На правах рукописи ЛОЩИНИНА Екатерина Александровна

На правах рукописи
Пи
ЛОЩИНИНА
Екатерина Александровна
ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ, ИНДОЛЬНОЙ
И СЕЛЕНОРГАНИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ
НА РОСТ И РАЗВИТИЕ КСИЛОТРОФНОГО БАЗИДИОМИЦЕТА
LENTINUS
ЕОООЕЗ
03.02.03 - микробиология
03.01.04-биохимия
1 О н о я 2011
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
4859203
Саратов - 2011
Работа выполнена в Учрехадении Российской академии наук Институте биохимии
и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН), г. Саратов
Научные руководители.
доктор биологических наук, профессор
Никитина Валентина Евгеньевна
доктор биологических наук
Цивилева Ольга Михайловна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Тараненко Татьяна Михайловна
доктор биологических наук
Терешина Вера Михайловна
Ведущая организация:
Федеральное государственное образовательное
учреждение высшего профессионального образования
«Пензенская государственная сельскохозяйственная академия»
Защита диссертации состоится «
» Но я оря
2011 года в «
на заседании диссертационного совета ДООгЛ-ге.ОТ при ИБФРМ РАН
по адресу: 410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13.
» часов
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ
и на сайте ИБФРМ РАН;
http://ibppm.ru/dissertacrannyy-sovef/
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.
Автореферат разослан «
» О / г т Я ^ ^ 2011 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 002.146.01,
доктор биологических наук, профессор
В.Е. Никитина
3
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Одним из приоритетных направлений современной микробиологии и биохимии является
расшифровка путей индуцирования биохимических процессов онтогенетического развития
грибов. Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и
биохимические процессы, их интенсивность во многом определяются факторами внешней
среды, которые требуют детального изучения.
Среди культивируемых базидиомицетов Lentinus edades (шиитаке) безусловно
относится к чиспу наиболее перспективных объектов. Этот гриб занимает второе место в
мире по объему промышленного производства и обладает ценными питательными и
целебными свойствами {Wasser and Weis, 1999; Zaidman et al., 2005; Hearst et ai, 2009; De
Roman, 2010; Shen et al., 2011]. Большое значение имеет вопрос о возможной оптимизации
искусственного выращивания этой культуры. Внедрение биологических способов стимуляции
роста мицелия и защиты его от посторонней микрофлоры позволило бы улучшить
технологию выращивания, сократив время культивирования шиитаке и одновременно
подавив рост контаминантов гриба. Повысить устойчивость гриба к негативн1?1М воздействиям
окружающей среды можно, вероятно, за счет выращивания его совместно со
стимулирующими рост микроорганизмами.
Бактерии рода Azospirillum, представители группы ризосферных бактерий, являются
ассоциативными азотфиксаторами, стимулирующими рост и развитие растений посредством
фиксации атмосферного азота и гормональной регуляции [Steenhoudt and Vanderleyden, 2000;
Bashan and de-Bashan, 2010; Fibach-Paldi et al., 2011]. Отмечается бактерицидная и
фунгицидная активность азослирилл [Red'kina, 1990; Милькова и др., 2003] и их лектинов
[Никитина, 2001] в отношении некоторых бактерий и микроскопических фибов. Сведения о
совместном культивировании базидиомицетов с бактериями рода Azospirillum в
искусственных условиях в литературе отсутствуют. Можно было надеяться, что в двойной
культуре шиитаке с азоспириллами проявятся ростостимулирующие свойства этих бактерий,
будет иметь место усиленная продукция соединений различной природы, способствующих
росту мицелия. К числу таких ростостимулирующих веществ относятся фитогормоны.
Роль растительных гормонов в морфообразовании высших грибов-ксилотрофов
практически не исследована, хотя в литературе встречаются предположения о том, что
фитогормонам принадлежит важное место в дифференциации фибной культуры, и что
процесс морфогенеза тесно связан с динамикой уровня эндогенных регуляторов роста, в том
числе основного фитогормона класса ауксинов - индолилуксусной кислоты (ИУК). Согласно
литературным данным, фитогормоны, в том числе ИУК, в определенных, значительно
различающихся для разных видов концентрациях могут оказывать положительное влияние на
прорастание спор, рост вегетативного мицелия и образование плодовых тел базидиомицетов
[McMeekin, 2000; Isikhuemhen and Vaugnas-Ward, 2005; Mukhopadhyay et al., 2005]. Крайне
немногочисленны сведения об обнаружении ИУК и исследовании путей ее биосинтеза у
ксилотрофных базидиомицетов. Сообщения об изучении синтеза индолилуксусной кислоты
ксилотрофом Lentinus edades в доступной нам литературе отсутствуют.
Большое значение для нормальной жизнедеятельности организмов имеет обеспечение
необходимыми микроэлементами. Селен - эссенциальный микроэлемент для большинства
живых организмов, влияющий на функциональное состояние клетки и метаболические
процессы [Барабой и Шестакова, 2004; Reilly, 2006]. Экспериментальные исследования
показали, что различные селеновые соединения в разных концентрациях селективно влияют
на развитие, скорость роста фибов и продукцию биоактивных компонентов, либо подавляя,
либо стимулируя эти процессы.
Значительное количество работ посвящено исследованию действия неорганических
форм селена на биохимический состав фибов [Одга et al., 2004; Zhao et al., 2004b; Muñoz et
al., 2006; Falandysz, 2008]. В то же время влияние на грибные культуры органических
соединений селена и метаболические пути утилизации этих веществ остаются практически не
изученными.
в последние годы в связи с наблюдающимся в ряде регионов дефицитом Se в рационе
людей и животных все больше развивается производство различных селен-обогащенных
продуктов как с помощью добавления селена в готовые пищевые продукты, так и путем
выращивания различных сельскохозяйственных культур на обогащенных селеном средах
[Combs, 2001; Whanger, 2002]. Многие виды макромицетов обладают способностью к
аккумуляции селена в очень высоких концентрациях [Голубкина и др., 2000; Borovicka and
Randa, 2007; Falandysz, 2008]. Поэтому исследование метаболизма селена у базидиомицетов
не только имеет большое фундаментальное значение, но и может получить практическое
применение для биологического синтеза низкотоксичных органических селеновых
соединений (селенопротеинов и селеновых аминокислот) (Одга eí al., 2004; Du ef al., 2007].
Перспективным направлением является также получение наночастиц элементного селена с
помощью грибного мицелия [Sasfry eí al., 2003; Narayanan and Sakthivel, 2010; Popescu et al
2010; Musan-at ef al., 2011].
Bee это обусловливает необходимость изучения индольных и селенорганических
соединений, а также совместного культивирования с бактериями в связи с процессами
цитодифференцировки и морфообразования фибов, выявления роли этих факторов в
жизнедеятельности фибных культур. Представляло интерес сравнить действие этих разных
по природе факторов между собой. Такого рода исследования могли бы быть полезны для
целенаправленного отбора эффективных индукторов, повышающих стресс-устойчивость
съедобных культивируемых грибов, как это имеет место у растений [Dat et al., 1998].
Важность изучения и разнообразие эффектов биотических и абиотических факторов в
онтогенезе базидиомицетов, а также разностороннее значение гриба шиитаке, ко времени
начала наших исследований явно не согласовывались с недостатком сведений о роли
индольных соединений и путей их трансформации, селенсодержащих органических
соединений в жизнедеятельности высших грибов. Не изучалась двойная культура
базидиомицета Lentinus edodes с бактериями вообще, и в частности с известными
продуцентами фитогормона индольной природы - почвенными ассоциативными бактериями
рода AzospiriUum. На основании вышеизложенного нами было предпринято настоящее
исследование.
Цель данной работы - исследование совместного культивирования ксилотрофного
базидиомицета Lentinus edodes (Berk.) Sing, с бактериями AzospiriUum brasilense и выявление
роли индольных и селенсодержащих соединений, характеристик их биосинтеза и путей
трансформации у грибной культуры.
Задачи исследования:
1. Оптимизировать условия совместного культивирования L edodes F-249 и А. brasilense
Sp7.
2. Изучить влияние азоспирилл на рост, морфологические и биохимические особенности
L edodes F-249.
3. Исследовать воздействие экзогенной ИУК и предшественников ее биосинтеза на рост
и развитие L edodes F-249.
4. Выявить способность L edodes F-249 к синтезу ИУК под влиянием различных
индольных соединений.
5. Установить пути биосинтеза ИУК изучаемой культурой L. edodes F-249 при
выращивании ксилотрофа в присутствии экзогенных синтетических аналогов соединений предшественников ИУК.
6. Изучить влияние органического селенсодержащего соединения (ДАФС-25) на рост L.
edades F-249 на жидких и твердых средах разного состава.
7. Определить возможные пути метаболизма селенорганического ксенобиотика ДАФС25 у шиитаке.
Научная новизна работы
Впервые была экспериментально подтверждена возможность, подобраны условия и
показана эффективность совместного глубинного культивирования базидиомицета Lentinus
edodes с бактериями AzospiriUum brasilense и получения посевного мицелия на основе
промежуточной совместной культуры. Выявлены положительные эффекты совместного
культивирования шиитаке и азоспирилл. Обнаружено снижение биотического влияния
посторонней микрофлоры на мицелий шиитаке в условиях двойной культуры с А. brasilense
Sp7, усиленное накопление маннита как биохимического предшественника подготовки к
плодоношению, отсутствие увеличения лекгиновой активности как один из показателей
благоприятных условий роста шиитаке в присутствии азоспирилл.
Впервые обнаружена и количественно охарактеризована способность ксилотрофного
базидиального гриба L edades к биосинтезу фитогормона ИУК и промежуточных соединений
этого синтеза, а также влияние шести индольных соединений при экзогенном введении в
среду на рост, морфогенез, уровень собственной продукции и конкурентные отношения
триптофан-зависимого и независимого путей биосинтеза ИУК макробазидиомицетом.
Впервые выявлена индукция генеративной стадии развития шиитаке индольным
производным. Установлено, что среди изученных соединений - предшественников ИУК
только индолилацетамид в концентрации порядка Ю'* г/л в культуральной жидкости L. edades
оказывает ярко выраженное стимулирующее влияние на формирование морфологической
структуры - коричневой мицелиальной пленки шиитаке.
Впервые выявлено накопление элементного селена в результате трансформации
селенорганического соединения высшим грибом Lentinus edades, обнаружена стимуляция
роста и развития мицелия под действием этого соединения.
Практическая значимость исследования
Научные положения работы выявляют первоочередные задачи начальных этапов
изучения смешанных культур высших грибов с симбиотическими ускоряющими рост растений
бактериями, функциональной роли последних в жизнедеятельности фибных культур, в
адаптационных и морфогенетических процессах, расширяют и углубляют современные
представления о разнообразии функций природных соединений группы индола, о физиологобиохимических механизмах регуляции их продукции базидиомицетами; позволяют с новых
позиций подойти к изучению селенорганических веществ.
В работе выявлены реальные пути оптимизации процесса получения плодовых тел
ценного высшего фиба. Обнаруженное положительное влияние таких факторов, как
совместное выращивание с азоспириллами и присутствие селенорганического препарата
ДАФС-25, на рост и развитие фибной культуры может быть использовано для
совершенствования условий культивирования шиитаке.
Материалы диссертации используются в научно-исследовательской работе ИБФРМ
РАН, Института химии СГУ, лаборатории экспериментальной микологии Института
микробиологии HAH Беларуси.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Бактерии Azospirillum brasilense в условиях совместной культуры с базидиомицетом
Lentinus edades стимулируют рост, усиливают конкурентоспособность посевного мицелия в
отношении контаминирующей микрофлоры и вызывают изменения в углеводном,
жирнокислотном и белковом составе мицелия.
2. Культура L. edades F-249 синтезирует соединения индольной природы при росте в
условиях пофуженного культивирования. Состав группы экстраклеточных индольных
соединений шиитаке зависит от условий .глубинного культивирования и включает в разных
соотношениях следующие компоненты: L-триптофан, ß-индолил-З-уксусную кислоту, ßиндолил-З-ацетальдегид,
ß-Индолил-З-ацетамид, индолил-З-пировиноградную
кислоту,
триптамин, 5-гидрокси-р-индолил-3-уксусную кислоту.
3. Путь биосинтеза ИУК изучаемой грибной культурой является триптофан-зависимым,
однако происходит переключение на триптофан-независимый путь при выращивании
ксилотрофа в присутствии экзогенного индола, а также при индуцировании биосинтеза
индолил-З-уксусной кислоты ее микродобавками.
4. Селенорганическое соединение ДАФС-25 является экзогенным регулятором роста и
развития L edades. В качестве одного из путей метаболизма ДАФС-25 впервые выявлено
выделение элементного селена в глубинной культуре высшего гриба.
Работа выполнена в лаборатории микробиологии Учре>вдения Российской академии
наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствии^ с
плановой тематикой «Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия» (№ гос.
регистрации 01970008158, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина); «Роль
углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов» (№
гос. регистрации 01200606184, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина);
«Изучение
гликопротеинов
и
биогенных
низкомолекулярных
соединений
в
жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200904389, научный
руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина).
Работа частично поддержана фантами РФФИ-БРФФИ (РФФИ и Белорусского
республиканского фонда фундаментальных исследований; руководитель с российской
стороны - д.б.н., проф. В.Е. Никитина): «Гликополимеры и углеводсвязывающие белки
ксилотрофных базидиомицетов: функции и биологическая активность» № 06-04-81042-Бел_а
(2006-2007 гг.); «Липофильные соединения мицелиальных грибов: образование,
характеристика» № 08-08-90004-Бел_а (2008-2009 гг.); «Соединения фитогормональной
природы в культуре базидиомицетов: биосинтез и физиологический эффект экзогенного
воздействия» № 10-04-90021-Бел_а (2010-2011 п".).
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на: Втором съезде Общества
биотехнологов России (Москва, 13-15 октября 2004); Всерос. научно-практ. конфер.
«Вавиловские чтения - 2004» (Саратов, 24-26 ноября 2004); 3-м Всерос. Конгрессе по
Медицинской микологии (Москва, март 2005); 9-й Межд. Пущинской школе-конфер. мол.
ученых «Биология - наука XXI века» (Пущине, 18-22 апреля 2005); Всерос. конфер.
«Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные
и прикладные аспекты» (Саратов, 15-17 июня 2005); Int. Conf. "Biocatalysis-2005;
Fundamentals&Applications" (St. Petersburg, 19-23 June, 2005); 4-м Всерос. Конфессе по
Медицинской микологии (Москва, 29-31 марта 2006); 10-й Пущинской школе-конфер. мол.
ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 17-21 апреля 2006); Межд. науч. конфер.
«Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти
профессора М.В. Гусева)» (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 1619 мая 2006); Межд. науч. конфер. «Современное состояние и перспективы развития
микробиологии и биотехнологии» (Минск, 1-2 июня 2006); Межд. науч. конф. «Микробные
технологии», поев. 140-летию со дня рожд. Д.К. Заболотного (Одесса, Украина, 11-15
сентября 2006); III межрегион, конфер. мол. ученых «Стратегия взаимодействия
микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 10-12 октября 2006); 5-м
Всерос. Конфессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007); VI Всерос. интерактивной
конфер. мол. ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии»
(Саратов, июнь 2007); XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 16-22 September
2007), Межд. научно-практ. конф., поев. 120-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова
«Вавиловские чтения - 2007» (Саратов, 27-30 ноября 2007); Междунар. науч. конф.
«Проблемы биоэкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 15-18
мая 2008); Втором Съезде микологов России (Москва, 16-18 апреля 2008); IV
межрегиональной конфер. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и
растений с окружающей средой» (Саратов, 14-16 октября 2008); Межд. научно-прает. конф.
«Вавиловские чтения - 2008» (Саратов, 26-27 ноября 2008); II Всерос. с межд. участием
конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 25-29 мая
2009); «VII Межд. Симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные
аспекты» (Москва, 19-23 октября 2009); Межд. науч.-практ. конф. «Вавиловские чтения 2009» (Саратов, 25-26 ноября 2009); 14-й Пущинской межд. шкопе-конф. мол. ученых
«Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010); VII Межд. конф. «Современное
состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 31 мая-4 июня
2010); V Всерос. конф. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений
с окружающей средой» (Саратов, 28 сентября-1 октября 2010); VIII Межд. конф.
«Биоантиоксидант» (Москва, 4-6 октября 2010); Всерос. симпозиуме с межд. участием, поев.
85-летию со дня рожд. В.А. Кумакова «Физиолого-биохимические основы продукционного
процесса у культивируемых растений» (Саратов, 13-15 октября 2010); Межд. конфер.
«Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология», поев. 100-летию со дня
рожд. академика Т.Б. Дарканбаева (Алматы, Казахстан, 28-29 октября 2010); Межд. науч,практ. конф. «Вавиловские чтения-2010» (Саратов, 25-26 ноября 2010); Всерос. симпозиуме
с межд. участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее,
будущее» (Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 27-29 января
2011), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ.
Личный вклад соискателя состоит в постановке и разработке путей выполнения всех
основополагающих задач, решаемых в рамках диссертационной работы, ключевая роль на
всех этапах исследования и интерпретации полученных результатов, участие в подготовке
публикаций.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числе 6 статей в
рецензируемых изданиях и 14 статей в сборниках научных трудов.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор
литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных
результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников
литературы.
Работа изложена на 169 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал
представлен 38 рисунками и 8 таблицами. Список цитируемой литературы включает 248
источников, в том числе 170 зарубежных, 116 опубликованы в XXI веке.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Обзор литературы (глава 1) представлен 4 разделами, 9 подразделами. В первой части
обзора кратко охарактеризованы морфолого-культуральные и физиолого-биохимические
особенности Lentinus edodes. Во второй части изложены современные представления о
бактериально-фибных симбиозах, описаны имеющиеся в литературе немногочисленные
исследования совместного культивирования базидиомицетов с бактериями в искусственных
условиях, освещены предпосылки для использования при получении двойных культур с
базидиальными грибами почвенных азотфиксаторов рода AzospiriUum. В третьей части
обзора литературы рассмотрено значение фитогормонов индольной природы в
жизнедеятельности базидиомицетов. Приведена характеристика фитогормона класса
ауксинов - р-индолил-З-уксусной кислоты (ИУК), рассмотрены особенности биосинтеза ИУК
микроорганизмами. Далее изложены сведения об изучении синтеза ИУК базидиальными
фибами и влияния экзогенной ИУК на рост и развитие фибных культур. В четвертой части
обзора приведена характеристика микроэлемента селена, охарактеризованы важнейшие
функции, выполняемые селеном и его соединениями в живых организмах, подчеркнуто
значение Se в питании человека. Рассмотрена способность шляпочных грибов к аккумуляции
селена и влияние этого микроэлемента на их ростовые характеристики. Приведены данные о
химическом составе и практическом применении органического селенсодержащего препарата
ДАФС-25. На основании каждого из разделов представленного обзора сформулированы
аспекты исследования для достижения цели настоящей работы и определен круг решаемых
для этого задач.
8
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования, условия культивирования
В работе использовали культуру Lentinus edades F-249 из коллекции высших
базидиальных фибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного
университета и штамм Azospirillum brasilense Sp7, полученный из Института микробиологии
РАН (г. Москва).
Для выращивания культур использовали среды следующего состава: сусло пивное (1,2
или 2° по Баллингу); среда на основе отвара пшеничной муки; среда на основе экстракта
дубовых опилок; среда с дрожжевым эксфактом состава (г/л): глюкоза - 10; дрожжевой
экстракт-1; КН2РО4-2; К2НРО4-З; MgS0v7H20-2,5; РеЗОч ^ Н г О - 0,03; СаСЬ-ГНгО - 0 , 0 2 ;
глюкозо-аспарагиновые среды состава (г/л): £>-глюкоза - 9; ¿.-аспарагин - 1,5 или О-глюкоза 10, L-acnaparHH-1; КН2РО4-2; К2НРО4-З; MgS04-7H20-2,5; FeS04-7H20-0,03; СаСЬ^НгО
- 0,02; модифицированная малатная среда [Day and Dfibereiner, 1976] состава (г/л): К2НРО4 3.0; КН2РО4 - 2,0; NaCI - 0,1; Мд304-7Нг0 - 0,2; СаСЬ - 0,02; FeSOíTHjO - 0,02; MnSOí-SHzO
- 0,1; N|2Mo04-2 Н2О - 0,002; NaOH - 2,24; яблочная кислота - 3,76 (рН 6,8-7,0). Плотные
среды получали, добавляя в питательные растворы 1,8-2% {шА/) агара, при этом
концентрацию пивного сусла увеличивали до 4° по Баллингу. Для получения плодовых тел
шиитаке использовали субстрат на основе зерна пшеницы и дубовых опилок в пропорции 1:4
(vA/).
Индольные соединения ("Sigma") и селенсодержащий препарат ДАФС-25 вносили в
среду виде растворов в 50%-ном этаноле, Na2Se03 и Na2Se04 ("Sigma") - в виде водного
раствора.
Температура выращивания монокультуры L. edades составила 26''С, совместной
культуры L edades и А. brasilense - 28°С.
Методы исследования
При посеве грибной культуры в качестве инокулята использовали 14-суточную культуру
L. edades F-249, выращенную на агаризованном пивном сусле (4° по Баллингу) при 26°С.
Среды инокулировали блоками мицелия (диаметр 5 мм) из расчета 10 блоков на 100 мл
жидкой среды или 1 блок на 1 чашку Петри. При исследовании диапазона концентраций
ДАФС-25 жидкие среды инокулировали мицелием, взятым с чашки Петри в виде сектора (1/8
чашки). Плодовые тела L. edades получали на плотном субстрате, состоящем из смеси
дубовых опилок и пшеничного зерна [Przybylowicz and Donoghue, 1991].
При исследовании совместного роста L edades F-249 и А. brasilense Sp7 на чашках
Петри с сусло-агаром шиитаке подсевали к растущей 24-часовой культуре А. brasilense или
помещали диск с мицелием на расстоянии 2-2,5 см от центра чашки Петри, и через 5 сут с
противоположной стороны подсевали штрихом азоспириллу. Смешанную культуру на жидких
средах получали, подсевая А. brasilense к L edodes либо в виде смыва с агаризованной
среды, либо в виде 24-часовой культуры на мапатной среде (2-10 ' клеток /мл).
Для оценки роста культур базидиомицетов на агаризованных средах определяли
скорость линейного роста колонии и ростовой коэффициент [Бухало, 1988]. При глубинном
культивировании шиитаке рост характеризовали по накоплению сухой биомассы мицелия
[Методы ..., 1982].
Экстракты из мицелия для определения белкового состава получали по
модифицированному методу Banerjee с соавт. [Banerjee et. ai, 1982] с использованием
буфера Tris-HCI (рН 7,5). Для определения углеводного состава высушенный и измельченный
мицелий экстрагировали трижды в течение 30 мин. кипящей дистиллированной водой или
этанолом соответственно. Для определения селенсодержащих аминокислот экстракцию
мицелия проводили дистиллированной водой в течение 3 ч при 37°С [Одга ef ai, 2004].
Индольные соединения определяли в культуральной жидкости (КЖ) методом
распределительной обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии
(ВЭЖХ) на приборном комплексе "Millichrom" ("Laboratornl Pristroje", Чехия). Колонка (150x4.6
мм) "Luna 5р С18(2)" ("Phenomenex", США), с предколонкой (типа Security Guard) той же
марки, носитель с химически связанными гидрофобными остатками 0,8 (5 мкм), элюент смесь метанол - вода (36 ; 64 либо 50 : 50, v/V).
Рентгенофлуоресцентный анализ осуществляли с помощью энергодислерсионного
рентгеновского спектрометра EDX-720 Energy Dispersive X-Ray Spectrophotometer.
Хромато-масс-спектрометрическое исследование (в варианте ГХ-МС) проводили на
газовом хромато-масс-спектрометре Trace GC - Trace DSQ ("ThermoFinnigan", США).
Рентгенофазовый анализ осуществляли на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3.0 с
СиКа-излучением (длина волны 1.54173 А).
Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в неденатурирующих условиях на
приборе для вертикального гель-электрофореза VE-4M («Хеликон», Россия) Визуализация
белковых спектров осуществлялась методом окраски при помощи нитрата серебра [Блохин,
1988].
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) КЖ и экстрактов из мицелия для определения
аминокислотного состава проводили на пластинках силикагеля в системе растворителей нбутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:1, v/v). Для визуализации результатов
разделения применяли раствор нингидрина (0,3 г нингидрина в смеси 100 мл н-бутанола и 3
мл ледяной уксусной кислоты).
Лектиновую активность КЖ и экстрактов из мицелия определяли реакцией
гемагглютинации с самопроизвольным оседанием эритроцитов в серии последовательных
разведений
лектина
[Луцик
и др.,
1981].
Использовали
2%-ную
суспензию
трипсинизированных эритроцитов кролика.
Состав углеводной фракции мицелия исследовали методом капиллярной газовой
хроматофафии на неподвижной жидкой фазе SE-54 с предварительным получением
синильных производных Сахаров, на приборе "Chrom 5" (ЧССР) с пламенно-ионизационным
детектором, используя кварцевую капиллярную колонку длиной 25 м. Триметилсилиловые
эфиры исследуемых проб и соединений-стандартов получали с использованием 1,1,1,3,3,3гексаметилдисилазана и триметилхлорсилана в качестве катализатора [Пецев и Коцев, 1987].
Липиды
для
анализа
жирнокислотного
состава
мицелия
экстрагировали
модифицированным методом Song с соавт. [Song et al., 1989]. Жирные кислоты
анализировали в виде метиловых эфиров методом газожидкостной хроматофафии (ГЖХ)
[Хроматофафия ..., 1986] на газожидкостном хроматографе «Биохром-1» на кварцевой
капиллярной колонке (длина 25 м, внутренний диаметр 0,2 мм) с неподвижной фазой SE-54.
Просвечивающую электронную микроскопию проводили на электронном микроскопе
"Libra 120" ("Carl Zeiss") при 120 kV и увеличении х4000 на никелевых сеточках с подложкой
(1%-ный раствор формвара в дихлорэтане), световую микроскопию - на микроскопе "Leica
DM6000B" ("Leica Microsystems") при увеличении х20 и х40.
Опыты по измерению фибной биомассы проводили в 5-10 повторностях, все остальные
- в 3 повторностях. При оценке полученных результатов пользовались методом расчета
стандартного отклонения среднего арифметического [Рокицкий, 1973]. Представленные в
работе данные имеют соответствующие доверительные интервалы при уровне
доверительной вероятности 0,95. Для количественной обработки данных использовали также
профамму Microsoft Excel 2003.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние азоспирилл на рост и развитие L. edades Р-24Э
Бактерии рода Azaspirillum являются перспективным объектом для совместного
культивирования с шиитаке благодаря своей способности стимулировать рост
симбиотических организмов и в то же время подавлять жизнедеятельность фитопатогенной
микрофлоры. Достаточно хорошо изучена способность азоспирилл к стимуляции роста
высших растений, исследуется и культивирование азоспирилл совместно с другими
микроорганизмами - водорослями, бактериями и микроскопическими грибами. Известно, что
в природных условиях бактерии рода Azospirillum ассоциируются также с микоризами и
спорокарпами микоризных грибов. Приступая к исследованию совместного культивирования
10
L. edades и А. brasilense, мы поставили задачу прежде всего экспериментально подтвердить
возможность, подобрать условия выращивания двойной культуры и выявить положительные
эффекты совместного культивирования шиитаке и азоспирилл.
Поведение совместных культур изучали на жидких и агаризованных средах, на твердом
^ ^ опилочно-зерновом субстрате. Морфология колоний А.
brasilense при культивировании
с шиитаке не
изменялась. Было установлено, что одной из наиболее
благоприятных сред для нормального роста обеих
культур является жидкая среда на основе пивного сусла.
На данной среде были получены все морфологические
стадии шиитаке. При совместном росте с азоспириллой в
жидкой глубинной культуре на данной среде сухая
биомасса мицелия увеличивалась на 60%. При
использовании
совместной
культуры в качестве
инокулята заметно ускорялся рост мицелия и на
опилочно-зерновом субстрате (рис. 1); наибольшее
Рис. 1. Рост мицелия L. edades
(30 сут) на опилочно-зерновом
положительное влияние азоспирилл на развитие гриба
субстрате при инокуляции:
наблюдалось при возрасте посевной совместной
а - монокультурой L. edades F-249; культуры 14 сут. Использование зернового мицелия,
б - совместной культурой
полученного на основе промежуточной совместной
L. edades F-249 и А. brasilense Sp7 культуры L. edades F-249 и А. brasilense Sp7, для
выращивания плодовых тел приводило к увеличению
урожайности шиитаке. Последовательная инокуляция
того же субстрата шиитаке и азоспириллой указанных
положительных последствий не имела.
Наблюдалось
явное
преимущество
двойной
культуры в плане подавления посторонней микрофлоры
(рис. 2). Оставленные в нестерильных условиях
открытые колбы с двойной культурой оказались
практически не подвержены контаминации, тогда как в
отрытых колбах с монокультурой гриба заражение
происходило во всех случаях. Фунгистатические
свойства двойной культуры в отношении посторонней
микрофлоры продолжали заметно отличаться от
Рис. 2. Совместная культура
L edades F-249 и Л, brasilense Sp7 монокультуры шиитаке при пересеве на опилочнозерновой субстрат. Этот субстрат используется для
на жидкой среде (пивное сусло)
получения плодовых тел съедобных ксилотрофных
и монокультура L, edades F-249
грибов. Мицелий при этом находится в нестерильных
того же возраста (30 сут),
условиях, и субстратные блоки сильно подвержены
зараженная посторонней
заражению конкурентной микрофлорой, в первую
микрофлорой
очередь плесневыми грибами, такими, как представители
рода Trichaderrna. Поэтому защита мицелия шиитаке от контаминации на данном этапе
культивирования приобретает особое значение, и решением этой проблемы может
послужить использование в качестве посевного материала двойной культуры L. edades с
азоспириллой.
Возможно, снижение биотического влияния контаминирующих микроорганизмов на
мицелий шиитаке происходит как благодаря большей физиологической активности мицелия,
так и за счет фунгистатического действия азоспирилл в отношении контаминантов.
Одним из важнейших свойств азоспирилл является биосинтез фитогормонов,
позволяющий рассматривать их как стимуляторы роста растений. Мы предположили, что
благоприятное влияние А. brasilense на шиитаке связано с выделением в среду
культивирования веществ фитогормональной природы. Исследовали влияние на грибную
монокультуру ИУК - растительного гормона, наиболее изученного как в отношении влияния
на базидиомицеты, так и в плане биосинтеза азоспириллой. При выращивании L. edades на
синтетической глюкозо-аспарагиновой среде с добавлением 2-10'^ - 2 Ю'® г/л ИУК сухая
11
биомасса мицелия увеличилась на 17-29%, а на пивном сусле ИУК в концентрации 2
г/л вызвала увеличение сухой биомассы на 56-64% (рис. 3). В то же время более
высокие концентрации - от 5-10"' г/л и выше на синтетической среде, 2-10'^ г/л и выше на
пивном сусле - ингибировали рост культуры.
-в 2,5
,
• 10 мг/л
Q 5 мг/л
0 2 мг/л
Н 0,5 мг/л
И 0,2 мг/л
И 0,02 мг/л
0 0,002 мг/л
И 0,0002 мг/л
И контроль
синтетическая
среда
tywio
Рис. 3. Накопление сухой биомассы монокультуры
L edodes F-249 на средах с ИУК
Однако при ВЭЖХ-анализе культуральных жидкостей как монокультур шиитаке и
азоспириллы, так и двойной культуры ИУК не была обнаружена, несмотря на присутствие
достаточно высоких концентраций ее основного предшественника - триптофана, что не
позволяет связать положительное влияние азоспирилл на рост гриба шиитаке при их
совместном глубинном культивировании с биосинтезом свободной ИУК бактериями.
Характеристика биохимических показателей грибного мицелия
при совместном культивировании L. edodes F-249 с А. brasilense Sp7
Среди
биохимических
особенностей
мицелия,
определяющих
способность
базидиомицета
к
плодоношению,
важное
место
занимают
его
f
аминокислотный, белковый, углеводный и жирнокислотный
669
состав.
Результаты ТСХ-исследования показали различия в
440
составе пула аминокислот КЖ и экстрактов из мицелия
монокультуры шиитаке и выращенной совместно с
азоспириллой.
Нативный электрофорез в полиакрипамидном геле
выявил различия в белковом составе мицелиальных
экстрактов L. edodes в монокультуре и при совместном росте
с А. brasilense (рис. 4). У двойной культуры наблюдалось
появление белков с молекулярной массой около 70 кДа и
140
двух высокомолекулярных белков около 200 и 300 кДа,
отсутствующих в мицелии монокультуры.
Определение
гемагглютинирующей
активности
культуральной жидкости не выявило отличий этого
показателя у двойной культуры и монокультуры гриба.
Рис. 4. Нативный электрофорез
Условия культивирования в присутствии азоспирилл не
являются для L. edodes стрессовыми, на что указывают экстрактов из мицелия L. edodes F-249
(21 сут). М - маркеры, 1 - экстракт
возрастание биомассы гриба и отсутствие изменения
мицелия монокультуры шиитаке,
лектиновой активности.
2 - экстракт мицелия шиитаке,
Изменения в углеводном и жирнокислотном составе
выращенного в двойной культуре
мицелия в двойной культуре по сравнению с
с А. brasilense
12
монокультурой гриба оказались качественно сходными с соответствующими биохимическими
изменениями, происходящими в мицелии перед плодоношением. В мицелии, выращенном в
присутствии А. brasilense, повышалось содержание полиола маннита (на стадии белого
мицелия и примордия - в 3 раза, на стадии коричневой мицелиальной пленки (КМП) - более
чем в 30 раз) и снижалась степень насыщенности жирных кислот. Это явление может служить
одним из аспектов объяснения обнаруженного нами положительного влияния А. brasilense
Sp7 на рост L edodes F-249.
Влияние экзогенной ИУК и ее предшественников
на рост и развитие шиитаке
По данным наших исследований, ИУК оказалась в стороне от стимулирующей рост
мицелия деятельности А. brasilense Sp7. Тем не менее, явная способность химического
аналога этого ауксина положительно влиять на накопление биомассы, проявляя при этом
дозозависимый характер, требовала дальнейшего изучения.
У грибов достаточно хорошо изучена роль ауксинов в жизнедеятельности только
определенных групп микокультур; фитопатогенных и микоризных. Фитогормональные
соединения служат у этих организмов для взаимодействия с растением-хозяином.
Способностью к продукции ауксинов могут обладать и грибы, не связанные тесно в процессе
своей жизнедеятельности с растениями. Достаточно давно выдвигаются предположения о
том, что фитогормоны, в том числе представители группы ауксинов, принимают участие в
процессах роста и дифференцировки не только у растений, но и у грибов, однако этот вопрос
до сих пор остается практически не исследованным. Поэтому следующим этапом наших
исследований явилось изучение способности Lentinus edodes F-249 экзогенно продуцировать
индолилуксусную кислоту, определение соединений, служащих в качестве предшественников
для синтеза ИУК и возможных путей этого синтеза, а также влияния этих соединений при
экзогенном введении в среду на рост, развитие и уровень продукции гетероауксина
культурой.
Изучили влияние экзогенной ИУК на накопление сухой биомассы мицелия в динамике
роста на синтетической среде (рис. 5). Вьюокие концентрации ИУК (10'^ - 10"*) г/л вызывали
уменьшение биомассы по сравнению с контролем; максимальным (почти в 2 раза) это
снижение оказалось на 7-10 сут, а после 14 сут негативное влияние ИУК становилось менее
выраженным. Более низкие концентрации ИУК в целом не оказывали выраженного
негативного влияния на L edodes, но на 10 сут на средах с 10"® - 10"® г/л ИУК биомасса
снижалась. Прирост биомассы по сравнению с контролем оказался максимальным на средах
с 10"^ и 10'^ г/л индолилуксусной кислоты после 14 сут культивирования.
—1
2
- 3
-• 4
--5
6
- 7
Рис. 5. Накопление биомассы мицелия Lentinus edodes F-249 на синтетической среде с ИУК.
1 - контроль, 2 - 10"® г/л ИУК, 3-10"^ г/л ИУК, 4-10"® г/л ИУК, 5-10"^ г/л ИУК,
6 - Ю"* г/л ИУК, 7-10"^ г/л ИУК, 8-10'^ г/л ИУК, 9 - 1 0 ' ' г/л ИУК
Помимо самой индолилуксусной кислоты, было изучено влияние ряда ее
предшественников на рост погруженной культуры L. edodes на синтетической глюкозоаспарагиновой среде. Триптофан добавляли к исходной среде в количестве 10 и 100 мг/л.
13
Аминокислота не оказала на культуру шиитаке заметно выраженного воздействия. 10 мг/л не
влияли достоверно на накопление биомассы, 100 мг/л слабо стимулировали рост. Влияние
индолил-З-ацетамида (ИААм), триптамина (ТАм), индолилпировиноградной кислоты (ИПВК) и
индола изучили в динамике роста. На средах с ИААм, ТАм и ИПВК рост мицелия был
несколько более интенсивным, чем в контрольном варианте опыта. В наибольшей степени
стимулировали накопление мицелия 100 мг/л триптамина и 0,1 мг/л ИААм, а 10-100 мг/л
индола заметно угнетали рост.
На средах с ИУК и ее предшественниками в большинстве случаев не наблюдалось
изменений в морфологии погруженного мицелия L. едодез. Исключение составила среда с
0,1 мг/л ИААм, на которой отмечено сокращение времени появления коричневой
мицелиальной пленки - специализированной морфоструктуры шиитаке, образующейся на
стадии, предшествующей плодоношению. Пленка появилась на этой среде уже на 17-е сут,
тогда как в контрольном варианте, при других концентрациях ИААм и на средах с остальными
индольными соединениями ее образования не наблюдалось. 0,1 мг/л И/\Ам оказали
наибольший стимулирующий эффект на накопление мицелиальной биомассы, и
максимальным (24%) прирост был именно на 17-е сут. Вероятно, с этим усилением роста
связано и ускорение образования КМП.
Биосинтез ИУК и ее предшественников
культурой L. edades F-249
Основным предшественником ИУК является аминокислота триптофан. Биосинтез ИУК из
триптофана (триптофан-зависимый синтез), у микроорганизмов может проходить по одному
из четырех путей: через ИПВК и индолил-З-уксусный альдегид (ИААльд) (наиболее
распространенный
путь); через
ТАм и ИААльд; через
ИААм либо через
индолилацетальдоксим и индолил-З-уксусный нитрил. Наряду с триптофан-зависимым
биосинтезом ИУК как у растений, так и у микроорганизмов выделяют также Тгр-независимый,
при котором индолилуксусная кислота образуется из индола или антраниловой кислоты не
через триптофан. Механизм Тгр-независимого биосинтеза ауксинов микроорганизмами
изучен крайне мало, а его вклад в биосинтез ИУК считается незначительным.
Состав культуральной жидкости L. edades F-249, выращенной на глюкозо-аспарагиновой
среде с добавками различных концентраций предшественников ИУК, изучили методом ВЭЖХ
с целью определить наличие и количественное содержание в ней индольных соединений,
вовлекающихся в процесс биосинтеза ИУК микроорганизмами. В культуральной жидкости L
edades F-249 были обнаружены следующие индольные соединения: ИУК, триптофан,
триптамин, ИААм, ИПВК, И/\Апьд, 5-гидрокси-индолил-З-уксусная кислота.
Способность L. edades к экзогенной продукции ИУК нами обнаружена впервые. На
среде, изначально не содержавшей триптофана, ИУК накапливалась в КЖ в максимальной
концентрации 7,43 мг/л (рис. 6).
оРис. 6. Синтез внеклеточной ИУК глубинной культурой Lentinus edades F-249 разного
возраста на средах с индольными соединениями
14
Добавление триптофана к среде выращивания вызывало увеличение содержания ИУК
до 9,33 мг/л (на среде со 100 мг/л триптофана). Стимулирующее действие на синтез ИУК
оказали 1-10 мг/л ТАм. Среды с добавлением индола характеризовались достаточно
высокими значениями ИУК (до 9 мг/л) на 14-21-е сут культивирования, причем количества
образовавшейся ИУК не зависели от исходной концентрации индола, изменявшейся на 4
порядка. На средах с ИПВК индолил-З-уксусная кислота обнаружилась лишь в очень малых
количествах (максимум 1,8 мг/л на 14 сут на среде с 100 мг/л ИПВК), однако было
обнаружено в вьюоких концентрациях (до 27,9 мг/л) промежуточное соединение синтеза ИУК
из ИПВК или триптамина - И/\Альд, не найденное на других средах (рис. 7).
2
э
35
30 25
и з сут
КЗ 7 сут
20
И 10 сут
15 1
10
0 14 сут
'
а 21 сут
5 О
-Ч^^
^^^ ^ ^ ^ ^
>
/
/
/
Рис. 7. Синтез внеклеточного ИААльд глубинной культурой Сеп(ти8 ес1ос1е8 Р-249 разного
возраста на средах с индольными соединениями
На всех изученных средах в КЖ присутствовал триптофан (рис. 8). Внесение 10 и 100
мг/л триптофана в среду привело к значительному повышению содержания этого вещества в
КЖ. Максимальное количество триптофана - 327 мг/л - отмечено на 14-е сут на среде, куда
изначально было внесено 100 мг/л этой аминокислоты.
® 3 сут
Е3 7 суг
И 10 суг
И 14 сут
й 2 1 суг
лО
^^
^^
^^ ^^^ ^^^
#
у
>
>
Рис. 8. Синтез внеклеточного триптофана глубинной культурой Lentinus еЬобвв Р-249 разного
возраста на средах с индольными соединениями
Индол не был обнаружен ни в одной из проб, в том числе и в тех случаях, когда его
добавляли в среду перед началом культивирования гриба.
15
В контроле, на средах с ТАм и ИААм при всех возрастах мицелия в КЖ присутствовала
окисленная форма ИУК - 5-гидрокси-ИУК, концентрации ее при этом колебались в пределах
от 0,78 до 2,63 мг/л. Исключение составила среда с 0,1 мг/л ИААм, где на 14-21 сут уровень
5-гидрокси-ИУК резко увеличился на порядок (рис. 9). Как было сказано выше, этот вариант
опыта отличался от остальных ранним появлением коричневой мицелиальной пленки. На 14
сут наблюдалась заметная пигментация мицелия, а к 17 сут пленка полностью образовалась.
Можно предположить, что 5-гидрокси-ИУК кислота вовлекается в процесс формирования
КМП.
•Ё
s
U
S
о
3- >,
а У
S §
d
I
^^^ ^^^ ^ ^ v ^
^^ ^ ^
о-
Рис. 9. Синтез внеклеточной 5-гидрокси-ИУК глубинной культурой Lentinus edodes F-249
разного возраста на средах с индольными соединениями
Определение возможных путей синтеза ИУК
культурой L. edodes F-249
Выявленная нами биосинтетическая способность гриба в отношении ИУК и ее
предшественника триптофана позволила сделать предположение о существовании у
исследуемой культуры Тгр-зависимого
синтеза ИУК. В КЖ L. edodes F-249
выявлены промежуточные соединения
Ш 3 сут
трех путей Тгр-зависимого биосинтеза ИУК
- через ТАМ, ИААм и ИПВК (рис. 10).
S 7 сут
Интересно, что ИААльд, являющийся
0 10 сут
интермедиатом синтеза ИУК как из ИПВК,
Н 14 сут
так и из ТАм, выявлен только на средах с
добавкой ИПВК, где ИААльд накапливался
И 21 сут
в больших количествах, однако уровень
ИУК в то же время был очень низким. Это
позволяет предположить, что путь синтеза
ТАМ
ИААм
ИПВК
ИУК через ИПВК не реализуется до конца.
Рис. 10. Содержание предшественников
Однако наряду с Тгр-зависимым
ИУК в КЖ глубинной культуры
биосинтезом ИУК у L. edodes, имеются
Lentinus edodes F-249 (контроль)
предпосылки для и Тгр-независимого пути
синтеза. Принято считать, что у бактерий
синтез ИУК - это путь детоксификации триптофана, поэтому для бактериальных продуцентов
именно триптофан - наиболее эффективный и «целесообразный» прекурсор ИУК. Для
изучаемого нами высшего гриба триптофан токсичным не является, по крайней мере вплоть
до относительно высоких концентраций, которые грибная культура создает при глубинном
культивировании (до 330 мкг/мл).
16
Одним из труднопреодолимых моментов на пути доказательства Тгр-независимости
биосинтеза ИУК является то, что индол может служить как предшественником ИУК при Тгрнезависимом биосинтезе, так и предшественником триптофана. Тгр, синтезированный из
индола, затем также может служить предшественником для ИУК. Случаи, когда ИУК
синтезируется культурой в отсутствие триптофана, не отмечены, что указывает на Тгрзависимый путь биосинтеза ИУК изучаемой грибной культурой. Тем не менее, можно
предположить, что происходит переключение на Тгр-независимый путь, или, что вероятнее,
подключение этого альтернативного пути, реализуемого в присутствии экзогенного индола в
интервале концентраций 10'^ - 10"* г/л. Необходимо оговориться в отношении добавок
индола, что и в этом случае фоновый уровень триптофана есть, но, во-первых, в сравнении с
контрольным опытом на 14-е сут он изменяется незначительно, а ИУК синтезируется в 1,51,9 раз больше, несмотря на явное снижение биомассы гриба под воздействием индола. Вовторых, концентрация триптофана в среде индифферентна к возрастанию уровня экзогенного
индола от 0,1 до 100 мг/л (в 1000 раз), а потому индол предположительно не является в
данном случае сколько-нибудь значимым прекурсором триптофана с дальнейшим
превращением последнего в ИУК. Повышенный уровень индола в культуральной среде
усиливал продукцию ИУК, а не триптофана. Это позволяет говорить о подключении Тгрнезависимого пути.
Признаки этого пути имеются и при индуцировании биосинтеза ИУК ее экзогенными
микродобавками (10"^— 10"® г/л). Например, при исходной концентрации 10'^ г/л ИУК на 10-е
сут выращивания уровень фитогормона составил около 4 Ю'^ г/л, т.е. возрос в 4000 раз).
Появление антраниловой кислоты (до 1,5 мг/л) как признака Тгр-независимого пути отмечено
нами только в этих экспериментальных условиях (рис. 11). В то же время сам триптофан в
КЖ на средах с 10"^ - 10"® г/л ИУК обнаружен не был.
0,00001
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
10
100
Концентрация ИУК в исходной среде, мг/л
Рис. 11. Синтез внеклеточной антраниловой кислоты глубинной культурой
Lentinus edodes F-249 разного возраста на средах с добавлением ИУК
Зависимость ростовых процессов L. edodes F-249
от присутствия ДАФС-25 в среде культивирования
Изучение эффектов селена в органической форме позволило выявить еще один
значимый факгор в отношении роста и развития L. edodes. Достаточно широко изучено
влияние солей селена на рост ряда грибных культур и аккумуляцию этого микроэлемента в
мицелии. В то же время, практически не исследованным остается влияние на грибы
селенорганических соединений. В качестве источника селена целесообразно использовать
органическое соединение, низкая токсичность физиологических концентраций в сочетании с
высокой эффективностью которого доказана ранее в отношении живых организмов. В нашей
работе мы рассмотрели влияние на L. edodes F-249 1,5-дифенил-3-селенпентадиона-1,5
(диацетофенонилселенид, препарат ДАФС-25). Данный препарат является одним из
немногочисленных селенорганических соединений, внедренных в практику, и используется в
17
сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки.
Изучена зависимость ростовых характеристик L edades от присутствия в жидких и
агаризованных средах ДАФС-25. Исследование ДАФС в диапазоне концентраций от 0,1 мкМ
до 1 мМ показало, что 0,1-1 мМ препарата угнетают рост гриба на сусло-агаре и
агаризованной синтетической глюкозо-аспарагиновой среде, тогда как более низкие
концентрации (0,1-1 мкМ) стимулируют мицелиальный рост (рис. 12).
— 1
- 2
•- 3
.. 4
—5
17 21
3 7 10 14 17 21 25 28
-6
Возраст, сут
Возраст, сут
б
Рис. 12. Значения ростовых показателей 1. edodes Р-249 на синтетических средах
с ДАФС-25: а - твердофазное культивирование, б - глубинное культивирование.
1 - гонтроль, 2 - 10"' М ДАФС-25, 3 - 10"® М ДАФС-25, 4 -10 = М ДАФС-25,
5 -10"* М ДАФС-25, 6 -10'^ М ДАФС-25
Стимулирующее действие селенорганического
соединения проявилось в первую очередь в заметном
увеличении плотности грибных колоний. Аналогичная
картина
наблюдалась
и
при
жидкофазном
культивировании: 0,1-1 мМ ДАФС-25 подавляли рост
гриба,
0,1-1
мкМ
оказывали
положительное
воздействие.
В
присутствии
0,1-1
мМ
ДАФС
при
культивировании L
edades на жидкой среде
наблюдалось красное или красновато-оранжевое
окрашивание мицелия (рис. 13), интенсивность
которого зависела от концентрации препарата и
Рис. 13. Красное окрашивание
сохранялась
в течение
длительного
периода
мицелия edodes Р-249
культивирования (до 90 сут). Согласно литературным
на средах с ДАФС-25.
данным, такое окрашивание характерно для бактерий,
Слева направо: контроль, 0,001,
0,1 и 1 мМ ДАФС-25 (14 сут)
водорослей и грибов, растущих на селенсодержащих
средах, и указывает на накопление культурой
элементного селена. В то же время на плотных средах с высокими концентрациями ДАФС-25
красного окрашивания мицелия не наблюдалось.
Возможные пути метаболизма ДАФС-25
культурой L. edades F-249
Определение химических форм селена в организмах, относящихся к различным
таксономическим группам, является актуальной областью исследований. В ряде стран с
целью устранения дефицита селена практикуется получение сельскохозяйственных растений
и промышленных микроорганизмов с повышенным содержанием этого микроэлемента.
Съедобные грибы являются очень благоприятным объектом для этого в связи с их
способностью аккумулировать селен. В последние годы появилось достаточно большое
число исследований, посвященных изучению химического состава грибов, выращенных на
средах с неорганическими соединениями селена - селенатами и селенитами. Установлено,
18
что селен содержится в грибах преимущественно в форме высоко биодоступных и
малотоксичных органических соединений - селенсодержащих аминокислот, как свободных,
так и входящих в состав белков. В то же время метаболические пути органических форм
селена в грибах остаются практически не исследованными. В ходе нашей работы мы впервые
изучили метаболизм селенорганического соединения ДАФС-25 у базидиомицетов на примере
L. edades.
Методом газожидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием на
полярной колонке исследовали состав КЖ глубинного выращивания шиитаке и их гексановых
экстрактов. В образцах с добавлением органического селена был обнаружен ацетофенон,
происхождение которого может быть связано только с деструкцией ДАФС-25.
Другим продуктом разложения селенорганического препарата может быть элементный
селен. Как было указано выше, для мицелия, росшего на средах с 0,1-1 мМ ДАФС-25,
оказалось характерно красное окрашивания мицелия, что является признаком накопления
Se". Первоначальное детектирование элементного селена в культуральной жидкости и
клетках гриба проводили с помощью качественной специфической реакции с метиленовым
голубым, позволяющей определять неорганические соединения селена. Дальнейшее
исследование соединений, синтезируемых грибом при его культивировании в присутствии
ДАФС-25, а также взятых для сравнения селенита и селената натрия, осуществляли методом
рентгеновской флуоресценции. Результаты анализа показали наличие селена во всех
образцах, при этом его количество различалось для разных селенсодержащих соединений и
зависело от концентрации селена в исходной среде. Максимальное содержание селена в
мицелии выявлено на среде с ДАФС-25, тогда как мицелий, выращенный с 10'^ М селената
натрия, не приобрел красного окрашивания и содержал селен лишь в следовых количествах.
Для подтверждения того, что селен содержится в мицелии именно в элементном
состоянии (нулевой степени окисления) провели рентгенофазовый анализ гиф L. edades F249, выращенных с соединениями селена. При выращивании гриба в присутствии 1 мМ
препарата в мицелии выявлена фаза, изоструктурная ДАФС-25, В этом же образце был
выявлен элементный селен.
Согласно
литературным данным, основным
селенсодержащим
компонентом
выращенного на среде с солями селена L. edades является аминокислота селенометионин
[Одга et al., 2004], Мы исследовали культуральные жидкости и экстракты из мицелия L
edades, выращенного при добавлении 0,1 мкМ, 0,1 мМ и 1 мМ ДАФС-25 к среде, методом ТСХ
с использованием в качестве стандартов коммерческих препаратов селенометионина,
селеноцистеина и селенометилцистина. Ни одной из этих аминокислот не удалось
обнаружить указанным методом ни в мицелиальных экстрактах, ни в КЖ, Это позволяет
заключить, что основным продуктом деструкции ДАФС-25 культурой L. edades F-249 является
элементный селен. Поскольку накопление элементного селена в мицелии коррелирует с
повышением уровня ДАФС-25 в среде, можно предположить, что разложение ДАФС-25 с
образованием Se" служит у L. edades для снижения токсического действия высоких
концентраций соединения, что характерно для многих микроорганизмов.
Электронная микроскопия образцов
окрашенного мицелия показала наличие
наноразмерных частиц
элементного
селена, диаметр которых колебался в
пределах 140-320 нм (рис. 14).
У синтезированных химическим
путем наночастиц селена обнаружены
противоопухолевые и антиоксидантные
свойства.
Это делает
их
очень
перспективным объектом для изучения,
и в последние годы все большее
внимание уделяется исследованиям.
Рис. 14. Гифы L edades F-249 (увеличение
посвященным
биотехнологическому
Х4000): а - при культивировании на среде
с 0,3 мМ ДАФС-25, б - контроль
получению таких частиц при помощи
микроорганизмов. Биосинтез селеновых
19
наночастиц при помощи культуры съедобного высшего фиба приобретает особую
актуальность в связи с простотой, доступностью и экологической безопасностью этого
метода.
Во всех известных нам работах для получения наночастиц селена при помощи
микроорганизмов используют неорганические соединения Se. Мы сравнили появление
окрашивания при культивировании шиитаке на средах с 0,3 мМ ДАФС-25, селенита и
селената натрия. Красное окрашивание наблюдалось на средах с добавлением ДАФС-25 и
селенита натрия, однако сроки его появления сильно различалась. На среде, содержащей 0,3
мМ ДАФС-25, мицелий становился красноватым уже через 3 ч, а через 1 сут был полностью
окрашен. В то же время на среде с NazSeOs культура начинала приобретать красноватое
окрашивание лишь после 7 сут роста, а интенсивного оранжево-красного цвета мицелий стал
к 10 сут выращивания. 0,3 мМ Na2Se04 не вызывали изменения цвета мицелия. Таким
образом, применение ДАФС-25 для получения наночастиц селена обладает существенным
преимуществом по сравнению с использованием селенита натрия, поскольку позволяет
значительно сократить время образования наночастиц.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Культивируемый гриб-ксилотроф, сочетающий высокую практическую значимость и явно
недостаточно изученные физиолого-биохимические особенности, базидиомицет Lentinus
edodes (шиитаке), представляет особый интерес в качестве объекта исследований в ряду
микокультур. Почвенным азотфиксирующим бактериям рода AzospiriUum уделяется
пристальное внимание как микроорганизмам, потенциально способным активно влиять на
рост и развитие сельскохозяйственных культур. Свойство, позволяющее рассматривать
бактерии рода AzospiriUum как стимуляторы роста растений, связано в том числе со
способностью этих микроорганизмов образовывать вещества фитогормональной природы.
Борьба с посторонней микрофлорой у шиитаке протекает значительно успешнее в
двойной культуре с азоспириллами по сравнению с монокультурой гриба, как это показано
впервые в настоящей работе. При этом не наблюдается повышения уровня индолилуксусной
кислоты в смешанной культуре и, казалось бы, следует предположить, что фитогормон не
участвует в мобилизации защитных сил высшего гриба против патогенов. Однако в
сосуществовании феноменов подавления контаминирующей микрофлоры и отсутствия
заметных изменений уровня ИУК в системе шиитаке-азоспирилла нет противоречия. Для
растений, например, ситуация складывается следующим образом [Яруллина, 2006]. При
грибном патогенезе фитопатогены индуцируют повышение содержания ИУК, что, в свою
очередь, приводит к снижению интенсивности окисления фенолов и подавлению защитного
ответа растения. Возможным механизмом, объясняющим это явление, служит способность
фитогормона ингибировать активность некоторых защитных окислительных ферментов. Это
ингибирование сыграло бы отрицательную для L edodes роль в борьбе с посторонней
микрофлорой, и не наблюдается в смешанной культуре L. edodes - AzospiriUum, где биомасса
мицелия в то же время накапливается значительно быстрее. Вышесказанное послужило
предпосылкой использования двойной культуры съедобных грибов с этими бактериями в
качестве посевного материала с высокими защитными свойствами благодаря увеличенной
скорости освоения мицелием плотного питательного субстрата (в нашей лаборатории
получен патент РФ [Никитина, 2005]).
Изучение процессов фитогормональной регуляции у высших грибов - фундаментальная
проблема миколоти, разработка которой находится на самой начальной стадии, в то же
время имеет важный биотехнологический аспект. Свойства соединений фитогормональной
природы, характеризующиеся высокой степенью изученности у высших растений и
интенсивно исследуемые у почвенных ассоциативных микроорганизмов, лишь в
несистематическом порядке и на явно недостаточном уровне описаны у макробазидиальных
грибов. Ростостимулирующие и защитные функции синтезируемых грибами веществ
фитогормональной природы находятся на начальных этапах исследования.
Изменения баланса фитогормонов относят к числу общих (неспецифических) реакций,
включенных в процесс формирования устойчивости растительных организмов к
20
неблагоприятным абиотическим факторам [Тарчевский, 2001; Шакирова, 2001; Чиркова,
2002J. При этом фитогормоны, являясь важными компонентами регуляторной системы, могут
играть ключевую роль не только в ростовых и морфогенетических процессах, но и в
адаптивных реакциях, связанных с воздействием неблагоприятных факторов [Таланова, 2009
и ссылки там же]. Фитогормоны, наряду с генетической системой, играют ключевую роль в
защитно-приспособительных реакциях растений на действие неблагоприятных факторов
абиотической природы.
Литературные данные по этой проблеме касаются прежде всего стрессовых гормонов,
абсцизовой кислоты (АБК) и этилена, способных действовать как регуляторы, определяя
ответ растительных клеток на неблагоприятные воздействия. Недостаточно внимания
уделяется участию фитогормонов фуппы ауксинов, предшественников и производных ИУК, в
жизнедеятельности высших культивируемых грибов, в том числе в период действия
неблагоприятных факторов.
Казалось бы, усиление биосинтеза ИУК, сопровождаемое снижением интенсивности
окисления фенолов, должно отрицательно сказываться и на формировании защитной
морфологической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки, пигментированной
как раз продуктами окислительной полимеризации фенольных соединений. Каков тогда
биологический смысл продукции ИУК после завершения стадии активного роста мицелия L.
edodes? На основании обнаруженных в нашей лаборатории физико-химических свойств и
реакционной способности внеклеточных лектинов шиитаке, выявленных аспектах их
физиолого-биохимической роли, участия в морфогенетическом развитии становится
очевидной способность лектина L2 легко связывать органические соединения с
образованием достаточно устойчивых комплексов, и в то же время это связывание обратимо.
Одним из таких органических соединений является ИУК, взаимодействующая с очищенными
препаратами лектинов с результирующим повышением активности лектинов почти на 2
порядка [Цивилева, 2008]. Формирование коричневой мицелиальной пленки сопровождается
увеличением лекгиновой активности, этому способствует ИУК, которая к тому же в связанной
с внеклеточными лектинами L. edodes форме в гораздо меньшей степени способна к
ингибированию ферментов, ответственными за окисление фенольных субстратов.
Основные известные пути биосинтеза ИУК связаны с триптофаном. Путь, независимый
от триптофана, встречается у растений, а среди бактерий обнаружен у азоспирилл и
цианобактерий. К настоящему времени превалирует мнение, что вклад трипофаннезависимого пути в биосинтез ИУК незначителен, сам механизм этого пути биосинтеза
ауксинов не изучен. И все-таки мнения исследователей разделились. Так, хотя
предшествующие работы доказывают существование индолацетамидного пути у Azospirillum
brasilense [Prinsen et al., 1993], приводят биохимические и генетические обоснования
использования азоспириллами также пути через ИПВК [Ваг and Окоп, 1995; Costacurta et al.,
1994], и в то же время делают предположения о том, что 90% ИУК у Azospirillum
биосинтезируется по триптофан-независимому пути [Prinsen et ai, 1993]. Пути биосинтеза
ИУК у макробазидиомицетов вообще рассматривались в лучшем случае только на уровне
положительного/отрицательного влияния добавок триптофана к среде выращивания.
Поэтому выявленная и количественно охарактеризованная в настоящей работе продукция
целого спектра индольных соединений культурой гриба шиитаке, - как предшественников
ИУК, так и продуктов их окисления - представляется важным шагом в плане изучения
гормональной регуляции у представителей царства грибов.
Известно, что ИУК является участником разнообразных взаимодействий экологического
характера: межвидовых, внутривидовых и обусловленных хозяйственной деятельностью
человека. Однако при этом не изучена биологическая активность ИУК в низких
концентрациях, окончательно не определен молекулярный механизм фитогормонального
действия ИУК, нет объяснения двухфазности воздействия гетероауксина. Известно, что
физиологическая активность ауксинов в растениях проявляется при очень низких
концентрациях - растяжение растительных клеток происходит под воздействием 0,1 нмоль/л
ИУК. Для исследования действия индолил-З-уксусной кислоты на фибную культуру мы взяли
ИУК в широком интервале концентраций (10"' - 10 ° г/л). М, (ИУК) = 174, поэтому самые
низкие изученные концентрации были примерно на порядок ниже наномолярных и
21
соответствовали вьшеуказанным литературным данным по физиологически активным
концентрационным величинам. В результате в обнаруженных нами разнонаправленных
эффектах экзогенной ИУК получило дополнительную иллюстрацию вышеописанное действие
малых доз фитогормона. Действительно, так же, как и в работе [Рогачева, 2008], своего рода
точкой смены «знака» биологического действия ИУК стала концентрация 5.7-Ю"^ моль/л
(1,0 Ю"^ г/л). Кроме того, при использовании ИУК в концентрации порядка 10" моль/л
(1,75-10'^ г/л), способствующей, по данным вышеуказанной работы, более эффективному
взаимодействию ауксина с мембраной или рецептором, мы наблюдали абсолютные
максимумы в соответствующей серии экспериментов (продукция ИУК и антранилата).
Имеющиеся в литературе единичные сведения о пути биотрансформации грибами
неорганических солей, в которых селен входит в состав аниона, с выделением элементного
Se, привели нас к изучению эффекта селенорганического вещества ДАФС-25 а культуре
шиитаке. Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что
селенсодержащий препарат ДАФС-25 оказывает заметное действие на процессы
жизнедеятельности L edodes, выраженное в изменении ростовых параметров культуры как
на жидких, так и на агаризованных средах. Селеновая добавка в наибольшей степени
стимулирует рост шиитаке на синтетической агаризованной среде, характеризующейся
низкими значениями ростовых показателей в отсутствие ДАФС-25. >При начальных
концентрациях диацетофенонилселенида в питательной жидкой среде не ниже 10" - 10
моль/л наблюдается появление красной пипиентации мицелия, интенсивность и период
возникновения которой зависят от концентрации ДАФС-25. Впервые мы сделали вывод о
способности глубинной культуры L edodes к деструкции ксенобиотика селенорганической
природы с образованием элементного селена красной модификации. В ходе дальнейших
исследований
предстоит
количественная
физико-химическая
характеристика
мультикомпонентной системы, создаваемой в процессе метаболизма соединения ДАФС-25
культурой фиба.
ВЫВОДЫ
1. Впервые показано, что совместное культивирование базидиомицета Lentinus edodes
бактериями Azospirillum brasilense приводит к стимуляции мицелиапьного роста, снижению
биотического влияния на шиитаке посторонней микрофлоры, усиленному накоплению в
мицелии маннита как биохимического предшественника плодоношения.
2. Впервые обнаружена и количественно охарактеризована способность
L edodes к
биосинтезу фитогормона ИУК и промежуточных соединений этого синтеза, а также влияние
шести индольных соединений при экзогенном введении в среду на рост, развитие и уровень
их продукции культурой. Получены экспериментальные доказательства сосуществования двух
альтернативных путей биосинтеза ИУК у L. edodes: триптофан-зависимого (в основном через
триптамин) и триптофан-независимого, реализуемого в присутствии экзогенного индола в
интервале конценфаций 1-10"^ - МО"* г/л, а также при индуцировании биосинтеза ИУК ее
экзогенными микродобавками.
^
3. Установлено положительное влияние экзогенной ИУК в интервале концентраций 1-10"^
- I-IO"* г/л на накопление биомассы L. edodes при минимальной ингибирующей рост
концентрации фитогормона около 5-10'* г/л. Обнаружено, что среди изученных соединений предшественников ИУК только индолил-З-ацетамид в концентрации порядка 10^ г/л в
культуральной жидкости L. edodes оказывает ярко выраженное стимулирующее влияние на
формирование морфологической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки.
4. Впервые изучено влияние селенорганического ксенобиотика ДАФС-25 на рост и
развитие шиитаке при различных условиях культивирования. На средах с начальными
концентрациями ДАФС-25 1-10"^ - 1-10"^ моль/л наблюдали выделение свободного селена и
ацетофенона, а в интервале концентраций 1-10"'^ - l -IO"® моль/л - стимуляцию роста мицелия,
зависящую от среды выращивания.
22
РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых изданиях
1. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А Н., Древко Б.И., Лощинина Е.А., Гарибова
Л.В. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и пектиновую активность
Lentinus edades // Биотехнология. - 2005. - № 2. - С. 56-62.
2. Лощинина Е.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Пономарева Е.Г.,
Шелудько A.B. Морфолого-культуральные характеристики базидиомицета Lentinus edades
при совместном культивировании с баетериями рода Azospiríllum ¡I Вестник СГАУ. 2006. - №
6, вып. 2. - С. 24-26.
3. Степанова Л.В., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В.,
Тюрюкина Е.В. Гемап-лютинирующая активность некоторых базидиальных ксилотрофов на
стадии дикариотического мицелия И Микол. и фитопатол. - 2006. - Т. 40, вып. 4. - С. 307-313.
4. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Никитина В.Е. Фитогормон ß-индолил-З-уксусная
кислота в искусственной культуре базидиомицетов // Вестник КазНУ. Серия биологическая. 2010. - № 3 (45). - С. 218-220.
5. Цивилева О.М., Учаева И.М., Андреев К.В., Лощинина Е.А., Панкратов А.Н.,
Дербенева В.В., Никитина В.Е. Биосинтез компонентов микробного фактора автолиза клеток в
присутствии триптофана при глубинном культивировании базидиомиицета Lentinus edades Н
Иммунопатология, аллергол., инфектол. - 2010. - Вып. 1. - С. 270-271.
6. Панкратов А.Н., Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Макаров O.E., Юрасов H.A., Никитина
В.Е. Выявление участия индола в ростовых и метаболических процессах мицелиального
фиба // Известия Саратовского университета. Новая серия. - 2011. - Т. 11. - Серия: Химия.
Биология. Экология. Вып. 2.
Статьи в сборниках научных трудов
1. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Древко Б.И. Влияние
селенсодержащего препарата ДАФС-25 на морфолого-культуральные характеристики
съедобного фиба шиитаке // «Вавиловские чтения - 2004»: Материалы Всероссийской
научно-практической конф., поев. 117-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова.
Саратов, 24-26 ноября 2004. Секция физиологии и защиты растений. - Саратов: Изд-во
СГАУ, 2004.-С. 36-39.
2. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Лощинина Е.А. Поиск
фуппоспецифичных пектинов фибного происхождения // Успехи медицинской микологии. Том
V / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. - М.: Национальная академия
микологии, 2005. - С. 201-205.
3. Никитина В.е., Цивилева О.М., Ветчинкина Е.П., Лощинина Е.А., Матора Л.Ю.,
Бурыгин ГЛ. Анализ белковых спектров и пектинов базидиомицета Lentinus edades И
Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии;
Материалы Межд. науч. конф., 1-2 июня 2006 г. Минск-Раков. -Мн.: ОДО «НоваПринт», 2006.
- С. 32-34.
4. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А. Взаимоотношения ксилотрофных
базидиомицетов и почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospiríllum // Успехи
медицинской микологии. Том VII / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2006. - С. 293-294.
5. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров O.E., Бабицкая В.Г., Щерба
В.В., Пучкова Т.А. Биохимические особенности развития мицелия Lentunus edades в
совместной культуре с диазотрофными бактериями Azospiríllum brasilense // Успехи
медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. - С. 9-12.
6. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Никитина В.Е.., Панкратов А.Н. Жирные кислоты
мицелия на разных стадиях морфогенетического развития Lentinus edades // Современные
проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. - Саратов:
Изд-во «Научная книга», 2007. - С. 116-118.
23
7. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E. Экспериментальные
предпосылки отнесения пути биосинтеза фитогормона ИУК базидиомицетом Lentinus edodes
к триптофанзависимому типу // «Вавиловские чтения - 2007»: Материалы межд. научнопракт. конф., поев. 120-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова. Саратов, 27-30 ноября
2007. Т. 1. - Саратов: Изд-во СГАУ, 2007. - С. 37-38.
8. Лощинина Е.А., Цивилева О.М, Никитина В.Е. Физиолого-биохимические процессы в
двойной культуре ксилотрофа Lentinus edodes с почвенными бактериями AzospiriUum
brasilense И Проблемы биозкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения):
материалы Междунар. науч. конф., Саранск, 15-18 мая 2008 г. / редкол.: A.C. Лукаткин (отв.
ред.) [и др.]. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2008. - С. 398-399.
9. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E. Выявление соединенийпредшественников при триптофанзависимом биосинтезе индолилуксусной кислоты грибом
Lentinus edodes (шииитаке) // «Вавиловские чтения - 2008»: Материалы межд. научно-пракг.
конф. Саратов, 26-27 ноября 2008. Ч. 1. - Саратов: ИЦ «Наука», 2008. - С. 30-32.
10. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E. Влияние соединений
индольной
природы
на биосинтез
индолил-З-уксусной
кислоты
ксилотрофным
базидиомицетом Lentinus edodes // Вавиловские чтения - 2009: Материалы Межд. науч.практ. конф. Саратов, 25-26 ноября 2009. Ч. 1. - Саратов: ООО Издательство «КУБиК», 2009.
- С . 47-49.
11. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров O.E., Щерба В.В., Пучкова Т А , Никитина
B.Е. Биосинтез биологически активных производных индола ксилотрофным базидиомицетом
// Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии:
Материалы VII Межд. конф. (Минск, 31 мая - 4 июня 2010 г.). - Минск: «Беларуская навука»,
2010.-С. 174-176.
12. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров O.E., Юрасов H.A., Панкратов А.Н., Штыков
C.Н., Никитина В.Е. Индуцированная окислительным стрессом продукция производных 5гидрокси-индолил-3- и фенольных соединений в культуре высшего фиба II Материалы VIII
Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 4-6 октября 2010. - М.: РУДН,
2010.-С. 503-505.
13. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров O.E., Никитина В.Е. Эффект низких
концентраций синтетического аналога ауксина в развитии мицелия ценного высшего
культивируемого гриба // Физиолого-биохимические основы продукционного процесса у
культивируемых
растений: Материалы докладов
Всероссийского
симпозиума с
меадународным участием. - Саратов: Издательство «Саратовский источник» (ФГУН
«Российская книжная палата» г. Москва), 2010. - С. 98-100.
14. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Ветчинкина Е.П., Никитина В.Е. Влияние
селенсодержащего соединения ДАФС-25 на рост ксилотрофного базидиомицета Lentinus
edodes и накопление элементарного селена грибной культурой II Вавиловские чтения - 2010:
Материалы Меход- науч.-практ. конф. в 3 томах - Саратов: Изд-во «КУБиК», 2010. - Т. 1. - С.
225.
Материалы конференций
1. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Древко Б.И., Лощинина Е.А.
Лектиновая активность и ростовые характеристики Lentinus edodes в присутствии
селенсодержащего препарата ДАФС-25 И Материалы Второго съезда Общества
биотехнологов России: Москва, 13-15 октября 2004 г. / Под ред. Р.Г. Василова - М.: МАКС
Пресс, 2004. - С. 73-74.
2. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Лощинина Е.А.. Влияние некоторых
низкомолекулярных соединений на пектиновую активность и морфогенез базидиомицета
Lentinus edodes И Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений:
фундаментальные и прикладные аспекты: Материалы Всероссийской конференции. Саратов,
15-17 июня 2005 г. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. - С. 38.
3. Лощинина Е.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Пономарева Е.Г.
Совместное культивирование гриба Lentinus edodes и бактерий рода AzospiriUum И Биология -
24
наука XXI века: 10-я Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 17-21 апреля
2006 года). Сборник тезисов. - Пущино: Изд-во Пущинского научного центра РАИ, 2006. - С.
199.
4. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е. Рост базидиомицета Lentinus edodes в
присутствии индолилуксусной
кислоты различного
происхождения
И Стратегия
взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы 111
межрегиональной конфер. мол. ученых. Саратов, 10-12 октября 2006 г. - Саратов: Научная
книга, 2006. - С. 52.
5. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А. Влияние бактерий рода Azospirillum на
рост и развитие съедобных грибов Lentinus edodes И Микробные технологии: Материалы
Межд. науч. конф., поев. 140-летию со дня рожд. Д.К. Заболотного, 11-15 сент 2006 г. Одесса, .
Украина. - Одесса: Астропринт, 2006. ~ С 87.
6. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E., Лощинина Е.А., Степанова Л.В.
Изменение углеводного и жирнокислотного состава мицелия Lentinus edodes при совместном
культивировании с ризосферными бактериями П Физиология микроорганизмов в природных и
экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева); Материалы международной
научной конференции, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19
мая 2006 г. - М.: МАКС Пресс, 2006. - С. 42.
7. Серяпин В.О., Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Учаева И.М., Макаров O.E., Панкратов
А.Н., Никитина В.Е. Ингибирование продукции внеклеточного триптофана в присутствии
метилфосфоновой кислоты в культуре базидиомицета Lentinus edodes // БИОЛОГИЯ - НАУКА
XXI ВЕКА: 14-я Пущинская межд. школа-конф. мол. ученых (Пущино, 19-23 апреля 2010 года).
Сборник тезисов. Том 2. - Пущино, 2010. - С. 259.
8. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Бурашникова М.М., Панкратов А.Н., Казариное И.А.,
Древко Б.И., Никитина В.Е. Трансформация органической формы селена в культуре
базидиомицета Lentinula edodes II Биологически активные вещества микроорганизмов:
прошлое, настоящее, будущее: Всероссийский симпозиум с международным участием.
Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова. Биологический факультет. 27-29 января 2011 г.:
Материалы / Отв.ред. Нетрусов А.И., Колотилова H.H. - М.: МАКС Пресс, 2011. - С. 127.
Список сокращений, использованных в автореферате:
5-гидрокси-ИУК - 5-гидрокси-индолил-З-уксусная кислота, ВЭЖХ - высокоэффективная
жидкостная хроматография, ГЖХ - газожидкостная хроматография, ГХ-МС - газожидкостная
хроматография с масс-селективным детектированием, ДАФС-25 1,5-дифенил-Зселенпентандион-1,5, ИААльд - индолил-З-ацетальдегид, ИААм - индолил-З-ацетамид,
ИПВК - индолил-З-пировиноградная кислота, ИУК - ß-индолил-З-уксусная кислота, КЖ культуральная жидкость, КМП - коричневая мицелиальная пленка, ТАм - триптамин, ТСХ тонкослойная хроматография, ЗеМе1-селенометионин, Тгр - триптофан.
Благодарности:
Диссертант выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории структурных
методов исследования ИБФРМ РАН (зав. лабораторией на период выполнения работы к.х.н. Е.Е Федоров), лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (зав. лабораторией - д.б.н. В.В.
Игнатов), лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН (зав. лабораторией - д.б.н. В.Е.
Никитина), Института химии Саратовского государственного Университета им. Н,Г.
Чернышевского.
Подписано к печати 21.10.2011 г. Тираж 100 экз.
Отпечатано в типофафии ООО «Техно-Декор»
410012, г. Саратов, ул. Московская 160