Кинетическая модель функционирования 2

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, НОЯБРЬ 2006
Дата поступления: 26.10.2006.
Кинетическая модель функционирования 2-кетоглутаратдегидрогеназы
Escherichia coli.
Могилевская ЕА., Лебедева Г.В., Демин О.В.
Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, МГУ им. М.В.Ломоносова,
Москва
Введение
2-кетоглутаратдегидрогеназа (KGDH, EC 1.2.4.2) — фермент цикла Кребса, кодируется
генами
sucAB,lpd
декарбоксилирования
и
катализирует
2-кетоглутарата
необратимую
(KG)
с
реакцию
образованием
окислительного
сукцинил-КоА
и
восстановлением NAD [1]:
KG + NAD + CoA = CO2 + NADH + SucCoA.
Методы
исследования.
Для
описания
механизма
функционирования
фермента
использовались литературные экспериментальные данные, полученные при исследовании
очищенной 2-кетоглутаратдегидрогеназы E. coli in vitro. Вывод уравнения скорости
работы фермента основывался на принципах квазистационарного состояния [2] и состоял
из нескольких этапов, описанных в работе [3]. Значения параметров уравнения скорости
выбирались
из
условия
наилучшего
совпадения
экспериментальных
данных
с
соответствующими им результатами численного решения уравнений с помощью пакета
программ DBSolve7.0 [4].
Результаты.
Известные
экспериментальные
данные.
Нами
были
использованы
следующие
литературные данные по функционированию 2-кетоглутаратдегидрогеназы E. coli:
1) 2-кетоглутаратдегидрогеназа — полиферментный комплекс, включающий три
ферментативные
активности:
2-кетоглутаратдекарбоксилазную,
дигидролипоилтранссукцинилазную и дигидролипоилдегидрогеназную. Фермент работает
по механизму Ping Pong по классификации Клеланда [5].
2) Реакция является практически необратимой: константа равновесия равна 2.5e6 [6].
3) В литературе описан эффект субстратного ингибирования фермента 2-кетоглутаратом
при концентрациях последнего, превышающих 0.08 mM [6].
4) Максимальная скорость работы фермента зависит от рН [7].
442
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, НОЯБРЬ 2006
Дата поступления: 26.10.2006.
5) Известные из литературы кинетические параметры 2-кетоглутаратдегидрогеназы
E. coli:
kcat2=5e4 1/мин (pH8.0; t=30^C) [6];
оптимальный pH 8.0 [8]
1) Построение каталитического цикла работы фермента.
Функционирование фермента описывалось в соответствии с необратимым Ping Pong
механизмом. Субстратное ингибирование фермента 2-кетоглутаратом [6] было описано с
помощью введения в модель двух сайтов связывания 2-кетоглутарата, между которыми
существует кооперативное взаимодействие. Мы предполагаем, что первый сайт
связывания 2-кетоглутарата обладает большим сродством к субстрату, чем второй. В то
же время стадия катализа в первом сайте характеризуется большей константой скорости
k1, чем стадия катализа во втором сайте k4. Схема каталитического цикла представлена на
рис. 1. Кроме того, мы описали зависимость активности фермента от pH (далее рНзависимость), исходя из классического предположения [2], что фермент может
протонироваться в активном сайте, причем активной является единожды протонированная
форма, а депротонированная и дважды протонированные формы являются неактивными.
На Рис. 1 синим цветом показано протонирование свободной формы фермента Е1, таким
же образом происходит протонирование всех других форм фермента - Е1-KG, Е1-KG2,
Е2, Е2-CoA, Е3, Е3-NAD – с константами диссоциации протона K1_H и K2_H.
Рис. 1. Схема каталитического цикла 2-кетоглутаратдегидрогеназы E. coli.
Обозначения: E1, E2, E3 – три формы фермента. Толстые стрелки обозначают
медленные стадии, тонкие стрелки обозначают быстрые стадии связывания субстратов.
Вывод уравнения стационарной скорости работы фермента:
443
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, НОЯБРЬ 2006
Дата поступления: 26.10.2006.
Поскольку реакция является практически необратимой [6], мы описывали работу
фермента только в прямом направлении в виде зависимости скорости от субстратов и
эффекторов. На схеме (рис. 1) стадии присоединения субстратов изображены тонкими
стрелками, а каталитические стадии - толстыми стрелками с константами скоростей k1,
k2, k3, k4. При выводе уравнения скорости мы предполагали, что все реакции
присоединения субстратов и протонов происходят намного быстрее, чем каталитические
стадии. Для стадий присоединения протонов мы предполагали, что они характеризуются
двумя параметрами – константой диссоциации протона от дважды протонированной
формы фермента и константой диссоциации протона от единожды протонированной
формы фермента независимо от того, какие субстраты присоединены к ферменту.
Учитывая эти предположения, мы вывели уравнение скорости:
(1)
Здесь, KGDH - концентрация фермента, K1_H и K2_H - константы диссоциации для
протонов,
k1, k2, k3, k4 – константы скорости для соответствующих стадий
каталитического цикла (см. Рис. 1), Kd1_KG и Kd2_KG - константы диссоциации для 2кетоглутарата от двух каталитических сайтов. Kd_CoA, Kd_NAD - константы
диссоциации для CoA и NAD соответственно.
444
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, НОЯБРЬ 2006
Дата поступления: 26.10.2006.
Константы диссоциации для протонов были определены по экспериментальным данным
[7] (см. Рис. 2). В работе [6] было показано, что субстратное ингибирование
Рис. 2.
Зависимость максимальной активности 2-кетоглутаратдегидрогеназы от pH,
представленная экспериментальными точками из [7] и описываемая кривой согласно
уравнению скорости (1) при t=25^C.
реакции 2-кетоглутаратом наблюдается при концентрациях последнего, превышающих
0.08 мМ. Исходя из этого факта, при описании зависимости начальной скорости от
концентрации 2-кетоглутарата при концентрациях ниже 0,08 мМ мы можем пренебречь в
уравнении (1) членами, в которые входит KG в квадрате, т.к. они характеризуют
связывание KG во втором сайте фермента. В этом случае мы можем выразить следующие
кинетические параметры фермента из уравнения (1):
445
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, НОЯБРЬ 2006
Дата поступления: 26.10.2006.
(2)
(3)
Здесь, kcat1 – число оборотов фермента, когда работает только один каталитический сайт,
Km1_KG, Km_CoA, Km_NAD - константы Михаэлиса для соответствующих субстратов
при концентрации 2-кетоглутарата ниже 0.08 мМ. Мы нашли их значения из описания
уравнением скорости (1) экспериментальной зависимости начальной скорости работы от
концентрации KG ниже 0.08 мМ (Рис. 3,a).
Рис. 3. Зависимость начальной скорости 2-кетоглутаратдегидрогеназы от концентрации 2кетоглутарата, представленная экспериментальными точками из [6] и описываемая
теоретической кривой согласно уравнению скорости (1) при следующих условиях:
CoA=0.5 мМ; NAD=3 мМ; KGDH=5,3 нМ; pH7.0; t=4oC.
Из найденного значения параметра kcat1 при pH7.0 мы выразили kcat10 и k1 из (2):
(4)
Константы диссоциации для CoA, NAD и первая константа диссоциации для KG были
выражены через оцененные значения констант Михаэлиса из уравнений (3).
446
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, НОЯБРЬ 2006
Дата поступления: 26.10.2006.
Оставшиеся параметры k2, k3, k4, Kd2_KG были определены из полной кривой
зависимости
начальной
скорости
от
2-кетоглутарата,
включающей
субстратное
ингибирование из [6] (Рис. 3,б).
Для определения значения параметра k4 мы выразили kcat20 из kcat2 при pH7.0:
(5)
Значения кинетических параметров были найдены из экспериментальных данных [6],
описывающих работу фермента при температуре 4оC. Для описания работы KGDH в
клетке E.coli необходимо скорректировать константы скорости к температуре 25-30оC. Из
[6] известно, что значение kcat2 было примерно в 10 раз выше при температуре 30оC, чем
при 4оC. Из-за отсутствия данных о значении kcat1 при температуре 30оC мы
предположили, что значение этого параметра также будет на порядок больше, чем при
4оC. Значения констант скорости k2 и k3 также были увеличены на порядок.
Концентрация фермента была вычислена по активности клеточного экстракта клеток E.
coli (см. ниже).
Значения параметров, оцененных по экспериментальным данным [6] (Рис. 3):
Km1_KG=0.02;
Km_CoA
=0.076;
Km_NAD=0.098;
Kd2_KG=0.25;
kcat2=5e4
(pH8.0;t=30^C)
kcat1=9.9e3; kcat2=4450; (pH7.0; t=4^C)
kcat1=9.9e4; (pH7.0; t=30^C)
k3=1e5; (t=4^C); 1e6 (t=30^C)
k2=1e6; (t=4^C); 1e7 (t=30^C); k-2=1; k-3=1;
Значения параметров, оцененных по экспериментальным данным [7] (Рис. 2):
K1_H=1.5e-7; K2_H=2.3e-5
Определение концентрации 2-кетоглутаратдегидрогеназы в зависимости от условий роста
культуры E. coli.
Нами была определена концентрация фермента по данным о специфической 2кетоглутаратдегидрогеназной активности экстракта клеток E.coli, которые росли на двух
различных
субстратах
–
ацетате
447
и
глюкозе.
Специфическая
2-
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, НОЯБРЬ 2006
Дата поступления: 26.10.2006.
кетоглутаратдегидрогеназная активность (SA) экстракта клеток E. coli на ацетате была
определена в работе [9]:
SA=0,058 микромоль/мин/мг белка
Поскольку 1 мг белка клеток E.coli соответствует 5.5 микроЛ внутриклеточного объема
[1] мы можем вычислить максимальную скорость работы фермента:
Vmax=10.6 мМ/мин
Далее концентрация KGDH может быть вычислена путем деления максимальной
скорости на число оборотов. Однако в этом случае мы должны использовать значение
числа оборотов при том же pH, при котором измерена Vmax, т.е. при физиологическом
для клетки E. coli pH7.3 [10]. Это значение числа оборотов при pH 7.3 мы можем найти,
используя введенную нами ранее pH-зависимость фермента:
(6)
Таким образом, мы получаем концентрацию KGDH в клетках E.coli, растущих аэробно на
ацетате:
(7)
Аналогично, используя значение специфической активности экстракта клеток E. coli,
растущей на глюкозе аэробно (SA=0,02 мкмоль/мин*мгбелка экстракта [9], из которой
рассчитывается максимальная скорость Vmax=4 мМ/мин), мы оценили концентрацию
фермента, которая присутствует в клетке в этих условиях:
(8)
Видно, что концентрация фермента при росте E. coli на глюкозе ниже его концентрации
при росте бактерии на ацетате, что соответствует экспериментальным данным о более
интенсивной работе цикла Кребса на ацетате.
Таким образом, нами была построена кинетическая модель функционирования 2кетоглутаратдегидрогеназы E. coli — выведено уравнение скорости работы фермента,
определены все входящие в него параметры. Мы учли эффект субстратного
448
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, НОЯБРЬ 2006
Дата поступления: 26.10.2006.
ингибирования 2-кетоглутаратом и pH на функционирование фермента. Также были
оценены концентрации фермента, которые присутствуют в клетках E. coli, растущих
аэробно на ацетате и глюкозе.
Литература.
1. Neidhardt F.C. E.coli and Salm.typhimurium: Cellular and Molecular Biology. V.1. P.3-6.
2. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. (Пер. Курганова Б.И.) 1979. Издво «Мир», Москва.
3. О.В. Демин, И.И. Горянин, С. Дронов, Г.В. Лебедева. Кинетическая модель
имидазолглицеролфосфат синтетазы из Escherichia coli. Биохимия, 2004, 69, 1625-1638.
4. Goryanin I., Hodgman T.C., and Selkov E. Mathematical simulation and analysis of cellular
metabolism and regulation. Bioinformatics, 1999, 15, 749-758.
5. Cleland W.W. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or
products. I. Nomenclature and rate equations. Biochim. Biophys. Acta. 1963, 67,104-137.
6. Waskiewicz D.E., Hammes G.G. Elementary steps in the reaction mechanism of the alphaketoglutarate dehydrogenase multienzyme complex from Escherichia coli: kinetics of
succinylation and desuccinylation.
1984. Biochemistry, 23(14), 3136-3143.
7. Amarasingham CR, Davis BD. Regulation of alpha-ketoglutarate dehydrogenase formation in
Escherichia coli. J Biol Chem, 240(9), 1965, 3664-3668.
8. Gupta, S.C.; Dekker, E.E.Oxidation of 2-keto-4-hydroxyglutarate by pig heart and Escherichia
coli alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex. Arch. Biochem. Biophys., 1979, 192, 324-326.
9. Peng L., Shimizu K. Global metabolic regulation analysis for Escherichia coli K12 based on
protein expression by 2-dimensional electrophoresis and enzyme activity measurement Appl.
Microbiol. Biotechnol. 2003, 61, 163-178.
10. Padan E, Zilberstein D, Schuldiner S. pH homeostasis in bacteria. Biochim. Biophys. Acta,
1981, 650, 151-16
449