ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ Лаборатория биоэлектрохимии, к. 354, корпус Б, ФГБУ «ИБМХ» РАМН

реклама
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ
БИОСЕНСОРЫ
Лаборатория биоэлектрохимии,
к. 354, корпус Б, ФГБУ «ИБМХ» РАМН , с.н.с. Супрун Е.В.
Биосенсор – устройство, состоящее из двух преобразователей
(трансдьюсеров) – биологического и физического. Биораспознающий слой
чувствителен к присутствию определяемого компонента и генерирует
сигнал, функционально связанный с концентрацией этого компонента.
БИОСЕНСОР
Анализируемая
смесь
Сигнал
Биослой
Трансдъюсер
Продукт
Биослой:
Целые организмы
Ткани
Клетки
Органеллы
Мембраны клеток
Ферменты
Рецепторы
Антитела
Нуклеиновые кислоты
Физические преобразователи:
Потенциометрические
Амперометрические
Кондуктометрические
Импедасометрические
Акустические
Тепловые
Оптические
Биораспознавание
Продуктивное
E  S  ES  E  P
ФЕРМЕНТЫ
ЦЕЛЫЙ
ОРГАНИЗМ
Непродуктивное
Ab  Ag  AbAg
АНТИГЕНАНТИТЕЛО
ЛИГАНДРЕЦЕПТОР
ДНК-ДНК
Требования к биосенсорам
Прямое определение в объекте без
предварительной подготовки;
Возможность непрерывного мониторинга;
Возможность миниатюризации;
Низкая стоимость в случае массового
производства;
МИРОВОЙ РЫНОК БИОСЕНСОРОВ
“Biosensors: then and now”
«Биосенсоры: тогда и
теперь»
Anthony Turner
30 лет назад
~1 статья / 2 года
< $ 5 миллионов /год
Сегодня
~4500 статей /год
~$13 миллиардов/год
График. Оценка прошлого, настоящего и будущего
мирового рынка биосенсоров. Данные взяты из
различных первичных и вторичных источников.
Trends in Biotechnology, Special Issue: Celebrating 30 years of biotechnology
March 2013, Vol. 31, No. 3
ЭЛЕКТРОХИМИЯ:
Химия посредством электричества
Электричество посредством химии
Электрохимические методы:
E = f(i, C, t)
i = f(E, С, t)
E
i
С
i- ток, А
E – потенциал, В
С – концентрация вещества, М
t – время, с
Электрохимическая ячейка
электроды
сравнения
рабочий
электролит
(раствор, расплав и пр.)
Схема работы биосенсора
Трансдьюсер
Биораспознающий
элемент
Объединение биохимической и
электрохимической реакций
Распознавание субстрата
Сигнал
ПЕРВЫЕ БИОСЕНСОРЫ
L. C. Clark, and C. Lyons, Ann.NY Acad.Sci. 102, 29 (1962).
?
S. J. Updike, and J. P. Hiks, Nature 214, 986 (1967).
ИДЕЯ ФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОДА
L. C. Clark, and C. Lyons, Ann.NY Acad.Sci. 102, 29 (1962).
ИДЕЯ ФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОДА
Volume 102 Issue Automated and
Semi-Automated Systems in Clinical
Chemistry , Pages 29 - 45
(October 1962)
Прототип аналитической стены с насосами, датчиками
и регистраторами для контроля O2, pH, CO2
ИДЕЯ ФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОДА
- рабочий электрод плотно
прилегает к мембранам, между
которыми заключен фермент.
A- электрод сравнения
B- рабочий электрод
C- цилиндр
D- электролит
E, G - мембраны
F- фермент
ИДЕЯ ФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОДА
рН-электрод
или
рO2- электрод
Кларка
Глюконовая кислота
+ H 2O 2
рН-электрод
датчик
H2O + CO2 + 2NH3
мембрана
ГЛЮКОЗОКСИДАЗА
УРЕАЗА
мембрана
Глюкоза + O2
CO(NH2)2 + 2H2O
L. C. Clark, and C. Lyons, Ann.NY Acad.Sci. 102, 29 (1962).
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТА
НА ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДА
S. J. Updike, and J. P. Hiks, Nature 214, 986 (1967).
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТА НА ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДА
ГЛЮКОЗА
+ O2
ГЛЮКОНОВАЯ
КИСЛОТА
+ H2O2
3 June 1967 Vol 214
No 5092 pp957-1066
O2
Глюкозоксидаза
в акриламидном
геле
O2-датчик
глюкозооксидаза
Глюкоза + O2 → Глюконовая кислота + H2O2
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТА НА ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДА
Сопряжение фермента и
электродных реакций
I поколение:
детектирование субстрата или продукта
ферментативной реакции: E  S  ES  E  P
II поколение : использование медиаторов:
Oxidase
Oxidized
Analyte
Analyte
M ox
M red
Fe
Electrode
III поколение : прямой биоэлектрокатализ:
S
-e
P
Биосенсор I поколения
(амперометрия)
Oxidase
Oxidized
Analyte
Analyte
O2
H2O2
Глюкозоксидаза и O2-электрод Кларка
Pt
Ag|AgCl
KCl
мембрана
Биосенсор I поколения
(потенциометрия)

уреаза
CO( NH 2 )2  2H 2O 
 HCOO   2 NH 4  OH 
Стеклянный рН-электрод и иммобилизованная
уреаза:
Ag|AgCl
HCl
membrane
Биосенсор II поколения
Glucose Oxidase
Glucose
+
Fc
Gluconic
acid
Fc
Fe
Electrode
A. E. G. Cass, G. Davis, G. D. Francis, H. A. O. Hill, W. G. Aston, I. J.
Higgins, E. V. Plotkin, L. D. L. Scott, and A. P. F. Turner, Analytical
Chemistry 56, 667-671 (1984).
Биосенсор II поколения
+/2+
Os
+/2+
Os
+/2+
Os
Glucose
+/2+
Os
_
Os
e
hydrogel
+/2+
Gluc. ac.
B.A. Gregg, A. Heller. Anal. Chem. 62 (1990) 258
Биосенсор III поколения
Peroxidase
H 2O2
-e
H2O
A.I.Yaropolov, V.Malovik, S.D.Varfolomeyev, I.V.Berezin. Proc. Russ. acad. Sci., 249
(1979) 1399
ГЛЮКОЗНЫЕ ТЕСТЫ –
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ
1975 - фирма Yellow Spring Instruments (USA)
YSI Blood Glucose Analyzer, Model 23A
- (16.25 in. D x 13 in. W x 8.375 in. D)
- первый рабочий анализатор
глюкозы на основе ферментного
электрода Кларка
ПРОБА: 25 мкл крови
ТОЧНОСТЬ: ±2%
http://www.chemheritage.org
ГЛЮКОЗНЫЕ ТЕСТЫ
1987 – фирма MediSense Inc. (UK) – первый
портативный анализатор глюкозы ExacTech
ГЛЮКОЗНЫЕ ТЕСТЫ
На сегодняшний день коммерчески
доступны более 40 различных
глюкометров производства 11 фирм.
Они отличаются: объемом пробы,
скоростью, размером, возможностью
хранения результатов и стоимостью.
Accu-Chek Complete BG System (Boehringer Mannheim)
Accu-Chek Easy (Boehringer Mannheim)
Accu-Chek Instant (Boehringer Mannheim)
Accu-Chek Instant Plus (Boehringer Mannheim)
Autolet® II Clinisafe (Owen Mumford)
Autolet® Lite Starter Pack (Owen Mumford)
Blood Glucose Strips (Roche)
Exatech® (Medisense)
Fingerstix Lancets (Bayer)
Glucofilm™ Test Strips (Bayer)
Glucose Control Solution (Roche)
Glutose® (Roche)
Lifescan One Touch® Basic™ System (Johnson & Johnson)
Medipoint Blood Lancets (Medipoint)
Monolet Lancet (Kendall-Sherwood)
Soft-Touch® II (Boehringer Mannheim)
Softclix (Roche)
Unilet Long-Body™ Lancets (Owen Mumford)
Unistik™-2 (Owen Mumford)
ТРИ ПОКОЛЕНИЯ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ
СЕНСОРОВ НА ГЛЮКОЗУ
I
Измерение сигнала
убыли кислорода или
прибыли пероксида
водорода
II
Измерение сигнала
искусственного редокс
медиатора
III-???
Измерение прямого
переноса электрона
между активным
центром
глюкозооксидазы и
электродом
БИОСЕНСОР НА ГЛЮКОЗУ
I – поколение:
Глюкоза + O2
O2 + 4H+ + 4 e-
Clark, L., Jr.; Lyons, C. Ann. NY Acad. Sci. 1962, 102, 29.
ГОД
Глюконовая кислота + H2O2
2H2O
(Pt- катод, восстановление)
II – поколение:
Глюкоза + ГОД(ок)
ГОД(вос) + 2М(ок)
2М(вос)
Глюконовая кислота + ГОД(вос)
ГОД(ок) + 2М(вос) + 2Н+
2М(ок) + 2e-
ГОД – глюкозооксидаза;
M – медиатор: ферроцен и его производные, ферроцианид,
проводящие органические соли, производные хинона, комплексы
переходных металлов, фенотиазины и феноксазины;
ГЛЮКОЗНЫЕ ТЕСТЫ СЕГОДНЯ
90% РЫНКА :
Life Scan
Roche Diagnostics
Abbott
Bayer
Глюкозные тесты – это медиаторные
биосенсоры «второго поколения» где
используются ферроцен и его
производные, либо проводящий
полимер на основе осмия.
Поперечный срез комерческой
тест-полоски для определения
глюкозы в крови (Abbott Inc.):
А – система электродов;
В – гидрофобный слой для
прохождения крови
ЭЛЕКТРОАКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ И
ПРЯМОЙ БИОЭЛЕКТРОКАТАЛИЗ
S
-e
P
Электроактивность белков
цитохром C
 S.R. Betso, M.H. Klapper, L.B. Anderson. J. Am. Chem. Soc. 94 (1972) 8197204.
 M.J. Eddowes, H.A.O. Hill. J. Chem. Soc. , Chem. Commun. (1977) 71
 P. Yeh, T. Kuwana. Chem. Lett. (1977) 1145-1148
ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЦИТОХРОМА С НА ПОВЕРХНОСТИ
ЭЛЕКТРОДА
Fe3+ + e → Fe2+
ОБРАТИМЫЙ ПЕРЕНОС
ЭЛЕКТРОНА С ЭЛЕКТРОДА НА
ЦИТОХРОМ С
ОБРАТИМЫЙ ПЕРЕНОС
ЭЛЕКТРОНА С ЭЛЕКТРОДА НА
ЦИТОХРОМ С
J. Chem. Soc. , Chem. Commun. (1977) 71
gold
Активация электроактивности
белков
N
N
ē
ē
M.J. Eddowes, H.A.O. Hill. J. Chem. Soc. , Chem. Commun. (1977) 71
P. Yeh, T. Kuwana. Chem. Lett. (1977) 1145-8
Прямой биоэлектрокатализ
Laccase
O2  4H   4e 
 2H 2O
S2
P2
Berezin I. V., Bogdanovskaya V. A., Varfolomeev S.D. et al.
Dokl.Akad.Nauk SSSR (Proc. Acad. Sci.) 240 (1978) 615-618.
Прямой
биоэлектрокатализ
Laccase
O2  4H   4e 
 2H 2O
E = 1.2 V
Равновесный потенциал
окисления-восстановления
пары O2/H2O
Berezin I. V., Bogdanovskaya V. A., Varfolomeev S.D. et al.
Dokl.Akad.Nauk SSSR (Proc. Acad. Sci.) 240 (1978) 615-618)
Впервые явление биоэлектрокатализа
с
участием
прямого
переноса
электронов электрод - активный центр
фермента
было
обнаружено
и
исследовано при изучении реакции
электрохимического
восстановления
кислорода
с
участием
медьсодержащей оксидазы – лакказы.
В
классической
электрохимии
восстановление кислорода – одна из
наиболее
сложных
проблем.
Известно, что равновесный потенциал
окисления-восстановления
пары
O2/H2O,
равный
1.23
В
устанавливается
лишь
на
предварительно
специально
обработанной платине и в особо
чистых растворах. В то же время
известны ферменты, которые активно
восстанавливают
кислород
по
четырехэлектронному механизму до
воды
без
промежуточного
образования в растворе пероксида
водорода.
Лакказа
является
медьсодержащем
ферментом,
осуществляющим четырехэлектронное
восстановление
кислорода
при
использовании в качестве донора
различных ароматических аминов и
фенолов. В активный центр фермента
входят
четыре
иона
меди,
осуществляющие
координированное
восстановление кислорода.
Основы прямого
биоэлектрокатализа
Исследования
активных центров
ферментов
Электрохимическое
регулирование
активности ферментов
Прямой биоэлектрокатализ
активный
центр
цепь
переноса
электрона
• ориентация белка;
• электроактивность концевых групп;
НЕПРОДУКТИВНОЕ БИОРАСПОЗНАВАНИЕ
РАСПОЗНАЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ
 антитела
 аптамеры
 олигонуклеотиды
 аффибоди
 сомамеры
 полимеры с молекулярными отпечатками
H1
S-
CL
C
-S
-
S-S-
-S-S-S-S-
CH2
CH2
Fc
C H1
CL
CH3
CH3
Иммуноглобулин
IgG molecule
VL
VH
VH
VL
Fab
ИММУНОСЕНСОРЫ
ДНК-СЕНСОРЫ
АПТАСЕНСОРЫ
ПОЛИМЕРЫ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ОТПЕЧАТКАМИ
Полимеры с молекулярными отпечатками – синтетические рецепторы
получаемые формованием полимера вокруг молекулярного шаблона.
Могут быть использованы вместо биомолекул как биораспознающие
элементы в различных областях включая химические сенсоры и биочипы.
Molecularly imprinted polymers (MIPs)
ПОЛИМЕРЫ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ОТПЕЧАТКАМИ
Polyakov M. V., Adsorption properties and structure of silica gel. Zhurnal
Fizieskoj Khimii/Akademiya SSSR, 2, 799-805, (1931)
Pauling, L., A theory of the structure and process of formation of antibodies.
Journal of the American Chemical Society 62, (10), 2643-2657. (1940)
Dickey, F.H., The preparation of specific adsorbents. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America
35, (5), 227-229. 1949
Еще в начале 1930-х годов наш химик М. В. Поляков сделал первые сорбенты, которые
обладали повышенной специфичностью к веществу, использованному при синтезе. Он
сформировал силикагель в присутствии алкилбензолов и обнаружил, что силикагель
приобретает к ним повышенную (примерно на 15%) избирательность — то есть
адсорбирует их лучше, чем другие соединения. Независимо от Полякова, эта мысль в
40-х годах прошлого века пришла Лайнусу Полингу, и он поручил ее экспериментально
проверить своему ученику Ф. Х. Дикки. Дикки показал, что полученный материал
действительно способен избирательно удерживать то вещество, которое он использовал
в качестве молекулярного шаблона при синтезе.
www.mipdatabase.com
БАЗА ДАННЫХ ПО MIPs
ПОЛИМЕРЫ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ОТПЕЧАТКАМИ
Области применения материалов
с молекулярными отпечатками.
«Химия и жизнь».
АФФИБОДИ
Nat Biotechnol. 1997 Aug;15(8):772-7.
Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alphahelical bacterial receptor domain.
Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Ståhl S, Uhlén M, Nygren PA.
Prof. Mathias Uhlén
Department of Biochemistry and Biotechnology, Royal Institute of
Technology (KTH), Stockholm, Sweden.
Abstract
Small protein domains, capable of specific binding to different target proteins have been
selected using combinatorial approaches. These binding proteins, called affibodies, were
designed by randomization of 13 solvent-accessible surface residues of a stable alpha-helical
bacterial receptor domain Z, derived from staphylococcal protein A. Repertoires of mutant Z
domain genes were assembled and inserted into a phagemid vector adapted for monovalent
phage display. Two libraries, each comprising approximately 4 x 10(7) transformants, were
constructed using either an NN(G/T) or an alternative (C/A/G)NN degeneracy. Biopanning
against the target proteins Taq DNA polymerase, human insulin, and a human apolipoprotein
A-1 variant, showed that in all cases significant enrichments were obtained by the selection
procedures. Selected clones were subsequently expressed in Escherichia coli and analyzed by
SDS-PAGE, circular dichroism spectroscopy, and binding studies to their respective targets by
biospecific interaction analysis. The affibodies have a secondary structure similar to the native Z
domain and have micromolar dissociation constants (KD) for their respective targets.
АФФИБОДИ
Моноклональные антитела
150 кДа
антиген
Аффибоди
6 кДа
антиген
антиген
СОВРЕМЕНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ
РАЗВИТИЯ БИОСЕНСОРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
МИКРОБНЫЕ ТОПЛИВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ
Микробные топливные элементы - производят электричество используя
метаболизм живых микроорганизмов, которые катализируют окисление
органических и неорганических субстратов с участием электрона. В
качестве топлива используется дешевая биомасса, такая как
сельскохозяйственные отходы и нечистоты.
ПЕРЕРАБОТКА ОТХОДОВ
ЭЛЕКТРИЧЕСТВО
Microbial fuel cells (MFCs)
Микробный топливный элемент
Топливо – сельскохозяйственные отходы,
сточные воды
Биотопливный элемент
Топливо - глюкоза
МИКРОБНЫЕ ТОПЛИВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ
Снимки сканирующим электронным микроскопом анода углеродного волокна
до и после формирования биопленки
БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК
КЛЕТОЧНЫЕ БИОСЕНСОРЫ
Redox centers Em
FAD
-
2Fe2S
+80 mV
4Fe4S
-240 mV
3Fe4S
-25 mV
Heme bH
+65mV
Heme bL
-95mV
Bacillus subtilis
Class 3 SQR
1
Electrode
КЛЕТОЧНЫЕ БИОСЕНСОРЫ
Mox
Mred
E
Oxidised Product
Substrate
2
Electrode
Mediated bioelectrocatalysis
Mox
Mred
Bacterial cell
Oxidised Product
Substrate
КЛЕТОЧНЫЕ БИОСЕНСОРЫ
Adam Heller type Os redoxpolymeras mediator
A. Heller, J. Phys. Chem.,
96 (1992) 3579-3587
КЛЕТОЧНЫЕ БИОСЕНСОРЫ
Permselective
electrode with cells
J. Haladjian, P. Bianco, F. Nunzi,
M. Bruschi, Anal. Chim. Acta, 289
(1994) 15-20
КЛЕТОЧНЫЕ БИОСЕНСОРЫ
Публикации
I.
I. Vostiar, E. E. Ferapontova, L. Gorton, Electrochem. Commun, 6 (2004) 621-
626.
II. S. Timur, B. Haghighi, J. Tkac, N. Pazarlıoğlu, A. Telefoncu, L. Gorton,
Bioelectrochemistry, 71 (2007) 38–45.
III. S. Timur, U. Anik, D. Odaci, L. Gorton, Electrochem. Commun., 9 (2007) 18101815.
IV. S. Alferov, V. Coman, A. Reshetilov, C. von Wachelfeldt, C. Hägerhäll, L. Gorton,
Electrochim. Acta, 54 (2009) 4979-4984.
Легкие человека on-a-chip.
Микроинженерная модель взаимодействия на альвеолярнокапилярной границе раздела реконструирующая клеточные,
биохимические и механические функции легких живого человека.
Модель организма человека
Биомиметические микросистемы разных органов могут быть объединены в
единый комплекс - микроустройство с микрофлюидной системой на
подобие физиологической – для оценки воздействия и токсичности
лекарств.
ЛАБОРАТОРИЯ
БИОЭЛЕКТРОХИМИИИ
ЛАБОРАТОРИЯ БИОЭЛЕКТРОХИМИИИ
ИБМХ РАМН
Электрохимические сенсоры
на основе цитохрома Р450
Аптасенсоры
Иммуносенсоры
1. Электрод сравнения
2. Рабочий электрод
3. Вспомогательный электрод
МОДИФИКАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДА
AuНЧ (ДДАБ, хлороформ)
AuНП (матричный синтез)
AuHЧ (H2O)
PbНП (L-цистеин)
AgНЧ (ДДАБ, хлороформ)
AgНП (поливиниловый
спирт)
СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР
НА КАРДИОМИОГЛОБИН
Mb–Fe(III) + ē + H+ ↔ Mb–Fe(II)
Mb–Fe(II) + O2  [Mb–Fe(II)O2 ]  Mb–Fe(III) + O2 –
ē
ГРАФИТОВЫЙ ЭЛЕКТРОД
- золотые наночастицы, стабилизированные ДДАБ
- кардиомиоглобин
- антитела к кардиомиоглобину
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРДИОМИОГЛОБИНА
В ОБРАЗЦАХ ПЛАЗМЫ КРОВИ
Электрохимический
иммуносенсор
-8
сыворотка без Mb
-10
Ток, A
-12
14M Mb в сыворотке
-14
-16
-18
-20
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
Потенциал, В
Electrochemical nanobiosensor for express diagnosis of acute myocardial infarction in undiluted
plasma / E. Suprun, T. Bulko, A. Lisitsa, O. Gnedenko, A. Ivanov, V. Shumyantseva, A. Archakov //
Biosensors and Bioelectronics– 2010.-V.25 (7).-P. 1694–1698.
КАТАЛИТИЧЕСКИЙ ЦИКЛ ЦИТОХРОМА P450
9
-R O H
Fe3+ ROH
8
Fe3+
RH 1
Fe3+ RH
.
NADPH-P450 REDUCTASEred
1e- 2
NADPH-P450 REDUCTASEox
FeOH3+ R
F e2 + R H
7
FeO3+ RH
6
-H2O
O2 3
Fe2+-O2 RH
Fe-OOH
RH
- red
Fe2+-O2 RH
1
e
+
b5
H
5
b5 ox 4
NADPH-P450 REDUCTASEred
NADPH-P450 REDUCTASEox
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ
ЦИТОХРОМА Р450
СХЕМА ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ
СУБСТРАТОВ ЦИТОХРОМОМ Р450 (P450s):
P450 + NAD(P)H + O2 +RH  P450 + NAD(P)+ ROH +H2O
0.2
0.0
-0.2
℮
℮
I, A
-0.4
-0.6
-0.8
1
-1.0
ГРАФИТОВЫЙ ЭЛЕКТРОД
1. электрод/AuНЧ/P450 2B4
2
-1.2
- субстрат
2. электрод/AuНЧ/P450 2B4 + субстрат
-1.4
- золотая наночастица
- цитохром Р450
-1.6
-1.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
E, V vs.Ag/AgCl
0.2
10-12-10-15 моль фермента на
электроде
ЦИКЛОВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЯ. 100 mM ФОСФАТНЫЙ БУФЕР, 50 mM KCl, pH 7.4 ,
(2) ПОСЛЕ ПРИБАВЛЕНИЯ СУБСТРАТА БЕНЗФЕТАМИНА. СКОРОСТЬ СКАНИРОВАНИЯ 50мВ/с
Электрохимические методы определения активности
цитохрома Р450
Fe(III)+e→Fe(II)
Циклическая вольтамперометрия
Амперометрическое титрование
1
0.0
0 мкМ 1 мкМ
0
-1
5 мкМ
Восстановительный ток CYP3A4
-2
I, A
-4
7 мкМ
-1.0
Каталитический ток
в присутствии тестостерона
-3
I, A
3 мкМ
-0.5
-5
-6
9 мкМ
-1.5
-2.0
10 мкМ
-7
-2.5
-8
-9
-1.0
-3.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
E,V vs Ag/AgCl
0.2
0.4
0.6
0
50
100
150
200
250
300
350
400
time, sec
71
Влияние витаминов-антиоксидантов на
активность цитохрома Р450
0.5
0.0
-0.5
CYP3A4
CYP3A4+диклофенак
CYP3A4+витамин С+диклофенак
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
-3.5
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
E, V vs. Ag/AgCl
155±7%
Каталитический ток CYP3A4, %
I, A
-1.0
Циклические
вольтамперограммы.
Витамины-антиоксиданты
увеличивают восстановительный
ток цитохрома Р450 в присутствии
маркерных субстратов
160
128±10%
140
135±10%
120
100%±2%
100
72%±10%
80
60
40
Активирующие влияние носит
концентрационно-зависимый
характер. Избыточное количество
антиоксидантов снижает
активность цитохрома Р450
20
0
1
2
CYP3A4
CYP3A4
+ ДФ
3
CYP3А4
+ 0.56 мМ
Вит. С
4
CYP3А4
+ Вит. С
+ ДФ
5
CYP3А4
+ 1.68 мМ
Вит. С
72
Анализ электрохимической активности
белков, обусловленной
аминокислотными остатками
Первичная структура
БЕЛКИ
Последовательность
аминокислот
Биораспознающие
элементы
Катализаторы
Аналиты
Вторичная структура
Третичная структура
Четвертичная структура
Комплекс белковых молекул
Электрохимическая активность белков
Кофакторы
Э
Л
Е
К
Т
Р
О
Д
Ионы
(Fe 3+, Ni 2+, Cu 2+, Zn 2+)
Гем
Коферменты
Флавинаденин динуклеотид (ФАД)
Пирролохинолин хинон (ПХХ)
ПХХ
Аминокислоты
O
O
HO
S
S
NH2
Цистин
Цистеин
OH
OH
N
N
H
Тирозин
O
OH
NH2
NH2
HO
NH2
HS
O
O
H3C
S
Метионин
OH
NH2
O
OH
OH
NH2
Гистидин
O
N
H
NH2
Триптофан
Электроокисление аминокислот
O
O
- 2e , - 2H+
NH2
HO
NH2
O
Тирозин
O
O
- 2e , - 2H+
NH2
N
H
NH2
N
Триптофан
O
N
N
H
O
OH
NH2
Гистидин
HO
N
N
H
.
OH
NH2
OH
+
N
N
H
.
полимеризация
OH
O
O
O
S
+ H2O, - e
O
S
OH
+ H2O, - e
Метионин
O
-e,-
O
H+
2 HS
Цистеин
S
NH2
O
O
+ H2O, - e
S
NH2
O
O
S
NH2
S
NH2
S
NH2
NH2
+ H2O, - 2e
S
O
NH2
Цистин
O
O
S
NH2
O
+ H2O, - e
O
S
S
O
NH2
NH2
O
+ H2O
S
O гидролиз
O
OH
NH2
NH2
O
O
O
OH
NH2
S
ИСТОРИЯ: окисление белков за
счет аминокислотных остатков
V. BRABEC
1980
J. A. REYNAUD
Анализ белков на основе
аминокислотной редокс активности
Окисление белков:
Э
E
L
Л
E
Е
C
К
T
Т
R
Р
O
О
D
Д
E
2.0
Ток, мкА
1.5
1.0
0.5
ПХ – пероксидаза хрена
α-Химотр A - α-химотрипсиноген A
из бычей пожелудочной железы
HSA – альбумин сыворотки человека
γ-Glob – γ-глобулины крови человека
Белок
ПХ
-Химотр A
Авидин
ЧСА
Область Еmax, мВ
Ок.
0.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Е, В (отн. Ag/AgCl)
Концентрации, M
Уравнение градуировочной прямой
N
R2
ЧСА
600 ÷ 650
1×10-7÷ 1×10-4
Ток, мкА = 0.53±0.03 + 0.071±0.005 Log (C, M)
6
0.991
γ-Глоб
600 ÷ 650
1×10-7÷ 1×10-4
Ток, мкА = 1.12±0.07 + 0.16±0.01 Log (C, M}
6
0.989
БСА
600 ÷ 650
5×10-7 ÷ 10-4
Ток, мкА = 0.61±0.01 + 0.086±0.003×Log (C, M)
6
0.998
Аминокислоты
O
O
+
OH - 2e , - 2H
5
Trp
Cys
Tyr
4
OH
NH2
HO
NH2
O
Тирозин
Ток, мкА
O
O
- 2e , - 2H+
3
OH
OH
NH2
N
H
2
NH2
N
Триптофан
1
O
2 HS
0
Цистеин
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
O
- 2e , - 2H+
OH
O
HO
NH2
S
NH2
NH2
1.0
Е, В (отн. Ag/AgCl)
Аминокислота
Область Emax, мВ
Область
концентраций, M
Уравнение градуировочной прямой
N
OH
S
R2
Триптофан
600 ÷ 700
5×10-7 ÷ 10-3
Ток, мкА = 0.4±0.3 + 29090±686×C, M
7
0.999
Цистеин
550 ÷ 750
10-5 ÷ 10-3
Ток, мкА = 0.002±0.030 + 2880±50×C, M
5
0.999
Тирозин
550 ÷ 600
5×10-7 ÷ 10-4
Ток, мкА = 0.029±0.003 + 17090±75×C, M
6
0.999
Tирозин и его производные
O
Tyr
3-NO2-Tyr
4
HO
O-PO4-Tyr
3
Ток, мкА
OH
ОКИСЛЕНИЕ
NH2
L-тирозин
O
2
OH
OH
1
O P O
Ок.
О-фосфо-L-тирозин
OH
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
O
O2N
Е, В (отн. Ag/AgCl)
NH2
HO
0
ВОССТАНОВЛЕНИЕ
ОКИСЛЕНИЕ
3-нитро-L-тирозин
Вос.
-5
ОКИСЛЕНИЕ
NH2
Ток, мкА
-10
-15
Аминокислота
-20
3-NO2-Tyr
Область Emax, мВ
Область
концентраций, M
Уравнение градуировочной прямой
N
R2
Тирозин
550 ÷ 600
5×10-7 ÷ 10-4
Ток, мкА = 0.029±0.003 + 17090±75×C, M
6
0.999
O-PO4-Тирозин
600 ÷ 650
5×10-5 ÷ 10-2
Ток, мкА = 0.025±0.003 + 40.8±0.6×C, M
5
0.999
3-NO2-Тирозин
750 ÷ 800
5×10-7 ÷ 10-4
Ток, мкА =0.05±0.03 + 32300±610 C, M
6
0.999
–700 ÷ –750
5×10-6 ÷ 10-4
Ток, мкА = -1.3±0.2 + 258270±3110 ×C, M
4
0.999
Tyr
-25
-30
-35
-1.0
-0.9
-0.8
-0.7
-0.6
Е, В (отн. Ag/AgCl)
-0.5
-0.4
Структура белков и их
окислительная способность
Биоинформатика
Электрохимия
1.0
Ток, мкА
Э
E
L
Л
E
Е
C
К
T
Т
R
Р
O
О
D
Д
E
0.5
Ок.
0.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Е, В (отн. Ag/AgCl)
ЧСА
1.0
1.2
Э
E
L
Л
E
Е
C
К
T
Т
R
Р
O
О
D
Д
E
Белок
Структура белков и их
окислительная способность
М, кДа Площадь
поверхности,
Å2
Tyr+Trp+Cys
В
последовательнос
ти
На поверхности
Всего
Электроактивных
БСА
66
24255.80
25
11
6
ЧСА
66
24732.71
22
10
6
Мб
18
6857.62
4
2
2
ПХ
44
11055.87
8
1
1
α-Химотр A
26
9072.70
12
6
5
Кат (тетрамер)
240
67331.34
124
48
36
Авидин (тетрамер)
66
18910.08
20
8
4
СОД (димер)
32
12091.53
4
2
2
Э
E
L
Л
E
Е
C
К
T
Т
R
Р
O
О
D
Д
E
Электрохимический сигнал –
число аминокислот
35
30
25
20
15
10
R=-0.306
5
0
0
-1
Электрохимический сигнал, 10 А В моль л
НЕТ КОРРЕЛЯЦИИ
-4
-1
Электрохимический сигнал, 10 А В моль л
Структура белков и их
окислительная способность
5
10
15
20
25
30
35
40
-1
35
Электрохимический сигнал, 10 А В моль л
Число электроактивных Tyr+Trp+Cys на поверхности
-4
30
30
-4
25
35
20
15
2
10
R =0.035
5
0
0
20
40
60
80
100
120
Число Tyr+Trp+Cys в последовательности
140
25
20
15
10
2
R =-0.184
5
0
0
10
20
30
40
Число Tyr+Trp+Cys на поверхности
50
Э
E
L
Л
E
Е
C
К
T
Т
R
Р
O
О
D
Д
E
Белок
Структура белков и их
окислительная способность
М, кДа Площадь
поверхности,
Å2
Tyr+Trp+Cys
В
последовательнос
ти
На поверхности
Всего
Электроактивных
БСА
66
24255.80
25
11
6
ЧСА
66
24732.71
22
10
6
Мб
18
6857.62
4
2
2
ПХ
44
11055.87
8
1
1
α-Химотр A
26
9072.70
12
6
5
Кат (тетрамер)
240
67331.34
124
48
36
Авидин (тетрамер)
66
18910.08
20
8
4
СОД (димер)
32
12091.53
4
2
2
Структура белков и их окислительная
способность
Плотность
Число аминокислот
Площадь поверхности белка
35
Олигомеры
Мономеры
30
Кат
25
20
15
СОД
10
-Химотр A
Авидин
БСА
Мб
ПХ
5
2
R =0.746
ЧСА
0
0
1
2
Олигомеры
Мономеры
30
Электрохимический сигнал,
-4
-1
10 А В моль л
-4
-1
Электрохимический сигнал, 10 А В моль л
Электрохимический сигнал –
3
4
5
6
7
Плотность Trp+Tyr+Cys на поверности,
-4
2
10 Число аминокислот / A
8
Кат
25
20
15
10
5
ПХ
СОД
Авидин
Мб
БСА
-Химотр A
2
R =0.909
ЧСА
0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
Плотность электроактивных аминокислотных остатков,
-4
2
10 число аминокислотных остатков / A
ВЫВОДЫ
 Белки сохраняют свою конформацию при наложении потенциала;
 Только правильно ориентированные аминокислоты могут
участвовать в электрохимических реакциях;
 Белки можно разделить на две группы: мономеры и олигомеры;
Э
E
L
Л
E
Е
C
К
T
Т
R
Р
O
О
D
Д
E
ПРИМЕНЕНИЕ
Анализ:
 конформации белков
 пост-трансляционных модификаций белков
 комплексов белок-белок и белок-лиганд
 состояний мономер-олигомер
 общего белка
Скачать