на правах рукописи УДК 577.322.5 Лесовой Дмитрий Михайлович
реклама
на правах рукописи УДК 577.322.5 Лесовой Дмитрий Михайлович ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТОКСИНОВ ЯДА КОБРЫ Naja oxiana С МЕМБРАНАМИ МЕТОДОМ ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ 03.00.02 –Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2006 Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ). Научный руководитель: Доктор химических наук, заведующий лаборатории структурной биологии ИБХ РАН Арсеньев Александр Сергеевич Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор МГУ Шайтан Константин Вольдемарович доктор химических наук, профессор МИТХТ Каплун Александр Петрович ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Ведущая организация: Защита состоится “ 20 ” декабря 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408-57-00, 408-56-27. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета). Автореферат разослан “ 18 ” ноября 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156.03 Брагин В.Е. к.ф.-м.н., доцент 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследований Мембраны играют ключевую роль в структурной организации всех живых клеток. Функционирование биомембран контролируется как их белковыми, так и липидными составляющими. Получение информации о структуре белков, а так же липид/белковых взаимодействиях лежат в основе понимания функций мембран. Среди мембранных белков хорошо известны такие структурные мотивы как трансмембранные α-спирали, β-бочонки. В последнее время исследуются периферические β-складчатые полипептиды, в частности, токсины из яда змей. Яд кобры Naja oxiana содержит цитотоксины и нейротоксины, обладающие общим структурным мотивом (Рис. 1). В данной работе были изучены цитотоксины I и II (CTI и CTII) и нейротоксин II (NTII). Суммарное содержание этих токсинов в сухом яде составляет около 40 %. Эти токсины являются небольшими ( ~ 60 аминокислотных остатков) основными белками, так как они содержат 9–12 положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина. Они характеризуются трёхпетельной укладкой полипептидной цепи, формируемой тяжами антипараллельной β-структуры, стабилизированной 4-мя дисульфидными связями (Рис. 1). Хотя аминокислотные последовательности и структурный мотив цитотоксинов и нейротоксинов гомологичны, спектры их биологической активности существенно отличаются. Цитотоксины проявляют гемолитическую и цитотоксическую активности, способны приводить к деполяризации мембран миофибрилл. Некоторые цитотоксины проявляют кардиотоксическую активность при малых концентрациях, приводя к увеличению частоты сердцебиения, а при больших концентрациях могут вызывать остановку сердца. Исследуются токсические эффекты цитотоксинов на клетки опухоли. Предполагается, что различие в цитотоксической активности молекул связано не с деталями вторичной структуры белков, а со спецификой взаимодействия боковых цепей аминокислотных остатков с липидами, так как было показано, что структура молекул цитотоксинов сохраняется при встраивании в липидное окружение. Связывание цитотоксинов с фосфолипидами определяет их способность приводить к лизису различных клеток. Предполагается, что эти эффекты обусловлены способностью цитотоксинов взаимодействовать с липидами и биологическими мембранами посредством комбинации как электростатических, так и гидрофобных сил. В экспериментах с модельными липидными мембранами показано, что цитотоксины приводят к слиянию фосфолипидных везикул, изменению термотропных характеристик фосфолипидных мембран, индуцируют фазовое разделение в смесях анионных и цвиттерионных фосфолипидов. Данные исследования привели к делению цитотоксинов на P- и S- типы, которые различаются присутствием пролина-31 (30) или серина-29 (28) в окончании второй петли. Тем не менее всё ещё отсутствует понимание связи между способами взаимодействия цитотоксинов с липидами и функцией цитотоксинов в биомембране. Для прояснения этой связи было изучено связывание цитотоксинов CTII и CTI с фосфолипидами, исследовано влияние цитотоксинов на упаковку фосфолипидов в составе модельных мембран. Нейротоксины из яда кобр являются высокоэффективными ингибиторами никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР). Мембранная же активность нейротоксинов, в отличие от цитотоксинов, изучена крайне слабо, хотя предполагается, что и для нейротоксинов мембраносвязанное состояние играет важную роль при взаимодействии с никотиновым ацетилхолиновым рецептором (нАХР). Поэтому представляет интерес детально исследовать взаимодействие нейротоксинов с мембранами, таким образом, получить информацию о мембраноактивном сайте молекулы токсина и его кооперативности с сайтом, блокирующем нАХР. 3 Рис. 1 Ленточные представления структуры CTII (а), CTI (б) и NTII (в) молекул токсинов. Жёлтым цветом показаны дисульфидные связи (структуры взяты из PDB-банка: код 1CB9 для CTII, 1RL5 для CTI и 1NOR для NTII). При исследовании липид/белковых взаимодействий важно получить структурнодинамическую информацию как о белке в связанном с мембраной состоянии, так и о характеристиках самой липидной мембраны особенно их изменениях вследствие взаимодействия с белком. В ЯМР спектроскопии в качестве модельных мембран используются липидные бислои, так как, обладая большим радиусом кривизны, они наиболее близки по своим характеристикам к биомембранам. При исследовании бислойных модельных мембран всё более широкое применение находит методика анализа 31 Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий. С ростом стационарных магнитных полей современных ЯМР спектрометров всё большее значение приобретают эффекты ориентирования молекул фосфолипидов в магнитном поле спектрометра. Для анализа 31Р-ЯМР спектров таких систем необходима разработка эффективных и доступных научному сообществу методов анализа экспериментальных спектров. В диссертации представлены разработанные методики анализа 31Р-ЯМР спектров фосфолипидных липосом реализованные в виде программы «P-FIT». При ЯМР исследованиях белков, связанных с бислойной мембраной, по причине большого размера бислойных мембранных систем и, как следствие, замедления вращательной диффузии белка классические ЯМР методики высокого разрешения неприменимы из-за сильного уширения сигналов в спектре белка. Поэтому представляет интерес разработка подходов, позволяющих преодолеть данные ограничения и охарактеризовать состояние белка в связанном с бислойной мембраной состоянии. В диссертации описана предложенная в работе методика применения ЯМР спектроскопии высокого разрешения для характеристики связанного с липидным бислоем состояния белка. Цель и задачи исследования Целью данной работы является определение характера изменений в липидной бислойной мембране вследствие взаимодействия с цитотоксинами (CTI и CTII) и нейротоксином (NTII), а так же определение роли мембраносвязанного состояния нейротоксина II на этапе взаимодействия с никотиновым ацетилхолиновым рецептором. Методы исследования В диссертационной работе использованы взаимодополняющие методики спектроскопии ЯМР, позволяющие охарактеризовать как индуцированные белком 4 изменения в липидной мембране, так и расположение белков при связывании с липидным бислоем. Методика 31Р-ЯМР спектроскопии широких линий использована для определения изменений в состоянии фосфолипидов вследствие взаимодействия с молекулами исследуемых токсинов. Расположение молекулы нейротоксина II при связывании с бислойной фосфолипидной мембраной определено с использованием гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Теоретические методики молекулярного моделирования использованы для детализации модели связывания белков с бислойной фосфолипидной мембраной. Научная новизна работы Полученные экспериментальные данные позволяют охарактеризовать различия встраивания токсинов CTI, CTII и NTII в бислойные фосфолипидные мембраны, роль поверхностной плотности заряда бислоя. Методами 1H- и 31Р- ЯМР определены области взаимодействия молекул цитотоксинов с бислойной анионной мембраной. Полученные экспериментальные данные согласуются с теоретическими данными по взаимодействию рассматриваемых токсинов с мембраной. При изучении связывания цитотоксинов с мембранами дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG) показано, что, встраиваясь в мембрану, они влияют как на ориентацию «головок» фосфолипидов, так и могут приводить к изменению её упругих характеристик. При соотношениях белок/липид выше некоторой пороговой величины происходит разрушение бислойной упаковки липидов в мембране с образованием изотропной фазы. Исследованы факторы, определяющие стехиометрию изотропной фазы и условия её формирования. Таким образом, удалось проанализировать механизм взаимодействия цитотоксинов с их мишенью – липидным бислоем. Исследовано влияние свойств липидной мембраны на связывание NTII с бислоем. Методами 1H-, 31Р- и гетероядерной ЯМР спектроскопии изучено взаимодействие NTII с липидными мембранами, моделирующими нативное окружение нАХР, состава диолеилфосфатидилхолин(DOPC)/диолеилфосфатидилсерин(DOPS)/холестерол(Chol)=3:1 :1 и DOPS. При связывании NTII с бислоем, как и в случае цитотоксинов, нейротоксин влияет на характер упаковки липидов, однако не приводит к разрушению бислоя. Были получены и проанализированы кривые связывания NTII с липидной мембраной, исследован характер встраивания молекул NTII в бислой. Эти данные характеризуют изменения в упаковке молекул фосфолипидов вследствие связывания с NTII. Методами гетероядерной ЯМР спектроскопии высокого разрешения с использованием 15N меченного NTII определён сайт связывания молекулы NTII с липидным бислоем. ЯМР данные по расположению сайта связывания NTII с бислойной липидной мембраной дополнены теоретическими результатами молекулярного моделирования. Полученные данные позволяют предложить «механизм мембранного катализа» при поиске лигандом (NTII) мембранного рецептора (нАХР): 1) повышение концентрации положительно заряженного NTII у анионной мембраны согласно теории Гуи-Чапмена; 2) формирование «нужной» для связывания с нАХР ориентации NTII на мембране; 3) поиск ацетилхолинового рецептора посредством латеральной диффузии в мембраносвязанном состоянии. Научная и практическая ценность Научная значимость работы определяется новизной и важностью перечисленных выше результатов. Основные направления их практического использования таковы: • полученные модели взаимодействия трёхпетельных токсинов с бислойными липидными мембранами, а так же роль этого взаимодействия в функционировании токсинов помогают понять молекулярные механизмы взаимодействия нейротоксина с нАХР, влияния цитотоксинов на предотвращение формирования тромбов в кровеносных 5 сосудах (предотвращение сердечного приступа и инсульта), а также токсических эффектов яда кобр на различные клетки, в частности, клетки опухоли; • разработанные в диссертации методы анализа 31Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий могут применяться для обработки экспериментальных спектров бислойных липосом с частичной ориентацией фосфолипидов в магнитном поле спектрометра, также позволяя получать дополнительную информацию об упругих характеристиках липидного бислоя; • использованные в работе подходы по применению гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения могут быть использованы для построения модели связывания белков с биологическими мембранами, преодолевая ограничение метода ЯМР высокого разрешения на использование протяженных бислойных липосом Апробация работы Основные материалы, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на семинарах в «Институте биоорганической химии» им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, представлены на международных конференциях: VIII Международный Семинар по Магнитному Резонансу (Ростов-на-Дону, Россия, 2006), Международном Симпозиуме и Летней Школе «Ядерный Магнитный Резонанс в Конденсированной Материи» (Санкт-Петербург, Россия, 2005 г. и 2006 г.), Зимней Международной Молодёжной научной школе “Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии” (Москва, Россия, 2003 г. и 2005 г.). Полученные результаты докладывались также на XIV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Крым, Украина, 2006). Публикации Основные результаты диссертации изложены в 3 статьях в реферируемых изданиях и 8 тезисах докладов, представленных на российских и международных научных конференциях. Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, трёх глав, включая литературный обзор, результатов и обсуждения, заключения и выводов. Общий объём работы составляет 102 страницы, включая 33 иллюстрации, 2 таблицы и список литературы, содержащий 137 наименований. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение Во введении обоснована необходимость и актуальность исследования механизмов мембранной активности цито- и нейротоксинов из яда Naja oxiana. Кратко изложены имеющиеся на сегодняшний день сведения о функции цитотоксинов и нейротоксинов. Глава 1. Обзор литературы При исследовании взаимодействия токсинов с липидами использованы методики Р-ЯМР спектроскопии широких линий. Существенная часть работы посвящена усовершенствованию методик анализа 31Р-ЯМР спектров фосфолипидов. Поэтому для описания теоретических основ метода, сравнения с другими доступными методиками и программами для анализа 31Р-ЯМР спектров, характеристики области применения созданной программы и интерпретации полученных результатов литературный обзор диссертационной работы посвящён методике 31Р-ЯМР спектроскопии широких линий в исследовании липид/белковых взаимодействий. 31 6 Глава 2. Материалы и методы Во второй главе приведены использованные методики ЯМР и предложенные в работе их модификации, условия работы с исследуемыми веществами, сведения об использованном в работе оборудовании, методах обработки экспериментальных ЯМР данных. В экспериментах были использованы как нативные, выделенные из яда кобры Naja oxiana, цито- и нейротоксины (полученные в лаборатории рецепции нейропептидов института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН д.х.н. Ю. Н. Уткиным) так и их 15N-меченые аналоги и мутантные формы (полученные в лаборатории инженерии белка института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН Я.С. Ермолюком, Е. Н., Люкмановой и А. В. Щукиным). В качестве модельных бислойных липидных мембран были использованы моно- и мультиламеллярные липосомы требуемого липидного состава, для приготовления которых использовались коммерчески доступные липиды (фирма AVANTI) без дополнительной очистки. Гетероядерные ЯМР спектры получены на ЯМР спектрометре Varian Unity 600 с рабочей частотой на протонах 600 МГц. Одномерные 31Р- и 1H- ЯМР спектры получены на спектрометре Bruker DRX500 с рабочей частотой на протонах 500 МГц. 31 Р-ЯМР спектры анализировались с помощью разработанного в диссертации метода, реализованного в виде программы «P-FIT», написанной на языке Mathematica (Wolfram Research). Метод базируется на использовании новой аналитической формулы, учитывающей частичную ориентацию фосфолипидов в магнитном поле, которая позволяет существенно улучшить как точность компьютерного анализа 31Р-ЯМР спектров фосфолипидных липосом, так и получать дополнительную информацию о характере упаковки фосфолипидов. Предложенный в диссертации метод анализа возмущений химических сдвигов NH сигналов белка в 1H-15N HSQC ЯМР спектре при связывании с мембраной основан на получении экспериментальных условий, при которых происходит обмен между мембраносвязанным и свободным состояниями белка. Условия обмена подбирались варьированием концентрации KCl. Анализ 1H-15N HSQC ЯМР спектров проводился с использованием программы VNMR (VARIAN). Методом Монте-Карло исследовалось взаимодействие цитотоксинов с неявно заданной моделью мембраны (программа FANMEM). Методом полноатомной молекулярной динамики исследовалось взаимодействие нейротоксина II с липидным бислоем (программа GROMACS). Расчёты проводились в сотрудничестве с А. Г. Коншиной и Ю. А. Косинским. Глава 3. Результаты Связывание токсинов с мембранами. 1Н-ЯМР спектроскопия Для определения диапазона соотношений липид/токсин, в котором молекулы токсинов полностью связаны с липидным бислоем, были получены 1H-ЯМР спектры водных растворов этих токсинов в температурном диапазоне 30-55оС в присутствии увеличивающегося количества липидных бислойных мембран (мультиламеллярных липосом). Возрастание содержания липидов в образцах приводило к падению интенсивности сигналов вплоть до их полного исчезновения вследствие иммобилизации белка в результате связывания с липидами. 1Н-ЯМР сигналы токсинов исчезают при соотношениях DPPG/CTII=10, DPPG/CTI=4 и DOPS/NTII=6, поэтому в дальнейшей работе использовали соотношения липид/белок, превышающие эти значения для обеспечения условий полного связывания токсинов с липидами. Следует отметить, что наименьшие соотношения липид/белок, при которых проявляются спектральные линии 1Н-ЯМР токсинов, не зависят от фазового состояния липидного бислоя. Предположительно это связано с определяющим характером 7 электростатических сил на этапе связывания положительно заряженных молекул токсинов с анионными фосфолипидами, так как гидрофобные взаимодействия, в отличие от электростатических, существенно зависят от фазового состояния бислоя. Определяющий характер электростатических сил при связывании также подтверждается отсутствием связывания рассмотренных токсинов с цвиттерионными фосфолипидными бислоями фосфатидилхолина (PC). Интересно отметить, что соотношения липид/белок, при которых достигается полное связывание катионных молекул токсинов с отрицательно заряженными фосфолипидами, близко к формальным зарядам этих токсинов при pH 5.5: +9 для CTII и +5 для CTI и NTII. При этом, как показано методами: оптической спектроскопии кругового дихроизма, молекулярного моделирования и ЯМР спектроскопии, стабилизированная четырьмя дисульфидными связями, трёхпетельная укладка полипептидной цепи токсинов сохраняется при взаимодействии с липидной мембраной. Влияние связывания токсинов на состояние мембраны: 31 Р-ЯМР спектроскопия 1 С помощью Н-ЯМР спектроскопии удалось охарактеризовать условия формирования связанного состояния токсинов с бислойной липидной мембраной. Описанные ниже экспериментальные данные нацелены на получение информации об этом состоянии: характеристики индуцированных токсинами как изменений в липидном бислое, так и его разрушении с формированием изотропной фазы. Так как форма линии 31 Р-ЯМР спектра мембран чувствительна к анизотропным движениям молекул фосфолипидов и, следовательно, к полиморфным переходам между такими состояниями, как бислойные упаковки липидов, гексагональная фаза и изотропная фаза. Такие переходы индуцировались рассматриваемыми токсинами при взаимодействии с мультиламеллярными липосомами бислойных мембран DPPG для цитотоксинов и DOPS для нейротоксина (Рис. 2). Рис. 2 Изменения формы линии 31P-ЯМР спектров мультиламеллярных липосом DPPG (а, б) и DOPS (в) вследствие связывания токсинов. Соотношение липид/белок (Л/Б) приведено рядом со спектрами, синим цветом показаны составляющие спектров. 8 В результате аппроксимации экспериментальных спектров теоретическими были количественно определены: процентное содержание изотропного сигнала в спектре (ISO), степень деформации (c/a, где c и a – полуоси эллипсоидальной мультиламеллярной липосомы), и анизотропия химического сдвига (CSA) ядер 31Р молекул фосфолипидов в зависимости от температуры (Рис. 3) и соотношения липид/токсин (Рис. 4). Формирование изотропной фазы Формирование изотропной составляющей спектра происходит вследствие динамического усреднения CSA. Цитотоксины приводят к такому усреднению из-за разрушения бислойной упаковки фосфолипидов с формированием инвертированных комплексов токсин/фосфолипид. На Рис. 3а показаны температурные зависимости содержания изотропного сигнала в 31Р-ЯМР спектрах DPPG в присутствии цитотоксинов. Как видно из Рис. 3, при соотношении липид/белок=14:1 изотропный сигнал практически не наблюдается для CTI при температуре Т<Тф (где Тф~41оС – температура фазового перехода гелевого состояния в жидкокристаллическое для молекул DPPG). При температурах Т>Тф интенсивность изотропной составляющей для CTI примерно в 10 раз меньше чем для CTII. Для CTII, в отличии от CTI, наблюдается S образная зависимость интенсивности изотропного сигнала (Рис. 3а). Процентное содержание изотропного сигнала возрастает на 70 % в узком температурном интервале 38-42оС, включающего Тф. Отсюда следует, что встраивание CTII в мембрану и последующее разрушение бислойной упаковки зависит от фазового состояния бислоя и, следовательно, от наличия «свободного пространства» между головками фосфолипидов. Рис. 3 Температурные зависимости интегральной интенсивности изотропной составляющей 31 Р-ЯМР спектров DPPG в присутствии токсинов CTII и CTI (а) и деформации мультиламеллярных липосом DPPG магнитным полем спектрометра в присутствии и без токсинов CTII и CTI (отношение продольной и поперечной осей эллипсоида вращения c/a) (б). Соотношения DPPG/токсин приведены на графиках. Зависимости интенсивности изотропного сигнала от соотношения липид/белок показаны на Рис. 4а. Значение ISO возрастает практически линейно с уменьшением этого соотношения для CTII при значениях менее 20:1. Аналогичная зависимость наблюдается и для CTI (Рис. 4а). Однако для CTI пороговое значение, при котором начинается рост 9 изотропного сигнала, смещено к меньшим значениям (~15:1). При 50оС изотропная фаза достигает интенсивности 100 % при DPPG/CTII ~10:1 и DPPG/CTI~6:1 (Рис. 4а). Такое различие может быть связано с отличиями в суммарном заряде этих цитотоксинов (+9 и +5 при рН 5.5 соответственно) и, как следствие, отличиями в стехиометрии комплексов DPPG/цитотоксин. Таким образом, изотропная фаза соответствует нейтральным комплексам липид/токсин, стехиометрия которых определяется зарядами молекул токсинов. Вне зависимости от фазового состояния бислойной мембраны и соотношения DOPS/NTII связывание нейротоксина II не приводило к формированию изотропного сигнала в 31Р-ЯМР спектрах DOPS. Следовательно, NTII не нарушает упаковку фосфолипидного бислоя. Влияние токсинов на анизотропию химического сдвига фосфолипидов В гелевом состоянии мембран не наблюдалось влияния связывания рассматриваемых токсинов на анизотропию химического сдвига ядра 31Р головной группы фосфолипидов. В жидкокристаллическом состоянии липидного бислоя наблюдалось изменение CSA лишь в присутствии CTI и NTII. Связывание CTII не приводило к изменению CSA фосфолипидов. Для иллюстрации отличий CTI и CTII приведены зависимости значений CSA от соотношения липид/токсин для мембран в жидкокристаллическом состоянии (Рис. 4б). Видно, что в случае CTI, уменьшение соотношения DPPG/CTI от 100:1 до 10:1 приводит к падению значений CSA на ~7 м. д. В отличии от CTI, значения CSA для всех исследованных соотношений DPPG/CTII как в гелевом так и в жидкокристаллическом состоянии (Рис. 4б) (59 ± 2 и 37 ± 1 м. д. соответственно) совпадают с соответствующими значениями для мембран чистого DPPG. Наблюдение этого эффекта для CTI и его отсутствие для CTII может свидетельствовать, что только CTI но не CTII способен индуцировать изменения в конформации или движениях «головки» фосфолипида. При связывании NTII с бислоями DOPS происходило уменьшение CSA от 49 м.д. до 31 м.д. для 5 % молекул DOPS при соотношении DOPS/NTII=14:1 и 10 % молекул DOPS при соотношении DOPS/NTII=7:1 (Рис. 2в). Стехиометрия влияния NTII на DOPS говорит о том, что одна молекула NTII влияет на анизотропию химического сдвига ~1 молекулы DOPS. Формирование компоненты с изменённой анизотропией химического сдвига свидетельствует о возмущении нейротоксином II конформации или движений «головок» DOPS. Влияние токсинов на эластичность фосфолипидного бислоя Молекулы фосфолипидов обладают диамагнитной анизотропией, что приводит к их ориентированию в магнитном поле спектрометра. Как следствие, форма фосфолипидных липосом в магнитном поле спектрометра претерпевает деформацию из сферической в эллипсоидальную, с направлением продольной оси эллипсоида параллельно магнитному полю. Это приводит к перераспределению интенсивности в 31РЯМР спектрах бислойных мембран между высокопольным и низкопольным плечами спектра. Как видно из Рис. 3б и Рис. 4в цитотоксины влияют на деформацию мультиламеллярных липосом магнитным полем. При возрастании количества цитотоксина, связанного с бислоями DPPG, происходит уменьшение степени деформации мультиламеллярных липосом с/а. Предполагается, что уменьшение степени деформации липосом происходит из-за возрастания модуля упругости бислоёв DPPG за счёт изменений в бислойной упаковке липидов при взаимодействии с молекулами цитотоксинов. Зависимости деформации липосом DPPG при связывании с CTI и CTII от соотношения липид/белок показаны на Рис. 4в. При достижении соотношения DPPG/CTII ≈ 14:1 деформация липосом не наблюдается, то есть липосомы становятся сферическими (с/а~1) (Рис. 4в). Уменьшение соотношения DPPG/цитотоксин приводит к 10 уменьшению значений с/а во всём исследованном температурном диапазоне. Тем не менее даже при значениях DPPG/цитотоксин выше 100:1 кривая не совпадает со значениями с/а для липосом, сформированных из чистого DPPG (Рис. 3б). Значения деформации липосом (с/а) при связывании CTI оказываются большими, в сравнении с CTII, во всём исследованном диапазоне значений DPPG/цитотоксин при Т>Тф (Рис. 4в). Температурные зависимости значений с/а липосом DPPG в присутствии CTI и CTII при выбранном соотношении DPPG/цитотоксин=14:1 показаны на Рис. 3б. Как в гелевом, так и в жидкокристаллическом состоянии мембран CTII предотвращает деформацию мультиламеллярных липосом DPPG в большей степени чем CTI. Связывание NTII с бислоями DOPS в жидкокристаллическом состоянии не приводило к заметному изменению степени деформации липосомы магнитным полем c/a. Следовательно NTII не оказывает существенного влияния на модуль упругости бислоёв DOPS. Рис. 4 Изменения параметров 31РЯМР спектров мультиламеллярных липосом DPPG в присутствия молекул токсинов при 50оС. С помощью компьютерной декомпозиции экспериментальных спектров были получены зависимости процентного содержания изотропной фазы (а), анизотропии химического сдвига (б) и параметра степени деформации мультиламеллярной липосомы магнитным полем спектрометра с/а (в) от соотношения липид/белок (Л/Б). Топология взаимодействия NTII с фосфолипидным бислоем При последовательном титровании NTII 100 нм моноламеллярными липосомами DOPC/DOPS/Холестерол=3:1:1 полное связывание (уширение 1H-15N HSQC ЯМР спектра NTII) было достигнуто при соотношении липид/NTII=40:1. При повышении в образце концентрации KCl согласно теории Гуи-Чапмена происходит увеличение экранирования поверхностного заряда бислоя, приводящее к ослаблению электростатического притяжения катионных молекул NTII отрицательно заряженным бислоем состава 11 DOPC/DOPS/Холестерол=3:1:1. При достижении концентрации 30 mM KCl и более происходило увеличение интенсивностей сигналов 1H-15N HSQC ЯМР спектра, что говорит о возрастании концентрации NTII в растворе за счёт увеличения экранирования заряда анионного DOPS. Выход значений интенсивностей сигналов 1H-15N SHQC ЯМР спектра на плато (соответствующий исчезновению связывания NTII с мембраной) наблюдался при концентрации KCl более 150 mM. Таким образом, были получены зависимости интенсивностей сигналов нейротоксина от концентрации KCl как основной, так и боковых цепей (Рис. 5). Для описания зависимостей значений интенсивностей NH сигналов аминокислотных остатков пропорциональных концентрации NTII в растворе от концентрации KCl была использована теоретическая модель Гуи-Чапмена, учитывающая различие положительных зарядов NTII в растворе и мембраносвязанном состоянии. С помощью этой модели удалось получить теоретические аппроксимации экспериментальных кривых связывания NTII с бислоем DOPC/DOPS/Холестерол=3:1:1 в зависимости от концентрации KCl. Для аминокислотных остатков, значения интенсивностей сигналов которых отмечены синим цветом на Рис. 5а, в, как было сказано выше, предполагалась прямая пропорциональность между интенсивностями сигналов NH групп основной цепи и концентрацией NTII в растворе. В качестве примера (Рис. 5д) приведены экспериментальные данные и теоретическая кривая связывания для интенсивности NH сигнала одного из таких аминокислотных остатков. Таким образом, были получены усреднённые (по набору аминокислотных остатков) значения эффективных зарядов белка в растворе и на мембране 5.4 ± 0.5 и 4.7 ± 0.5 соответственно, которые оказались близки к формальному заряду +5 молекулы NTII при pH=5.5. Рассмотрим более детально значения относительных (с нормировкой на значения интенсивностей сигналов NTII в растворе) интенсивностей сигналов NH основной цепи в диапазоне 73-83 мM KCl (Рис. 5а). Наблюдается разделение значений интенсивностей на две группы (на Рис. 5а обозначенные синим и красным цветами). Для сравнения приведены интенсивности сигналов NTII в зависимости от концентрации KCl в отсутствии липосом, где как видно из Рис. 5б, подобного разделения не наблюдалось. Красным цветом отмечены значения интенсивностей для остатков Glu2, Cys3, Gln6, Cys17, Asn22, Gly41, Asn50, Arg58. На Рис. 5 приведены средние (в диапазоне 73-83 мM KCl) значения интенсивностей сигналов NH для основной (в) и боковых (г) цепей (жёлтым цветом отмечены значения интенсивностей сигналов NH боковых цепей остатков 6 и 50). В диапазоне концентраций KCl (73-83 мM) происходит обмен между состояниями NTII, связанным с мембраной, и NTII в растворе. В связанном с мембраной (моноламеллярная липосома 100 μм) состоянии скорость поперечной релаксации R2 NTII много больше, чем для NTII в растворе. Для случая R2 связанное>>R2 свободное теоретически и экспериментально показано, что интенсивность сигнала белка уменьшается при увеличении разницы химических сдвигов между этими двумя состояниями. Таким образом, для аминокислотных остатков (помеченных на Рис. 5в красным и Рис. 5г жёлтым цветом) происходит наибольшее изменение химического сдвига сигналов NH при связывании токсина с мембраной. 12 Рис. 5 Падение интенсивностей сигналов NH основной цепи (а) аминокислотных остатков в 1H15 N HSQC спектрах молекулы NTII в частично связанном с мембраной состоянии (липид/NTII=40:1) в сравнении с аналогичной зависимостью в отсутствии липидных мембран (б). Значения интенсивностей нормированы на интенсивности сигналов в спектре NTII в не связанном с мембраной состоянии при 230 мМ KCl. Зависимость значения интенсивностей NH сигналов основной цепи (в) и боковых цепей (г) от номера аминокислотного остатка. д) Экспериментальная зависимость (синий цвет) интенсивности NH сигнала аминокислотного остатка основной группы от концентрации KCl и её теоретическая аппроксимация по модели Гуи-Чапмена (чёрный цвет). 13 Известно, что у поверхности анионной мембраны происходит уменьшение диэлектрической проницаемости среды, локальное уменьшение pH и изменение концентрации ионов соли. Варьирование этих параметров растворителя показало незначительные средние изменения химических сдвигов NH сигналов остатков Glu2, Cys3, Gln6, Cys17, Asn22, Gly41, Arg58 в то время как изменения химических сдвигов NH основной и боковой цепи Asn50 в семь раз превосходили средние значения. Таким образом наиболее вероятно, что Asn50 не взаимодействует напрямую с липидами. На Рис. 6 показано расположение NH групп аминокислотных остатков Glu2, Cys3, Gln6, Cys17, Asn22, Gly41, Arg58 на структуре NTII. Из Рис. 6 видна их пространственная локализация, что указывает на взаимодействие NTII с мембраной этой областью (Рис. 6). Рис. 6 Модель взаимодействия NTII с поверхностью мембраны. Обозначены аминокислотные остатки, NH сигналы которых претерпевают наибольшее изменение значения химического сдвига при связывании с мембраной. Влияние аминокислотных замен на расположение молекулы NTII на мембране Для изучения роли сайта связывания NTII с мембраной была получена мутантная форма NTII с двумя аминокислотными заменами Glu2Gln и Asp57Asn в сайте связывания молекулы с мембраной (Рис. 6). Исследование влияния этих замен (увеличивающей положительный заряд белка) на активность NTII методом конкурентного ингибирования связывания 125I–a–бунгаротоксина с нАХР в мембранах из электрического органа ската Torpedo californica показало, что активность мутантной формы NTII в сравнении с нативным NTII уменьшилась в 3 раза. Другие замены аминокислотных остатков в молекулах нейротоксинов не затрагивающие сайта связывания нейротоксинов с нАХР и приводящие к увеличению заряда не меняют либо повышают активность нейротоксинов по ингибированию нАХР. Аналогично эксперименту с нативным NTII с помощью метода гетероядерного ЯМР, используя NTII с заменами Glu2Gln и Asp57Asn, были получены зависимости интенсивностей NН сигналов аминокислотных остатков в условиях обмена между связанным с мембраной и свободным состояниями мутантной формы NTII. 14 Рис. 7 Зависимость значения интенсивностей 1H-15N сигналов в HSQC спектрах мутантной формы NTII основной цепи (а) и боковых цепей (б) от номера аминокислотного остатка. Значения интенсивностей нормированы на интенсивности сигналов в спектре мутантной формы NTII в не связанном с мембраной состоянии. Аминокислотные остатки обозначены аналогично Рис. 5в, г. В отличие от нативного NTII, для мутантной формы NTII анализ полученных экспериментальных данных показал отсутствие существенных различий в поведении химических сдвигов NH аминокислотных остатков при взаимодействии с мембраной DOPC/DOPS/Холестерин=3:1:1 (Рис. 7а, б). Это говорит об отсутствии предпочтительного сайта связывания с липидным бислоем и, как следствие, преобладающей ориентации мутантной формы NTII на мембране, что в сумме с данными по ухудшению ингибирования нАХР подтверждает предположение о роли сайта связывания нативного NTII в ограничении ориентационной свободы и формировании “предпочтительной” для взаимодействия с нАХР ориентации молекулы NTII (Рис. 6). Детализация топологии взаимодействия токсинов с мембраной Как было показано выше, при взаимодействии NTII с липидным бислоем DOPC/DOPS/Холестерол=3:1:1, моделирующим нативное липидное окружение нАХР, решающую роль играет электростатическое взаимодействие с анионным фосфолипидом DOPS. Для детализации описания этого взаимодействия были проведены теоретические расчёты полноатомной молекулярной динамики при взаимодействии молекул NTII с фосфолипидным бислоем DOPS. Анализ данных показал согласованность теоретической модели расположения NTII на липидном бислое (Рис. 8б) с полученной экспериментально (Рис. 6). Также в результате теоретического моделирования был определён предпочтительный сайт связывания нейротоксином II головок фосфолипидов DOPS (Рис. 8б). Молекула NTII участвует в связывании одной молекулы DOPS, что как было показано методом 31Р-ЯМР спектроскопии, приводит к изменению анизотропии химического сдвига ядра 31Р фосфатного фрагмента DOPS. При связывании фосфатидилсерина происходит образование водородных связей с аминокислотными остатками Arg58, Asp57 и Glu2 молекулы NTII. 15 Рис. 8 Аминокислотные последовательности (а) и пространственные структуры NTII (б), CTII (в) и CTI (г) с распределением электростатического (Eэл) потенциала и молекулярного гидрофобного потенциала. Дисульфидные связи представлены над последовательностью. Заряженные аминокислотные остатки окружающие петли цитотоксинов обозначены синим цветом и заключены в прямоугольники. Гидрофобные остатки в окончании петель цитотоксинов обозначены зелёным цветом. Структуры белков даны в ленточном представлении и соответствуют состояниям с наименьшей энергией, найденным с помощью молекулярного моделирования. Все виды даны при одном расположении молекул токсинов. Граница раздела мембрана–раствор обозначена горизонтальной линией. Показана молекула DOPS в связанном с NTII состоянии, обозначены аминокислотные остатки NTII формирующие водородные связи с DOPS (б). 16 С помощью метода Монте-Карло для взаимодействия цитотоксинов с неявно заданной моделью мембраны было определено расположение молекул на мембране. Как CTII, так и CTI проникают в мембрану гидрофобными окончаниями трёх петель: аминокислотные остатки 5–10 (петля I), 24–36 (петля II) и 46–50 (петля III) (Рис. 8а, в, г), что хорошо согласуется с полученными ранее данными спектроскопических исследований CTII и CTI в модельных мембранах. С другой стороны, одинаковые модели связывания, полученные для CTI и CTII в неявно заданной мембране, не позволяют охарактеризовать тонкие отличия в поведении этих токсинов на границе бислой-вода. Для решения данной задачи была произведена оценка различий «свободной энергии» ( ΔΔ G) между мембранно-связанным и водным состояниями CTI и CTII. В данном случае термин «энергия» используется для суммы внутренней энергии белка и энергии, возникающей вследствие взаимодействия белка с гетерогенной средой, моделирующей мембрану (Eсольватации), где энергия самой мембраны предполагается постоянной. С помощью анализа низкоэнергетических состояний, найденных с помощью метода конформационного поиска Монте Карло, были найдены значения ΔΔ G −6.8 и −14.1 Ккал/моль (1 кал=4.184 Дж) для CTI и CTII соответственно. Следовательно CTII связывается с мембраной более сильно, чем CTI, хотя их модели встраивания очень похожи. Взаимодействие трёхпетельных токсинов с липидной мембраной: комбинированное рассмотрение Принимая во внимание экспериментальные результаты по взаимодействию трёхпетельных токсинов с липидными мембранами дополненные теоретическими данными, возникает следующая картина взаимодействия токсинов с мембраной (Рис. 9). Связывание катионных токсинов с отрицательно заряженной мембраной происходит вследствие электростатического взаимодействия, приводящего к связыванию белков с поверхностью мембраны (Рис. 9б, в переход 1→2). На схеме (Рис. 9б, в состояние 2) представлено жидкокристаллическое состояние мембраны, хотя переход 1→2 также реализуется и для гелевого состояния липидного бислоя. Предполагается, что этот процесс слабо зависит от фазового состояния мембраны и главным образом определяется электростатическим зарядом белка и поверхностной плотностью заряда мембраны. Так, для электростатически нейтрального бислоя связывания всех токсинов не наблюдалось. Белок электростатически иммобилизованный на поверхности липид/вода далее встраивается в мембрану гидрофобно. Это положение справедливо для молекул цитотоксинов и анионных мембран DPPG в жидкокристаллическом состоянии. Молекулы нейротоксина II, как было показано выше, не встраиваются в гидрофобную область мембраны взаимодействуя лишь с областью полярных «головок» липидного бислоя. Основным фактором, обеспечивающим гидрофобное встраивание цитотоксинов является наличие в их молекулах единой гидрофобной области, сформированной тремя петлями молекулы (Рис. 8б, в). 17 Рис. 9 a) Молекулы CTI, CTII и NTII, совмещенные по основной цепи. б) Схематичное представление моделей связывания трёхпетельных цитотоксинов с липидными мембранами. На рисунке представлен лишь верхний монослой бислойной мембраны. Количество молекул липидов, представленных на рисунке не соответствует стехиометрии взаимодействия, обсуждаемой в тексте. в) Предполагаемый “Мембранно-опосредованный путь” поиска нейротоксином II мембранного рецептора нАХР. NTII из межклеточного раствора (1) к поверхности клеточной мембраны (2) и достижения нАХР (3) посредством латеральной диффузии. 18 Глубина их встраивания в мембрану ограничена гидрофильным поясом, сформированным положительно заряженными остатками лизина и аргинина. Процесс встраивания описывается константой гидрофобного связывания kг. Эта константа зависит от гидрофобного потенциала поверхности молекулы белка, встроенного в гидрофобную область мембраны. Поэтому равновесие более смещено к состоянию 3 (Рис. 9б) для CTII в сравнении с CTI. Как результат, влияние CTI на модуль упругости бислоя DPPG и, следовательно, деформацию липосом в магнитном поле менее значительно в сравнении с CTII. Вследствие отсутствия протяженных гидрофобных участков поверхности молекул NTII взаимодействует лишь с полярной областью «головок» липидной мембраны. Следовательно, влияние NTII на модуль упругости бислоя и степень деформации липосом в магнитном поле мало́ в сравнении с эффектами цитотоксинов. Накопление цитотоксинов во встроенном в гидрофобную область мембраны состоянии 3 приводит к достижению критической концентрации белка, выше которой происходит разрушение бислойной упаковки липидов. Формируется изотропная фаза (Рис. 9б, состояние 4) образование которой описывается константой равновесия kISO. Среди факторов, влияющих на kISO, можно указать способность пептидов изменять кривизну липидной поверхности. Это свойство зависит от расположения молекулы белка относительно липидов и от организации различных мембранных фосфолипидов в соответствии с их «формой молекулы». Вероятно эта способность зависит от комбинации электростатических и гидрофобных свойств молекул цитотоксинов, приводящих к формированию электрически нейтральных стехиометричных комплексов молекул токсинов с фосфолипидами. Переходы между состояниями, представленными на Рис. 9, отражаются в виде следующих изменений формы линии 31P-ЯМР спектра: если состояние 1 (Рис. 9б, в) соответствует 31P-ЯМР спектру мультиламеллярных липосом в отсутствии токсина, то состояние 2 (Рис. 9б, в) преимущественно характеризуется изменениями значений CSA. Это состояние наблюдается в чистом виде лишь для NTII, но не для CTI и CTII. Его вклад практически отсутствует для CTII, связанного с DPPG в жидкокристаллической фазе. Состояние 3 (Рис. 9б) характеризуется невозмущённым значением CSA. Тем не менее вследствие гидрофобного встраивания происходит изменение характера упаковки липидов, приводящее к изменениям характеристики упругости мембраны и, следовательно, приводящее к изменению степени деформации липосом в магнитном поле c/a. Это состояние в случае CTII приводило к падению значений c/a до 1, соответствующей недеформированным (сферическим) липосомам. Состояние 4 (Рис. 9б) представлено в 31P-ЯМР спектре только в виде изотропного сигнала. Это состояние наблюдалось для обоих цитотоксинов, в отличие от нейротоксина. Биологическая роль мембраносвязанного состояния токсинов Описанные мембраносвязывающие свойства токсинов из яда кобры Naja oxiana связаны с их биологической активностью. Связывание цитотоксинов с мембраной приводит к изменению поверхностной плотности заряда липидного бислоя и нарушениям его бислойной упаковки (Рис. 9б). Эти эффекты способствуют действию фосфолипаз. Появление лизофосфолипидов в комбинации со способностью цитотоксинов разрушать бислойную упаковку мембраны приводит к разрушению клеточных мембран. Для NTII, блокирующего нАХР, предложен механизм «мембранного катализа»: 1) Первоначально повышается примембранная концентрация NTII под действием электростатических взаимодействий между анионным бислоем и катионным NTII (Рис. 9в, переход 1 → 2). Таким образом, происходит электростатическая аккумуляция NTII на поверхности мембраны. 2) Второй шаг механизма «мембранного катализа» происходит в мембраносвязанном состоянии лиганда. За счёт связывания с мембраной нейротоксина II 19 происходит ограничение ориентационной свободы с позиционированием окончания второй петли молекулы в состоянии, доступном для ингибирования нАХР (Рис. 9в, состояние 2). Расположение NTII на поверхности бислоя и селективность к мембранному окружению рецептора обеспечиваются специфичностью взаимодействия головных групп фосфолипидов с боковыми цепями аминокислотных остатков сайта H нейротоксина. 3) Преимуществом третьего шага в механизме «мембранного катализа» является замена пространственного диффузионного поиска рецептора лигандом в растворе на более быстрый двумерный латеральный диффузионный поиск в мембраносвязанном состоянии, из которого происходит первичное распознавание лиганда рецептором (Рис. 9в переход 2 → 3). Следовательно, происходит выигрыш за счёт понижения размерности диффузионного поиска рецептора нАХР лигандом NTII с трёхмерной диффузии в растворе на двумерную в мембраносвязанном состоянии. Заключение Разработан метод анализа Р-ЯМР спектров широких линий, имеющий ряд преимуществ при анализе экспериментальных спектров фосфолипидных дисперсий, реализованный в виде программы «P-FIT». Получена новая аналитическая формула формы линии 31Р-ЯМР спектра, учитывающая частичную ориентацию фосфолипидов в магнитном поле, которая позволяет существенно улучшить как точность компьютерного анализа 31Р-ЯМР спектров фосфолипидных липосом, так и получать дополнительную информацию о характере упаковки фосфолипидов. С использованием программы может производиться декомпозиция 31Р-ЯМР спектров с произвольным количеством перекрывающихся сигналов с анализом их параметров. В данной работе продемонстрировано практическое использование данной программы при анализе формы линии 31Р-ЯМР спектров липосом фосфолипидов в присутствии и без белков. Программа написана на языке Mathematica (Wolfram Research), доступна научному сообществу, и на данный момент используется в ряде других лабораторий. Разработан метод определения сайта связывания белка с мембраной на основе гетероядерной ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Методика позволяет анализировать возмущения значений химических сдвигов сигналов белка в результате его связывания с липидным бислоем. Данный подход основан на получении экспериментальных условий, при которых происходит обмен между двумя состояниями белка: свободным и связанным с бислойной липидной мембраной. В результате, эта методика даёт возможность преодолеть ограничения метода ЯМР высокого разрешения на размер используемых модельных мембран при изучении липид/белковых взаимодействий, позволяя использовать моноламеллярные бислойные липосомы, наиболее полно моделирующие свойства нативных биомембран. Связывание токсинов яда кобры Naja oxiana с липидным бислоем определяется поверхностной плотностью заряда мембраны, в то время как различия в их расположении в бислое определяются свойствами поверхности молекул токсинов, обладающих общей трёхпетельной структурой (Рис. 9а). Показано, что цитотоксины взаимодействует с анионной липидной мембраной окончаниями трёх петель молекулы (Рис. 9б), а нейротоксин II противоположной от петель Н-областью (Рис. 9в состояние 2). Причём для CTI, в сравнении с CTII, равновесие смещено к состоянию без гидрофобного встраивания в мембрану (Рис. 9б состояние 2). Встраиваясь в мембрану, токсины влияют как на ориентацию «головок» фосфолипидов, так и могут приводить к изменению её упругих характеристик. В случае цитотоксинов при соотношениях белок/липид выше некоторой пороговой величины происходит разрушение бислойной упаковки липидов в мембране и образование изотропной фазы, стехиометрия которой определяется зарядами цитотоксинов. Таким образом, удалось раскрыть механизм взаимодействия цитотоксинов с их мишенью – липидным бислоем (Рис. 9б). Определена возможная роль связывания 31 20 NTII с мембраной и ориентация токсина относительно липидного бислоя на этапе связывания с нАХР (Рис. 9в). Полученные данные дают основание предположить «механизм мембранного катализа» при поиске нейротоксином II мембранного никотинового ацетилхолинового рецептора. Выводы: 1) Разработана программа для анализа экспериментальных 31Р-ЯМР спектров фосфолипидных дисперсий с использованием аналитического выражения формы линии спектра, учитывающего эффекты ориентации молекул липидов в магнитном поле спектрометра. Это позволяет повысить как точность аппроксимации экспериментального спектра теоретическим так и получить дополнительную информацию о свойствах липидной мембраны. 2) Разработана методика использования гетероядерной ЯМР спектроскопии высокого разрешения, для изучения взаимодействия белка с бислойной липидной мембраной. 3) Определено влияние молекул токсинов на упаковку липидов в составе бислойной мембраны и условия её разрушения. Получены модели взаимодействия цитотоксинов CTI, CTII и нейротоксина NTII с липидным бислоем, отражающие биологические функции этих токсинов. 4) Предложен механизм мембранного катализа при связывании нейротоксина II с никотиновым ацетилхолиновым рецептором. МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ: 1. Д. М. Лесовой, Э. В. Бочаров, П. В. Дубовский, М. А. Дубинный, Е. Н. Люкманова, А.В. Щукин, Ю.Н. Уткин, Д А. Долгих, А.С. Арсеньев «Разные биологические функции общего структурного мотива токсинов яда кобры Naja oxiana» // VIII Международный Семинар по Магнитному Резонансу (Спектроскопия, Томография и Экология), Ростов-на-Дону, Россия, 11-16 сентября 2006, Материалы Семинара, с. 66. 2. D. M. Lesovoy, E. V. Bocharov, E. N. Lyukmanova, A. V. Schukin, E. N. Tkach and A. S. Arseniev «Characterisation of protein/lipid bilayer interaction by liquid NMR technique» // International Symposium and Summer School “Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter” 3rd Meeting “NMR in Heterogeneous Systems”, Saint Petersburg, Russia, 9-13 July 2006, Book of Abstracts, p.77. 3. D. M. Lesovoy, E. V. Bocharov, E. N. Lyukmanova, E. N. Tkach, A. V. Schukin, I. E. Kasheverov, V. I. Tsetlin, D. A. Dolgikh, A. S. Arseniev «Interaction of Neurotoxin II with lipid bilayer mimicking native membrane» // XIV International conference “New information technologies in medicine, biology, pharmacology and ecology”, Crimea, Ukraine 31 May-9 June 2006, Book of Abstracts, p.281-283. 4. M. A. Dubinnyi, D. M. Lesovoy, P. V. Dubovskii, V.V. Chupin, A.S. Arseniev « Modeling of 31P-NMR spectra of magnetically oriented phospholipid liposomes: A new analytical solution» // Solid State Nuclear Magnetic Resonance, 29(4), 2006 Jun, p. 305-11. 5. Д. М. Лесовой, М. А. Дубинный, П. В. Дубовский «Анализ 31Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий с помощью программы «P-FIT» // XVII зимняя международная молодёжная научная школа “Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии” секция “Физико-химические методы 21 исследования биологически активных соединений”, Москва, 7-10 февраля 2005, Тезисы докладов и стендовых сообщений с. 69. 6. P. V. Dubovskii, D. M. Lesovoy, M. A. Dubinnyi, A. G. Konshina, Y. N. Utkin, R. G. Efremov, A. S. Arseniev «Interaction of three-finger toxins with phospholipid membranes: comparison of S- and P-type cytotoxins» // Biochemical journal, 387(Pt 3), 2005 May 1, p. 807-815. 7. E. V. Bocharov, A. G. Sobol, K. V. Pavlov, S. A. Krachkovskii, A. V. Zhuravlyova, D. M. Lesovoy, E. N. Lyukmanova, A. V. Schukin, Y. S. Ermolyuk, E. N. Tkach, A. S. Arseniev «Functional dynamics of proteins revealed by NMR study of L7/L12, TGF-β3, barnase and neurotoxin II» // International Symposium and Summer School “Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter” 2nd Meeting “NMR in Heterogeneous Systems”, Saint Petersburg, Russia, 11-15 July 2005, Book of Abstracts, p.33. 8. Д. М. Лесовой, П. В. Дубовский «Взаимодействия токсинов из яда кобры Naja oxiana с фосфолипидными мембранами» // XV зимняя международная молодёжная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” секция “Физико-химические методы исследования биологически активных соединений”, Москва, 10-14 февраля 2003, Тезисы докладов и стендовых сообщений с. 46. 9. P. V. Dubovskii, D. M. Lesovoy, M. A. Dubinnyi, Y. N. Utkin, A. S. Arseniev « Interaction of the P-type cardiotoxin with phospholipid membranes» // European Journal of Biochemistry, 270(9), 2003 May, p. 2038-2046. 10. Д. М. Лесовой, П. В. Дубовский, А. С. Арсеньев «Изучение методом 31Р-ЯМР взаимодействия кардиотоксина с модельными фосфолипидными мембранами» // XLIV Юбилейная научная конференция МФТИ посвящённая 50-летию создания МФТИ “Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук”, МоскваДолгопрудный 23-30 ноября 2001, Труды Конференции часть IV, с. 37. 11. Д. М. Лесовой, М. Н. Жмак, Е. Н. Люкманова, П. В. Дубовский «Взаимодействие аналога пептида слияния из гемагглютинина вируса гриппа с фосфолипидными липосомами: изучение методом 31Р-ЯМР» // Успехи современного естествознания, т. 10, 2004, с. 38-39. 22
