствующей zona требуют pellucida для предотвращения агглютинации эмбрионов (Peura et al., 1998). Для индивидуального культивирования предложены капли среды объемом 10 мкл (Carolan et al., 1996). Gardner et al. (1993) рассчитали, что капли среды SOF объемом 20 мкл содержат запас энергетических субстратов, достаточный для культивирования одного эмбриона в течение шести дней. Развитие в каплях объемом меньше 10 мкл очень низкое (Lane, Gardner, 1992; Carolan et al., 1996). Также в каплях малого объема происходит накопление токсических веществ, таких как аммиак (Gardner, Lane, 1993; Sinclair et al., 1997, 1998) и свободные радикалы (Johnson, Nasr-Esfahani, 1994). Что бы избежать воздействия этих негативных факторов применяют замену среды каждые 48 ч. Однако эта замена сама по себе оказывает отрицательное влияние на дальнейшее развитие эмбриона (Fukui et al., 1996). Капли такого маленького объема невозможно использовать в открытом виде из-за испарения воды из среды и резких перепадов температуры. Всеобще используемое покрытие таких капель маслом позволяет 48 минимизировать эти проблемы, но большая поверхность соприкосновения масла со средой приводит к диффузии жирорастворимых веществ, необходимых для эмбриона, что отрицательно сказывается на дальнейшем развитии эмбриона (Xu, 1987). Таким образом, большое внимание уделяется оптимизации среды культивирования, объему среды на один эмбрион и замене среды во время культивирования эмбрионов. Модификациям субстрата (т.е. покрытию дна культурального сосуда, изменению его формы и т.д.) уделяется мало внимания. Vajta et al. (2000) предложили метод, удачно сочетающий в себе достоинства группового и индивидуального культивирования. Сущность его состоит в том, что на дне лунки четырехлуночного планшета заточенным металлическим стержнем делают углубления для индивидуального культивирования эмбрионов. В этом случае эмбрионы, находясь в общем объеме среды, располагаются в индивидуальных ячейках. Это особенно важно для культивирования эмбрионов без zona pellucida, что позволяет с одной стороны избежать агглютинации эмбрионов, а с другой форма индивидуальной ячейки позволяет бластомеров на стадии дробления. предотвратить потерю отдельных 49 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа была выполнена в период с 2005 по 2010 годы в лаборатории клонирования животных отдела «Биотехцентр» ГНУ НИИПЗК в рамках тематического плана НИР института на 2006—2010 г. по теме: «Разработать эффективные способы, направленные на создание новых типов животных, тканей и культур клеток на основе методов клеточной инженерии», № госрегистрации 15070.7815014664.06.8.002.1. Биологический материал. Комплексы ооцит – клетки cumulus oophorus (КОК) выделяли из яичников убитых животных. Яичники крупного рогатого скота (Bos taurus) получали в убойном цехе ООО «Мясокомбинат «Ступинский» (г. Ступино, МО) от половозрелых телок и коров. Яичники свиней (Sus scrofa domesticus) получали в убойном цехе ОАО «Мясокомбинат Раменский» (г. Раменское, МО) от свинок в возрасте 6–8 мес. Яичники транспортировали в течение 3–5 ч в термосе в 0,9%-ном растворе хлорида натрия с 50 мкг/мл гентамицина сульфата (НПП «ПанЭко», Россия) при температуре около 30ºС. Для получения линии фетальных фибробластов использовали плоды крупного рогатого скота. Матку коровы примерно на четвертом месяце стельности, полученную в убойном цехе ООО «Мясокомбинат «Ступинский», помещали в чистый полиэтиленовый пакет и доставляли в лабораторию в течение 3–5 ч при температуре окружающего воздуха (февраль, март). Для получения линий фибробластоподобных клеток кожи от взрослого животного использовали фрагменты кожи уха. Уши крупного рогатого скота получали в убойном цехе ООО «Мясокомбинат «Ступинский», уши свиней в убойном цехе ОАО «Мясокомбинат Раменский». Уши помещали в 50 полиэтиленовый пакет для пищевых продуктов и транспортировали в лабораторию в течение 3–5 ч при температуре окружающего воздуха. Подготовка стеклянной посуды. Стеклянную лабораторную посуду сразу после использования тщательно ополаскивали проточной водопроводной водой. Сильно загрязненную и новую посуду сначала мыли горячей водопроводной водой с пищевой содой и горчичным порошком, затем тщательно ополаскивали. После этого все ёмкости погружали в раствор детергента «7Х» (MP Biomedicals, Германия) на ночь. На следующий день посуду многократно промывали вначале проточной водопроводной водой, затем дистиллированной и в заключение водой, полученной на установке MilliQ (Millipore, США). Посуду сушили в сухожаровом шкафу. Горловины высушенных сосудов закрывали фольгой и стерилизовали 2 ч в сухожаровом шкафу при температуре 160ºС (Freshney, 2005). Лабораторный пластик. Одноразовые пластиковые наконечники для автоматических пипеток и микроцентрифужные пробирки типа «Эппендорф» стерилизовали в сухожаровом шкафу при 120ºС в течение 2 ч в закрытых металлических стерилизаторах. Стерильные пластиковые флаконы для культуры клеток с невентилируемыми крышками площадью 25 см2 (Corning, США), чашки Петри с крышками пластмассовые лабораторные однократного применения диаметром 40 и 90 мм (ОАО «Фирма Медполимер», С-Петербург) использовали без предварительной подготовки. Растворы и питательные среды. В работе использовали реактивы фирмы «Sigma-Aldrich» (США). Растворы и питательные среды готовили в лаборатории на основе маточных растворов: NaCl – 154 мM; KCl – 158 мM; CaCl2x2H2O – 110 мM; 51 MgCl2x6H2O – 110 мM; NaH2PO4 – 20 мM; KH2PO4 – 20 мM; HEPES – 200 мM; Феноловый красный – 10 мкг/мл. Маточного раствора гидрокарбоната натрия в виду его неустойчивости при хранении не готовили, эту соль отвешивали каждый раз при приготовлении среды. Для приготовления растворов применяли деионизированную воду с удельным сопротивлением не менее 18 МОм/см, полученную на установке MilliQ. Растворы стерилизовали фильтрованием через фильтрующие насадки (Millipore, Ирландия) с диаметром пор 0,22 мкм. Хранили в холодильнике при 4ºС. Маточные растворы для добавления в среды ex tempore готовили в деионизированной воде: нария пируват 66 мM, L-глутамин 200 мM; в растворе хлорида натрия 154 мM: цистеамин 10 мM, гепарин 10 мг/мл и раствор гормонов – гонадотропина хорионического (ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия) 1000 Ед/мл + фолликулостимулирующий гормон (ФСГ-супер, ООО «Агробиомед», Россия) 1 мг/мл. Данные растворы делили на аликвоты для использования в течение одного рабочего дня, замораживали и хранили при –20ºС. Раствор 17β-эстрадиола готовили в спирте-ректификате 1 мг/мл. Хранили в холодильнике при 4ºС во флаконе из темного стекла. Основу сред для работы с ооцитами, эмбрионами и соматическими клетками на воздухе составляла модифицированная среда TLP-HEPES (Bavister, Yanagimachi, 1977) c добавлением 1 мМ L-глутамина, pH среды доводили до 7,2–7,4, осмотическое давление составляло 270–280 мОсмоль/л (среда T-0). Для проведения ряда манипуляций в среду T-0 добавляли 5 или 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (ФСК, НПП 52 «ПанЭко», Россия, среда Т-5 и Т-10, соответственно) и 0,01% поливинилалкоголя (PVA) - среда T-PVA. Среду T-PVA использовали для приготовления рабочих растворов: фитогемагглютинина (PHA) 50 мкг/мл; бычьего сывороточного альбумина (BSA) 1 и 30 мг/мл (среда T-BSA1 и TBSA30, соответственно), 0,1%-ного раствора гиалуронидазы. На основе среды Т-10 готовили раствор проназы 2 мг/мл. Приготовленные растворы делили на аликвоты для использования в течение одного рабочего дня, замораживали и хранили при –20ºС. При выделении КОК использовали раствор DPBS (НПП «ПанЭко», Россия). Среду для дозревания КОК готовили на основе среды 199 с солями Эрла (НПП «ПанЭко», Россия) с добавлением натрия пирувата 0,66 мM, цистеамина 0,1 мM, глутамина 2 мM, гонадотропина хорионического 5 Ед/мл, гормона фолликулостимулирующего 5 мкг/мл, эстрадиола 1 мкг/мл и 10% ЭСК. Для ферментативной дезагрегации тканей готовили 0,25%-ный раствор трипсина в DРВS без солей кальция и магния. Для культивирования соматических клеток использовали ростовую среду на основе среды DMEM (Gibco, Великобритания) с добавлением 4 мM L-глутамина, ФСК в количестве 10% кроме случаев оговоренных отдельно. Для элекрослияния пар цитопласт-соматическая клетка готовили среду, содержащую 270 мМ D-маннитола, 0,1 мМ MgCl2, 0,5 мМ HEPES, 0,05% BSA, pH готовой среды 7,3. Для культивирования эмбрионов готовили среду SOF (Synthetic Oviduct Fluid, Tervit et al., 1972). Вначале готовили основу среды SOF следующего состава: 53 Феноловый красный – 10 мкг/мл; NaCl – 107,7 мM; KCl – 7,16 мM; CaCl2x2H2O – 1,71 мM; MgCl2x6H2O – 0,49 мM; NaHСO3 – 25,0 мM; KH2PO4 – 1,19 мM; Na lactate – 3,30 мM; NEAA – 1%; EAA – 2%; В емкость для приготовления среды наливали около 50% расчетного количества воды и добавляли компоненты по списку, дожидаясь полного растворения и смешивания компонента прежде, чем добавить следующий. В состав среды включали растворы заменимых аминокислот (NEAA) по рецептуре MEM и незаменимых аминокислот (EAA) по рецептуре BME. После смешивания всех компонентов объем доводили водой до расчетного в мерной колбе. Приготовленную среду стерилизовали фильтрованием, хранили при 4ºС. В день применения к основе среды SOF добавляются Натрия пируват – 0,33 мМ; L-глутамин – 1,0 мМ; Гентамицина сульфат – 50 мкг/мл; ЭСК – 5%. Осмотическое давление готовой среды 268–274 мОсмоль/л. Во все рабочие растворы и питательные среды (кроме оговоренных отдельно) в день применения добавляли гентамицина сульфат 50 мкг/мл. Получение эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота. Кровь получали от клинически здоровых телок в начале проявления признаков половой охоты с соблюдением правил асептики. Кровь брали 54 иглой с надетой на оливу силиконовой трубочкой длинной около 10 см. Во флаконы ёмкостью 250 мл перед взятием крови наливали 10–15 мл 1% раствора хлорида натрия, тщательно смачивали внутреннюю поверхность флакона и выливали. Кровь направляли по стенке флакона для предотвращения вспенивания. Набирали около 200 мл крови в каждый флакон, закрывали пробкой, помещали в коробку из пенопласта и транспортировали в лабораторию. В лаборатории флаконы с кровью помещали в термостат при 39ºС на 2– 3 ч и следили за образованием сгустка. После формирования сгустка его осторожно отделяли от стенок зондом, флакон закрывали чистой пробкой и помещали на ночь в холодильник. Утром при помощи шприца через иглу отбирали отделившуюся сыворотку крови в центрифужные пробирки и центрифугировали при температуре от 0ºС до 4ºС в течение 30 мин при 1000 g для осаждения попавших клеток крови. Сыворотку отбирали, расфасовывали по 25–45 мл в пластиковые флаконы и замораживали. Перед использованием сыворотку размораживали, инактивировали в водяной бане при температуре 56ºС в течение 30 мин. После этого делили сыворотку на аликвоты для однократного применения и повторно замораживали. Дозревание in vitro ооцитов крупного рогатого скота и свиней. Все манипуляции по выделению КОК из яичников проводили при комнатной температуре. Для выделения ооцитов из поверхностных антральных фолликулов яичников крупного рогатого скота применяли специальное приспособление (Маленко, 2001). Приспособление представляет собой лезвие бритвы, разрезанное на 4 части, на торцевых сторонах каждой из частей оставлены выступы и режущие кромки. Лезвие зажимали кровоостанавливающим зажимом, который служил ручкой при работе. Для плотной фиксации лезвия 55 на одну из браншей зажима надевали кусочек силиконовой трубочки. Яичник, фиксированный хирургическим пинцетом, помещали в чашку Петри диаметром 90 мм с 15–20 мл раствора DPBS с 10 мкг/мл гепарина. Стенку поверхностных антральных фолликулов диаметром 2–8 мм (Leibfried, First, 1979) разрезали режущим кончиком приспособления, после чего выступом с закругленными углами выскребали его внутренние стенки. Содержимое чашки Петри после обработки около 15 яичников переливали в пробирку объемом 100 мл с коническим дном. Через 2–3 мин удаляли надосадочный слой. Осадок пипеткой переносили в две чашки Петри диаметром 90 мм с 5– 7 мл раствора DPBS. Ооциты собирали под стереомикроскопом (NIKON, Япония) при помощи стеклянной микропипетки наружным диаметром 400 мкм в чашки Петри диаметром 40 мм с 2 мл раствора DPBS c 5% ФСК. Для дозревания отбирали ооциты с равномерной мелкозернистой цитоплазмой, окруженные плотным многослойным кумулюсом (КОК). При наличии сопутствующих КОК ломтиков гранулёзы удаляли их при помощи пипетки. КОК помещали в эквилибрированную среду дозревания по 60–80 штук/мл, предварительно дважды ополоснув в этой среде. Культивировали при 39ºС в атмосфере воздуха с 5% СО2. Яичники свиней доставляли в лабораторию в 0,9%-ном растворе хлорида натрия с 50 мкг/мл гентамицина сульфата в термосе при температуре 33–35ºС. Дальнейшую процедуру получения ооцитов свиней проводили подобно получению ооцитов крупного рогатого скота. Подготовка цитопластов. Через 15 ч от начала дозревания КОК крупного рогатого скота при помощи автоматической пипетки на 200 мкл переносили в 0,1%-ный раствор гиалуронидазы (Rowlands, 1944; Gwatkin, 1964) на 3 мин при 39ºС. Большинство ооцитов в это время имели расширенные слои кумулюса. Стеклянной пипеткой с наружным диаметром 250 мкм собирали частично освобожденные от клеток кумулюса ооциты и помещали их в «эппендорф» с 0,5 мл 0.1%-ного раствора гиалуронадазы. 56 Пробирки выдерживали на Vortex (Heidolph, Германия) при максимальных оборотах в течение 3 мин. Содержимое пробирки переносили в чашку Петри диаметром 40 мм с 2 мл раствора DPBS c 5% ФСК. Стеклянной пипеткой собирали освобожденные от клеток кумулюса ооциты и переносили в среду Т-10. По 15–20 ооцитов помещали в капли раствора проназы на 2 мин при 39ºС (Mintz, 1962; Gwatkin, 1964). По истечении указанного времени zona pellucida сильно расширялась и истончалась, а сами ооциты несколько деформировались. Ооциты осторожно, но по возможности быстро, проводили последовательно через несколько капель среды Т-10. При этом в процессе переноса ооциты освобождались от zona pellucida и остатков проназы. Все ооциты, освобожденные от zona pellucida, объединяли в свежей капле среды Т-10. Лизис ооцитов на данном этапе практически отсутствовал. Ооциты с выделившимся PBI считали дозревшим до стадии MII и отбирали для энуклеации. Остальные ооциты помещали в подготовленные заранее капли из среды дозревания и просматривали с интервалом 30 мин. При каждом просмотре все ооциты, выделившие к этому времени PBI, отбирали для энуклеации. Наблюдение за созреванием ооцитов крупного рогатого скота вели до 24 ч от начала дозревания (hours postinitiation of maturation, hpm). Ввиду того, что дозревание ооцитов свиней in vitro очень растянуто по времени (Funahashi et al., 1997; Grupen et al., 1997), для синхронизации фаз мейоза у ооцитов свиней в раствор DPBS при выделении ооцитов и среду созревания добавляли неспецифический ингибитор синтеза протеинов – циклогексимид (Ye et al., 2002) 5 мкг/мл. Через 24 ч культивирования КОК отполаскивали от циклогексимида и дальнейшее культивирование проводили в среде без циклогексимида. Освобождение ооцитов свиней от клеток кумулюса и zona pellucida проводили через 39 hpm аналогично ооцитам крупного рогатого скота. Лизис ооцитов на данном этапе работы практически 57 отсутствовал. Ооциты с выделившимся PBI считали дозревшими до MII и отбирали для энуклеации. Оставшиеся ооциты возвращали в капли кондиционированной среды дозревания и продолжали культивировать до 48 hpm. Ежечасно просматривали и отбирали ооциты с выделившимся PBI. Энуклеацию ооцитов крупного рогатого скота и свиней проводили в масляной камере Фонбрюна (Фонбрюн, 1951). Камера имеет металлическое основание с закрепленным на нем нижним стеклом и верхнее покровное стекло, установленное через прокладку на нижнем стекле, в результате чего образуется щелевая камера. В полость между стеклами вносится среда Т-10 и минеральное масло. Ооциты энуклеировали на инвертированном микроскопе (Axiovert M35, OPTON, Германия) при помощи микроманипулятора (КМ-2, Россия) путем аспирации РВI с небольшим участком прилегающей цитоплазмы стеклянной микропипеткой с наружным диаметром 20–25 мкм. Полученные цитопласты возвращали в среду дозревания ооцитов и инкубировали при тех же условиях до использования. «Теплая» трипсинизация тканей плода крупного рогатого скота. Стенку доставленной в лабораторию матки с плодом от коровы примерно на 4-м месяце стельности смачивали спиртом и прожигали в месте предполагаемого разреза, а затем рассекали скальпелем. Плод извлекали и освобождали от плодных оболочек. В области передней конечности плода отрезали примерно 1–2 г мягких тканей. Ткань тщательно отполоскали в растворе DPBS. После этого ткань ножницами измельчили на кусочки размером примерно 1 мм3 и трижды отполоскали раствором DPBS. К измельченной ткани добавили 0,25%-ный раствор трипсина, выдержали в термостате при 39ºС 7 мин, а затем поместили на магнитную мешалку. Полученную суспензию отобрали. Действие трипсина ингибировали добавлением ФСК (1 мл сыворотки на 10 58 мл суспензии клеток). К ткани вновь добавили раствор трипсина и повторили описанные выше действия дважды. Объединённую суспензию клеток центрифугировали при 1000 g 5 мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл ростовой среды. Полученные клетки равномерно распределили на 3 флакона. В каждый флакон добавили по 5 мл ростовой среды с 5,6 мкг/мл амфотерицина В. Флаконы помещали в инкубатор с атмосферой воздуха, содержащей 7% СО2 при температуре 39ºС. Ростовую среду заменяли свежей средой с 5,6 мкг/мл амфотерицина В на следующий день и через 3 дня. На 5 день использовали среду без амфотерицина. На 7 день среду удалили, монослой первичной линии клеток снимали 0,05%-ным раствором трипсина в 0,02%-ном растворе версена. Пипетировали, добавив 5 мл ростовой среды. Суспензию клеток поровну поделили на 3 флакона (включая исходный). Затем во все флаконы добавили по 5 мл ростовой среды. Монослой первого пассажа снимали на 4 день 0,05%-ным раствором трипсина в 0,02%-ном растворе версена. «Холодная» трипсинизация тканей плода крупного рогатого скота. Ножницами отрезали кожный лоскут в области грудной стенки плода. Фрагмент измельчили при помощи двух скальпелей на кусочки размером примерно 1 мм3. После измельчения ткань тщательно отполоскали раствором DPBS. Всю измельченную ткань разделили на две равные части для обработки трипсином двумя вариантами: Вариант 1. Измельченную ткань промыли раствором DPBS, и залили 0,25%-ным раствором трипсина в количестве 1 мл раствора на каждые 100 мг ткани и оставили при 4ºС на 15 ч (на ночь). Утром раствор трипсина удалили. Флакон с тканью поместили в термостат при 39ºС, через 30 мин добавили 3 мл ростовой среды и пипетировали для получения суспензии клеток. Суспензию клеток использовали для посева. 59 Вариант 2. Измельченную ткань тщательно промыли раствором DPBS и оставили в таком растворе на 15 ч (на ночь). Утром раствор DPBS заменили 0,25%-ным раствором трипсина в количестве 1 мл раствора на каждые 100 мг ткани и оставили при 4ºС на 8 ч. Раствор трипсина удалили. Флакон с тканью поместили в термостат при 39ºС, через 30 мин добавили 3 мл ростовой среды и пипетировали для получения суспензии клеток. В обоих вариантах в полученную суспензию клеток добавляли 10% ФСК для инактивации действия трипсина. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 1000 g 5 мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл ростовой среды. Посев полученной суспензии клеток и дальнейшее субкультивирование проводили аналогично «теплой» трипсинизации описанной выше. Получение линии фибробластоподобных клеток кожи взрослого животного. Доставленное в лабораторию из убойного цеха ухо крупного рогатого скота или свиньи мыли водой с мылом, сбривали волосяной покров, дважды с интервалом в 5 мин обрабатывали кожу 70%-ным спиртом. Пробойник для биркования крупного рогатого скота (ПБМ-4, Россия) тщательно протирали 70%-ным спиртом, рабочую часть смачивали 96%-ным спиртом и прожигали. На предварительно подготовленном участке уха пробойником выбивали фрагмент дискообразной формы. Полученный фрагмент уха помещали в раствор DPBS. Кожные лоскуты с обеих сторон фрагмента отделяли от ушного хряща и измельчали на кусочки размером около 1 мм3. Кусочки трижды промывали раствором DPBS, а затем ростовой средой DMEM с 50 мкг/мл гентамицина сульфата и 5,6 мкг/мл амфотерицина В. Кусочки ткани переносили в культуральный флакон, равномерно распределяли по дну, и добавляли около 1 мл ростовой среды DMEM с 50% ФСК. На следующий день добавляли еще 1 мл ростовой среды DMEM. Культивировали при 39ºС в атмосфере воздуха с 7% СО2. Каждые три дня среду заменяли свежей средой DMEM с 10% ФСК. Через 10 60 дней культивирования кусочки ткани удаляли, колонии выселившихся клеток промывали DРВS. Клетки снимали при помощи 0,05%-ного раствора трипсина в 0,02%-ном растворе версена с последующим пипетированием до образования равномерной суспензии клеток. Затем добавляли 5 мл ростовой среды DMEM и оставляли на культивирование в том же флаконе до образования монослоя. Криоконсервацию выделенных линий соматических клеток проводили на 2–3 пассажах при достижении не менее 80%-го монослоя. Суспезию клеток, предназначенных для криоконсервации, центрифугировали в течение 5 мин при 1000 g для осаждения. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в небольшом количестве ростовой среды. Концентрацию клеток подсчитывали в камере Горяева. Суспензию разбавляли средой для криоконсервации, состоящей из ростовой среды с 10% DMSO и 15% ФСК до концентрации 2,0–3,0 х 106 клеток/ мл. Подготовленную суспензию клеток загружали в 0,25 мл пластиковые соломинки следующим образом: 1. Столбик среды для консервирования длинной 10 мм, чтобы смочить пробку соломинки для ее герметизации; 2. Столбик среды длинной 15 мм; 3. Столбик суспензии клеток длинной 60 мм. Этот столбик занимает около 60% объема всей соломинки (около 0,15 мл); 4. Столбик среды длинной 15 мм. Все столбики разделяются воздушными пузырьками. Конец соломинки запаивали нагретым на спиртовке анатомическим пинцетом. Соломинки помещали в прибор для программного замораживания (РПЗ, Россия) и охлаждали до температуры –7ºС со скоростью 1ºС/минуту. После этого пинцетом, охлажденным в жидком азоте, прикасались к соломинке в середине столбика с суспензией клеток. Это инициирует кристаллизацию раствора в соломинке. Соломинки возвращали в прибор для 61 замораживания и продолжали охлаждать со скоростью 0,3ºС/мин до –33–– 36ºС. После этого соломинки переносили в жидкий азот. Использование криоконсервированных клеток в качестве кариопластов непосредственно после размораживания. Соломинку с замороженными клетками помещали в водяную баню при 37ºС на 30 сек, протирали 70% спиртом, стерильными ножницами отрезали один край, опускали этот край в пробирку с 0,5 мл ростовой среды. Отрезали другой край соломинки, при этом содержимое соломинки вытекало в пробирку. Содержимое пробирки перемешивали, отбирали для работы 0,05 мл суспензии клеток и помещали в «эппендорф» с 0,5 мл среды T-10. Эти клетки хранились при комнатной температуре и использовались для приготовления конструкций в течение 2–3 ч. Оставшуюся часть суспензии клеток использовали для дальнейшего культивирования. Использование кариопластов криоконсервированных после клеток дополнительного в качестве культивирования. Криоконсервированные клетки после размораживания сеяли в концентрации 1,5 х 105 клеток/мл и культивировали до образования монослоя в течение 2–3 суток, а затем дополнительно еще 3–4 суток без замены среды. Перед использованием клеток монослой снимали 0,05%-ным раствором трипсина в 0,02%-ном растворе версена. Затем добавляли 0,5 мл ростовой среды и пипетировали до образования клеточной суспензиии. 0,05 мл суспензии клеток отбирали для работы, подготовив их так же, как и при использовании размороженных клеток. Оставшуюся суспензию использовали для дальнейшего культивирования. Получение клеток в G1 фазе клеточного цикла. В чашку Петри диаметром 100 мм наливали 10 мл ростовой среды с 10% ФСК. Фетальные фибробласты бычка, прошедшие криоконсервацию после второго пассажа, были разморожены и посеяны в концентрации 5,0 х 104 клеток/мл среды. Культивировали при 39ºС в атмосфере воздуха с 7% СО2. На следующий 62 день ростовую среду заменяли свежей и оставляли культивироваться 2 ч. По истечении указанного времени чашку «встряхивали» в течение 1 мин на Vortex при средних оборотах. Среду собрали и центрифугировали 5 мин при 700 g. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 0,1 мл ростовой среды. Из полученной суспензии под стереомикроскопом вручную стеклянной пипеткой с наружным диаметром 80–100 мкм отбирали пары мелких клеток, которые были соединены друг с другом цитоплазматическим мостиком. Отобранные пары клеток разделяли стеклянной иглой диаметром 2–5 мкм на микроманипуляторе в среде Т-10. Подготовка пар цитопласт-соматическая клетка. Цитопласты и соматические клетки-доноры ядер отполаскивали в T-PVA. Подготовку пар проводили вручную под стереомикроскопом в микрокаплях раствора PHA. Цитопласт потоком жидкости из пипетки принуждали прокатиться по лежащему на дне капли фибробласту. После объединения пары оставляли в растворе PHA еще в течение 5 мин (Oback et al., 2003). Затем пары переносили в T-PVA. Для использования в качестве доноров ядер из суспензии отбирали самые мелкие клетки округлой формы с блестящей поверхностью. Электрослияние пар цитопласт-соматическая клетка. Полученные пары цитопласт-соматическая клетка переносили в раствор маннитола, а затем в камеру для электрослияния, заполненную раствором маннитола (камера с параллельными проволочными электродами, ИБП РАН, Россия). Конструкции в камере вручную ориентировали таким образом, чтобы плоскость соприкосновения их мембран была по возможности параллельна электродам. Для проведения электрослияния конструкции подвергали одиночному импульсу постоянного тока 1800 В/cм длительностью 20 мкс. Конструкции из камеры перемещали в заранее заготовленные микрокапли среды T-10 под минеральным маслом. Контроль электрослияния проводили 63 через 10–15 мин. Слившиеся конструкции до активирования помещали в капли с кондиционированной средой дозревания. Активирование конструкций. Реконструированные эмбрионы активировали химическим методом с использованием иономицина и 6DMAP (Susko-Parrish et al., 1994). В две лунки четырехлуночного планшета наливали 0,5 мл среды T-B1, в оставшиеся две такое же количество среды T-B30. Вначале конструкции помещали в лунку со средой T-B1 на 4 мин при 39ºС. Затем во вторую лунку со средой T-B1 добавляли маточный раствор иономицина до рабочей концентрации 5 мкМ, перемешивали и туда быстро переносили конструкции. Планшет помещали в термостат при 39ºС на 4 мин. По истечении указанного времени конструкции переносили в лунку со средой T-B30 также на 4 мин при 39ºС, после чего переносили во вторую лунку со средой T-B30 при таких же условиях. Затем эмбрионы по одному помещали в капли предварительно эквилибрированной среды TALP-Fert с 2 мМ 6-DMAP объемом 10–15 мкл и инкубировали в атмосфере воздуха с 7% СО2 при 39ºС в течение 4 ч. Культивирование реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота. Реконструированные активированные эмбрионы крупного рогатого скота отполаскивали от раствора 6-DMAP в среде Т-10. Дальнейшее культивирование проводили в специально подготовленных четырехлуночных планшетах. Заточенным металлическим стержнем на дне каждой лунки планшета (Биомедикал, Москва) делали ячейки для индивидуального культивирования конструкций (Vajta et al., 2000). В каждую лунку наливали по 0,5 мл среды SOF и 0,4 мл минерального масла. Культивирование реконструированных эмбрионов проводили в с эксикаторе с трехкомпонентной газовой смесью 5% СО2, 5% О2, 90% N2, при температуре 39ºС. На дно эксикатора наливали небольшое количество стерильной дистиллированной воды. Планшет помещали на фарфоровый поддон. Крышку фиксировали резиновыми кольцами. Через отверстие в 64 крышке опускали стеклянную трубочку соединенную силиконовыми шлангами с баллоном, содержащим указанную газовую смесь. Газовую смесь пропускали в течение 2 мин. Затем трубку удаляли, а отверстие в крышке закрывали пробкой. Замену газовой смеси проводили каждые 48 ч. Дробление оценивали через 42–48 ч после активирования, развитие до стадии бластоцисты через 8,5 суток культивирования. Статистический анализ. Результаты представлены как средняя арифметическая±стандартная ошибка средней арифметической. Данные были проанализированы при помощи метода Стьюдента (Лакин, 1980). 65 2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Дозревание in vitro ооцитов крупного рогатого скота и свиней В используемой нами системе дозревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro 88,2% (1234 из 1399, 10 повторов) ооцитов достигли MII. Основная масса ооцитов 47,9% (670 из 1399) завершила дозревание к 17,5 hpm. Затем наблюдали резкий спад в скорости дозревания. В период с 18 до 20 hpm количество дозревших ооцитов в расчете на 30 мин вновь увеличилось. За этот период 28,3% ооцитов (396 из 1399) завершили ядерное дозревание. Затем, начиная с 20 hpm и до окончания периода наблюдения 24 hpm вновь был резкий спад в уровне дозревания до 2,6% ооцитов и ниже за 30 мин период. Таким образом, при анализе динамики дозревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro по времени нами были выделены две относительно компактные группы ооцитов. Группа «рано дозревших» ооцитов завершала ядерное дозревание к 17,5 hpm и группа «позднодозревших» ооцитов завершала ядерное дозревание в период 18–20 hpm (Malenko et al., 2009). Освобождение ооцитов свиней от клеток кумулюса и zona pellucida заканчивали к 40 hpm, в это время PBI было обнаружено у 23,9% ооцитов. Через час, в 41 hpm, PBI обнаружили еще у 23,4% ооцитов. В дальнейшем наблюдали резкий спад в уровне дозревания ооцитов вначале до 3,7–5% ооцитов за час в период с 42 до 44 hpm, и еще ниже до конца периода наблюдения (рис. 1). 66 Рис.1. Динамика созревания ооцитов свиней in vitro (3 повтора; n=598) К 48 hpm уровень дозревания ооцитов свиней in vitro в наших условиях составил 62,4% (373 из 598, 3 повтора). Таким образом, значительная часть ооцитов свиней – 47,3% от общего числа ооцитов или 75% от всех дозревших, завершили ядерное дозревание к 41 ч от начала культивирования. 2.2.2. Эффективность «слепой» энуклеации ооцитов крупного рогатого скота и свиней без zona pellucida Энуклеацию ооцитов крупного рогатого скота проводили при комнатной температуре на микроманипуляторе микроманипуляций. Камеру заполняли средой в камере для Т-10 без добавления цитохалазина В. Микрохирургические манипуляции выполняли стеклянной пипеткой с ровно обрезанным кончиком диаметром 25–30 мкм, без применения 67 присоски. Пипетку использовали и для правильной ориентации ооцитов, и для аспирации. Ооцит пипеткой ориентировали таким образом, чтобы PBI было расположено на 3 ч. Пипетку подводили к PBI и создавали небольшое отрицательное давление в инъекторе. Пипетку осторожно двигали вверхвниз, чтобы убедиться, что верхушка PBI зафиксирована пипеткой. Затем увеличивали отрицательное давление в инъекторе. После того, как столбик вошедшей в пипетку вслед за PBI цитоплазмы ооцита по высоте превысит высоту аспирированного PBI в 1,5–2 раза, прекращали создавать отрицательное давление в инъекторе. Резко двигали пипетку вверх-вниз и вправо-влево. В результате между ооцитом и аспирированной в пипетку частью образовывался тонкий перешеек, который был разорван при дальнейших движениях аспирационной пипетки. Цитопласты переносили из камеры в капли кондиционированной среды дозревания. Лизис полученных цитопластов практически отсутствовал. Для определения эффективности выбранного метода энуклеации часть предполагаемых цитопластов и аспирированных фрагментов ооцитов с РВI окрашивали флуоресцентным витальным ядерным красителем Hoechst 33342. Маточный раствор Hoechst 33342 готовили в воде в концентрации 1 мг/мл, расфасовывали, для защиты от света пробирки заворачивал в фольгу и хранили при –20ºС. Перед использованием маточный раствор разбавляли средой T-PVA до концентрации красителя 5 мкг/мл. Объекты, предназначенные для окрашивания, помещали в раствор красителя на 30 мин при 39ºС в темноте, затем отполаскивали в среде T-PVA. Hoechst 33342 применяли для окрашивания как живых клеток и эмбрионов, так и зафиксированных. Для фиксации подготовленные клетки помещали на 30 мин в 2.5%-ный раствор параформальдегида в T-PVA, а затем переносили в раствор T-PVA и хранили при 4ºС. При последующем окрашивании концентрацию красителя снижали до 2 мкг/мл, а время 68 окрашивания до 15 мин, т.к. мембраны фиксированных клеток легко проницаемы для красителя. Интенсивность люминесценции Hoechst 33342 быстро снижается под воздействием видимого света и, особенно, УФ. Для увеличения продолжительности люминесценции красителя готовили препараты с использованием специального раствора. На предметное стекло наносил 4 столбика из вазелина. В центр обозначенного квадратного поля с помощью микропипетки помещали фиксированный и окрашенный эмбрион (или несколько эмбрионов) в маленькой капле среды. Покровное стекло с помощью глазного пинцета помещали углами на опорные столбики из вазелина. Покровное стекло путем мягкого надавливания препаровальной иглой, контролируя под стереомикроскопом, опускали до контакта с поверхностью капли и далее до контакта с эмбрионом, слегка прижимая эмбрион к предметному стеклу. После этого зазор между покровным и предметным стеклами заполняли раствором, предотвращающим быстрое падение интенсивности свечения Hoechst 33342 (Nguyen et al., 2003): 10 mM Tris–HCl 10 mM EDTA-disodium salts 100 mM NaCl 100 mM mercaptoethylamine pH 7,6–7,8 Раствор добавляли каплями с одной стороны покровного стекла из пипетки, а с противоположной стороны покровного стекла оттягивали его кусочком фильтровальной бумаги. После заполнения пространства между предметным и покровными стеклами указанным раствором покровное стекло по краям тщательно промазывали бесцветным лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание жидкости. 69 Локализацию хроматина выявляли по сине-голубому свечению в УФ лучах под люминесцентным микроскопом (Zeiss, Германия) при длине волны возбуждения 360 нм. Предварительная обработка ооцитов, связанная с удалением клеток кумулюса и zona pellucida, в ранние сроки дозревания, не нарушает связи между PBI и метафазарным веретеном. Первые полярные тельца ооцитов крупного рогатого скота и свиней хорошо различимы как под стереомикроскопом, так и под микроскопом в проходящем свете (рис. 2a, 3а). В отсутствии zona pellucida полярные тельца удерживаются на поверхности ооцитов благодаря связи с материнскими хромосомами и поэтому четко указывают на их расположение (рис. 2b, 3b). 70 Рис. 2. Ооцит крупного рогатого скота без zona pellucida на стадии метафаза II с выделившимся PBI. Объектив х20. a) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в проходящем свете. b) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в УФ свете. Материнские хромосомы ооцита находятся в непосредственной близости от PBI. 71 Рис. 3. Ооцит свиньи без zona pellucida на стадии метафаза II с выделившимся PBI. Объектив х20. a) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в проходящем свете. b) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в УФ свете. Материнские хромосомы ооцита находятся в непосредственной близости от PBI. 72 В нашей работе была показана высокая эффективность метода «слепой» энуклеации ооцитов крупного рогатого скота без zona pellucida – около 97% (табл. 1; Prokofiev et al., 2007). Таблица 1.Эффективность «слепой» энуклеации ооцитов крупного рогатого скота без zona pellucida Число № энуклеированных эксперимента ооцитов n Получено цитопластов n Эффективность энуклеации % 1 13 13 100,0 2 39 35 89,7 3 59 56 94,9 4 27 27 100,0 5 89 89 100,0 Всего 227 220 96,9 Материнские хромосомы удаляются в составе аспирированных фрагментов ооцитов (рис. 4a, b). Цитопласты сохраняют около 97% объема исходных ооцитов (рис. 5a, b). 73 Рис. 4. Фрагменты цитоплазмы, удаленные вместе с первыми полярными тельцами в процессе энуклеации ооцитов крупного рогатого скота. Объектив х10. а) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в проходящем свете. b) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в УФ свете. Материнские хромосомы находятся в удаленных вместе с PBI фрагментах ооцитов. 74 Рис. 5. Энуклеированные ооциты крупного рогатого скота без zona pellucida. Окрашенный Hoechst 33342 препарат в УФ свете. В результате энуклеации ядерный материал удален полностью. Объектив х10. 75 Этот же метод был опробован для энуклеации ооцитов свиней без zona pellucida на стадии MII. Энуклеацию ооцитов свиней проводили, так же как и ооцитов крупного рогатого скота. Всего в 5 экспериментах было проэнуклеированно 233 ооцита свиней. К сожалению 158 полученных цитопластов (67,8%) разрушились в результате лизиса. При проведении энуклеации ооцитов неизбежно происходит нарушение целостности цитоплазматической мембраны. Всякое нарушение её непрерывности, как правило, приводит к гибели клетки в связи с резким нарушением клеточного гомеостаза. Традиционно для повышения устойчивости клеточной мембраны к механическим повреждениям в процессе энуклеации в среду энуклеации добавляют цитохалазин В (Puera et al., 1998; Vajta et al., 2001, 2003; Oback, Wells, 2003). Цитохалазин В вызывает деконденсацию микрофиламентов клеточного цитоскелета, что приводит к увеличению пластичности и адаптивности цитоплазматической мембраны к различным механическим повреждениям. Однако, в наших условиях, отсутствие цитохалазина В в среде энуклеации ооцитов крупного рогатого скота не привело к лизису полученных цитопластов. По аналогии при энуклеации ооцитов свиней в среду также не добавляли цитохалазин В. Высокий уровень лизировавших цитопластов говорит о меньшей устойчивости ооцитов свиней к механическим повреждениям при энуклеации и необходимости добавления цитохалазина В в среду энуклеации. В 5 экспериментах было исследовано 75 полученных цитопластов, приготовленных методом «слепой» энуклеации ооцитов свиней. Хроматин был удален из 73 ооцитов (рис. 6a, b; 7a, b). 76 Рис. 6. Фрагменты цитоплазмы, удаленные вместе с первыми полярными тельцами в процессе энуклеации ооцитов свиней. Объектив х10. а) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в проходящем свете. b) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в УФ свете. Материнские хромосомы находятся в удаленных вместе с PBI фрагментах ооцитов. 77 Рис. 7. Энуклеированные ооциты свиньи без zona pellucida. Объектив х10. а) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в проходящем свете. b) Окрашенный Hoechst 33342 препарат в УФ свете. В результате энуклеации ядерный материал удален полностью. 78 Материнские хромосомы были обнаружены только у 2 ооцитов после энуклеации. Общий уровень эффективности «слепой» энуклеации ооцитов свиней без zona pellucida составил 97,3 % (73/75; табл. 2). Таблица 2. Эффективность «слепой» энуклеации ооцитов свиней без zona pellucida Исследовано Получено Эффективность № предполагаемых цитопластов энуклеации опыта цитопластов n % n 1 19 18 94,7 2 17 17 100,0 3 10 9 90,0 4 21 21 100,0 5 8 8 100,0 97,3 Итого 75 73 Таким образом, «слепая» энуклеация ооцитов крупного рогато скота и свиней без zona pellucida при использовании PBI в качестве указателя расположения материнских хромосом является эффективным методом подготовки цитопластов. 2.2.3. Получение и криоконсервация линий фетальных фибробластов и фибробластоподобных клеток кожи взрослого животного Получение линий фетальных фибробластов крупного рогатого скота. Для получения линий фетальных фибробластов нами был использован метод ферментативной дезагрегации вариантах: «теплая» трипсинизация; «холодная» трипсинизация. (трипсинизация) ткани в двух 79 Полученную в результате трипсинизации суспензию клеток высевали в культуральные флаконы при концентрации 2–2,5 х 105 клеток/мл среды. Флаконы помещали в СО2 инкубатор с 7% СО2 в воздухе при температуре 39ºС. При посеве трисинизации, суспензии через 3 дня клеток, полученной культура клеток методом «тёплой» представляла собой прикрепленные к ростовой поверхности очаги по 20–30 клеток, либо отдельные клетки вытянутой веретенообразной формы. Сомкнутый монослой был достигнут на 10 сутки культивирования. Монослой снимали 0,05%-ным раствором трипсина в 0,02%-ном растворе версена. Клетки пересевали в разведении 1:3. При холодной трипсинизации ткань не полностью дезагрегировала до состояния суспензии, напротив, было отмечено набухание фрагментов. После активного пипетирования дожидались осаждения оставшихся фрагментов ткани в течение нескольких секунд и отбирали надосадочную суспензию клеток в отдельную пробирку. В полученную суспензию добавляли 5% ФСК для инактивации действия трипсина. Дальнейшее культивирование проводили проводили его при «теплой» аналогично трипсинизации. На тому, вторые как сутки культивирования в среде было относительно небольшое количество клеток, не прикрепившихся к культуральной поверхности. На ростовой поверхности культуральных флаклонов отмечали большое количество групп клеток по 5– 12 штук вытянутой веретенообразной формы. Сомкнутый монослой был достигнут на 3 сутки в обоих вариантах «холодной» трипсинизации. При последующем субкультивировании клетки высевали в разведении 1:3. Криоконсервацию культур клеток проводили на 2 или 3 пассаже по достижении не менее 80% монослоя. Получение линий фибробластоподобных клеток кожи взрослого животного. Для получения фибробластоподобных клеток кожи взрослого 80 крупного рогатого скота и свиней были испытаны методы ферментативной дезагрегации («теплая» и «холодная» трипсинизация) ткани и метод эксплантатов. Для ферментативной дезагрегации измельченную ткань обрабатывали так же, как и ткань плода. Причем при «холодной» трипсинизации измельченную ткань выдерживали в растворе трипсина в течение ночи. После обработки ферментом ткани не дезагрегировали, а при «холодной» трипсинизации даже набухли и увеличились в объеме. При последующей попытке пипетировать кусочки ткани частично дезагрегировали. В обоих случаях в суспензии были получены только единичные клетки. В результате переноса их в ростовую среду и последующего культивирования в течение 10 суток получить культуру клеток не удалось. Для получения линии клеток методом эксплантатов кусочки ткани размером примерно 1 мм3 переносили в культуральный флакон, равномерно распределяли по дну шпателем, и осторожно наливали около 1 мл ростовой среды с 50% ФСК. Среды должно быть столько, чтобы только смочить всю поверхность флакона, на которую поместили эксплантаты. Флаконы помещали в инкубатор при 39ºС в атмосфере воздуха с 7% СО2. На следующий день очень осторожно, чтобы не вызвать смещения эксплантатов, добавляли столько ростовой среды, чтобы эксплантаты были погружены в среду на половину своей высоты (примерно 1 мл на флакон). В последующем каждые три дня среду заменяли свежей ростовой средой с 10% ФСК. Большая часть эксплантатов прикрепилась к культуральной поверхности и не смещалась при замене среды. Небольшое количество не прикрепившихся эксплантатов удаляли во время замены среды. На седьмые сутки культивирования обнаружили выселение и прикрепление к поверхности флакона единичных фибробластоподобных клеток. 81 На десятые сутки наблюдали значительный рост клеток и заполнение ими пространства вокруг эксплантатов. На этом этапе эксплантаты механически удаляли. Клетки снимали 0,05%-ным раствором трипсина в 0,02%-ном растворе версена в течение 4 минут при 39ºС и пипетировали до образования равномерной суспензии. Затем наливали 5 мл ростовой среды и продолжали культивирование в том же флаконе. Таким образом, первичная культура была пересеяна без смены флакона. На вторые сутки культивирования фибробластоподобные клетки вытянутой веретенообразной формы закрыли дно флакона почти на 80%. Изредка встречались очаги округлой формы мелких эпителиальных клеток, окруженные крупными клетками квадратной формы по периферии, видимые даже невооруженным глазом в виде белых точек. Полученный монослой клеток снимали 0,05%-ным раствором трипсина в 0,02%-ном растворе версена в течение 3-х мин при 39ºС. Такой продолжительности обработки трипсином не достаточно для отделения эпителиальных клеток, и они остались прикрепленными к подложке. В то же время фибробластоподобные клетки отделились от субстрата при пипетировании и перешли в суспензию. Полученную суспензию посеяли в разведении 1:3 и культивировали до образования монослоя 3 суток. В монослое второго пассажа встречались только единичные очаги эпителиальных клеток. Криоконсервацию полученных линий клеток проводили на 3 пассаже. При подготовке суспензии клеток для криоконсервации время обработки монослоя раствором трипсина было также снижено до 3 мин, что способствовало более полному освобождению от эпителиальных клеток. Клетки после размораживания высевали в концентрации 1–1,5х105 клеток/мл. Таким образом, содержимое одной соломинки использовали для посева клеток в две чашки Петри диаметром 35 мм с 2 мл среды или в один культуральный флакон на 25 см2 с 5 мл среды культивирования. 82 Результаты выделения и криоконсервации линий фетальных фибробластов крупного рогатого скота и фибробластоподобных клеток кожи крупного рогатого скота и свиней. Специального исследования жизнеспособности клеток, прошедших криоконсервацию, не проводили. Однако размороженные клетки после посева быстро прикреплялись к подложке, распластывались и возобновляли клеточный цикл. На следующий день обнаруживалось только небольшое количество неприкрепленных клеток, находящихся во взвеси, что свидетельствует о высокой жизнеспособности клеток, прошедших криоконсервацию. Всего нами было получено и криоконсервировано 2 линии фетальных фибробластов от двух плодов крупного рогатого скота. Из тканей взрослых животных было получено и криоконсервировано 3 линии фибробластоподобных клеток кожи крупного рогатого скота и 2 линии фибробластоподобных клеток кожи свиней (табл. 3). Криоконсервированные линии соматических клеток хранятся в лаборатории в жидком азоте в сосуде Дьюара. Таблица 3. Получение и криоконсервация соматических клеток плода и взрослых животных Вид животного Крупный рогатый скот Свинья Тип клеток Фетальные фибробласты Фибробластоподобные клетки кожи Фибробластоподобные клетки кожи Количество линий n 2 3 2 Таким образом, нами выделены и криоконсервированны первичные линии клеток для использования их в качестве доноров ядер. Наличие нескольких линий клеток очень важно в работе по клонированию животных, 83 учитывая вариабельность в эффективности клонирования при использовании различных линий соматических клеток в качестве доноров ядер. 2.2.4. Получение фетальных фибробластов крупного рогатого скота в G1 фазе клеточного цикла Исследование возможности получения фетальных фибробластов крупного рогатого скота в G1 фазе клеточного цикла в результате самопроизвольного завершения митоза. Выбор стадии клеточного цикла клетки-донора ядра имеет решающее значение для успеха всей процедуры SCNT в целом. Мы в своей работе, как и во многих других лабораториях (Wilmut et al., 1997; Oback, Wells, 2003), использовали клетки в G0 фазе, синхронизированные контактным ингибированием. Однако более подходящим донором ядра может являться клетка в G1 фазе (Kasinathan et al., 2001b). Клетки животных при культивировании in vitro прикреплены к подложке. Во время митоза клетка округляется, её прикрепление к подложке оказывается минимальным, и она может отделяться от неё. Митоз протекает в две фазы – кариокинез и цитокинез. Цитокинез обычно происходит после того, как клетка претерпела деление ядра (кариокинез) в ходе митоза. Цитоплазма и органоиды клетки распределяются между дочерними клетками приблизительно поровну. В результате образуются две полностью разделенные дочерние клетки, которые тут же переходят в G1 фазу клеточного цикла. Нами ставилась цель – выделить клетки на стадии цитокинеза для получения клеток в G1 фазе клеточного цикла в результате самопроизвольного или механического разделения клетки на две дочерние. Для этой цели фетальные фибробласты, прошедшие криоконсервацию после второго пассажа, были разморожены и посеяны в концентрации 5.0 х 84 104 клеток/мл среды в чашку Петри диаметром 100 мм с 10 мл ростовой среды. Культивировали при 39ºС в атмосфере воздуха с 7% СО2. На следующий день в ростовой среде отмечали небольшое количество не прикрепившихся клеток. Для их удаления заменяли среду, после чего продолжали культивирование в течение 2 ч. Затем чашку «встряхивали» на Vortex в течение 1 мин при средних оборотах. Среду собрали и центрифугировали 5 мин при 700 g. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 0.1 мл ростовой среды. При просмотре полученной суспензии под стереомикроскопом обнаружили большое количество клеток с ярковыраженной бороздой деления, что является морфологическим признаком клетки в стадии цитокинеза. Такие клетки собирали вручную стеклянной пипеткой с наружным диаметром 80–100 мкм. Собранные парные клетки размещали индивидуально в микрокапли ростовой среды и помещали в инкубатор при 39ºС в атмосфере воздуха с 7% СО2. Другую часть клеток помещали в микрокапли среды Т-10 и оставляли при комнатной температуре. В обоих вариантах клетки просматривали каждые 10 мин. Клетки в ростовой среде в инкубаторе в течение 20–30 мин, а в среде Т-10 при комнатной температуре в течение 1–1,5 ч прикреплялись к подложке и распластывались. Таким образом, самопроизвольного разделения соматических клеток с ярковыраженной бороздой деления на две дочерние клетки округлой формы, не прикрепленные к подложке, не наблюдали. Получить фетальные фибробласты крупного рогатого скота в G1 фазе клеточного цикла путем самопроизвольного разделения клеток по завершению митоза не удалось. Исследование возможности механического разделения клеток, находящихся на стадии цитокинеза М фазы, для получения клеток в G1 фазе клеточного цикла. Клетки, отобранные на стадии цитокинеза по 85 описанному в предыдущей главе способу, помещали в среде Т-10 в камеру для микроманипуляций. Стеклянной иглой диаметром 2–5 мкм ориентировали клетки таким образом, чтобы плоскость борозды деления была параллельна игле. Кончиком иглы надавливали в месте соединения дочерних клеток между собой. Материнская клетка легко распадалась на две отельные клетки округлой формы. Полученные таким образом клетки переносили в микрокапли ростовой среды, инкубировали при 39ºС в атмосфере воздуха с 7% СО2 и просматривали каждые 10 мин. Лизиса механически разделенных клеток не наблюдали. Все полученные клетки в течение 40 мин прикреплялись к подложке и распластывались. Таким образом, возможно получение клеток в G1 фазе клеточного цикла путем механического разделения клеток, находящихся в цитокинезе М фазы клеточного цикла. Механически разделенные клетки после переноса в ростовую среду быстро прикрепляются к подложке, распластываются и возобновляют клеточный цикл, что свидетельствует о высокой жизнеспособности полученных клеток. 2.2.5. Подготовка пар цитопласт-соматическая клетка к электрослиянию Для использования клеток в качестве доноров ядер сразу после размораживания отбирали 0,05 мл полученной суспензии клеток и переносили в пробирку с 0,5 мл среды T-10. Эти клетки хранились при комнатной температуре и использовались в качестве доноров ядер в течение 2–3 ч. Для дальнейшего культивирования полученную суспензию клеток делили поровну на две чашки Петри диаметром 35 мм, в каждую добавляли по 2 мл ростовой среды. Культивировали при 39ºС в атмосфере воздуха с 7% 86 СО2 до образования монослоя 2–3 суток, а затем еще дополнительно 3–4 суток без замены среды. В этом случае в результате контактного ингибирования популяция клеток оказывается синхронизированной в G0 фазе клеточного цикла (Campbell et al., 1996a; Wilmut et al., 1997; Baguisi et al., 1999; Kues et al., 2000; Reggio et al., 2001; Gibbons et al., 2002; Wells et al., 2003; Yu et al., 2003). Монослой снимали 0,05%-ным раствором трипсина в 0,02%-ном растворе версена. Клетки суспендировали в 0,5 мл ростовой среды. Затем отбирали 0,05 мл суспензии клеток и подготавливали их также как и клетки сразу после размораживания. Для приготовления конструкций отбирали 0,05 мл суспензии клеток со дна пробирки со средой Т-10 и переносили в другую пробирку с 1 мл среды T-PVA. Через 10 мин небольшое количество суспензии клеток со дна этой пробирки переносили стеклянной пипеткой с наружным диаметром 50–100 мкм в микрокапли среды T-PVA. Для приготовления пар цитопласт-соматическая клетка фетальные фибробласты крупного рогатого скота или фибробластоподобные клетки кожи свиней объединяли с цитопластами, приготовленными из ооцитов соответствующих видов животных, вручную под стереомикроскопом в микрокаплях раствора PHA. При этом для использования в качестве доноров ядер отбирали наиболее мелкие клетки правильной округлой формы с гладкой блестящей поверхностью. Цитопласт потоком жидкости из пипетки принуждали прокатиться по лежащему на дне капли фибробласту. После объединения одного фибробласта с цитопластом, пары оставляли в растворе PHA еще в течение 5 мин. Затем пары переносили последовательно в раствор T-PVA и раствор маннитола. При применении раствора фитогемагглютинина 50 мкг/мл в среде TPVA для подготовки пар фибробласты удерживались на поверхности цитопластов и не терялись в ходе последующих манипуляций (табл. 4). 87 Таблица 4. Эффективность приготовления пар освобожденных от zona pellucida цитопласт-фетальный фибробласт крупного рогатого скота при использовании фитогемагглютинина в качестве связующего агента № опыта Использовано цитопластов n 1 2 3 4 5 Итого 76 42 104 40 50 312 Получено пар цитопластсоматическая клетка для элекрослияния n % 73 96,1 41 97,7 101 99,0 37 92,5 46 92,0 95,5 298 Таким образом, объединение освобожденного от zona pellucida цитопласта с соматической клеткой в растворе фитогемагглютинина 50 мкг/мл является высокоэффективным и надежным методом получения пар цитопласт-соматическая клетка для последующего электрослияния. 2.2.6. Воздействие электроимпульса на ооциты крупного рогатого скота в зависимости от наличия кальция в среде Исследовали вероятность активирования ооцитов крупного рогатого скота под воздействием импульса электрического тока в среде, содержащей соли кальция и без добавления кальция. В качестве контроля использовали ооциты, оплодотворенные in vitro или активированные химическим методом. Использовали ооциты в возрасте 20–22 ч от начала дозревания in vitro. Подготовку спермы и оплодотворение ооцитов проводили по методу Parrish et al. (1985). Для активирования химическим методом ооциты обрабатывали в растворе 5 мкМ иономицина в течение 4 мин, а затем инкубировали в течение 4 ч в растворе, содержащем 2 мМ 6-DMAP. 88 Опытные ооциты крупного рогатого скота были подвергнуты одиночному электроимпульсу 1800 В/см продолжительностью 20 мкс в среде элекрослияния, содержащей 270 мМ маннитола, 0,1 мМ MgCl2, 0,5 мМ HEPES, 0,05% BSA с добавлением или без добавления 0,05 мМ CaCl2. Затем ооциты помещали на инкубирование в среду с добавлением 2 мМ 6-DMAP на 4 ч. После этапа инкубирования в присутствии 6-DMAP подвергнутые электроимпульсу и химически активированные ооциты культивировали в течение 12 ч в среде SOF. Полученные зиготы окрашивали Hoechst 33342 и исследовали под микроскопом в УФ свете. Наличие одного (для активированных) или двух (для in vitro оплодотворенных ооцитов) пронуклеусов свидетельствовало об активировании ооцитов. В результате in vitro оплодотворения оплодотворенными оказались 66,7% ооцитов (8 из 12). При химическом активировании пронуклеусы были обнаружены у 80,8% ооцитов (42 из 52; табл. 5). Таблица 5. Активирование ооцитов крупного рогатого скота под воздействием различных факторов Способ активирования Спермием (in vitro оплодотворение) Химическое активирование (иономицин + 6-DMAP) Электроимпульс в среде с кальцием Электроимпульс в среде без кальция Количество экспериментов n Всего ооцитов n Активировано n (%) 1 12 8 (66,7) 3 52 42 (80,8) 2 34 16 (47,1) 1 15 4 (26,7) 89 На этом фоне около половины ооцитов крупного рогатого скота в возрасте 20–22 hpm были активированы в результате проведения электрического импульса в случае присутствия солей кальция в растворе маннитола (рис. 8). Но если в среду не добавляли кальций, то этот показатель резко снизился и составил 26,7% (табл. 5). Рис. 8. Зиготы крупного рогатого скота в возрасте 16 ч, полученные в результате воздействия электрического импульса 1800 В/см 20 мкс в среде с 0,05 мМ CaCl2. и последующего инкубирования в среде 2 мМ 6DMAP в течение 4 ч. Препарат в УФ свете (окраска Hoechst 33342). Активированные ооциты содержат по 1 пронуклеусу (указаны стрелками). Таким образом, отсутствие солей кальция в среде электрослияния позволяет снизить цитоплазмы ооцита. возможность преждевременного активирования 90 2.2.7. Изучение эффективности электрослияния пар цитопластсоматическая клетка в среде без кальция Подготовленные в растворе фитогемагглютинина пары цитопластсоматическая клетка переносили в раствор для электрослияния следующего состава: 270 мМ маннитола, 0,1 мМ MgCl2, 0,5 мМ HEPES и 0,05% BSA, а затем в камеру для электрослияния, заполненную таким же раствором. Пары в камере вручную ориентировали таким образом, чтобы плоскость соприкосновения их мембран была по возможности параллельна электродам. Пары подвергали одиночному импульсу постоянного тока 1800 В/cм длительностью 20 мкс. Пары из камеры перемещали в заранее подготовленные микрокапли среды T-10 под минеральным маслом при температуре 39ºС. Контроль электрослияния проводили через 10–15 мин. Отсутствие солей кальция в среде не сказалось на результатах электрослияния. После проведения электроимпульса конструкции сливались в течение 10–15 мин. Эффективность электрослияния соматических клеток с цитопластами, полученными из ооцитов крупного рогатого скота и свиней, была на уровне 95% (табл. 6). Таблица 6. Эффективность электрослияния пар цитопласт-соматическая клетка в среде без солей кальция Вид животного Количество опытов n Сливали пар n Слилось пар n (%) Крупный рогатый скот Свиньи 12 538 510 (94,8) 3 300 289 (96,3) Таким образом, отсутствие солей кальция в среде электрослияния не оказало негативного влияния на эффективность электрослияния цитопласта и соматической клетки. 91 2.2.8. Активирование реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida химическим методом Ооциты, освобожденные от zona pellucida, обладают повышенной склонность к слипанию друг с другом. Поэтому при активировании одновременно работали с небольшой группой в 10–15 конструкций. Лизис конструкций на данном этапе отсутствовал (табл. 7). Таблица 7. Сохранность реконструированных эмбрионов после их активирования № опыта 1 2 3 4 5 Итого Поставлено на активирование n 75 94 84 97 146 496 Получено пригодных для культивирования n % 70 93,3 85 90,4 80 95,2 94 96,9 138 94,5 94,2 467 Во избежание агрегации конструкций друг с другом на этапе инкубирования в течение 4 ч в среде, содержащей 2 мМ 6-DMAP, их размещали по одной на каплю. Тем не менее, на данном этапе 5,8% реконструированных эмбрионов (29 из 496) прилипали ко дну чашки. Попытка отделить эмбрион от дна при помощи пипетки приводила к его повреждению и лизису. 92 2.2.9. Приготовление питательных сред и метод культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida Осмотическое давление полученных растворов и питательных сред измеряли на осмометре МО 3300 (Advanced Instruments, США). Водородный показатель измеряли на pH метре МР 220 (Metter Toledo, Великобритания) эти показатели сред приведены в табл. 8. Таблица 8. Осмотическое давление и pH приготовленных растворов и питательных сред Раствор или питательная среда SOF T-0 T-PVA Среда электрослияния Осмотическое давление мОсмоль/л 268–274 271–280 270–276 276–278 pH 7,30–7,41 7,26–7,41 7,24–7,32 7,40–7,80 Основные работы с ооцитами, цитопластами, реконструированными эмбрионами проводили в микрокаплях среды, покрытых минеральным маслом. Для культивирования реконструированных эмбрионов применяли систему WOW. Систему готовили за сутки до начала культивирования эмбронов. В каждую лунку четырехлуночного планшета наливали по 0,5 мл среды SOF. Металлическим заточенным стержнем на дне лунки выдавливали 25 ячеек (5 рядов по 5 ячеек). По форме полученные ячейки представляют собой усеченный конус, направленный основанием вверх. Диаметр ячейки по уровню дна лунки 0,46–0,48 мм, диаметр дна ячейки 0,08–0,10 мм. Автоматической пипеткой на 100 мкл под стереомикроскопом тщательно промывали каждую ячейку. Среду удаляли, наливали свежую и сверху закрывали 0,4 мл минерального масла. Так же из среды SOF готовили капли 93 по 50 мкл покрытые минеральным маслом для отмывания конструкций после инкубирования в растворе 6-DMAP. Подготовленный планшет помещали на несколько часов для эквилибрирования в СО2 инкубатор при 39ºС с 7% СО2 в атмосфере воздуха. Реконструированные эмбрионы после инкубирования в растворе 6-DMAP трижды промывали в каплях среды SOF. Стеклянной микропипеткой с наружным диаметром 250 мкм переносили эмбрионы в подготовленный планшет по 25 шт в лунку. Затем эмбрионы размещали по одному в подготовленные в этой лунке ячейки для индивидуального культивирования. Для размещения всех 25 эмбрионов требовалось 25–30 сек. Дробление оценивали через 42–48 ч после активирования, развитие до стадии бластоцисты через 8,5 суток культивирования. Форма ячеек вносит незначительные искажения при наблюдении за эмбрионами и позволяет точно определять количество бластомеров при дроблении эмбриона. Выпадения эмбрионов на ранних стадиях развития из ячеек, связанное с перемещением планшета, не наблюдали. Эмбрионы, развившиеся до стадии бластоцисты, по размерам превышали размеры ячеек и иногда выпадали из них при перемещении планшета. Бластоцисты легко извлекались из ячеек стеклянной микропипеткой с наружным диаметром 400–450 мкм. 2.2.10. Использование криоконсервированных соматических клеток в качестве доноров ядер сразу после оттаивания и после дополнительного культивирования Подготовка клеток для использования в качестве доноров ядер начиналась за 5–7 суток до предполагаемого эксперимента. Эта подготовка включает в себя размораживание клеток и их культивирование. Такая подготовка требует точного графика доставки материала в лабораторию. 94 Поэтому возник вопрос о возможности использования соматических клеток в качестве доноров ядер сразу после размораживания. Для этой цели фетальные фибробласты оттаивали и суспендировали в среде Т-10. В качестве контроля прошедшие криоконсервацию клетки были разморожены, посеяны и культивировались в течение 5–7 суток без пересева и замены среды. Монослой снимали 0,05%-ным раствором трипсина в 0,02%ном растворе версена. В виде суспензии в среде T-10 клетки находились 2–3 ч. В обоих вариантах опыта при подготовке пар в качестве кариопластов отбирали небольшие блестящие округлые клетки. Практически все пары сливались в течение 15 мин после электроимпульса. По уровню дробления реконструированных эмбрионов при использовании в качестве доноров ядер клеток сразу после размораживания и после дополнительного культивирования были получены близкие результаты, до стадии бластоцисты в обоих случаях развивалось около 30% реконструированных эмбрионов (табл. 9; Прокофьев и др., 2008). Таблица 9. Развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота в зависимости от метода подготовки соматических клеток-доноров ядер Фибробласты Реконструирован ных эмбрионов n Число дробившихся эмбрионов n (%) Число бластоцист n (%) Сразу после размораживания (4 повтора) 179 97 (54,2) 52 (29,1) После предварительного культивирования (6 повторов) 203 128 (63,1) 61 (30,1) 95 Таким образом, фетальные фибробласты, криоконсервированные с использованием программного замораживателя, могут использоваться в качестве доноров ядер непосредственно после оттаивания без дополнительного культивирования. 2.2.11. Влияние длительности пребывания ядра соматической клетки в неактивированном цитопласте на эффективность развития реконструированных эмбрионов in vitro В первой серии ооциты, дозревавшие in vitro, были использованы в качестве цитопластов для двух групп реконструированных эмбрионов. Возраст цитопластов ко времени активирования в обеих группах составлял 23–25 ч от начала дозревания. При этом в группе 1 период от электрослияния до активирования реконструированных эмбрионов составлял от 1 до 2 ч, а в группе 2 свыше 3 ч. Различия между группами оказались высоко достоверными по всем определяемым показателям. Больше дробилось и развивалось до стадии 4 бластомеров и бластоцисты реконструированных эмбрионов в случае активирования через 3 ч и больше после электрослияния (табл. 10). Таблица 10. Развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro при разной продолжительности периода от электрослияния до активирования Груп па Число эмбрионов n Дозревание ооцитов ч Интервал до активиро вания ч 1 104 19–22 1–2 2 152 ≤18 3 – 5,5 Развитие эмбрионов ≥2 бластомера n (%) ≥4 бластомера n (%) Бластоциста n (%) 41 (42,3±8,7) a 112 (80,0±8,0) b 20 (20,4±4,0) a 93 (69,6±10,1) b 15 (14,7±4,5) a 59 (43,8±7,5) b В пределах колонок различие между группами достоверно с точностью p < 0,01 a,b 96 Исходная группа дозревавших in vitro ооцитов была одна и та же для обеих групп в каждый день проведения экспериментов (6 повторов). Однако для получения конструкций использовались не совсем идентичные цитопласты. Завершившие дозревание in vitro в период до 18 hpm ооциты были энуклеированы и сразу использованы в качестве цитопластов в группе 2 с длительным периодом пребывания кариопласта в не активированной цитоплазме. Для получения реконструированных эмбрионов группы 1 использовались энуклеированные ооциты, завершившие ядерное дозревание в период от 19 до 22 hpm. Это позволило проводить активирование конструкций обеих групп одновременно. Однако фактор динамики дозревания in vitro ооцитов, используемых в качестве цитопластов, мог оказать влияние на полученные результаты. Для выяснения этого предположения было проведено несколько экспериментов на основе общих дозревавших in vitro исходных партий ооцитов. Для обеих групп продолжительность периода от электрослияния до активирования реконструированных эмбрионов составляла 3,2 ч. Но в качестве цитопластов были использованы энуклеированные ооциты, завершившие ядерное дозревание к 18 hpm (группа 1, табл. 11), или в период от 18,5 до 20 hpm (группа 2, табл. 11). По дроблению эти группы не различались. Однако до стадии 4 бластомеров и бластоцисты развивалось больше реконструированных эмбрионов, полученных на основе энуклеированных ооцитов, завершивших ядерное дозревание in vitro в более короткий срок (табл. 11). 97 Таблица 11. Развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, полученных при использовании ооцитов разного срока дозревания Группа Число эмбрио нов n Дозревание ооцитов ч Интервал до активирования ч 1 101 ≤18 3,2 2 80 18,5–20 3,2 Развитие эмбрионов ≥2 ≥4 Бластоцис бластомера бластомера та n (%) n (%) n (%) 70 60 44 (70,5±8,9) (60,2±8,6) (43,8±7,0) 58 43 30 (71,7±3,1) (51,9±3,5) (35,4±3,4) При учете всех экспериментов с длительностью пребывания ядра соматической клетки в не активированной цитоплазме ооцита в среднем от 3,0 до 3,7 ч показатели дробления, достижения стадии 4 бластомеров и развития до стадии бластоцисты были достоверно выше при использовании дозревших к 18 hpm ооцитов-цитопластов (группа 1; табл. 12), чем дозревших за более длительный период (группа 2; табл. 12). Таблица 12. Развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro в зависимости от сроков дозревания ооцитов-реципиентов и времени активирования конструкций Группа Число эмбрионов n Дозревание ооцитов ч 1 109 18–20 2 340 ≤18 3 313 ≤18 Интервал Развитие эмбрионов до ≥2 ≥4 Бластоцист активировабластомера бластомера а ния n (%) n (%) n (%) ч 73 54 34 3–3,7 (67,7±4,7) (49,1±3,9) (31,0±5,1) 255 201 130 3–3,2 (74,6±4,2) (61,2±4,5) (40,2±4,0) 222 186 136 4–5 (72,9±4,8) (62,8±5,6) (46,4±5,0) В большинстве последующих экспериментов в качестве цитопластов нами были использованы энуклеированные ооциты, дозревание которых в 98 условиях in vitro завершалось к 18 hpm. При увеличении продолжительности периода от электрослияния до активирования до 4–5 ч выход бластоцист имел тенденцию к увеличению и составил 46,4% (группа 3; табл. 12), хотя по общему дроблению и дроблению до 4 бластомеров различий с группой 2 не наблюдалось. Для 155 реконструированных эмбрионов срок активирования после электрослияния был увеличен до 5,5–6,0 ч (группа 1; табл. 13). Таблица 13. Развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro при продолжительности периода от электрослияния до активирования свыше 5 ч Развитие эмбрионов Число Интервал до ≥2 ≥4 Группа эмбрионов активирования Бластоциста бластомера бластомера n ч n (%) n (%) n (%) 102 80 55 1 155 5,5– 6,0 (72,4±8,1) (55,5±5,5) (35,6±4,3) 707 552 380 2 1038 1,0 – 5,7 (69,4±2,9) (54,3±3,1) (37,6±2,6) К сожалению, в этой группе в качестве цитопластов в разные дни (всего проведено 5 повторов) использовались энуклеированные ооциты разного срока дозревания. Дробление, развитие до стадии ≥4 бластомеров и бластоцисты у реконструированных эмбрионов группы 1 (табл. 13) точно соответствовали этим показателям общей группы 2 (табл. 13). 99 3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Развитие методов созревания яйцеклеток млекопитающих in vitro позволило подойти к решению проблемы использования для генной инженерии и клонирования животных ооцитов, полученных из убойного материала. Яйцеклетки млекопитающих до овуляции находятся на стадии диплотены профазы первого деления мейоза. После извлечения ооцитов из фолликулов и помещения их в соответствующую среду у большинства ооцитов самопроизвольно возобновляется мейоз, который продолжается до остановки на метафазе второго деления мейоза. Условия дозревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro оказывают существенное влияние на дробление зигот и последующее развитие эмбрионов до стадии бластоцисты (Rose, Bavister, 1992). Клетки кумулюса, окружающие ооцит, участвуют в синтезе и транспорте питательных веществ в ооцит. Кроме того, они генерируют сигналы, которые регулируют метаболизм ооцита, ядерное и цитоплазматическое дозревание (Osborn, Moor, 1982). Вместе с тем было показано, что освобождение ооцитов крупного рогатого скота от клеток кумулюса через 15 hpm не оказывает отрицательного влияния на последующее развитие клонированных или партеногенетически активированных эмбрионов крупного рогатого скота (Galli et al., 2002; Li et al., 2006). Динамику дозревания in vitro ооцитов крупного рогатого скота наблюдали с 30-минутным интервалом с 16 до 24 hpm. Более 47% ооцитов достигли MII фазы к 17,5 hpm, представляя собой довольно компактную группу «ранодозревших» ооцитов. Вторая группа, составляющая около 28% всех ооцитов, достигли MII фазы в период с 18 до 20 hpm. Таким образом, при созревании ооцитов крупного рогатого скота in vitro по срокам дозревания формируются две относительно компактные группы. 100 Многочисленные исследования показывают, что при созревании ооцитов свиней in vitro фазы мейоза протекают в них несинхронно (Motlik, Fulka, 1976; Yoshida et al., 1989; Funahashi et al., 1993; Grupen et al., 1997). Несинхронность фаз мейоза в свиных ооцитах во время дозревания может быть объяснено вариабельностью в стадиях развития ооцитов на начало культивирования (Funahashi et al., 1997). Свиные ооциты, как правило, дозревают in vitro в течение 40–44 ч от начала культивирования (Betthauser et al., 2000; Miyoshi et al., 2000; Park et al., 2002; Lai et al., 2002). Однако 36% ооцитов дозрели до фазы МII к 24 hpm (Miyoshi et al., 2002). Таким образом, процесс дозревания ооцитов свиней in vitro оказывается растянутым почти на сутки. Рядом исследований показана возможность синхронизации фаз мейоза у ооцитов свиней при созревании их in vitro при использовании циклогексимида. В процессе дозревания ооцитов происходит синтез ряда регуляторных белков, в частности циклина В. Циклин В является регуляторной субъединицей MPF, который вызывает GVBD и PCC и ооцит переходит в фазу MII. Циклогексимид, являясь неспецифическим ингибитором синтеза протеина, ингибирует синтез циклина В, в результате развитие ооцита блокируется на стадии GV (Fulka et al., 1986; Kubelka et al., 1988; Jung et al., 1993; Rozinek et al., 1995). На основании этих исследований была предложена двушаговая система дозревания ооцитов свиней in vitro. Сущность ее заключается в том, что вначале дозревание проводят в среде, содержащей ингибитор дозревания, затем, тщательно отполоскав, ооциты переносят в среду без ингибитора (Krischek, Meinecke, 2001). Действие циклогексимида на ооциты свиней обратимо и не оказывает токсического эффекта. Fulka et al. (1986) инкубировали ооциты свиней в 101 течение суток в среде с 5 мкг/мл циклогексимида, а затем еще сутки в среде без циклогексимида. При этих условиях GVBD наблюдали у 95% ооцитов. Мы культивировали КОК свиней в среде дозревания с циклогексимидом в течение 24 ч, затем переносили в среду без циклогексимида. Динамику дозревания in vitro ооцитов свиней наблюдали с 60-ти минутным интервалом от 40 до 48 hpm. Общий уровень дозревания ооцитов свиней составил 62,4%. Большая часть дозревших ооцитов (около 47% всех ооцитов) достигли MII фазы к 41 hpm. Около 13% всех ооцитов достигли фазы MII в течение следующих трех часов в период с 42 до 44 hpm. Таким образом, при дозревании in vitro ооцитов свиней нам удалось их синхронизировать и получить компактную по времени дозревания группу ооцитов. Это оказалось существенным для энуклеации ооцитов без zona pellucida «слепым» методом. Энуклеация – очень важный этап в процессе клонирования животных. Фактически при энуклеации происходит механическое разделение ооцита на две части – не содержащую хроматин (цитопласт) и содержащую материнский хроматин. От того, насколько эффективно будет произведено это разделение, зависит дальнейший успех развития реконструированного эмбриона. При неполном удалении материнского хроматина может возникнуть анеуплоидия. Развитие такого эмбриона, как правило, не происходит, в редких случаях развиваются особи с резко выраженными аномалиями. Имеются сообщения о том, что уменьшение объема цитопласта не отражается на уровне дробления и числе образования бластоцист, однако вызывает достоверное снижение числа клеток в составе бластоцист, что может оказать отрицательное влияние на последующее развитие плода (Westhusin et al., 1996; Zakhartchenko et al., 1997; Peura et al., 1998; Greising, Jonas, 1999). Поэтому при подготовке цитопластов методом разрезания ооцитов пополам для получения одного реконструированного эмбриона 102 необходимо использовать два цитопласта (Peura et al., 1998; Vajta et al., 2001; Booth et al., 2001). Энуклеация оказывает прямое влияние на ультраструктуру получаемого цитопласта. В результате энуклеации могут разрушаться некоторые компоненты цитоплазмы, либо их количество резко уменьшается в результате удаления части вместе с генетическим материалом (Greising, Jonas, 1999). Даже если донорское ядро способно обеспечить дальнейшее развитие реконструированного эмбриона до стадии бластоцисты, само развитие может не начаться, если процессы метаболизма будут ограничены в результате повреждений цитоплазмы ооцита. При энуклеации ооцитов крупного рогатого скота и свиней на стадии MII веретено деления и метафазарная пластинка не визуализируются при световой микроскопии. В большинстве работ PBI не считается точным указателем расположения хромосом. В ходе подготовки ооцита к процедуре SCNT оно подвергается механическому воздействию, особенно при удалении клеток кумулюса. В результате этого PBI может сместиться относительно места его первоначального расположения (Bordignon, Smith, 1998; Mitalipov et al., 1999; Nour, Takahashi, 1999; Dominko et al., 2000; Liu et al., 2000). Для определения локализации флуоресцентным витальным хроматина красителем используют Hoechst окрашивание 33342. Краситель специфически связывается с аденином и тимином, входящими в состав ДНК, образуя флуоресцирующие комплексы с длинной волны возбуждения – 346 нм и длинной волны эмиссии – 460 нм (Comings, 1975; Muller, Gautier, 1975; Richards et al., 1985). При исследовании под микроскопом в УФ лучах локализация хроматина выявляют по сине-голубому свечению. Однако использование данного метода имеет один серьезный недостаток – облучение УФ лучами может повреждать ДНК и/или некоторые органеллы клетки. Облучение ооцитов крупного рогатого скота в течение 10 сек не оказывает отрицательного влияния на развитие клонированных 103 эмбрионов (Dominko et al., 2000; Kubota et al., 2000; Onishi et al., 2000; Loi et al., 2001; Forsberg et al., 2002). Экспозиция более 30 сек приводит к повреждению мембраны и нарушению синтеза протеина в ооцитах крупного рогатого скота (Smith, 1993). При работе с ооцитами без zona pellucida по мере выделения PBI оно удерживается на поверхности только до того времени, пока существует связь с веретеном деления (Nour, Takahashi, 1999). Это позволяет вместе с PBI гарантированно удалять весь материнский хроматин при очень незначительном снижении объема полученного цитопласта в сравнении с ооцитом до энуклеации. Это нашло свое подтверждение в наших экспериментах по энуклеации «слепым» методом ооцитов крупного рогатого скота и свиней без zona pellucida. Полученная эффективность энуклеации ооцитов крупного рогатого скота составила 96,9% (220 цитопластов из 227 ооцитов), ооцитов свиней – 97,3% (73 цитопласта из 75 ооцитов). При этом в наших условиях при энуклеации ооцитов без zona pellucida методом аспирирования при помощи микроманипулятора удалялось меньше 3% объема цитопласта, что согласуется с данными Oback, Wells (2003). Поэтому для получения реконструированных эмбрионов мы объединяли один фетальный фибробласт с одним энуклеированым ооцитом. Таким образом, при энуклеации MII ооцитов крупного рогатого скота и свиней без zona pellucida методом «слепой» энуклеации PBI может служить точным указателем места расположения материнского хроматина. Кроме того, слепая энуклеация ооцитов без zona pellucida по технике исполнения несколько проще по сравнению с традиционной методикой, так как не требуется предварительная фиксация ооцита, а инструменты просты в изготовлении: не требуется присоска, аспирационная пипетка не затачивается. Всякое нарушение непрерывности поверхностной клеточной мембраны при энуклеации, как правило, приводит к гибели клетки в связи с резким 104 нарушением клеточного гомеостаза. Чтобы избежать этого в большинстве работ в среду энуклеации добавляют цитохалазин В (Liu et al., 2002). Цитохалазин дестабилизирует кортикальные мирофиламенты, делает клеточную мембрану более пластичной и устойчивой к повреждениям при микроманипуляциях. Поэтому считается, что цитохалазин В играет исключительно благоприятную роль в резком повышении клеточной устойчивости к механическим повреждениям в процессе энуклеации. В нашей работе мы не добавляли цитохалазин В в среду энкулеации, тем не менее, лизис цитопластов крупного рогатого скота практически отсутствовал. Таким образом, в наших условиях оказалось возможным проводить этап энуклеации ооцитов крупного рогатого скота без добавления в среду цитохалазина В. При энуклеации ооцитов свиней в таких же условиях большая часть цитопластов лизировала в течение 30 мин после энуклеации. Этот факт необходимо учитывать при энуклеации ооцитов свиней. Использование в качестве доноров ядер клеток взрослых животных имеет огромное значение при воспроизводстве животных, показавших высокие хозяйственно-полезные качества (быки-производители, коровырекордистки по удою) и, соответственно, имеющие уникальный редко возникающий генотип, который не может быть полностью передан потомкам при традиционных способах размножения. Кроме того, открываются широкие перспективы по сохранению исчезающих видов животных и восстановлению их численности. Но продолжительность жизни культур клеток, полученных из тканей взрослого животного не достаточна для проведения их генетической трансформации in vitro с целью получения трасгенных животных. Культуры клеток, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с культурами из соответствующих тканей взрослых животных. Продолжительность жизни культур клеток, полученных из эмбриональных 105 тканей, позволяет провести их генетическую трансформацию in vitro и в последующем использовать их в системе по получению трансгенных животных. Для использования в качестве клеток-доноров ядер было необходимо получить и криоконсервировать линии фибробластов плодов крупного рогатого скота и линии фибробластоподобных клеток кожи крупного рогатого скота и свиней. Клетки в ткани и клетки, растущие в монослое, прикрепляются друг к другу и субстрату при помощи мукопротеидов и в некоторых случаях коллагена. По этой причине для диссоциации тканей и отделения клеток от монослоя используются растворы протеаз. Традиционно для этих целей используется трипсин. Длительная инкубация клеток с трипсином оказывает повреждающее действие на клетки. Лучшим способом инактивации действия трипсина является добавление сыворотки крови (или среды с сывороткой крови), которая содержит естественный ингибитор трипсина. Испытанные нами варианты метода ферментативной дезагрегации тканей плода крупного рогатого скота имели примерно равную эффективность при получении первичных линий клеток. Однако метод «холодной» трипсинизации имеет некоторые преимущества по сравнению с «теплой» трипсинизацией. Фибробласты, полученные «холодной» трипсинизацией, быстрее прикреплялись к субстрату и приступали к пролиферации, в то время как при «теплой» трипсинизации к субстрату прикрепились только единичные фибробласты. Кроме того, обнаруженные на вторые сутки культивирования многочисленные клетки во взвеси в ростовой среде при «теплой» трипсинизации говорят о повреждающем действии трипсина на клетки при таком методе дезагрегации ткани. При 4°С трипсин проникает в межклеточный матрикс, минимально проявляя свою ферментативную активность. При последующем помещении в термостат трипсин начинает действовать не только на поверхности кусочка ткани, но и 106 в глубине его. В результате чего снижается общее время обработки ткани трипсином. Таким образом, «холодная» трипсинизация является более щадящим методом дезагрегации ткани и оказывает меньшее повреждающее действие на клетки по сравнению с «теплой» трипсинизацией. Кроме того «теплая» трипсинизация в сравнении с «холодной» трипсинизацией требует больших затрат времени на обработку, большего расхода материалов и дополнительного оборудования (магнитная мешалка). При последующем субкультивировании линий клеток, полученных как «теплой», так и «холодной» трипсинизацией, не было выявлено разницы в скорости пролиферации и времени достижения монослоя. Для получения фибробластоподобных клеток кожи крупного рогатого скота и свиней нами были испытаны метод трипсинизации и метод эксплантатов. Методом трипсинизации, как по варианту «теплой», так и «холодной», была получена суспензия с единичными клетками, первичную культуру из которых получить не удалось. Поэтому был испытан метод эксплантатов. При использовании метода эксплантатов нами преследовалась цель – достичь прикрепления эксплантатов к субстрату, выселения фибробластоподобных клеток из эксплантатов и их дальнейшего роста с образованием монослоя. Использование небольшого количества питательной среды, содержащей 50% сыворотки крови, на начальном этапе культивирования способствует с одной стороны улучшению питания эксплантатов, а с другой способствую фиксированию кусочков на поверхности дна флакона. Это, в свою очередь, способствует началу выселения из эксплантатов клеток. После того, как вокруг эксплантатов начали развиваться очаги клеток, интенсивно делился только внешний слой клеток, а во внутренних слоях клетки находятся в состоянии контактного ингибирования. Поэтому снятие монослоя сразу после удаления эксплантатов и посев его в том же флаконе 107 включает в процесс размножения большее количество клеток, что приводит к быстрому заселению клетками всей поверхности дна флакона. Полученная культура представляла собой по морфологическим признакам смесь фибробластоподобных и эпителиальных клеток. Нами была предпринята попытка получения более чистой культуры фибробластоподобных клеток. Сокращение времени обработки трипсином до 3-х мин не повлияло на отделение фибробластоподобных клеток от поверхности культивирования, но оказалось недостаточным для отделения эпителиальных клеток. Таким образом, метод эксплантатов оказался оптимальным способом получения фибробластоподобных клеток кожи крупного рогатого скота и свиней. Применение питательной среды с 50% сыворотки в первые сутки культивирования способствует фиксации эксплантатов на субстрате и последующему выселению клеток. Выбор способа низкотемпературной консервации клеток оказывает решающее влияние на их качество для использования в качестве доноров ядер. При световой микроскопии клеток, замороженных без регулируемого снижения температуры и с регулируемым понижением температуры, различий выявлено не было. При электронной же микроскопии было выявлено повреждение мембран у клеток, прошедших процедуру замораживания без регулируемого понижения температуры. Это объясняет низкую эффективность электрослияния последних с цитопластами по сравнению с клетками, замороженными по программе (Hayes et al., 2005). Поэтому мы замораживали соматические клетки с регулируемым снижением температуры с использованием программного замораживателя. Замораживание клеток в концентрации 2,5–3 х 106 на 1 мл среды позволяет использовать одну соломинку для засева двух чашек Петри диаметром 35 мм (2 мл среды) либо одного флакона на 25 см2 (5 мл среды). 108 Специального исследования жизнеспособности клеток, прошедших криоконсервацию, мы не проводили, однако размороженные клетки после посева быстро прикреплялись к подложке, распластывались и возобновляли клеточный цикл (за исключением незначительной части предположительно погибших, которые оставались во взвеси). Полученные результаты в совокупности могут свидетельствовать об отсутствии значительных повреждений фетальных фибробластов при криоконсервации в наших условиях. Криоконсервацию фетальных фибробластов проводили по достижению монослоя не менее 80%, в это время около 80% клеток находится в G0/G1 фазе клеточного цикла (Hayes et al., 2005). Мы предположили, что и после оттаивания клетки в G0/G1 фазе будут составлять около 80% всей клеточной популяции в суспензии. При дополнительном культивировании в течение 5–6 суток без замены среды, суспензия будет представлена в основном клетками в G0 фазе клеточного цикла (Campbell et al., 1996a; Kasinathan et al., 2001a). Эффективность процесса SCNT зависит от многих факторов. Один из широко дискутируемых вопросов – значение фазы клеточного цикла донора ядра. Основная цель при введении донорского ядра в цитопласт – восстановление нормального количества хромосом. В ряде работ показана высокая эффективность клонирования при использовании цитопластов, полученных из неактивированных MII ооцитов, в сравнении с цитопластами, полученными из предварительно активированных ооцитов (Wakayama et al., 2001a; Heyman et al., 2003). Основное отличие цитоплазмы неактивированного ооцита – это высокая активность MPF. При введении донорского ядра в S фазе в цитоплазму MPF индуцирует целый ряд хромосомных аномалий: анеуплодию, фрагментацию хромосом, слипанию хроматина, разрывы хромосом (Collas et al., 1992). При использовании клеток доноров ядер в G2 фазе клеточного цикла после завершения PCC и формирования ядерной оболочки начинается 109 репликация ДНК, что приводит к избытку ДНК в ядре (Blow, Laskey, 1988; Collas et al., 1992; Barnes et al., 1993; Campbell et al., 1993; Fulka et al., 1996). Наиболее подходящими для использования в качестве доноров ядер считаются клетки в G0–G1 фазе клеточного цикла (Campbell et al., 1996a, b). Первое потомство использовании по технологии эпителиальных сихронизированных на клеток SCNT было молочной получено железы G0 фазе клеточного цикла при овцы, сывороточным голоданием (Wilmut et al., 1997). Авторы высказали предположение, что G0 фаза клеточного цикла – необходимое условие для полного репрограммирования ядра. Широкое использование клеток в G0 фазе объясняется легкостью синхронизации путем сывороточного голодания или контактного ингибирования. Однако в популяции фетальных фибробластов свиньи на пятые сутки сывороточного голодания менее 50% клеток были G0 фазе. Отбор из такой популяции наиболее мелких округлых клеток позволил получить около 72% клеток в G0 фазе (Boquest et al., 1999). После переноса коровам-реципиентам эмбрионов, полученных в результате реконструкции цитопласта клетками-донорами ядер, происходящих из различных тканей и синхронизированных сывороточным голоданием, уровень развития до родов был не высок. Он составлял 0–6% для фибробластоподобных клеток кожи (Dominko et al., 1999; Zakhartchenko et al., 1999; Kishi et al., 2000), 4–25% для эпителиальных клеток молочной железы (Zakhartchenko et al., 1999; Kishi et al., 2000) и 10% для клеток гранулезы (Wells et al., 1999). Уровень развития эмбрионов до стадии бластоцисты при реконструкции цитопласта клетками-донорами ядер в G0 и G1 фазе клеточного цикла был примерно равный (22% и 25% соответственно), но после переноса этих эмбрионов 50 телкам-сурогатным матерям было получено 0 и 5 телят, соответственно (Kasinathan et al., 2001а, b). 110 Urakawa et al. (2004) использовали фетальные фибробласты в качестве доноров ядер в G1 фазе клеточного цикла. В результате переноса 10-ти телкам-реципиентам 10 реконструированных эмбрионов на стадии бластоцисты было получено 9 живых телят. Таким образом, эмбрионы, полученные при реконструкции цитопласта соматической клеткой в G1 фазе оказались более способны к развитию после переноса их самкам-реципиентам. Для синхронизации клеточной популяции используют ингибиторы клеточного цикла, которые, однако, с одной стороны не дают 100% синхронизации, а с другой стороны могут оказывать цитотоксическое действие (Cooper, 1998). Альтернативным путем без использования цитостатиков является отбор клеток по морфологическим признакам в стадии цитокинеза митотического деления. На этой фазе клетки отделяются от субстрата и представляют собой клетку, поделенную глубокой бороздой деления на две части сферической формы. Клетки такой морфологии легко различимы при световой микроскопии и могут быть собраны вручную при помощи пипетки под стереомикроскопом. Две дочерние клетки, получившиеся в результате разделения материнской, сразу переходят в G1 фазу клеточного цикла и могут быть использованы в качестве доноров-ядер. Делящиеся клетки можно собрать из среды культивирования, просматривая чашку с культурой под световым микроскопом. Несмотря на то, что для реконструкции цитопластов требуется небольшое количество клеток-доноров ядер, данная методика требует больших затрат времени. Так для сбора 30 клеток, из которых можно получить 60 доноров ядер, было затрачено около 30 мин (Oback, Wells, 2003). Усовершенствование данной методики привело к созданию «sake-off» метода (Kasinathan et al., 2001b). В этом случае у пролиферирующей культуры клеток вначале проводят замену питательной среды, что позволяет освободиться от погибших, неприкрепившихся к субстрату клеток. Встряхивание сосуда с клетками 111 через 2 ч после замены среды на Vortex вызывает отделение клеток, находящихся в фазе цитокинеза, от субстрата. Последующая концентрация клеток путем центрифугирования сокращает время, необходимое для поиска и сбора клеток. Уловить момент времени от разделения материнской клетки на две дочерние до их прикрепления к субстрату нам не удалось. Поэтому была предпринята попытка механического разделения клетки, находящейся в стадии цитокинеза, на микроманипуляторе. Не смотря на то, что в среду для микроманипуляций цитохалазин В не добавляли, лизиса клеток не наблюдалось. Это говорит о незначительном повреждении цитоплазматической мембраны в результате разделения. Механически разделенные клетки могут сохраняться в среде Т-10 в комнатных условиях в течение 1–1,5 ч и быть использованы в качестве доноров ядер при реконструкции цитопластов. Эти же клетки, перенесенные в ростовую среду, прикреплялись к субстрату и начинали пролиферировать, что говорит о 100% жизнеспособности полученных таким способом клеток. Таким образом, можно получить достаточное количество соматических клеток, находящихся в G1 фазе клеточного цикла, для использования их в качестве доноров ядер без применения цитостатиков, путем отбора вручную под стереомикроскопом клеток в фазе цитокинеза и последующим механическим разделением их на дочерние клетки на микроманипуляторе. На сегодняшний день предложены два основных способа введения донорского генома в цитопласт: путем инъекции донорского ядра в цитопласт или путем электрослияния цитопласта и целой клетки-донора ядра. Не смотря на то, что ядра могут быть перенесены путем инъекции в цитоплазму (Collas, Barnes, 1994), все же наиболее широко применяемым методом является электрослияние. Условием успешного электрослияния является тесный контакт мембран цитопласта и клетки донора ядра. После инъекции клетки-донора 112 ядра в перивителлиновое пространство для усиления контакта пары помещают в гипотонический раствор. В результате объемы как цитопласта, так и соматической клетки увеличиваются, они принимают более округлую форму и контакт в месте соприкосновения мембран усиливается. Для более надежного контакта используется метод локальных электродов. Такие электроды представляют собой две вольфрамовых проволочки, между которыми при помощи микроманипулятора зажимается цитопласт и клеткадонор ядра. При использовании цитопластов без zona pellucida клетка-донор ядра может быть фиксирована на его поверхности при помощи лектина, выделенного из фасоли обыкновенной – фитогемагглютинина. В наших условиях один цитопласт соединяли с одним фетальным фибробластом. Выдерживание в растворе еще 5 мин после объединения надежно фиксировало клетку на поверхности цитопласта. Отделение клеток не наблюдали при последующих манипуляциях, связанных с переносом полученных пар микропипеткой. Кроме того, при данном методе отпадает необходимость использования микроманипулятора на этапе подготовки пар. Однако обработка цитопластов в растворе фитогемагглютинина может отрицательно повлиять на последующее развитие реконструированных эмбрионов в виду того, что некоторые растительные лектины обладают цитотоксическим действием (Ashworth et al., 1995) и нарушают развитие предымплантационных эмбрионов мышей (Reeve, 1982; Johnson, 1986). Booth et al. (2001) показали, что выдерживание зигот крупного рогатого скота без zona pellucida в растворе фитогемагглютинина 300 мкг/мл в течение 5 мин не снижает уровня их развития до стадии бластоцисты, по сравнению с развитием зигот не обработанных фитогемагглютинином. Для успешного проведения электрослияния необходимо, чтобы соответствующий импульс был применен к точно ориентированным по отношению к электродам парам клеток, имеющим тесный контакт на участке 113 соприкосновения их мембран. При использовании в качестве цитопласта двух половинок ооцита конструкции под воздействием переменного электического поля прикрепляют непосредственно к одному из электродов (Peura, Vajta, 2003; Tecirlioglu et al., 2003). Таким образом, мембрана цитопласта, не защищенная zona pellucida, вступает в прямой контакт с одним из электродов. Для облегчения последующего отделения от электродов и предотвращения возможного повреждения мембраны конструкции электроды предварительно обрабатывают раствором с высоким содержанием белка (Vajta et al., 2005). Мы не использовали переменное электрическое поле в камере ни до, ни после проведения импульса электрослияния, при этом уровень электрослияния клеток в наших экспериментах составлял свыше 95%. Видимо, фитогемагглютинин обеспечивает создание достаточно плотного контакта между мембранами клеток на площади их соприкосновения. В состав среды электрообработки включают 0,1–0,3 М маннитола. При обеспечении необходимого осматического давления это уменьшает электропроводимость среды (а соответственно выделение тепла при протекании тока – закон Джоуля-Ленца), а также предотвращает коллоидноосмотический лизис клеток после пробоя (Kinosita, Tsong, 1977). Поскольку электрический пробой приводит к резкому, хотя и временному, неспецифическому увеличению проницаемости плазматических мембран, жизнеспособность клеток сильно зависит от состава среды, в которой проводится электрообработка. Одновалентные ионы (Na+, K+, Li+) в среде электрообработки не влияют на жизнеспособность клеток после электрослияния. Двухвалентные ионы могут приводить к лизису и последующей гибели клеток (Rols, Teissie, 1989). Подъем концентрации внутриклеточного кальция является основным пусковым механизмом, вызывающим активирование ооцита. 114 Электрический импульс вызывает проникновение ионов Ca2+ из окружающей среды в цитоплазму ооцитов, и вызывают активирование (Whittingham, 1980; Ducibella et al., 1988; Marcus, 1990). В отсутствие солей кальция в среде, даже при оптимальных параметрах электроимпульса, не происходит подъема концентрации ионов Ca2+ в цитоплазме ооцитов свиней (Sun et al., 1992) и крупного рогатого скота (Collas et al., 1993). Sun et al. (1992) сделали предположение, что нахождение трансплантированного ядра в условиях неактивированной цитоплазмы в течение некоторого периода времени может способствовать более полному репрограммированию ядра. Для предотвращения активирования ооцитов во время воздействия импульса электрического тока нами была предпринята попытка использовать среду электрослияния без добавления солей кальция. При этом в контрольных экспериментах уровень активирования ооцитов составил около 26%, в то время как при использовании среды с солями кальция, количество активированных было почти в два раза выше – 47%. В нашей работе электрослияние осуществлялось в растворе маннитола без добавления солей кальция. Около 95% всех пар цитопласт-соматическая клетка сливалось в течение 10–15 мин. Таким образом, можно использовать среду электрослияния, не содержащую соли кальция. Это не снижает эффективность электрослияния цитопласта с соматической клеткой-донором ядра, но способствует предотвращению преждевременного активированя конструкций. Активирование еще один важный этап процедуры NT. Ооциты млекопитающих до оплодотворения останавливаются в MII фазе за счет высокой активности MPF. При повышении внутриклеточной концентрации кальция снижается активность MPF, что приводит к завершению мейоза, 115 формированию пронуклеуса и синтезу ДНК (Collas et al., 1993; Verlhac et al., 1994). При естественном оплодотворении, в результате проникновения спермия возникают осциллирующие возрастания концентрации кальция в цитоплазме. Предложены различные методы и средства активирования ооцитов: электрический ток, этанол, иономицин. Действие физических и химических агентов основано на повышении концентрации внутриклеточного кальция (Presicce, Yang, 1994; Soloy et al., 1997; Liu et al., 1998; Mitalipov et al., 1999). Однако у «молодых» ооцитов активность MPF быстро восстанавливается и ооцит останавливается в так называемой MIII фазе. Что бы избежать этого блокирования дополнительно применяют обработку ингибиторами синтеза белка (циклогексимид) или ингибитором фосфорилирования (6-DMAP; Soloy et al., 1997; Liu et al., 1998). При этом инкубирование ооцитов мышей и крупного рогатого скота в растворе 6-DMAP без предварительного подъема концентрации внутриклеточного Ca2+ не вызвало их активирования (Szöllösi et al., 1993; Liu et al., 1998). Единичный электроимпульс вызывает повышение концентрации внутриклеточного кальция (Sun et al., 1992). При оптимальном режиме (1000 В/см 60 мкс, дважды) и содержании в среде 0,1мМ кальция активировалось 100% ооцитов свиней с образованием пронуклеусов (Sun et al., 1992). При активировании ооцитов крупного рогатого скота электроимпульсом в среде, содержащей 0,1 мМ кальция, в сочетании с последующим инкубированием с 6-DMAP, дробилось 79,2 и 69,1 и развивалось до бластоцисты 15,1 и 27,3% ооцитов в возрасте 20 или 24 hpm, соответственно (Shen et al., 2008). По данным First et al. (1992) электрический импульс в среде с солями кальция вызывает активирование ооцитов крупного рогатого скота, однако, уровень развития до стадии бластоцисты не высокий. 116 При обработке ооцитов иономицином, а затем 6-DMAP наблюдали высокий уровень активирования, образования пронуклеусов и развития до стадии бластоцисты как у овец (Loi et al., 1998a, b), так и у крупного рогатого скота (Liu et al., 1998). Мы на этапе электрослияния использовали среду без солей кальция для предотвращения их активирования на этом этапе. Активирование проводили в среде с 5 мкМ иономицина, после чего ооциты выдерживали в среде с 2 мМ 6-DMAP в течение 4 ч. Уровень активирования был около 80%. Основным компонентом растворов и питательных сред является вода и к её качеству предъявляются серьезные требования. Широко доступным источником воды является водопроводная вода. Однако водопроводная вода содержит примеси. Количественный и качественный состав примесей в водопроводной воде не постоянен и зависит от источника водоснабжения, времени года и применяемых технологий очистки воды. Такая вода не пригодна для приготовления растворов, но была использована для мытья посуды и инструментов при условии, что в последующем они будут вымыты водой высокой степени очистки (дистиллированной, деионизированной). Дистилляция как наиболее широко распространенный метод очистки воды для лабораторных целей позволяет значительно снизить содержание органических и неорганических примесей. Наиболее очищенная вода получается после очистки на специальных установках для получения деионизированной воды. Основным показателем качества очистки воды является ее удельное сопротивление. При удалении из воды неорганических примесей её электропроводимость резко падает. Для нашей работы мы использовали воду с удельным сопротивлением не менее 18 МОм/см, полученную на установке Milli-Q. pH полученной воды около 5. Воду хранили в плотно закрытых стеклянных флаконах с силиконизированной внутренней поверхностью при 4ºС. Для приготовления 117 растворов и питательных сред использовали воду, хранившуюся не более недели. Существуют два основных способа приготовления питательных сред: Путем отвешивания всех необходимых ингредиентов и растворения их в воде; Путем приготовления концентрированных (маточных) растворов и добавления их в необходимых количествах. В наших условиях имеется потребность в постоянном приготовлении относительно небольших объемов сред, поэтому наиболее подходящим оказался второй способ. Этот способ позволяет сократить погрешность в количествах вещества в результате сокращения частоты взвешивания (готовый маточный раствор используется в течение длительного времени) и в результате увеличения массы навески соли, необходимой для приготовления маточного раствора в сравнении с навеской, необходимой для приготовления такого же объема среды. Кроме того, одни и те же маточные растворы применяются для приготовления различных питательных сред. Маточные растворы могут сохраняться продолжительное время в условиях холодильника или в замороженном состоянии. Одним из ключевых свойств растворов и питательных сред является их стерильность. Это достигается путем соблюдение предельной стерильности на всех этапах приготовления растворов и питательных сред (стерильная посуда, инструменты, пипетки) и финальной стерилизацией готового продукта путем фильтрования. Так как исходный материал – яичники, полученные при нутровке туш, уши животных – был заведомо не стерильный, для предотвращения контаминации в питательные среды непосредственно перед применением вводили антибиотик: гентамицина сульфат, а в отдельных случаях и фунгицид амфотерицин В в общепринятых концентрациях. 118 Питательные среды, содержащие гидрокарбонат натрия, хранили во флаконах с плотно закрытыми пробками. В настоящее время одним из важных вопросов является создание эффективных систем культивирования эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты, поскольку наиболее эффективна трансплантация эмбрионов на этой стадии нехирургическим путем. Ранее успешно использовалось индивидуальное культивирование эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты в небольших каплях среды (Carolan et al., 1996; Peura et al., 1998; Hagemann et al., 1998, 1999; Ji, Bavister, 2000; Oback, Wells, 2003). В тоже время было отмечено, что при культивировании in vitro эмбрионов млекопитающих группами уровень развития до стадии бластоцисты значительно выше, чем при индивидуальном культивировании (Vajta et al., 2000). В своей работе Lockart, Eagle, (1959) установили, что при попытке культивирования in vitro единичных соматических клеток человека и животных или клеток в малых концентрациях (до 100 клеток в 1 мл среды) они погибают или растут очень медленно. При добавлении в среду культивирования серина (Lockart, Eagle, 1959) или цистина (Ealge et al., 1961) клетки пролиферировали и при малых концентрациях. В результате подробного изучения потребностей клеток в зависимости от плотности популяции была разработана концепция «кондиционированной среды» (Eagle, Piez, 1962). Клетки синтезируют различные компоненты, однако они выходят из клеток в среду со скоростью, превышающей биосинтетическую способность клеток. В кондиционированной среде наступает равновесие между выходом метаболитов из клеток в среду и обратным захватом этих метаболитов клетками. Поэтому наиболее эффективно именно групповое культивирование эмбрионов млекопитающих. Однако в результате лишения ооцитов zona pellucida цитопласты и реконструированные эмбрионы обладают повышенной «липучестью» и 119 проявляют склонность к агрегации друг с другом. Поэтому возникает необходимость индивидуального культивирования каждого эмбриона. На этапе активирования это достигается размещением эмбрионов на 4 ч по одному в индивидуальных каплях среды, содержащей 6-DMAP, а на этапе культивирования применением системы WOW (Vajta et al., 2000). Система культивирования WOW совмещает в себе положительные качества как индивидуального, так и группового культивирования эмбрионов. Размещение эмбрионов в лунках по одному предотвращает их агрегацию друг с другом. Каждый эмбрион, находясь в лунке, оказывается несколько изолированным от окружающей среды стенками лунки. Благодаря этому каждый эмбрион находится в небольшом количестве среды, объемом приблизительно 0,04 мкл (Vajta et al., 2005), состав которой несколько меняется в результате жизнедеятельности эмбриона, что весьма благоприятно сказывается на развитии эмбриона (Lopes et al., 2003). Вместе с тем общего количества среды в лунке (0,4 мл) оказывается достаточно, чтобы обеспечить эмбрион всеми необходимыми питательными веществами на всем протяжении культивирования и тем самым избежать замены среды. При дроблении эмбриона связь между бластомерами минимальна и при индивидуальном культивировании эмбрионов без zona pellucida в каплях возможна их дезагрегация на отдельные бластомеры. Коническая форма ячеек в системе WOW способствует сохранению контактов между бластомерами. Таким образом, система WOW является оптимальным решением при выборе метода культивирования эмбрионов без zona pellucida. Однако культуральные сосуды для данной системы не производятся в промышленных условиях, поэтому требуется их приготовление в условиях лаборатории. В оригинальной методике авторы рекомендуют выплавлять ячейки на дне лунки 4-х луночного планшета при помощи штопальной иглы, 120 разогретой в пламени горелки (Vajta et al., 2000). Однако при плавлении пластика могут образовываться токсические вещества (Booth et al., 2001). Мы не выплавляли ячейки нагретой иглой, а выдавливали их заточенным металлически стержнем. Предварительно в лунку наливали 0,5 мл готовой среды SOF. Ввиду того, что на дно лунки оказывалось значительное давление в процессе выдавливания ячеек, планшет ставали на квадратную пластину из прозрачного органического стекла размером 5 х 5 см, толщиной 0,7 см. На этой пластине отмечали места расположения ячеек и использовали ее в качестве трафарета. После выдавливания каждую ячейку тщательно промывали при помощи автоматической пипетки. Среду заменяли свежей, покрывали 0,4 мл минерального масла и эквилибрировали при 39°С в атмосфере воздуха с 5% СО2 в течение ночи. Работа по клонированию животных предполагает ведение культуры соматических клеток для использования их в качестве доноров ядер. Обычно замороженные и хранящиеся в жидком азоте соматические клетки оттаивают и культивируют до достижения монослоя 2–3 суток, а затем дополнительно еще 3–4 суток для достижения синхронизации на G0 фазе. Данное условие требует точного согласования времени начала культивирования соматических клеток и доставки яичников, что не всегда представляется возможным. Вариабельность в составе среды и продолжительности культивирования клеток может сказаться на результатах развития реконструированных эмбрионов и представляет собой один из источников нестабильности экспериментальных данных при их повторе. Всех этих недостатков можно избежать, используя клетки непосредственно после их размораживания. В этом случае, на протяжении серии экспериментов будет использована однородная популяция клеток, культивировавшаяся в одинаковых условия. Кроме того, использование клеток сразу после оттаивания исключает всю предварительную работу с 121 ними, связанную с культивированием. Клетки оттаивают и готовят за 15–20 мин до начала приготовления пар цитопласт-соматическая клетка. При приготовлении пар цитопласт-соматическая клетка мы старались отбирать мелкие округлые с блестящей поверхностью клетки, поскольку такая морфология характерна для клеток, находящихся в G0/G1 фазе клеточного цикла. В нашей работе фетальные фибробласты, используемые в качестве доноров ядер, сливались с цитопластами практически в 100% случаев. Это наблюдалось как при использовании фетальных фибробластов сразу после размораживания, так и после предварительного их культивирования. Разницы по уровню развития до бластоцисты так же выявлено не было. Таким образом, замороженные по программе фетальные фибробласты крупного рогатого скота могут использоваться в качестве доноров ядер при получении клонированных эмбрионов крупного рогатого скота как непосредственно после их размораживания, так и после дополнительного культивирования. В ряде лабораторий принят протокол «отдаленного» активирования. При этом продолжительность периода от электрослияния до активирования конструкций может составлять от 2 до 4 ч (Cibelli et al., 1998; Galli et al., 2003; Vajta et al., 2006) или 5–6 ч (Schurmann et al., 2006), хотя на этапе электрослияния в растворе маннитола присутствовал кальций. Boquest et al. (2002) подчеркивают, что успех по получению клонированных поросят был обусловлен созданием системы трансплантации, когда донорское ядро подвергается воздействию не активированной цитоплазмы около 3 ч перед активированием. Прямое воздействие факторов ооцита перед его активированием на ДНК кариопласта признано важным (Campbell et al., 1996a), так как предоставляется время для повторной сборки ядерного аппарата (Wakayama et al., 1998). Цитоплазматические факторы, необходимые для 122 репрограммирования ядра соматической клетки, исчезают вскоре после активирования, хотя их молекулярная природа не известна (Tani et al., 2001). Galli et al. (2003) считают, что оптимальное время от сливания до активирования составляет 2–3 ч. В этом случае ядро получает достаточный интервал для ремоделирования и репрограммирования под воздействием цитоплазмы MII ооцита (Liu et al., 2001). В сравнительных экспериментах получены противоречивые результаты. Так, по данным Wakayama et al. (1998) активирование непосредственно после инъекции ядра достоверно ухудшило развитие реконструированных эмбрионов мышей in vitro до стадии морулабластоциста (39,9%) по сравнению с периодом 1–3 (58,4%) или 3–6 ч (66,9%). У крупного рогатого скота развитие клонированных эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты достоверно увеличивалось при проведении активирования спустя период от 2 до 8 ч после электрослияния по сравнению с одновременным сливанием-активированием (Cibelli et al., 1998; Wells et al., 1998, 1999; Liu et al., 2001; Shin et al., 2002a; Akagi et al., 2003; Shen et al., 2008). Однако по мнению других авторов удлинение периода от электрослияния до активирования свыше 2 ч (Choi et al., 2004; Aston et al., 2006) или до 4 ч (Sung et al., 2007) вызывает достоверное снижение жизнеспособности эмбрионов in vitro. Авторы считают, что избыточная продолжительность пребывания ядра донора в цитоплазме реципиента ведет к дезорганизации хромосом, не нормальной структуре хроматина, выделению PB и ограниченному образованию пронуклеусов. По мнению Choi et al. (2004) реконструированные эмбрионы крупного рогатого скота должны быть активированы в пределах 2 ч после сливания для повышения их развития in vitro. Хотя отсрочка активирования ооцита после переноса ядра может увеличить развитие у крупного рогатого скота и мышей, по мнению Kubota et 123 al., (2000) и Wakayama et al., (2001a, b) это не существенно для этих видов животных. При отсрочке активирования на 3 ч развитие до стадии бластоцисты (44.2%) было достоверно выше, чем при одновременном слиянии – активировании (28%). Однако продолжительность выдержки ядер соматических клеток под воздействием цитоплазматических факторов ооцита не повлияла на выживаемость клонированных плодов и телят (Akagi et al., 2003). Продолжительность до активирования 1–2 ч дает более низкий уровень фрагментации ядер и более высокое развитие эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. Но после трансплантации эмбрионов они были схожи по способности вызывать стельность. Таким образом, одного часа оказалось достаточно, а период свыше 2 ч уже снижал жизнеспособность эмбрионов in vitro (Aston et al., 2006). В наших условиях при продолжительности периода около 3 часов от электрослияния в среде без добавления солей кальция до активирования до стадии бластоцисты in vitro развивалось 40% реконструированных эмбрионов. Нами было установлено, что по срокам завершения ядерного дозревания in vitro могут быть выделены две относительно компактные группы ооцитов крупного рогатого скота. Около 48% ооцитов выделяют PB I к 17,5 часам от начала дозревания. В период с 18 до 20 hpm ядерное дозревание завершают еще около 28% ооцитов. Уровень развития реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании цитопластов, приготовленных из рано дозревших ооцитов, был достоверно выше, чем при использовании цитопластов, приготовленных из ооцитов, дозревших к 18–20 hpm (Malenko et al., 2009). Эти данные согласуются с результатами работ Miyoshi et al. (2002), сделавшими заключение, что продолжительность периода дозревания может 124 быть связана со способностью ооцитов свиней в последующем поддерживать развитие реконструированных эмбрионов. Уровень развития до стадии бластоцисты NT эмбрионов свиней, полученных при использовании ооцитов, дозревших к 24 ч, был значительно выше, чем при использовании ооцитов, дозревших к 42 ч от начала дозревания. Клонированные эмбрионы свиней развиваются значительно лучше, когда для реконструкции используются цитопласты из ооцитов, дозревших через 33 ч, чем при использовании ооцитов, дозревших через 44 ч (Cheong et al., 2000; Ikeda, Takahashi, 2001). При этом ооциты свиней, активированные в 24 ч и 42 ч после дозревания, не имеют разницы в уровне партеногенетического развития до стадии бластоцисты (Miyoshi et al., 2002). В нашей работе при интервале от электрослияния до активирования 3– 3,7 ч эмбрионы, реконструированные с использованием быстро дозревших ооцитов-реципиентов, развивались in vitro успешнее, чем полученные на основе поздно дозревших ооцитов. К сожалению, мы не сразу обратили внимание на фактор срока дозревания ооцитов. Поэтому в экспериментах со сроком пребывания ядра в неактивированной цитоплазме менее 2 ч были использованы только поздно дозревшие ооциты. Таким образом, низкий уровень развития эмбрионов этой группы во многом мог быть обусловлен качеством цитопластов. Если в качестве цитопластов использовались энуклеированные быстро дозревшие ооциты, увеличение интервала между электрослиянием и активированием с 3–3,7 до 4–5 ч имело тенденцию к увеличению выхода бластоцист до 46%. 125 4. ВЫВОДЫ 1. Использование на начальном этапе культивирования эксплантатов небольшого количества питательной среды, содержащей 50% сыворотки крови, способствует их фиксации на субстрате и последующему выселению из них клеток. Для выделения линий фетальных фибробластов эффективным является «холодный» метод трипсинизации. 2. Фетальные фибробласты крупного рогатого скота, криоконсервированные по достижении 80–100%-ного монослоя, могут использоваться в качестве доноров ядер сразу после оттаивания без дополнительного культивирования. 3. Соматические клетки в G1 фазе клеточного цикла можно получить путем механического разделения на микроманипуляторе клеток, находящихся в цитокинезе М фазы. 4. Первые полярные тельца на поверхности ооцитов свиней располагаются в непосредственной близости от материнских хромосом. Метод «слепой» энуклеации ооцитов свиней без zona pellucida является эффективным методом подготовки цитопластов без использования ядерных красителей и применения УФ света. 5. Уровень активации ооцитов крупного рогатого скота под воздействием электроимпульса в среде с 0,05 мМ CaCl2 составляет 47,1% и резко снижается (до 26,7%) при отсутствии солей кальция. 6. Эффективность электрослияния пар цитопласт-соматическая клетка, подготовленных с использованием фитогемагглютинина, в растворе маннитола без включения солей кальция составляет 95%. 7. Для получения реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida на стадии бластоцисты эффективной является система WOW, которая позволяет совместить достоинства как группового, так и индивидуального культивирования эмбрионов in vitro. 126 8. При интервале между электрослиянием и активированием 4–5 ч уровень развития реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты составил 46% при использовании в качестве цитопластов энуклеированных ооцитов крупного рогатого скота, дозревших in vitro к 18 ч от начала дозревания. 127 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 1. Результаты проведенных экспериментов вошли в состав 5 отчетов лаборатории клонирования животных отдела «Биотехцентр» ГНУ НИИПЗК: «Изучить возможность клонирования особей крупного рогатого скота путем пересадки ядер соматических клеток» (промежуточный, утв. в 2006 г), «Разработать методику получения первичной линии соматических клеток от взрослого животного для получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота» (промежуточный, утв. в 2007 г), «Изучить эффективность использования получении ооцитов реципиентов клонированных разного эмбрионов срока крупного дозревания рогатого при скота» (промежуточный, утв. в 2008 г), «Изучить влияние режима электрослияния – активирования конструкций на развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro» (промежуточный, утв. в 2009 г), «Разработать методические положения по получению клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании соматических клеток-доноров ядер и дозревших in vitro энуклеированных ооцитов-реципиентов» (заключительный, утв. в 2010 г). 2. Результаты экспериментов вошли в состав методических рекомендаций «Методические положения по получению клонированных эмбрионов крупного рогатого скота и их культивированию in vitro, обеспечивающие выход бластоцист на уровне 40–45%», предназначенных для научных сотрудников, преподавателей, аспирантов и студентов научноисследовательских институтов, ветеринарных и биологических факультетов ВУЗов. 128 6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 1. Соматические клетки, криоконсервированные по достижении 80– 100%-ного монослоя, могут быть использованы в качестве клеток-доноров ядер сразу после размораживания без дополнительного культивирования. 2. Для выделения линии фибробластоподобных клеток кожи взрослого животного рекомендуется метод эксплантатов. Для лучшей фиксации фрагментов ткани на культуральной поверхности в первые сутки рекомендуется использование питательной среды с 50% сыворотки крови. 3. Для электрослияния конструкций цитопласт-соматическая клетка крупного рогатого скота, подготовленных с применением фитогемагглютинина, рекомендуется использовать среду без включения солей кальция. 4. Для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida рекомендуется система WOW. Размещение эмбрионов в микроячейках позволяет избежать агрегации их друг с другом и обеспечивает создание микросреды в непосредственной близости к эмбриону, а достаточно большой общий объем среды в лунке планшета позволяет исключить необходимость ее замены во время культивирования эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты. 129 7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Епифанова, О.И. Покоящиеся клетки. Свойства и функции в организме / О.И. Епифанова, В.В. Терских, В.А. Полуновский. – М.: Наука, 1983. – 180 с. 2. Животная клетка в культуре: (Методы и применение в биотехнологии) / под общ. ред. Л.П. Дьяконова. – М.: Спутник+, 2000. – 398 с. 3. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин – М.: Высшая школа, 1980. – 293 с. 4. Маленко, Г.П. Устройство для выделения комплексов «ооциткумулюс» из антральных фолликулов яичников крупного рогатого скота / Г.П. Маленко // Сельскохозяйственная биология. 2001. – № 4. – С. 117–119. 5. Прокофьев, М.И. Реконструирование эмбрионов крупного рогатого скота с использованием в качестве доноров ядер свежеразмороженных фетальных фибробластов / М.И. Прокофьев, О.И. Степанов, А.В Комиссаров и др. // Сельскохозяйственная биология. 2008. – № 4. – С. 53–57. 6. Фонбрюн, П. Методы микроманипуляции. пер. с франц. / П. Фонбрюн. – М.: Изд-во иностр. лит., 1951. – 168 с. 7. Фрей-Висслинг, А. Сравнительная органеллография цитоплазы / А. Фрей-Висслинг. – М.: Мир, 1976. – 144 с. 8. Akagi, S. Developmental potential of bovine nuclear transfer embryos and postnatal survival rate of cloned calves produced by two different timings of fusion and activation / S. Akagi, N. Adachi, K. Matsukawa et al. // Mol. Reprod. Dev. 2003. – V. 66. – P. 264–272. 9. Arat, S. Production of transgenic bovine embryos by transfer of transfected granulosa cells into enucleated oocytes / S. Arat, S.J. Rzucidlo, J. Gibbons et al. // Mol. Reprod. Dev. 2001. – V. 60. – P. 20–26. 130 10. Ashworth, P.J. Flow cytometric detection of bicarbonate-induced changes in lectin binding in boar and ram sperm populations / P.J. Ashworth, R.A. Harrison, N.G. Miller et al. // Mol. Reprod. Dev. 1995. – V. 40. – P. 164–176. 11. Aston, K.I. Effect of the time interval between fusion and activation on nuclear state and development in vitro and in vivo of bovine somatic cell nuclear transfer embryos / K.I. Aston, G.P. Li, B.A. Hicks et al. // Reproduction. 2006. – V. 131. – P. 1–8. 12. Baguisi, A. Production of goats by somatic cell nuclear transfer / A. Baguisi, E. Behboodi, D.T. Melican et al. // Nat. Biotech. 1999. – V. 17. – P. 456– 461. 13. Barnes, F.L. Influence of recipient oocyte cell cycle stage on DNA synthesis, nuclear envelope breakdown, chromosome constitution, and development in nuclear transplant bovine embryos / F.L. Barnes, P. Collas, R. Powell et al. // Mol. Reprod. Dev. 1993. – V. 36. – P. 33–41. 14. Bavister, B.D. Development of preimplantation embryos of the golden hamster in a defined culture medium / B.D. Bavister, M.L. Leibfried, G. Lieberman // Biol. Reprod. 1983. – V. 28. – P. 235–247. 15. Bavister, B.D. Regulation of hamster embryo development in vitro by amino acids / B.D. Bavister, S.H. McKiernan // In: Bavister BD, editor. Preimplantation embryo development. New York: Springer Verlag, 1993. – P. 57– 72. 16. Bavister, B.D. The effects of sperm extracts and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster spermatozoa in vitro / B.D. Bavister, R. Yanagimachi // Biol. Reprod. 1977. – V. 16. – P. 228–237. 17. Berridge, M.J. Phosphoinositides and signal transductions / M.J. Berridge // Rev. Clin. Basic. Pharm. 1985. – V. 5. – P. 5–13. 18. Betthauser, J. Production of cloned pigs from in vitro systems / J. Betthauser, E. Forsberg, M. Augenstein et al. // Nat. Biotechnol. 2000. – V. 18. – P. 1055–1059. 131 19. Blow, J.J. A role for the nuclear envelope in controlling DNA replication within the cell cycle / J.J. Blow, R.A. Laskey // Nature. 1988. – V. 332. – P. 546–548. 20. Boland, M.P. Use of the rabbit oviduct as a screening tool for the viability of mammalian eggs / M.P. Boland // Theriogenology. 1984. – V. 21. – P. 126–137. 21. Booth, P.J. Effect of two activation treatments and age of blastomere karyoplasts on in vitro development of bovine nuclear transfer embryos / P.J. Booth, P. Holm, G. Vajta et al. // Mol. Reprod. Dev. 2001. – V. 60. – P. 377–383. 22. Boquest, A.C. Flow cytometric cell cycle analysis of cultured porcine fetal fibroblast cells / A.C. Boquest, B.N. Day, R.S. Prather // Biol. Reprod. 1999. – V. 60. – P. 1013–1019. 23. Boquest, A.C. Production of cloned pigs from cultured fetal fibroblast cells / A.C. Boquest, C.G. Grupen, S.J. Harrison et al. // Biol. Reprod. 2002. – V. 66. – P. 1283–1287. 24. Bordignon, V. Telophase enucleation: an improved method to prepare recipient cytoplasts for use in bovine nuclear transfer / V. Bordignon, L.C. Smith // Mol. Reprod. Dev. 1998. – V. 49. – P. 29–36. 25. Bowan, R.A. In vitro development of bovine embryos in chemically defined media / R.A. Bowan, J.F. Hasler, G.E. Seidel // Proc. 88th Annu. Res. Conf.: abstr. – Colorado State Univ. Fort Collins, 1975. – P. 171. 26. Braude, P. Human gene expression first occurs between the four- and eight-cell stages of preimplantation development / P. Braude, V. Bolton, S. Moore // Nature. 1988. – V. 332 – P. 459–461. 27. Braude, P. Post-transcriptional control in the early mouse embryo / P. Braude, H. Pelham, G. Flach et al. // Nature. 1979. – V. 282. – P. 102–105. 28. Brinster, R.L. Studies on the development of mouse embryos in vitro. III. The effect of energy source / R.L. Brinster // J. Exp. Zool. 1965. – V. 158. – P. 59–68. 132 29. Brock, H. The production of viable bovine ova / H. Brock, L.E. Rowson // J. Agr. Sci. (Camb.) 1952. – V. 42. – P. 479. 30. Brophy, B. Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of beta-casein and kappa-casein / B. Brophy, G. Smolenski, T. Wheeler et al. // Nat. Biotechnol. 2003. – V. 21. – P. 157–162. 31. Byrne, J.A. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer / J.A. Byrne, D.A. Pedersen, L.L. Clepper et al. // Nature. 2007. – V. 450. – P. 497–502. 32. Camous, S. Cleavage beyond the block stage and survival after transfer of early bovine embryos cultured with trophoblastic vesicles / S. Camous, Y. Heyman, W. Méziou et al. // J. Reprod. Fertil. 1984. – V. 72. – P. 479–485. 33. Campbell, K.H. Cell cycle coordination in embryo cloning by nuclear transfer / K.H. Campbell, P. Loi, P. Cappai et al. // Rev. Reprod. 1996 a. – V. 1. – P. 40–46. 34. Campbell, K.H. Nuclear-cytoplasmic interactions during the first cell cycle of nuclear transfer reconstructed bovine embryos: implications for deoxyribonucleic acid replication and development / K.H. Campbell, W.A. Ritchie, I. Wilmut // Biol. Reprod. 1993. – V. 49. – P. 933–942. 35. Campbell, K.H. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line / K.H. Campbell, J. McWhir, W.A. Ritchie et al. // Nature. 1996 b. – V. 380. – P. 64–66. 36. Canseco, R.S. Embryo density and medium volume effects on early murine embryo development / R.S. Canseco, A.E. Sparks, R.E. Pearson et al. // J. Assist. Reprod. Genet. 1992. – V. 9. – P. 454–457. 37. Carlson, D. Oviduct secretion in the cow / D. Carlson, D.L. Black, G.R. Howe // J. Reprod. Fertil. 1970. – V. 22. – P. 549–552. 38. Carolan, C. Effect of follicle size and quality on the ability of follicular fluid to support cytoplasmic maturation of bovine oocytes / C. Carolan, P. Lonergan, P. Monget et al. // Mol. Reprod. Dev. 1996. – V. 43. – P. 477–483. 133 39. Carolan, P. In vitro production of bovine embryos using individual oocytes / P. Carolan, C. Lonergan, H. Khatir et al. // Mol. Reprod. Dev. 1996. – V. 45. – P. 145–150. 40. Cell biology: a laboratory handbook: 4 vol. / ed. J.E. Celis. – San Diego: Academic Press., 1998. 41. Chambers, E.L. The activation of sea urchin eggs by the divalent ionophores A23187 and X-537A / E.L. Chambers, B.C.Pressman, B. Rose // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. – V. 60. – P. 126–132. 42. Cheong, H.T. Birth of mice after transplantation of early cell-cyclestage embryonic nuclei into enucleated oocytes / H.T. Cheong, Y. Takahashi, H. Kanagawa // Biol. Reprod. 1993. – V. 48. – P. 958–963. 43. Cheong, H.T. Development of reconstituted pig embryos by nuclear transfer of cultured cumulus cells / H.T. Cheong, K. Ikeda, M.A. Diaz et al. // Reprod. Fertil. Dev. 2000. – V. 12. – P. 15–20. 44. Chesne, P. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells / P. Chesne, P.G. Adenot, C. Viglietta et al. // Nat. Biotechnol. 2002. – V. 20. – P. 366–369. 45. Choi, J.Y. Effect of activation time on the nuclear remodeling and in vitro development of nuclear transfer embryos derived from bovine somatic cells / J.Y. Choi, C.I. Kim, C.K. Park et al. // Mol. Reprod. Dev. 2004. – V. 69. – P. 289– 295. 46. Cibelli, J.B. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts / J.B. Cibelli, S.L. Stice, P.J. Golueke et al. // Science. 1998. – V. 280. – P. 1256–1258. 47. Collas, P. Barnes F.L. Nuclear transplantation by microinjection of inner cell mass and granulosa cell nuclei / P. Collas, F.L. Barnes // Mol. Reprod. Dev. 1994. – V. 38. – P. 264–267. 134 48. Collas, P. Histone H1 kinase activity in bovine oocytes following calcium stimulation / P. Collas, E.J. Sullivan, F.L. Barnes // Mol. Reprod. Dev. 1993. – V. 34. – P. 224–231. 49. Collas, P. Influence of cell cycle stage of the donor nucleus on development of nuclear transplant rabbit embryos / P. Collas, J.J. Balise, J.M. Robl // Biol. Reprod. 1992. – V. 46. – P. 492–500. 50. Collas, P. Relationship between nuclear remodeling and development in nuclear transplant rabbit embryos / P. Collas, J.M. Robl // Biol. Reprod. 1991. – V. 45. – P. 455–465. 51. Comings, D.E. Mechanisms of chromosome banding. VIII. Hoechst 33258-DNA interaction / D.E. Comings // Chromosoma. 1975. – V. 52. – P. 229– 243. 52. Cooper, S. Mammalian cells are not synchronized in G1-phase by starvation or inhibition: considerations of the fundamental concept of G1-phase synchronization / S. Cooper // Cell. Prolif. 1998. – V. 31. – P. 9–16. 53. Critser, E.S. Use of a fluorescent stain for visualization of nuclear material in living oocytes and early embryos / E.S. Critser, N.L. First // Stain. Technol. 1986. – V. 61. – P. 1–5. 54. Crosby, I.M. Control of protein synthesis during early cleavage of sheep embryos / I.M. Crosby, F. Gandolfi, R.M. Moor // J. Reprod. Fertil. 1988. – V. 82. – P. 769–775. 55. Cyert, M.S. Regulation of MPF activity in vitro / M.S. Cyert, M.W. Kirschner // Cell. 1988. – V. 53. – P. 185–195. 56. Czolowska, R. Behaviour of thymocyte nuclei in non-activated and activated mouse oocytes / R. Czolowska, J.A. Modlinski, A.K. Tarkowski // J. Cell. Sci. 1984. – V. 69. – P. 19–34. 57. Diamond, L.E. A human CD46 transgenic pig model system for the study of discordant xenotransplantation / L.E. Diamond, C.M. Quinn, M.J. Martin et al. // Transplantation. 2001. – V. 71. – P. 132–142. 135 58. Dinnyés, A. High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic cell nuclear transfer / A. Dinnyés, D. Yunping, Sh. Jiang et al. // Biol. Reprod. 2000. – V. 63. – P. 513–518. 59. Djojosubroto, M.W. Telomeres and telomerase in aging, regeneration and cancer / M.W. Djojosubroto, Y.S. Choi, H.W. Lee et al. // Mol. Cells. 2003. – V. 15. – P. 164–175. 60. Dominko, T. Dynamic imaging of the metaphase II spindle and maternal chromosomesin bovine oocytes: implications for enucleation efficiency verification, avoidanceof parthenogenesis, and successful embryogenesis / T. Dominko, A. Chan, C. Simerly et al. // Biol. Reprod. 2000. – V. 62. – P. 150–154. 61. Dominko, T. Optimization strategies for production of mammalian embryos by nuclear transfer / T. Dominko, J. Ramalho-Santos, A. Chan et al. // Cloning. 1999. – V. 1. – P. 143–152. 62. Donahue, R.P. Maturation of the mouse oocyte in vitro. I. Sequence and timing of nuclear progression / Donahue R.P. // J. Exp. Zool. 1968. – V. 169. – P. 237–249. 63. Donnay, I. Effects of co-culture and embryo number on the in vitro development of bovine embryos / I. Donnay, A. Van Langendonckt, P. Auquier et al. // Theriogenology. 1997. – V. 47. – P. 1549–1561. 64. Dou, Q.-P. Transcriptional activation of thymidine kinase, a marker for cell cycle control / Q.-P. Dou, A.B. Pardee // Progr. Nucleic. Acids. Res. Mol. Biol. 1996. – V. 53. – P. 197–217. 65. Draghia-Akli, R. Myogenic expression of an injectable proteaseresistant growth hormone- releasing hormone augments long-term growth in pigs / R. Draghia-Akli, M.L. Fiorotto, L.A. Hill et al. // Nat. Biotechnol. 1999. – V. 17. – P. 1179–1183. 136 66. Du, F. Differential cytoplast requirement for embryonic and somatic cell nuclear transfer in cattle / F. Du, L.Y. Sung, X.C. Tian et al. // Mol. Reprod. Dev. 2002. – V. 63. – P. 183–191. 67. Ducibella, T. Cell shape and membrane changes in the eight-cell mouse embryos: Prerequisites for morphogenesis of the blastocyst / T. Ducibella, E. Anderson // Dev. Biol. 1975. – V. 47. – P. 45–58. 68. Ducibella, T. Quantitative studies of changes in cortical granule number and distribution in the mouse oocyte during meiotic maturation / T. Ducibella, E. Anderson, D.F. Albertini et al. // Dev. Biol. 1988. – V. 130. – P. 184–197. 69. Dulic, V. Association of humane cyclin E with a periodic G1-S phase protein kinase / V. Dulic, E. Lees, S.I. Reed // Science. 1992. – V. 257. – P. 1958– 1961. 70. Eagle, H. A growth medium for human cell lines / H. Eagle // Proc. Soc. Biol. Med. 1955. – V. 89. – P. 96–99. 71. Eagle, H. The biosynthesis of cystine in human cell cultures / H. Eagle, K.A. Piez, V.I. Oyama // J. Biol. Chem. 1961. – V. 236. – P. 1425–1428. 72. Eagle, H. The population-dependent requirement by cultured mammalian cells for metabolites which they can synthesize / H. Eagle, K. Piez // J. Exp. Med. 1962. – V. 116. – P. 29–43. 73. Endo, M. Calcium release from the sarcoplasmic reticulum / M. Endo // Physiol. Rev. 1977. – V. 57. – P. 71–108. 74. Epel, D. The initiation of development at fertilization / D. Epel // Cell. Differ. Dev. 1990. – V. 29. – P. 1–12. 75. Evans, M.J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos / M.J. Evans, M.H. Kaufman // Nature. 1981. – V. 292. – P. 154–156. 76. Eyestone, W.H. Co-culture of early cattle embryos to the blastocyst stage with oviducal tissue or in conditioned medium / W.H. Eyestone, N.L. First // J. Reprod. Fertil. 1989. – V. 85. – P. 715–720. 137 77. Eyestone, W.H. Culture of one- and two-cell bovine embryos to the blastocyst stage in the ovine oviduct / W.H. Eyestone, M.L. Leibfried-Rutledge, D.L. Northey et al. // Theriogenology. 1987. – V. 28. – P. 1–7. 78. Fahning, M.L. The free amino acid content of uterine fluids and blood serum in the cow / M.L. Fahning, R.H. Schultz, E.F. Graham // J. Reprod. Fertil. 1967. – V. 13. – P. 229–236. 79. Farnham, P.J. The role of E2F in the mammalian cell cycle / P.J. Farnham, J.E. Slansky, R. Kollmar // Biochim. Biophys. Acta. 1993. – V. 1155. – P. 125–131. 80. Farnham, P.J. Transcriptional regulation of mouse dihydrofolate reductase in the cell cycle / P.J. Farnham, R.T. Schimke // J. Biol. Chem. 1985. – V. 260. – P. 7675–7680. 81. First, N.L. Systems for production of calves from cultured bovine embryonic cells / N.L. First, M.M. Sims, S.P. Park et al. // Reprod. Fertil. Dev. 1994. – V. 6. – P. 553–562. 82. Fodor, W.L. Expression of a functional human complement inhibitor in a transgenic pig as a model for the prevention of xenogeneica hyperacute organ rejection / W.L. Fodor, B.L. Williams, L.A. Matis et al. // PNAS. 1994. – V. 91. – P. 11153–11157. 83. Ford, C.C. Maturation promoting factor and cell cycle regulation / C.C. Ford // J. Embryol. Exp. Morphol. 1985. – V. 89. – P. 271–284. 84. Forsberg, E.J. Production of cloned cattle from in vitro systems / E.J. Forsberg, N.S. Strelchenko, M.L. Augenstein et al. // Biol. Reprod. 2002. – V. 67. – P. 327–333. 85. Frei, R.E. Qualitative and quantitative changes in protein synthesis occur at the 8–16-cell stage of embryogenesis in the cow / R.E. Frei, G.A. Schultz, R.B. Church // J. Reprod. Fertil. 1989. – V. 86. – P. 637–641. 86. Freshney, R.I. Culture of animal cells: a manual of basic technique / R.I. Freshney. – New York: Wiley-Liss Inc., 2005. – 696 p. 138 87. Fukui, Y. Effect of medium renewal during culture in two different culture systems on development to blastocysts from in vitro produced early bovine embryos / Y. Fukui, E.S. Lee, N. Araki // J. Anim. Sci. 1996. – V. 74. – P. 2752– 2758. 88. Fukui, Y. Effects of sera, hormones and granulosa cells added to culture medium for in vitro maturation, fertilization, cleavage and development of bovine oocytes / Y. Fukui, H. Ono // J. Reprod. Fertil. 1989. – V. 86. – P. 501–506. 89. Fulka, J. Effect of cycloheximide on nuclear maturation of pig and mouse oocytes / J. Fulka, J. Motlík, J. Fulka et al. // J. Reprod. Fertil. 1986. – V. 77. – P. 281–285. 90. Fulka, J.J. Chromosome condensation activity (CCA) in bisected C57BL/6JxCBA mouse oocytes / J.J. Fulka, N. Ouhibi, J. Fulka et al. // Reprod. Fertil. Dev. 1995. – V. 7. – P. 1123–1127. 91. Fulka, J.J. Culture of horse oocytes in vitro / J.J. Fulka, A. Okolski // J. Reprod. Fertil. 1981. – V. 61. – P. 213–215. 92. Fulka, J.J. Nuclear transplantation in mammals: remodelling of transplanted nuclei under the influence of maturation promoting factor / J.J. Fulka, N.L. First, R.M. Moor // BioEssays. 1996. – V. 18. – P. 835–840. 93. Funahashi, H. Effects of different serum supplements in maturation medium on meiotic and cytoplasmic maturation of pig oocytes / H. Funahashi, B.N. Day // Theriogenology. 1993. – V. 39. – P. 965–973. 94. Funahashi, H. Synchronization of meiosis in porcine oocytes by exposure to dibutyryl cyclic adenosine monophosphate improves developmental competence following in vitro fertilization / H. Funahashi, T.C. Cantley, B.N. Day // Biol. Reprod. 1997. – V. 57. – P. 49–53. 95. Gadbois, D.M. Multiple kinase arrest points in the G1 phase of nontransformed mammalian cells are absent in transformed cells / D.M. Gadbois, H.A. Crissman, R.A. Tobey et al. // PNAS. 1992. – V. 89. – P. 8626–8630. 139 96. Galli, C. Comparison of microinjection (piezo-electric) and cell fusion for nuclear transfer success with different cell types in cattle / C. Galli, I. Lagutina, I. Vassiliev et al. // Cloning Stem Cells. 2002. – V. 4. – P. 189–196. 97. Galli, C. Introduction to cloning by nuclear transplantation / C. Galli, I. Lagutina, G. Lazzari // Cloning Stem Cells. 2003. – V. 5. – P. 223–232. 98. Gao, S. Somatic cell-like features of cloned mouse embryos prepared with cultured myoblast nuclei / S. Gao, Y.G. Chung, J.W. Williams et al. // Biol. Reprod. 2003. – V. 69. – P. 48–56. 99. Gardner, D.K. Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture / D.K. Gardner, M. Lane // Biol. Reprod. 1993. – V. 48. – P. 377–385. 100. Gardner, D.K. Concentrations of nutrients in mouse oviduct fluid and their effects on embryo development and metabolism in vitro / D.K. Gardner, H.J. Leese // J. Reprod. Fertil. 1990. – V. 88. – P. 361–368. 101. Gardner, D.K. Uptake and metabolism of pyruvate and glucose by individual sheep preattachment embryos developed in vivo / D.K. Gardner, M. Lane, P. Batt // Mol. Reprod. Dev. 1993. – V. 36. – P. 313–319. 102. Gibbons, J. Enhanced survivability of cloned calves derived from roscovitine-treated adult somatic cells / J. Gibbons, S. Arat, J. Rzucidlo et al. // Biol. Reprod. 2002. – V. 66. – P. 895–900. 103. Golbus, M.S. The effects of inhibitors of RNA synthesis (alphaamanitin and actinomycin D) on preimplantation mouse embryogenesis / M.S. Golbus, P.G. Calarco, C.J. Epstein // J. Exp. Zool. 1973. – V. 186. – P. 207–216. 104. Golovan, S.P. Pigs expressing salivary phytase produce lowphosphorus manure / S.P. Golovan, R.G. Meidinger, A. Ajakaiye et al. // Nat. Biotechnol. 2001. – V. 19. – P. 741–745. 105. Gonda, K. Reversible disassembly of somatic nucleoli by the germ cell proteins FRGY 2a and FRGY 2b / K. Gonda, J. Fowler, N. Katoku-Kikyo et al. // Nat. Cell Biol. 2003. – V. 5. – P. 205–210. 140 106. Goto, S. Effects of spindle removal on MPF and MAP kinase activities in porcine matured oocytes / S. Goto, K. Naito, S. Ohashi et al. // Mol. Reprod. Dev. 2002. – V. 63. – P. 388–393. 107. Greising, T. The influence of enucleation on the ultrastructure of in vitro matured and enucleated cattle oocytes / T. Greising, L. Jonas // Theriogenology. 1999. – V. 52. – P. 303–312. 108. Grupen, C.G. Asynchronous meiotic progression in porcine oocytes matured in vitro: a cause of polyspermic fertilization? / C.G. Grupen, H. Nagashima, M.B. Nottle // Reprod. Fertil. Dev. 1997. – V. 9. – P. 187–191. 109. Gwatkin, R.B. Effect of enzymes and acidity on the zona pellucida of the mouse egg before and after fertilization / R.B. Gwatkin // Reproduction. 1964. – V. 7. – P. 99–105. 110. Hafez, E.S. Maturation division oocytes in bovine following gonadotropin injections / E.S. Hafez, I. Ishibashi // Cytogenetics. 1964. – V. 48. – P. 167–183. 111. Hagemann, L.J. Development during single IVP of bovine oocytes from dissected follicles: interactive effects of estrous cycle stage, follicle size and atresia / L.J.Hagemann, S.E. Beaumont, M. Berg et al. // Mol. Reprod. Dev. 1999. – V. 53. – P. 451–458. 112. Hagemann, L.J. Development of bovine embryos in single in vitro production (sIVP) systems / L.J. Hagemann, L.L. Weilert, S.E. Beaumont et al. // Mol. Reprod. Dev. 1998. – V. 51. – P. 143–147. 113. Hartwell, L.H. Cell cycle control and cancer / L.H. Hartwell, M.B. Kastan // Science. 1994. – V. 266. – P. 1821–1828. 114. Hayes, O. Effect of cryopreservation on fusion efficiency and in vitro development into blastocysts of bovine cell lines used in somatic cell cloning / O. Hayes, L.L. Rodriguez, A. Gonzalez et al. // Zygote. 2005. – V. 13. – P. 277–282. 115. Heintz, N. The regulation of histone gene expression during the cell cycle / N. Heintz // Biochim. Biophys. Acta. 1991. – V. 1088. – P. 327–339. 141 116. Heyman, Y. Frequency and occurrence of late-gestation losses from cattle cloned embryos / Y. Heyman, P. Chavatte-Palmer, D. LeBourhis et al. // Biol. Reprod. 2002. – V. 66. – P. 6–13. 117. Heyman, Y. Preliminary results on variability in oocyte recovery and developmental competence in cattle derived from embryonic cloning: work in progress / Y. Heyman, M. Tamassia, C. Richard et al. // Theriogenology. 2003. – V. 60. – P. 891–900. 118. Hill, J.R. Abnormal in utero development of cloned animals: implications for human cloning / J.R. Hill // Differentiation. 2002. – V. 69. – P. 174–178. 119. Ikeda, K. Effects of maturational age of porcine oocytes on the induction of activation and development in vitro following somatic cell nuclear transfer / K. Ikeda, Y. Takahashi // J. Vet. Med. Sci. 2001. – V. 63. – P. 1003– 1008. 120. Ilyin, V. Effects of alcohols on responses evoked by inositol trisphosphate in Xenopus oocytes / V. Ilyin, I. Parker // J. Physiol. 1992. – V. 448. – P. 339–354. 121. Inoue, K. Effects of donor cell type and genotype on the efficiency of mouse somatic cell cloning / K. Inoue, N. Ogonuki, K. Mochida et al. // Biol. Reprod. 2003. – V. 69. – P. 1394–1400. 122. Ireland, J.J. Development of nonovulatory antral follicles in heifers: changes in steroids in follicular fluid and receptors for gonadotropins / J.J. Ireland, J.F. Roche // Endocrinology. 1983. – V. 112. – P. 150–156. 123. Jaffe, L.F. Sources of calcium in egg activation: a review and hypothesis / L.F. Jaffe // Dev. Biol. 1983. – V. 99. – P. 265–276. 124. Javed, M.H. Determination of pentose phosphate and EmbdenMeyerhof pathway activities in bovine embryos / M.H. Javed, R.W. Wright // Theriogenology. 1991. – V. 35. – P. 1029–1037. 142 125. Ji, W. Development of zona-free hamster ova to blastocysts in vitro / W. Ji, B.D. Bavister // Theriogenology. 2000. – V. 54. – P. 827–834. 126. Johnson, L.V. Wheat germ agglutinin induces compaction- and cavitation-like events in two-cell mouse embryos / L.V. Johnson // Dev. Biol. 1986. – V. 113. – P. 1–9. 127. Johnson, M.H. Radical solutions and cultural problems: could free oxygen radicals be responsible for the impaired development of preimplantation mammalian embryos in vitro? / M.H. Johnson, M.H. Nasr-Esfahani // Bioessays. 1994. – V. 16. – P. 31–38. 128. Jones, G.M. Evolution of a culture protocol for successful blastocyst development and pregnancy / G.M. Jones, A.O. Trounson, D.K. Gardner et al. // Hum. Reprod. 1998. – V. 13. – P. 169–177. 129. Jung, T. Kinetics of MPF and histone H1 kinase activity differ during the G2- to M-phase transition in mouse oocytes / T. Jung, R.M. Moor, J. Fulka // Int. J. Dev. Biol. 1993. – V. 37. – P. 595–600. 130. Kane, M.T. Fractionated serum dialysate and synthetic media for culturing 2- and 4-cell rabbit embryos / M.T. Kane, R.H. Foote // Biol. Reprod. 1970. – V. 2. – P. 356–362. 131. Kane, M.T. The effects of pH on culture of one cell rabbit ova to blastocysts in bicarbonatebuffered medium / M.T. Kane // J. Reprod. Fertil. 1974. – V. 38. – P. 477–480. 132. Kane, M.T. The role of nutrients, peptide growth factors and co-culture cells in development of preimplantation embryos in vitro / M.T. Kane, E.W. Carney, J.E. Ellington // Theriogenology. 1992. – V. 38. – P. 297–313. 133. Kang, Y. Casein genes and genetic engineering of the caseins / Y. Kang, R. Jimenez-Flores, T. Richardson // Basic Life Sci. 1986. – V. 37. – P. 95– 111. 143 134. Kasinathan, P. Effect of fibroblast donor cell age and cell cycle on development of bovine nuclear transfer embryos in vitro / P. Kasinathan, J.G. Knott, P.N. Moreira et al. // Biol. Repod. 2001a. – V. 64. – P. 1487–1493. 135. Kasinathan, P. Production of calves from G1 fibroblasts / P. Kasinathan, J.G. Knott, Z. Wang et al. // Nat. Biotechnol. 2001b. – V. 19. – P. 1176–1178. 136. Kato, Y. Cloning of calves from various somatic cell types of male and female adult, newborn and fetal cows / Y. Kato, T. Tani, Y. Tsunoda // J. Reprod. Fertil. 2000. – V. 120. – P. 231–237. 137. Kato, Y. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult / Y. Kato, T. Tani, Y. Sotomaru et al. // Science. 1998. – V. 282. – P. 2095–2098. 138. Kim, J.H. Effects of phosphate, energy substrates, and amino acids on development of in vitro-matured, in vitro-fertilized bovine oocytes in a chemically defined, protein-free culture medium / J.H. Kim, K. Niwa, J.M. Lim et al. // Biol. Reprod. 1993. – V. 48. – P. 1320–1325. 139. Kinosita, K. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes / K. Kinosita, T.Y. Tsong // Biochim. Biophys. Acta. 1977. – V. 471. – P. 227–242. 140. Kirschner, M. The timing of early developmental events in Xenopus / M. Kirschner, J. Newport, J. Gerhart // Trends. Genet. 1985. – V. 1. – P. 41–47. 141. Kishi, M. Nuclear transfer in cattle using colostrum-derived mammary gland epithelial cells and ear-derived fibroblast cells / M. Kishi, Y. Itagaki, R. Takakura et al. // Theriogenology. 2000. – V. 54. – P. 675–684. 142. Kline D., Kline J.T. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg / Kline D., Kline J.T. // Dev. Biol. 1992. – V. 149. – P. 80–89. 143. Koff, A. Cyclin E, a new class of human cyclin that can activate the cdc2/CDC28 kinase / A. Koff, F. Cross, A. Fisher et al. // Cell. 1991. – V. 66. – P. 1217–1228. 144 144. Kono, T. Nuclear transfer and reprogramming / T. Kono // Rev. Reprod. 1997. – V. 2. – P. 74–80. 145. Krek, W. Cell synchronization / W. Krek, J.A. DeCaprio // Methods Enzymol. 1995. – V. 254. – P. 114–124. 146. Krischek, C. Roscovitine, a specific inhibitor of cyclin-dependent protein kinases, reversibly inhibits chromatin condensation during in vitro maturation of porcine oocytes / C. Krischek, B. Meinecke // Zygote. 2001. – V. 9. – P. 309–316. 147. Kubelka, M. Time sequence of germinal vesicle breakdown in pig oocytes after cycloheximide and P-aminobenzamidine block / M. Kubelka, J. Motik, J. Fulka et al. // Gamete. Res. 1988. – V. 19. – P. 423–431. 148. Kubiak, J.Z. The metaphase II arrest in mouse oocytes is controlled through microtubule-dependent destruction of cyclin B in the presence of CSF / J.Z. Kubiak, M. Weber, H. de Pennart et al. // EMBO J. 1993. – V. 12. – P. 3773– 3778. 149. Kubota, C. In vitro and in vivo survival of frozen-thawed bovine oocytes after IVF, nuclear transfer, and parthenogenetic activation / C. Kubota, X. Yang, A. Dinnyes et al. // Mol. Reprod. Dev. 1998. – V. 51. – P. 281–286. 150. Kubota, C. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture / C. Kubota, H. Yamakuchi, J. Todoroki et al. // PNAS. 2000. – V. 97. – P. 990–995. 151. Kues, W.A. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors / W.A. Kues, M. Anger, J.W. Carnwath et al. // Biol. Reprod. 2000. – V. 62. – P. 412–419. 152. Kues, W.A. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts by serum deprivation initiates a nonconventional form of apoptosis / W.A. Kues, J.W. Carnwath, D. Paul et al. // Cloning Stem Cells. 2002. – V. 4. – P. 231–243. 153. Kues, W.A. The contribution of farm animals to human health / W.A. Kues, H. Niemann // Trends. Biotechnol. 2004. – V. 22. – P. 286–294. 145 154. Lai, L. Production of -1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning / L. Lai, D. Kolber-Simonds, K.-W. Park et al. // Science. 2002. – V. 295. – P. 1089–1092. 155. Lane, M. Effect of incubation volume and embryo density on the development and viability of mouse embryos in vitro / M. Lane, D.K. Gardner // Hum. Reprod. 1992. – V. 7. – P. 558–562. 156. Lanza, R.P. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer / R.P. Lanza, J.B. Cibelli, F. Diaz et al. // Cloning. 2000. – V. 2. – P. 79–90. 157. Lasserre, A. The kinetics of oocyte activation and dynamics of polar body formation in Calomys musculinus and Calomys laucha (RodentiaSigmodontinae) / A. Lasserre, E. Cebral, A.D. Vitullo // Zygote. 1999. – V. 7. – P. 347–356. 158. Latham, K.E. Cloning: questions answered and unsolved / K.E. Latham // Differentiation. 2004. – V. 72. – P. 11–22. 159. Latham, K.E. Early and delayed aspects of nuclear reprogramming during cloning / K.E. Latham // Biol. Cell. 2005. – V. 97. – P. 119–132. 160. Lee, H.H. Regulation of cyclin D1, DNA topoisomerase I, and proliferating cell nuclear antigen promoters during the cell cycle / H.H. Lee, W.H. Chiang, S.H. Chiang et al. // Gene Expr. 1995. – V. 4. – P. 95–109. 161. Lee, J.H. Effects of enucleation and caffeine on maturation-promoting factor (MPF) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) activities in ovine oocytes used as recipient cytoplasts for nuclear transfer / J.H. Lee, K.H. Campbell // Biol. Reprod. 2006. – V. 74. – P. 691–698. 162. Leese, H.J. The formation and function of oviduct fluid / H.J. Leese // Reproduction. 1988. – V. 82. – P. 843–856. 163. Leibfried, L. Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro / L. Leibfried, N.L. First // J. Anim. Sci. 1979. – V. 48. – P. 76–86. 146 164. Lewin, В. Driving the cell cycle: M phase kinase, its partners, and substrates / В. Lewin // Cell. 1990. – V. 61. – P. 743–752. 165. Li, G.P. Review of enucleation methods and procedures used in animal cloning: state of the art / G.P. Li, K.L. White, T.D. Bunch // Cloning Stem Cells. 2004. – V. 6. – P. 5–13. 166. Liu, H. In vitro development of mouse zygotes following reconstruction by sequential transfer of germinal vesicles and haploid pronuclei / H. Liu, J. Zhang, L.C. Krey et al. // Hum. Reprod. 2000. – V. 15. – P. 1997–2002. 167. Liu, L. Parthenogenetic development and protein patterns of newly matured bovine oocytes after chemical activation / L. Liu, J.C. Ju, X. Yang // Mol. Reprod. Dev. 1998. – V. 49. – P. 298–307. 168. Liu, L. Regenerated bovine fetal fibroblasts support high blastocyst development following nuclear transfer / L. Liu, T. Shin, J.H. Pryor et al. // Cloning. 2001. – V. 3. – P. 51–58. 169. Lockart, R.Z. Requirements for growth of single human cells: "nonessential" amino acids, notably serine, are necessary and sufficient nutritional supplements / R.Z. Lockart, H. Eagle // Science. 1959. – V. 129. – P. 252–254. 170. Lohka, M.J. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events / M.J. Lohka, M.K. Hayes, J.L. Maller // PNAS. 1988. – V. 85. – P. 3009–3013. 171. Loi, P. Development of parthenogenetic and cloned ovine embryos: effect of activation protocols / P. Loi, S. Ledda, J.J. Fulka et al. // Biol. Reprod. 1998a. – V. 58. – P. 1177–1187. 172. Loi, P. Embryo transfer and related technologies in sheep reproduction / P. Loi, G. Ptak, M. Dattena et al. // Reprod. Nutr. Dev. 1998b. – V. 38. – P. 615– 628. 173. Loi, P. Genetic rescue of an endangered mammal by cross-species nuclear transfer using post-mortem somatic cells / P. Loi, G. Ptak, B. Barboni et al. // Nat. Biotechnol. 2001. – V. 19. – P. 962–964. 147 174. Lopes, A. Microsensor oxygen measurement around in vitro developing cattle embryos: preliminary observations / A. Lopes, L.D.M. Ottosen, T. Greve et al. // Therigenology. 2003. – V. 59. – P. 345. 175. Machaty, Z. Strategies for activating nuclear transfer oocytes / Z. Machaty, R.S. Prather // Reprod. Fertil. Dev. 1998. – V. 10. – P. 599–613. 176. Malenko, G.P. Efficiency of asynchronously in vitro-matured oocytes as recipients for nuclear transfer and of blind enucleation in zona-free bovine cloning / G.P. Malenko, O.I. Stepanov, A.V. Komissarov et al. // Cloning Stem Cells. 2009. – V. 11. – P. 287–292. 177. Maller, J.L. Regulation of amphibian oocyte maturation / J.L. Maller // Cell. Differ. 1985. – V. 16. – P. 211–221. 178. Manes, C. The participation of the embryonic genome during early cleavage in the rabbit / C. Manes // Dev. Biol. 1973. – V. 32. – P. 453–459. 179. Marcus, G.J. Activation of cumulus-free mouse oocytes / G.J. Marcus // Mol. Reprod. Dev. 1990. – V. 26. – P. 159–162. 180. Marx, J. Medicine. Building better mouse models for studying cancer / J. Marx // Science. 2003. – V. 299. – P. 1972–1975. 181. Masui, Y. Oocyte maturation / Y. Masui, H.J. Clarke // Int. Rev. Cytol. 1979. – V. 57. – P. 185–282. 182. Matsushime, H. Colonystimulating factor 1 regulates novel cyclins during the G1 phase of the cell cycle / H. Matsushime, M.F. Roussel, R.A. Ashmun et al. // Cell. 1991. – V. 65. – P. 701–713. 183. Matsushime, H. Identification and properties of an atypical catalytic subunit (p34psk-J3/cdk4) for mammalian d type G1 cycline / H. Matsushime, M.E. Ewen, D.K. Strom et al. // Cell. 1992. – V. 71. – P. 323–334. 184. McCreath, K.J. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells / K.J. McCreath, J. Howcroft, K.H. Campbell et al. // Nature. 2000. – V. 405. – P. 1066–1069. 148 185. McGaughey, R.W. Cytogenetic analysis of pig oocytes matured in vitro / R.W. McGaughey, C. Polge // J. Exp. Zool. 1971. – V. 176. – P. 383–395. 186. McGrath, J. Nuclear transplantation in mouse embryos / J. McGrath, D. Solter // J. Exp. Zool. 1983. – V. 228. – P. 355–362. 187. Melo, E.O. Isolation of transfected fibroblast clones for use in nuclear transfer and transgene detection in cattle embryos / E.O. Melo, R.V. Sousa, L.T. Iguma et al. // Genet. Mol. Res. 2005. – V. 4. – P. 812–821. 188. Miltenberger, R.J. An E-box-mediated increase in cad transcription at the G1/S-phase boundary is suppressed by inhibitory c-Myc mutants / R.J. Miltenberger, K.A. Sukow, P.J. Farnham // Mol. Cell. Biol. 1995. – V. 15. – P. 2527–2535. 189. Mintz, B. Experimental study of the developing mammalian egg: removal of the zona pellucida / B. Mintz // Science. 1962. – V. 138. – P. 594–595. 190. Mitalipov, S.M. Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabbit embryos activated with inositol 1,4,5-trisphosphate / S.M. Mitalipov, K.L. White, V.R. Farrar et al. // Biol. Reprod. 1999. – V. 60. – P. 821–827. 191. Miyoshi, K. Establishment of a porcine cell line from in vitro-produced blastocysts and transfer of the cells into enucleated oocytes / K. Miyoshi, Y. Taguchi, Y. Sendai et al. // Biol. Reprod. 2000. – V. 62. – P. 1640–1646. 192. Miyoshi, K. Utility of rapidly matured oocytes as recipients for production of cloned embryos from somatic cells in the pig / K. Miyoshi, S.J. Rzucidlo, S.L. Pratt et al. // Biol. Reprod. 2002. – V. 67. – P. 540–545. 193. Moens, A. Differential ability of male and female rabbit fetal germ cell nuclei to be reprogrammed by nuclear transfer / A. Moens, S. Chastant, P. Chesne et al. // Differentiation. 1996. – V. 60. – P. 339–345. 194. Moessner, J. The quality of human embryo growth is improved when embryos are cultured in groups rather than separately / J. Moessner, W.C. Dodson // Fertil. Steril. 1995. – V. 64. – P. 1034–1035. 149 195. Moor, R.M. Hormonal and follicular factors affecting maturation of sheep oocytes in vitro and their subsequent developmental capacity / R.M. Moor, A.O. Trounson // J. Reprod. Fertil. 1977. – V. 49. – P. 101–109. 196. Morgan, A.J. Jacob R. Ionomycin enhances Ca2+ influx by stimulating store-regulated cation entry and not by a direct action at the plasma membrane / A.J. Morgan, R. Jacob // Biochem. J. 1994. – V. 300. – P. 665–672. 197. Motlik, J. Breakdown of the germinal vesicle in bovine oocytes cultivated in vitro / J. Motlik, H.H. Koefoed-Johnsen, J. Fulka // J. Exp. Zool. 1978. – V. 205. – P. 377–383. 198. Motlik, J. Breakdown of the germinal vesicle in pig oocytes in vivo and in vitro / J. Motlik, J. Fulka // J. Exp. Zool. 1976. – V. 198. – P. 155–162. 199. Motlik, J. Cultivation of pig oocytes in vitro (protein concentration, nuclear maturation, timing of meiosis) / J. Motlik // Folia. Biol. 1972. – V. 18. – P. 345–349. 200. Muller, W. Interactions of heteroaromatic compounds with nucleic acids: A; T-specific non-intercalating DNA ligands / W. Muller, F. Gautier // Eur. J. Biochem. 1975. – V. 54. – P. 385–394. 201. Naglee, D.L. Effect of osmolarity on in vitro development of rabbit embryos in a chemically defined medium / D.L. Naglee, R.A. Maurer, R.H. Foote // Exp. Cell. Res. 1969. – V. 58. – P. 331–333. 202. Nakao, H. Effects of co-culture, medium components and gas phase on in vitro culture of in vitro matured and in vitro fertilized bovine embryos / H. Nakao, N. Nakatsuji // Theriogenology. 1990. – V. 33. – P. 591–600. 203. Navara, C.S. Microtubule organization in the cow during fertilization, polyspermy, parthenogenesis, and nuclear transfer: The role of the sperm aster / C.S. Navara, N.L. First, G. Schatten // Dev. Biol. 1994. – V. 162. – P. 29–40. 204. Newcomb, R. Birth of calves after in vivo fertilisation of oocytes removed from follicles and matured in vitro / R. Newcomb, W.B. Christie, L.E. Rowson // Vet. Rec. 1978. – V. 102. – P. 461–462. 150 205. Nguyen, V.T. Stage-specific effects of the osmolarity of a culture medium on the development of parthenogenetic diploids in the pig / V.T. Nguyen, S. Kure-bayashi, H. Harayama et al. // Theriogenology. 2003. – V. 59. – P. 719– 734. 206. Niemann, H. Transgenic farm animals: present and future / H. Niemann, W. Kues, J.W. Carnwath // Rev. Sci. Tech. 2005. – V. 24. – P. 285–298. 207. Nour, M.S. Preparation of young preactivated oocytes with high enucleation efficiency for bovine nuclear transfer / M.S. Nour, Y. Takahashi // Theriogenology. 1999. – V. 51. – P. 661–666. 208. Nurse, P. Universal control mechanism regulating onset of M-phase / P. Nurse // Nature. 1990. – V. 344. – P. 503–508. 209. Oback, B. Cloned cattle derived from a novel zona-free embryo reconstruction system / B. Oback, A.T. Wiersema, P. Gaynor et al. // Cloning Stem Cells. 2003. – V. 5. – P. 3–12. 210. Oback, B. Practical aspects of donor cell selection for nuclear cloning / B. Oback, D. Wells // Cloning Stem Cells. 2002. – V. 4. – P. 169–174. 211. Oback, O. Cloning cattle / O. Oback, D.N. Wells // Cloning Stem Cells. 2003. – V. 5. – P. 243–257. 212. Ohtsubo, M. Cyclin-dependend regulation G1 in mammalian fibroblasts / M. Ohtsubo, J.M. Roberts // Science. 1993. – V. 259. – P. 1908–1912. 213. Onishi, A. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei / A. Onishi, M. Iwamoto, T. Akita et al. // Science. 2000. – V. 289. – P. 1188–1190. 214. Ono, Y. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer / Y. Ono, N. Shimozawa, M. Ito et al. // Biol. Reprod. 2001. – V. 64. – P. 44–50. 215. Osborn, J.C. Cell interactions and actin synthesis in mammalian oocytes / J.C. Osborn, R.M. Moor // J. Exp. Zool. 1982. – V. 220. – P. 125–129. 151 216. Ozil, J.P. The parthenogenetic development of rabbit oocytes after repetitive pulsatile electrical stimulation / J.P. Ozil // Development. 1990. – V. 109. – P. 117–127. 217. Palmiter, R.D. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes / R.D. Palmiter, R.L. Brinster, R.E. Hammer et al. // Nature. 1982. – V. 300. – P. 611–615. 218. Park, K.W. Mosaic gene expression in nuclear transferderived embryos and the production of cloned transgenic pigs from ear-derived fibroblasts / K.W. Park, L. Lai, H.T. Cheong et al. // Biol. Reprod. 2002. – V. 66. – P. 1001–1005. 219. Parrish, J.J. Capacitation of bovine spermatozoa by oviduct fluid / J.J. Parrish, J.L. Susko-Parrish, R.R. Handrow et al. // Biol. Reprod. 1989. – V. 40. – P. 1020–1025. 220. Parrish, J.J. Effect of heparin and chondroitin sulfate on the acrosome reaction and fertility of bovine sperm in vitro / J.J. Parrish, J.L. Susko-Parrish, N.L. First // Theriogenology. 1985. – V. 24. – P. 537–549. 221. Petters, R.M. Genetically engineered large animal model for studying cone photoreceptor survival and degeneration in retinitis pigmentosa / R.M. Petters, C.A. Alexander, K.D. Wells et al. // Nat. Biotechnol. 1997. – V. 15. – P. 965–970. 222. Peura, T.T. A comparison of established and new approaches in ovine and bovine nuclear transfer / T.T. Peura, G. Vajta // Cloning Stem Cells. 2003. – V. 5. – P. 257–277. 223. Peura, T.T. The effect of recipient oocyte volume on nuclear transfer in cattle / T.T. Peura, I.M. Lewis, A.O. Trounson // Mol. Reprod. Dev. 1998. – V. 50. – P. 185–191. 224. Phelps, C.J. Production of 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs / C.J. Phelps, C. Koike, T.D. Vaught et al. // Science. 2003. – V. 299. – P. 411–414. 152 225. Pincus, G. Observations on the development of cow ova in vivo and in vitro / G. Pincus // Proc. of 1st National Egg Transfer Breeding Conf.: – San Antonio, 1951. – P. 18. 226. Pincus, G. The comparative behavior of mammalian eggs in vivo and in vitro: I. The activation of ovarian eggs / G. Pincus, E.V. Enzmann // J. Exp. Med. 1935. – V. 62. – P. 665–675. 227. Pinkerton, J.H. Development of the human ovary – a study using histochemical technics / J.H. Pinkerton, D.G. McKay, E.C. Adams et al. // Obstet. Gynecol. 1961. – V. 18. – P. 152–181. 228. Pinto-Correia, C. Chromatin and microtubule organization in the first cell cycle in rabbit parthenotes and nuclear transplant embryos / C. Pinto-Correia, P. Collas, F.A. Ponce de Leon et al. // Mol. Reprod. Dev. 1993. – V. 34. – P. 33– 42. 229. Polejaeva, I.A. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells / I.A. Polejaeva, S.H. Chen, T.D. Vaught et al. // Nature. 2000. – V. 407. – P. 86–90. 230. Polejaeva, I.A. New advances in somatic cell nuclear transfer: application in transgenesis / I.A. Polejaeva, K.H. Campbell // Theriogenology. 2000. – V. 53. – P. 117–126. 231. Prather, R.S. Nuclear transplantation in early pig embryos / R.S. Prather, M.M. Sims, N.L. First // Biol. Reprod. 1989. – V. 41. – P. 414–418. 232. Presicce, G.A. Parthenogenetic development of bovine oocytes matured in vitro for 24 hr and activated by ethanol and cycloheximide / G.A. Presicce, X. Yang // Mol. Reprod. Dev. 1994. – V. 38. – P. 380–385. 233. Prokofiev, M.I. Blind enucleation of oocytes is highly efficient in zonafree bovine cloning / M.I. Prokofiev, O.I. Stepanov, A.V. Komissarov et al. // Reprod. Fertil. Dev.: Proceedings of the annual conference of the international embryo transfer society. – Kyoto, Japan, 2007. – V. 19. – P. 156–157. 153 234. Qi, Z. Nuclear transplantation by microinjection in rabbit / Z. Qi, L. Ziyi, L. Zhong-hua et al. // Theriogenology. 1997. – V. 47. – P. 239. 235. Quelle, D.E. Overexpression of mouse D-type cyclins accelerates G1 phase in rodent fibroblasts / D.E. Quelle, R.A. Ashman, S.A. Shurtlef et al. // Genes. Dev. 1993. – V. 7. – P. 1559–1571. 236. Reeve, W.J. Effect of concanavalin A on the formation of the mouse blastocyst / W.J. Reeve // J. Reprod. Immunol. 1982. – V. 4. – P. 53–64. 237. Reggio, B.C. Cloned transgenic offspring resulting from somatic cell nuclear transfer in the goat: oocytes derived from both follicle-stimulating hormone-stimulated and nonstimulated abattoir-derived ovaries / B.C. Reggio, A.N. James, H.L. Green et al. // Biol. Reprod. 2001. – V. 65. – P. 1528–1533. 238. Restall, B.J. The fallopian tube of the sheep. III. The chemical composition of the fluid from the fallopian tube / B.J. Restall, R.G. Wales // Aust. J. Biol. Sci. 1966. 19. – P. 687–698. 239. Richards, W.L. Measurement of cell proliferation in microculture using Hoechst 33342 for the rapid semiautomated microfluorimetric determination of chromatin DNA / W.L. Richards, M.K. Song, H. Krutzsch et al. // Expl. Cell. Res. 1985. – V. 159. – P. 235–246. 240. Rieger, D. Measurement of the metabolism of energy substrates in individual bovine blastocysts / D. Rieger, P. Guay // J. Reprod. Fertil. 1988. – V. 83. – P. 585–591. 241. Robinson, T.J. The control of fetility in sheep. II. The augmentation of fertility by gonadotropin treatment of the ewe in the normal breeding season / T.J. Robinson // J. Agr. Sci. (Camb.) 1950. – V. 41. – P. 6. 242. Robl, G.M. The effects of protein supplements on the in vitro development of IVM/IVF bovine oocytes / G.M. Robl, J.R. Dobrinsky, R.T. Duby // Theriogenology. 1991. – V. 35. – P. 263. 154 243. Rols, M.P. Ionic-strength modulation of electrically induced permeabilization and associated fusion of mammalian cells / M.P. Rols, J. Teissie // Eur. J. Biochem. 1989. – V. 179. – P. 109–115. 244. Rose, T.A. Effect of oocyte maturation medium on in vitro development of in vitro fertilized bovine embryos / T.A. Rose, B.D. Bavister // Mol. Reprod. Dev. 1992. – V. 31. – P. 72–77. 245. Rosenkrans, C.F. In vitro synthesis of prostaglandin E and F2 alpha by pig endometrium in the presence of estradiol, catechol estrogen and ascorbic acid / C.F. Rosenkrans, B.C. Paria, D.L. Davis et al. // J. Anim. Sci. 1990. – V. 68. – P. 435–443. 246. Rosenkrans, C.F. Pig blastocyst development in vitro is affected by amino acids / C.F. Rosenkrans, D.L. Davis, G. Milliken // J. Anim. Sci. 1989. – V. 67. – P. 1503–1508. 247. Rowlands, W. Capacity of hyaluronidase to increase the fertilizing power of sperm / W. Rowlands // Nature. 1944. – V. 154. – P. 332–333. 248. Rozinek, J. Microtubule rearrangement during in vitro maturation of pig oocytes. Effect of cycloheximide / J. Rozinek, J. Petr, R. Grocholova et al. // Reprod. Nutr. Dev. 1995. – V. 35. – P. 685–694. 249. Sadler, S.E. Inhibition of Xenopus oocyte adenylate cyclase by progesterone: a novel mechanism of action / S.E. Sadler, J.L. Maller // Adv. Cyc. Nuc. Prot. Phospor. Res. 1985. – V. 19. – P. 179–194. 250. Sato, E. Arresting substance and arresting mechanism of meiosis in mammalian oocyte / E. Sato, T. Ishibashi // Horumon. To. Rinsho. 1982. – V. 30. – P. 69–74. 251. Schini, S.A. Two-cell block to development of cultured hamster embryos is caused by phosphate and glucose / S.A. Schini, B.D. Bavister // Biol. Reprod. 1988. – V. 39. – P. 1183–1192. 252. Schmidt, K.D. No effect of in vitro production of embryos on size and organ weight in premature newborn calves / K.D. Schmidt, P.T.Sangild, H. 155 Jacobsen, et al. // Proc. 14th Sci. Meet. Eur. Embryo. Trans. Assoc.: – Venice, Italy, 1988. – P. 244 253. Schnieke, A.E. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts / A.E. Schnieke, A.J. Kind, W.A. Ritchie et al. // Science. 1997. – V. 278. – P. 2130–2133. 254. Schultz, G.A. Estimation of the diversity of transcription in early rabbit embryos / G.A. Schultz, C. Manes, W.E. Hahn // Biochem. Genet. 1973. – V. 9. – P. 247–259. 255. Schurmann, A. Early zygotes are suitable recipients for bovine somatic nuclear transfer and result in cloned offspring / A. Schurmann, D.N. Wells, B. Oback // Reproduction. 2006. – V. 132. – P. 839–848. 256. Seshagiri, P.B. Glucose inhibits development of hamster 8-cell embryos in vitro / P.B. Seshagiri, B.D. Bavister // Biol. Reprod. 1989 a. – V. 40. – P. 599– 606. 257. Seshagiri, P.B. Phosphate is required for inhibition by glucose of development of hamster 8-cell embryos in vitro / P.B. Seshagiri, B.D. Bavister // Biol. Reprod. 1989 b. – V. 40. – P. 607–614. 258. Shen, L. Cell death by bortezomib-induced mitotic catastrophe in natural killer lymphoma cells / L. Shen, W. Au, K. Wong et al. // Mol. Cancer. Ther. 2008. – V. 7. – P. 3807–3815. 259. Shiina, Y. Role of the extracellular Ca2+ on the intracellular Ca2+ changes in fertilized and activated mouse oocytes / Y. Shiina, M. Kaneda, K. Matsuyama et al. // J. Reprod. Fertil. 1993. – V. 97. – P. 143–150. 260. Shin, M.R. Nuclear and microtubule reorganization in nucleartransferred bovine embryos / M.R. Shin, S.W. Park, H. Shim et al. // Mol. Reprod. Dev. 2002 a. – V. 62. – P. 74–82. 261. Shin, T. A cat cloned by nuclear transplantation / T. Shin, D. Kraemer, J.H. Pryor et al. // Nature. 2002 b. – V. 415. – P. 859. 156 262. Simerly, C. Molecular correlates of primate nuclear transfer failures / C. Simerly, C. Simerly, T. Dominko et al. // Science. 2003. – V. 300. – P. 297 263. Sims, M. Production of calves by transfer of nuclei from cultured inner cell mass cells / M. Sims, N.L. First // PNAS. 1994. – V. 91. – P. 6143–6147. 264. Smith, J.R. Inhibitors of DNA synthesis from senescent and quiescent human diploid fibroblasts / J.R. Smith, O.M. Pereira-Smith, C.K. Lumpkin et al. // J. Cell. Biol. 1985. – V. 101. – P. 141. 265. Smith, L.C. Membrane and intracellular effects of ultraviolet irradiation with Hoechst 33342 on bovine secondary oocytes matured in vitro / L.C. Smith // J. Reprod. Fertil. 1993. – V. 99. – P. 39–44. 266. Soloy, E. Time course of pronuclear deoxyribonucleic acid synthesis in parthenogenetically activated bovine oocytes / E. Soloy, J. Kanka, D. Viuff et al. // Biol. Reprod. 1997. – V. 57. – P. 27–35. 267. Spiering, A.L. A potent DNA synthesis inhibitor expressed by the immortal cell line SUSM-1 / A.L. Spiering, J.R. Smith, O.M. Pereira-Smith // Exp. Cell Res. 1988. – V. 179. – P. 159–167. 268. Sreenan, J. Culture of fertilized cow eggs / J. Sreenan, P. Scanlon, I. Gordon // J. Agr. Sci. (Camb.) 1968. – V. 70. – P. 183. 269. Stanke, D.F. Proteins and amino acids in bovine oviducal fluid / D.F. Stanke, J.D. Sikes, D.W. DeYoung et al. // J. Reprod. Fertil. 1974. – V. 38. – P. 493–496. 270. Stein, G.H. Nuclear accumulation of p21Cip1 at the onset of mitosis: a role at the G2/M-phase transition / G.H. Stein, D.F. Far, S.I. Reed // Mol. Cell. Biol. 1998. – V. 18. – P. 546–557. 271. Steinhardt, R.A. Is calcium ionophore a universal activator for unfertilised eggs? / R.A. Steinhardt, D. Epel, E.J. Carroll et al. // Nature. 1974. – V. 252. – P. 41–43. 157 272. Sun, F.Z. A comparison of intracellular changes in porcine eggs after fertilization and electroactivation / F.Z. Sun, J. Hoyland, X. Huang et al. // Development. 1992. – V. 115. – P. 947–956. 273. Sung, L. Premature chromosome condensation is not essential for nuclear reprogramming in bovine somatic cell nuclear transfer / L. Sung, P. Shen, B. Jeong et al. // Biol. Reprod. 2007. – V. 76. – P. 232–240. 274. Susko-Parrish, J.L. Inhibition of protein kinases after an induced calcium transient causes transition of bovine oocytes to embryonic cycles without meiotic completion / J.L. Susko-Parrish, M.L. Leibfried-Rutledge, D.L. Northey et al. // Devel. Boil. 1994. – V. 166. – P. 729–739. 275. Swann, K. The part played by inositol trisphosphate and calcium in the propagation of the fertilization wave in sea urchin eggs / K. Swann, M. Whitaker // J. Cell Biol. 1986. – V. 103. – P. 2333–2342. 276. Szollosi, M.S. Inhibition of protein kinases by 6-dimethylaminopurine accelerates the transition to interphase in activated mouse oocytes / M.S. Szollosi, J.Z. Kubiak, P. Debey et al. // J. Cell. Sci. 1993. – V. 104. – P. 861–872. 277. Takahashi, Y. In vitro development of bovine one-cell embryos: Influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids and vitamins / Y. Takahashi, N.L. First // Theriogenology. 1992. – V. 37. – P. 963–978. 278. Tani, T. Direct exposure of chromosomes to nonactivated ovum cytoplasm is effective for bovine somatic cell nucleus reprogramming / T. Tani, Y. Kato, Y. Tsunoda // Biol. Reprod. 2001. – V. 64. – P. 324–330. 279. Tani, T. Reprogramming of bovine somatic cell nuclei is not directly regulated by maturation promoting factor or mitogen-activated protein kinase activity / T. Tani, Y. Kato, Y. Tsunoda // Biol. Reprod. 2003. – V. 69. – P. 1890– 1894. 280. Tarkowski, A.K. Development of blastomeres of mouse eggs isolated at the 4- and 8-cell stage / A.K. Tarkowski, J. Wróblewska // J. Embryol. Exp. Morphol. 1967. – V. 18. – P. 155–180. 158 281. Tecirlioglu, R.T. Birth of a cloned calf derived from a vitrified handmade cloned embryo / R.T. Tecirlioglu, A.J. French, I.M. Lewis et al. // Reprod. Fertil. Dev. 2003. – V. 15. – P. 361–366. 282. Tervit, H.R. Birth of lambs after culture of sheep ova in vitro for up to 6 days / H.R. Tervit, L.E.A. Rowson // J. Reprod. Fertil. 1974. – V. 38. – P. 177– 179. 283. Tervit, H.R. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova / H.R. Tervit, D.G. Whittingham, L.E.A. Rowson // J. Reprod. Fert. 1972. – V. 30. – P. 493–497. 284. Thibault, C. Some pathological aspects of ovum maturation and gamete transport in mammals and man / C. Thibault // Acta. Endocrinol. 1972. – V. 71. – P. 59–66. 285. Trounson, A.O. Attempts to produce identical offspring in the sheep by mechanical division of the ovum / A.O. Trounson, N.W. Moore // Aust. J. Biol. Sci. 1974. – V. 27. – P. 505–510. 286. Urakawa, M. Examination of a modified cell cycle synchronization method and bovine nuclear transfer using synchronized early G1 phase fibroblast cells / M. Urakawa, A. Ideta, T. Sawada et al. // Theriogenology. 2004. – V. 62. – P. 714–728. 287. Urakawa, M. Examination of a modified cell cycle synchronization method and bovine nuclear transfer using synchronized early G1 phase fibroblast cells / M. Urakawa, A. Ideta, T. Sawada et al. // Theriogenology. 2004. – V. 62. – P. 714–728. 288. Vajta, G. Hand-made cloning approach: potentials and limitations / G. Vajta, P.M. Kragh, N.R. Mtango et al. // Reprod. Fertil. Dev. 2005. – V. 17. – P. 97–112. 289. Vajta, G. Handmade somatic cell cloning in cattle / G. Vajta, I.M. Lewis, R.T. Tecirlioglu // Methods. Mol. Biol. 2006. – V. 348. – P. 183–196. 159 290. Vajta, G. Handmade somatic cell cloning in cattle: analysis of factors contributing to high efficiency in vitro / G. Vajta, I.M. Lewis, A.O. Trounson et al. // Biol. Reprod. 2003. – V. 68. – P. 571–578. 291. Vajta, G. New method for culture of zona-included or zona-free embryos: the well of the well (WOW) system / G. Vajta, T.T. Peura, P. Holm et al. // Mol. Reprod. Dev. 2000. – V. 55. – P. 256–264. 292. Vajta, G. Somatic cell cloning without micromanipulators / G. Vajta, I.M. Lewis, P. Hyttel et al. // Cloning. 2001. – V. 3. – P. 89–95. 293. Van Soom, A. Sucrose-induced shrinkage of in vitro produced bovine morulae: effect on viability, morphology and ease of evaluation / A. Van Soom, M.T. Ysebaert, A.V. Medts et al. // Theriogenology. 1996. – V. 46. – P. 1131– 1147. 294. Verlhac, M.H. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes / M.H. Verlhac, J.Z. Kubiak, H.J. Clarke et al. // Development. 1994. – V. 120. – P. 1017–1025. 295. Wakayama, T. Cloning of male mice from adult tail-tip cells / T. Wakayama, R. Yanagimachi // Nat. Genet. 1999 b. – V. 22. – P. 127–128. 296. Wakayama, T. Effect of cytokinesis inhibitors, DMSO and the timing of oocyte activation on mouse cloning using cumulus cell nuclei / T. Wakayama, R. Yanagimachi // Reproduction. 2001 a. – V. 122. – P. 49–60. 297. Wakayama, T. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei / T. Wakayama, A.C. Perry, M. Zuccotti et al. // Nature. 1998. – V. 394. – P. 369–374. 298. Wakayama, T. Mice cloned from embryonic stem cells / T. Wakayama, I. Rodriguez, A.C. Perry et al. // PNAS. 1999 a. – V. 96. – P. 14984–14989. 299. Wakayama, T. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type / T. Wakayama, R. Yanagimachi // Mol. Reprod. Dev. 2001 b. – V. 58. – P. 376–383. 160 300. Wales, R.G. Effects of ions on the development of the pre-implantation mouse embryo in vitro / R.G. Wales // Aust. J. Biol. Sci. 1970. – V. 23. – P. 421. 301. Wang, W.H. Activation of porcine oocytes with calcium ionophore: effects of extracellular calcium / W.H. Wang, Z. Machaty, N. Ruddock et al. // Mol. Reprod. Dev. 1999. – V. 53. – P. 99–107. 302. Wang, W.L. Effect of condition medium and glucose concentration on the in vitro development of early bovine embryos / W.L. Wang, H.S. Jiang, K.H. Lu et al. // Theriogenology. 1990. – V. 33. – P. 343. 303. Watson, A.J. Expression of growth factor ligand and receptor genes in the preimplantation bovine embryo / A.J. Watson, A. Hogan, A. Hahnel et al. // Mol. Reprod. Dev. 1992. – V. 31(2). – P. 87–95. 304. Wells, D.N. Cloning sheep from cultured embryonic cells / D.N. Wells, P.M. Misica, A.M. Day et al. // Reprod. Fertil. Dev. 1998. – V. 10. – P. 615–626. 305. Wells, D.N. Coordination between donor cell type and cell cycle stage improves nuclear cloning efficiency in cattle / D.N. Wells, G. Laible, F.C. Tucker et al. // Theriogenology. 2003. – V. 59. – P. 45–59. 306. Wells, D.N. Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulosa / D.N. Wells, P.M. Misica, H.R. Tervit // Cells Biol. Reprod. 1999. – V. 60. – P. 996–1005. 307. Wells, J. Protein-DNA interactions at the major and minor promoters of the divergently transcribed dhfr and rep3 genes during the Chinese hamster ovary cell cycle / J. Wells, P. Held, S. Illenye et al. // Mol. Cell. Biol. 1996. – V. 16. – P. 634–647. 308. Westhusin, M.E. Reducing the amount of cytoplasm available for early embryonic development decreases the quality but not quantity of embryos produced by in vitro fertilization and nuclear transplantation / M.E. Westhusin, P. Collas, D. Marek et al. // Theriogenology. 1996. – V. 46. – P. 243–252. 309. Westhusin, M.E. Viable embryos and normal calves after nuclear transfer into Hoechst stained enucleated demi-oocytes of cows / M.E. Westhusin, 161 M.J. Levanduski, R. Scarborough et al. // J. Reprod. Fertil. 1992. – V. 95. – P. 475–480. 310. Whittingham, D.G. The involvement of calcium in the activation of mammalian oocytes / D.G. Whittingham, G. Siracusa // Exp. Cell. Res. 1978. – V. 113. – P. 311–317. 311. Wiley, L.M. Effect of potassium concentration, type of protein supplement, and embryo density on mouse preimplantation development in vitro / L.M. Wiley, S. Yamami, D. Van Muyden // Fertil. Steril. 1986. – V. 45. – P. 111– 119. 312. Willadsen, S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos / S.M. Willadsen // Nature. 1986. – V. 320. – P. 63–65. 313. Wilmut, I. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells / I. Wilmut, A.E. Schnieke, J. McWhir et al. // Nature. 1997. – V. 385. – P. 810–813. 314. Wintenberger, S. Development in vitro of the ovum of the sheep and of the goat / S. Wintenberger, L. Dauzier, C. Thibault // Soc. Biol. Fil. 1953. – V. 147. – P. 1971–1974. 315. Won, K.A. Growth-regulatde expression of D-type cyclin genes in human diploid fibroblasts / K.A. Won, Y. Xiong, D. Beach et al. // PNAS. 1992. – V. 89. – P. 9910–9914. 316. Woods, G.L. A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer / G.L. Woods, K.L. White, D.K. Vanderwall et al. // Science. 2003. – V. 301. – P. 1063. 317. Wright, R.W. Aspects of in vitro fertilization and embryo culture in domestic animals / R.W. Wright, K.R. Bondioli // J. Anim. Sci. 1981. – V. 53. – P. 702–729. 318. Wright, R.W. In vitro culture of embryos from adult and prepuberal ewes / R.W. Wright, G.B. Anderson, P.T. Cupps et al. // J. Anim. Sci. 1976. – V. 42. – P. 912–917. 162 319. Wright, R.W. Successful culture in vitro of swine embryos to the blastocyst stage / R.W. Wright // J. Anim. Sci. 1977. – V. 44. – P. 854–858. 320. Yang, X. Potential of hypertonic medium treatment for embryo micromanipulation: II. Assessment of nuclear transplantation methodology, isolation, subzona insertion, and electrofusion of blastomeres to intact or functionally enucleated oocytes in rabbits / X. Yang, L. Zhang, A. Kovacs et al. // Mol. Reprod. Dev. 1990. – V. 27. – P. 118–129. 321. Ye, J. Synchronization of porcine oocyte meiosis using cycloheximide and its application to the study of regulation by cumulus cells / J. Ye, A.P. Flint, K.H. Campbell et al. // Reprod.. Fertl. Dev. 2002. – V. 14. – P. 433–442. 322. Yin, X.J. Nuclear remodelling and the developmental potential of nuclear transferred porcine oocytes under delayed-activated conditions / X.J. Yin, S.K. Cho, M.R. Park et al. // Zygote. 2003. – V. 11. – P. 167–174 323. Yoshida, M. Effects of gonadotropins and estradiol-17b on the timing of nuclear maturation and cumulus mass expansion in pig oocytes cultured in vitro / M. Yoshida, K. Bamba, Y. Kojima // Jpn. J. Anim. Reprod. 1989. – V. 35. – P. 86–91. 324. Younis, A.I. Influence of serum and hormones on bovine oocyte maturation and fertilization in vitro / A.I. Younis, B.G. Brackett, R.A. FayrerHosken // Gamete Res. 1989. – V. 23. – P. 189–201. 325. Yu, Y.S. Studies of the cell cycle of in vitro cultured skin fibroblasts in goats: work in progress / Y.S. Yu, X.S. Sun, H.N. Jiang et al. // Theriogenology. 2003. – V. 59. – P. 1277–1289. 326. Zaidi, A. Life-supporting pig-to-primate renal xenotransplantation using genetically modified donors / A. Zaidi, M. Schmoeckel, F. Bhatti et al. // Transplantation. 1998. – V. 65. – P. 1584–1590. 327. Zakhartchenko, V. Adult cloning in cattle: potential of nuclei from a permanent cell line and from primary cultures / V. Zakhartchenko, R. Alberio, M. Stojkovic et al. // Mol. Reprod. Dev. 1999. – V. 54. – P. 264–272. 163 328. Zakhartchenko, V. Karyoplast-cytoplast volume ratio in bovine nuclear transfer embryos: effect on developmental potential / V. Zakhartchenko, M. Stojkovic, G. Brem et al. // Mol. Reprod. Dev. 1997. – V. 48. – P. 332–338. 329. Zakhartchenko, V. Nuclear transfer in cattle using in vivo-derived vs. in vitro-produced donor embryos: effect of developmental stage / V. Zakhartchenko, H.D. Reichenbach, J. Riedl et al. // Mol. Reprod. Dev. 1996. – V. 44. – P. 493– 498. 330. Zawada, W.M. Somatic cell cloned transgenic bovine neurons for transplantation in parkinsonian rats / W.M. Zawada, J.B. Cibelli, P.K. Choi et al. // Nat. Med. 1998. – V. 4. – P. 569–574. 331. Zhang, X. Presence of amino acids and insulin in a chemically defined medium improves development of 8-cell rat embryos in vitro and subsequent implantation in vivo / X. Zhang, D.T. Armstrong // Biol. Reprod. 1990. – V. 42. – P. 662–668. 332. Zhou, Q. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation / Q. Zhou, J.P. Renard, G. Le Friec et al. // Science. 2003. – V. 302. – P. 1179. 333. Zimmermann, U. Electric field-induced cell-to-cell fusion / U. Zimmermann, J. Vienken // J. Membr. Biol. 1982. – V. 67. – P. 165–182. 164 ПРИЛОЖЕНИЯ
