ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописи ТЮЛЕНЕВ Алексей Валерьевич РОЛЬ ИЗМЕНЕНИЙ РЕДОКС-СТАТУСА ПРИ АДАПТАЦИИ ESCHERICHIA COLI К МЕНЯЮЩИМСЯ УСЛОВИЯМ СРЕДЫ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических профессор Октябрьский О.Н. Пермь – 2015 наук, 2 СОДЕРЖАНИЕ СОДЕРЖАНИЕ ...................................................................................................................................... 2 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................ 5 ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................. 7 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .................................................................................................................. 14 ГЛАВА 1. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И КЛЕТОЧНЫЕ ТИОЛЫ КАК ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ РЕДОКС-СТАТУС КЛЕТОК ........................................................................... 14 1.1 Активные формы кислорода .............................................................................. 14 1.2 Редокс-активные тиолы ...................................................................................... 15 1.2.1 Цистеин ............................................................................................................. 15 1.2.2 Глутатион .......................................................................................................... 17 1.2.2.1 Свойства и синтез глутатиона ..................................................................... 17 1.2.2.2 Восстановление глутатиона (глутатионредуктаза) ................................... 20 1.2.2.3 Турновер глутатиона (γ-глутамилтранспептидаза и γглутамильный цикл) .................................................................................................. 21 1.2.2.4 Транспорт глутатиона .................................................................................. 23 1.2.2.5 Трансмембранная циркуляция глутатиона ................................................ 24 1.3 Тиол-зависимые редокс-системы клетки ......................................................... 25 1.3.1 Глутаредоксины и тиоредоксины .................................................................. 25 1.3.2 Периплазматические редокс-системы ........................................................... 28 1.4 Eh в бактериальных культурах и низкомолекулярные тиолы ....................... 29 ГЛАВА 2. РОЛЬ РЕДОКС-РЕГУЛЯЦИИ ПРИ АДАПТАЦИИ E. COLI К СТРЕССАМ ............. 31 2.1 Окислительный стресс ....................................................................................... 31 2.1.1 Пероксидный стресс ........................................................................................ 31 2.1.2 Супероксидный стресс .................................................................................... 32 2.2 ArcAB и FNR системы........................................................................................ 34 2.3 Общий стрессовый ответ и строгий ответ ....................................................... 36 2.4 Другие примеры участия тиолов в редокс-регуляции .................................... 39 2.5 Роль GSH в регуляции транспорта К+ .............................................................. 40 3 2.6 Транспорт фосфата ............................................................................................. 44 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .................................................................................................... 48 ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................................................. 48 3.1 Объекты исследования ....................................................................................... 48 3.2 Питательные среды и условия культивирования ............................................ 49 3.3 Определение удельной скорости роста ............................................................ 50 3.4 Колониеобразующая способность .................................................................... 50 3.5 Определение живых и мертвых клеток (live-dead test) ................................... 51 3.6 Определение окислительно-восстановительного потенциала (Eh) и pH в среде культивирования.............................................................................................. 51 3.7 Измерение парциального давления кислорода ................................................ 52 3.8 Выявление изменений мембранного потенциала ............................................ 52 3.9 Скорость продукции супероксида .................................................................... 53 3.10 Определение концентрации перекиси водорода в среде и в клетке............ 54 3.11 Определение концентрации глутатиона ......................................................... 54 3.12 Определение концентрации внутриклеточного калия .................................. 56 3.13 Определение β-галактозидазной активности ................................................. 56 3.14 Определение концентрации цистеина ............................................................ 57 3.15 Статистическая обработка полученных результатов .................................... 58 3.16 Материалы ......................................................................................................... 58 ГЛАВА 4. ТРАНСМЕМБРАННАЯ ЦИРКУЛЯЦИЯ ГЛУТАТИОНА ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ПАРАМЕТРОВ СРЕДЫ В ПЕРИОДИЧЕСКИХ КУЛЬТУРАХ ESCHERICHIA COLI ................. 59 4.1 Изменение удельной скорости роста у различных штаммов E. coli при переходе к микроаэробным условиям ..................................................................... 59 4.2 Изучение экспрессии rpoS::lacZ и sodA::lacZ как маркеров индукции RpoS и ArcAB регулонов........................................................................................................ 62 4.3 Продукция экстраклеточного супероксида в периодической культуре E. coli ...................................................................................................................................... 63 4.4 Статус глутатиона в растущей культуре E. coli............................................... 64 4 4.5 Взаимосвязь трансмембранной циркуляции GSH с глобальными регуляторными системами клетки ........................................................................... 68 ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ АФК НА ЭКСПОРТ ГЛУТАТИОНА .............................. 73 5.1 Влияние экзогенных АФК, генерируемых ксантиноксидазой, на рост и циркуляцию GSH у бактерий E. coli ........................................................................ 73 5.2 Взаимодействие глутатиона с экзогенными АФК .......................................... 79 5.3 Влияние АФК на жизнеспособность и мембранный потенциал клеток ....... 82 ГЛАВА 6. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ТРАНСМЕМБРАННОЙ ЦИРКУЛЯЦИЕЙ ГЛУТАТИОНА И ИОННЫМИ ПОТОКАМИ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ДОСТУПНОСТИ ФОСФАТА И СУЛЬФАТА В СРЕДЕ ..................................................................................................................... 88 6.1 Роль неорганического фосфата и сульфата в циркуляции глутатиона у бактерий E. coli........................................................................................................... 88 6.2 Изменение Δψ и продукции супероксидного радикала при добавлении Pi к голодающим по фосфату клеткам ............................................................................ 95 6.3 Влияние искусственных изменений ΔμH+ на экспорт глутатиона при добавлении фосфата в голодающую культуру ....................................................... 97 6.4 Изучение связи между экспортом GSH и К+ при добавлении фосфата и сульфата в культуры, голодающие по этим субстратам ........................................ 99 ГЛАВА 7. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПОРТА ГЛУТАТИОНА ПРИ АМИНОКИСЛОТНОМ ГОЛОДАНИИ .................................................................................................................................... 105 7.1 Изменение циркуляции глутатиона и цистеина при аминокислотном голодании и возобновлении роста ......................................................................... 105 7.2 Изменение продукции супероксидного радикала при добавлении валина 109 7.3 Изменение циркуляции глутатиона при добавлении низкой концентрации валина и предобработке хлорамфениколом .......................................................... 110 ОБСУЖДЕНИЕ ................................................................................................................................. 114 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................................. 123 ВЫВОДЫ .................................................................................................................... 125 ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................................................... 127 5 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ АФК активные формы кислорода Е единица активности фермента КОЕ колониеобразующая единица ФАД флавинадениндинуклеотид ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота CCCP карбонилцианид-мета-хлорофенилгидразон (carbonyl cyanide mchlorophenyl hydrazone) DCCD N,N'-дициклогексилкарбодиимид (N,N'-dicyclohexylcarbodiimid) DiBAC4(3) бис-(1,3-дибутилбарбитуратовая кислота)-триметиноксонол (Bis-(1,3Dibutylbarbituric Acid)-Trimethine Oxonol) DTT DL-дитиотреитол (DL-dithiothreitol) DTNB 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic)) кислота Eh окислительно-восстановительный потенциал GGT γ-глутамилтранспептидаза GOR глутатионоксидоредуктаза (glutathione oxidoreductase) GSH глутатион восстановленный (GSHin – внутриклеточный, GSHout – экстраклеточный) GSSG глутатион окисленный (GSSGout – экстраклеточный) GS-Q конъюгат глутатиона с хиноном H+ катион водорода HPI каталаза гидропероксидаза I (hydroperoxidase I) НРII гидропероксидаза II (hydroperoxidase II) K+ катион калия MOPS 3-[N-Морфолино]пропан-сульфоновая (3-[N- Morpholino]Propanesulfonic) кислота NEM N-этилмалеимид (N-ethylmaleimide) ОD600 оптическая плотность (optical density) при длине волны 600 нм Pi анион фосфата неорганического 6 pO2 парциальное давление кислорода (p)ppGpp гуанозин(пента-)тетрафосфат Q хинон (Qel – окисленная форма, QH – восстановленная форма) Qor хиноноксидоредуктаза Si анион сульфата неорганического SOD супероксиддисмутаза (superoxide dismutase) XO ксантиноксидаза (xanthine oxidase) Δx делеция гена x 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. Изучение механизмов регуляции жизнедеятельности клеток, в том числе и бактерий, является одним из самых важных и актуальных направлений современной экспериментальной биологии. В последние десятилетия все большее внимание уделяется исследованию регуляторных механизмов с участием редокс-активных соединений. В этот способ регуляции вовлечены активные формы кислорода (АФК), в особенности супероксидный анион и перекись водорода. В другую группу входит ряд эндогенных соединений, способных к редокс-превращениям, среди них особое значение имеют соединения, содержащие тиоловые (SH-) группы, глутатион (GSH), тиоредоксин, глутаредоксин, пероксиредоксины и др. Взаимодействие АФК, указанных тиолов и SH-групп в составе активных центров в белках приводит к изменению активности этих белков, что составляет молекулярную основу редокс-регуляции (Kwon et al., 2003; Paget, Buttner, 2003). В наибольшей степени редокс-регуляция изучена у эукариот. Известно, что у этих организмов АФК и редокс-активные тиолы принимают участие в регуляции экспрессии генов, клеточной сигнализации, а так же вовлечены в механизм программируемой клеточной смерти – апоптоза (Voehringer, 1999; Klatt, Lamas, 2000; Filomeni et al., 2002). У бактерий известно несколько молекулярных систем, включенных в редокс-регуляцию. У Escherichia coli одним из главных транскрипционных регуляторов, контролирующих переключение между аэробным и анаэробным метаболизмом, является белок FNR. Даже при очень низкой внутриклеточной концентрации O2 происходит инактивация FNR, в реактивации FNR в качестве редуктанта может участвовать GSH (Unden et al., 2002). Другой системой, контролирующей у E. сoli экспрессию генов при пониженном парциальном давлении кислорода, является ArcAB. При дефиците O2 убихинон-зависимая киназа ArcB (сенсор) автофосфорилируется и далее 8 фосфорилирует ArcA (регулятор), сообщая ему способность связываться с ДНК и регулировать большое число оперонов, контролирующих катаболизм углерода и внутриклеточный редокс-статус. Молекулярный механизм, лежащий в основе связи между дыхательной цепью и ингибированием киназы ArcB в аэробных условиях, включает образование интермолекулярных дисульфидных связей вследствие специфического окисления хинонами двух редокс-активных цистеиновых остатков в сенсоре (Malpica et al., 2004). Одним из наиболее изученных примеров редокс-регуляции c участием тиолов у бактерий является ответ E. coli на действие пероксида. В присутствии низких концентраций H2O2 активируется экспрессия ряда антиоксидантных генов, часть из которых находится под контролем транскрипционного фактора OxyR. Активация OxyR происходит при образовании внутримолекулярной дисульфидной связи. Восстановление этой дисульфидной связи под действием глутаредоксина 1 в присутствии глутатиона (GSH) или тиоредоксина (Trx1) инактивирует OxyR. Важно, что OxyR проявляет чувствительность как к H2O2, так и к изменению внутриклеточного тиол-дисульфидного статуса (Aslund et al., 1999). Ранее было обнаружено, что при различных переходных процессах, в том числе при стрессах, в аэробных культурах E. coli наблюдаются характерные изменения редокс-потенциала среды (Eh) в область отрицательных значений, прямо не связанные с изменениями рН и pO2 в среде. Основной вклад в эти изменения Eh вносят внеклеточные низкомолекулярные тиолы (НМТ), в том числе, GSH. Выявлена связь между изменениями экстраклеточных НМТ, внутриклеточными уровнями ионов калия и рН в этих ситуациях (Октябрьский, Смирнова, 2012). Позже были опубликованы данные, свидетельствующие о существовании непрерывной циркуляция глутатиона между аэробно растущими клетками E. coli и средой. Параметры процесса определяются условиями среды (pH, Eh, pO2 и др.), энергетикой клетки, трансмембранными ионными потоками и значительно изменяются при стрессах (Smirnova et al., 2012). Роль этих изменений в регуляции активности бактерий остается мало изученной. Было предположено, 9 что трансмембранная циркуляция НМТ вместе с реакциями, определяющими направление ионных потоков и внутриклеточный рН, может составлять существенную часть сенсорного и исполнительного механизмов, быстро реагирующих на изменения параметров среды и клетки. Требуются дальнейшие исследования для подтверждения этой гипотезы. До настоящего времени остаются мало изученными системы экспорта глутатиона и регуляция их активности у бактерий E. coli. Известен только один кассетный АТФ-зависимый транспортер CydDC, осуществляющий перенос GSH в периплазматическое пространство (Pittman et al., 2005), который не участвует в экспорте глутатиона при экспоненциальном росте (Smirnova et al., 2012). Таким образом, значительная часть внутриклеточного GSH экспортируется через не идентифицированные транспортеры. Цель настоящего исследования – изучить вклад активных форм кислорода и трансмембранной циркуляции тиолов в редокс-регуляцию клеточных функций E. coli при изменении ростовых условий. Основные задачи исследований: 1. Изучить изменения продукции АФК, трансмембранных потоков GSH и редокс-статуса глутатиона в периодических культурах E. coli родительского типа и мутантов по генам, связанным с изменением редокс-статуса клеток и регуляцией адаптивных процессов. 2. Исследовать влияние экзогенных АФК на экспорт глутатиона и мембранный потенциал в клетках мутантов и родительского штамма. 3. Осуществить мониторинг экстраклеточного супероксида, GSH, мембранного потенциала и внутриклеточного калия при добавлении фосфата и сульфата к родительским и мутантным клеткам E. coli, голодающим по этим субстратам. 4. Изучить изменения АФК и тиолов (цистеин и GSH) при аминокислотном голодании в клетках родителя и мутантов по гену relA. Научная новизна. 10 Впервые показано, что экспорт и редокс-статус глутатиона у E. coli находятся под контролем RelA, ArcAB и RpoS, что свидетельствует о включении трансмембранной циркуляции глутатиона в общую регуляторную сеть бактериальной клетки. Через сигнальную цепь «менахинон → ArcB → СydDC» статус глутатиона и интенсивность его трансмембранной циркуляции может контролироваться редокс-состоянием дыхательной цепи. Впервые обнаружено, что в растущих культурах E. coli микромолярные дозы экзогенных O2·- и Н2О2 стимулируют экспорт GSH и модулируют мембранный потенциал (Δψ). Получены доказательства, что экспортируемый глутатион вносит вклад в защиту периплазмы от окислительного стресса. Впервые показано, что внесение фосфата в голодающую по нему культуру E. coli приводит одновременно к обратимому повышению Δψ, кратковременному усилению продукции супероксида и стимуляции редокс-чувствительного экспорта GSH, тесно сопряженного с транспортом К+ из клеток. Сопряженные изменения потоков GSH и К+ наблюдаются также при внесении SO4 2- в культуру, голодающую по сульфату. Экспортная система калия KefC является не только мишенью для регуляции глутатионом, но прямо или косвенно участвует в экспорте GSH. Впервые установлено, что переход растущих E. coli в режим аминокислотного голодания приводит к ускорению продукции супероксида и стимулирует экспорт цистеина и GSH в среду. Мутация relA противоположным образом влияет на трансмембранные потоки цистеина и глутатиона, свидетельствуя об участии алармона (p)ppGpp в регуляции экспорта этих тиолов при аминокислотном голодании. Теоретическая и практическая значимость работы. Наибольшее значение для фундаментальной науки имеют данные, свидетельствующие о том, что у бактерий E. coli экспорт и редокс-статус глутатиона находятся под контролем глобальных регуляторов ArcAB и RpoS, и зависят от уровня (p)ppGpp. Обнаружен сигнальный путь, связывающий интенсивность циркуляции глутатиона с редокс-состоянием дыхательной цепи, а 11 также индукция совокупности экспорта глутатиона полученные результаты трансмембранной бактериальной циркуляции клетки. Эти низкими свидетельствуют глутатиона данные дозами в общую расширяют оксидантов. о включении регуляторную наши В сеть представления о молекулярных механизмах, контролирующих адаптацию бактерий к изменению условий среды. Обнаруженные связи между циркуляцией глутатиона и глобальными регуляторами, контролирующими рост бактерий, могут быть мишенями при поиске новых антибактериальных препаратов, с одной стороны, и разработке путей управления развитием бактериальных культур в биотехнологии, с другой стороны. Глутатион антиоксидантов относится и к выпускается группе на высокоэффективных рынок фармпрепаратов природных в качестве биологически активной добавки. В биотехнологии в качестве источников получения GSH используются микроорганизмы. Одним из критических моментов в получении глутатиона является выделение его из микробных клеток. В нашей работе показано, что, используя мутантные штаммы E. coli и обработку клеток стимуляторами экспорта GSH, можно значительно увеличить концентрацию глутатиона в среде. Используя эти приемы, можно повысить эффективность процесса получения GSH в биотехнологии за счет сокращения стадии разрушения клеток и упрощения процедуры очистки. Методология и методы исследования. Объектом исследования служили бактерии Escherichia coli из библиотеки одиночных делеционных мутантов Escherichia coli (Keio Knockout collection). В экспериментах использовали также двойные мутанты, и штаммы, содержащие одновременно соответствующие мутации и слияния промоторов генов katG, sodA и др. со структурным геном lacZ, кодирующем β-галактозидазу. Эти штаммы были сконструированы в лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов ИЭГМ на основе мутантов из Keio collection, используя трансдукцию с фагом РI и трансформацию плазмид. Парциальное давление кислорода в культуре 12 регистрировали полярографическим методом с использованием электрода Кларка. Окислительно-восстановительный потенциал среды (Eh) регистрировали потенциометрическим методом с применением комбинированного платиновохлорсеребряного электрода c непрерывной регистрацией значений Eh. Восстановленный и окисленный глутатион определяли модифицированным методом Титца в образцах, отобранных через мембранный фильтр. Количество экстраклеточного цистеина измеряли модифицированным методом Гайтонде. Концентрацию калия в клетках измеряли методом Meury и Kepes на атомноадсорбционном спектрометре. Продукцию супероксидного радикала определяли по восстановлению цитохрома C. Перекись водорода измеряли чувствительным спектрофлуориметрическим методом с красителем Amplex Red и пероксидазой (AR/HRP). Экспрессию генов оценивали по степени индукции β-галактозидазы в штаммах, несущих соответствующие генные слияния. Для выявления изменений мембранного потенциала использовали проникающий флуоресцентный краситель DiBAC4(3). Количество живых и мертвых клеток определяли с помощью флуоресцирующих красителей SYTO 9 и пропидиум йодида (PI). Способность к образованию колоний устанавливали после высева бактерий на чашки с LBагаром. Бактерии выращивали на минимальной среде М9 с глюкозой (0.15%) или на среде MOPS с заданной концентрацией фосфата в колбах при 37ºС в орбитальном термостатируемом шейкере при 150 об/мин. Применяемые методы адекватны поставленным задачам и соответствуют мировому уровню. Положения, выносимые на защиту: 1. Трансмембранная циркуляция глутатиона в периодической культуре E. coli зависит от продукции эндогенного супероксида и регулируется с участием глобальных регуляторов RpoS, ArcAB и синтетазы (p)ppGpp RelA. 2. Экзогенный супероксид стимулирует экспорт глутатиона из клеток E. coli и изменяет мембранный потенциал (∆ψ). 3. Обратимый выход GSH при добавлении фосфата к голодающим клеткам E. coli связан с гиперполяризацией мембраны, усилением продукции супероксида и экспортом калия через транспортные системы KefB и KefC. 13 4. RelA-зависимый синтез (p)ppGpp противоположным образом регулирует экспорт цистеина и глутатиона в клетках E. coli при аминокислотном голодании. Степень достоверности и апробация результатов: Результаты исследований по теме диссертации представлены на II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2015). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ (1 статья в иностранном рецензируемом журнале). Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах печатного текста, иллюстрирована 44 рисунками и 2 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, четырех глав собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержит 200 источников, из них 4 отечественных и 196 зарубежных авторов. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и соответствует направлению исследований по теме «Молекулярные механизмы адаптации микроорганизмов к факторам среды» (номер госрегистрации 01201353249). Исследования поддержаны грантом Программы МКБ Президиума РАН №12-П-4-1013 «Роль изменений редокс-статуса среды и периплазмы во внутри- и межклеточной сигнализации при стрессах у бактерий» и грантом РФФИ № 13-04-00706 «Роль трансмембранной циркуляции низкомолекулярных тиолов в защите бактерий Escherichia coli от активных форм кислорода при стрессах». Научные положения и выводы диссертационной работы базируются на результатах собственных исследований автора. 14 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА 1. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И КЛЕТОЧНЫЕ ТИОЛЫ КАК ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ РЕДОКС-СТАТУС КЛЕТОК 1.1 Активные формы кислорода Поддержание нормального редокс-статуса внутри клеток всех организмов играет важную роль в их жизнедеятельности. В то же время, изменения редокссостояния внутриклеточного содержимого, являющиеся следствием стрессовых воздействий или результатом активности самих клеток, вносят вклад в регуляцию клеточных процессов. В значительной мере, поддержание редокс-гомеостаза и редокс-регуляция обеспечиваются взаимодействием активных форм кислорода (АФК) и тиол-содержащих молекул, глутатиона, тиоредоксинов, глутаредоксинов и др. (Октябрьский, Смирнова, 2007). Активные формы кислорода (АФК), вызывающие окислительный стресс, являются неизбежным следствием аэробного образа жизни организмов. В клетках E. coli одноэлектронное восстановление молекулярного кислорода флавиновыми ферментами или окисление хинонов может приводить к генерированию супероксидного аниона (Imlay, Fridovich, 1991; Messner, Imlay, 1999). О2- является нестабильным и при его дальнейшем восстановлении образуется Н2О2 (Fridovich, 1995). Последняя вступает в реакцию с восстановленным железом, приводя к образованию гидроксильного радикала (·ОН) (реакция Фентона). Еще одна реакция, приводящая к образованию .OH, это катализируемая металлами реакция между O2·ˉ и H2O2 (реакция Хабер-Вейса). АФК повреждают белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Действие супероксидного радикала связано, главным образом, с инактивацией ферментов семейства дегидратаз, вследствие окисления железо-серных кластеров [4Fe-4S] (Flint et al., 1993). H2O2 эффективно окисляет тиолы в ферментах, переводя их в неактивную форму. Гидроксильный радикал обладает наибольшей реакционной 15 способностью, а, следовательно, и токсичностью в отношении большинства биомолекул, включая ДНК (Imlay, Linn, 1988, Imlay, 2003). К активным формам кислорода относят продуцируемые фагоцитарными клетками азотные интермедиаты (NO, HOONO, RSNO). In vitro показано, что окись азота (NO) блокирует дыхание бактерий посредством связывания с активным центром цитохромоксидаз (Butler et al., 1997). Пероксинитрит (HOONOˉ), формируемый в результате реакции между NO· и O2·ˉ, быстро окисляет дегидратазные кластеры и тиолы (Keyer, lmlay, 1997). Нитрозотиолы (RSNO), стимулирующие окисление тиолов, образуются при взаимодействии пероксинитритов с тиолами (Vliet et al., 1998), либо оксида азота с тиолами в присутствие кислорода или металлов (Gow et al., 1997). 1.2 Редокс-активные тиолы 1.2.1 Цистеин L-цистеин – тиол-содержащая аминокислота, входящая в состав белков, необходима для биосинтеза большого числа серосодержащих соединений (метионин, тиамин, биотин и коферменты). Кроме того, цистеин играет ключевую роль в сборке белковых молекул, их фолдинге и стабилизации посредством формирования дисульфидных связей. L-цистеин-содержащие белки, такие как тиоредоксин (Trx) и глутаредоксин (Grx), участвуют в защите клеток от окислительного стресса. Недавно показано, что периплазматический цистеин защищает клетки Escherichia coli от продуцируемого фагоцитами пероксида водорода (Ohtsu et al., 2010). В то же время, в определенных условиях цистеин может индуцировать окислительный стресс. При возрастании внутриклеточной концентрации он восстанавливает свободное железо, способствуя в ходе реакции Фентона продукции гидроксильных радикалов, повреждающих ДНК (Park, Imlay, 2003). Клетки бактерий поддерживают низкий уровень цистеина в цитоплазме, что достигается путем регуляции его синтеза и деградации. Синтез цистеина включает две стадии. На первом этапе происходит О-ацетилирование L-серина при участии L-серин-О-ацетилтрансферазы (SAT, cysE). А далее О-ацетил-L- 16 серин(тиол)-лиаза замещает ацетильную группу на серу. Один из способов регуляции уровня цистеина происходит по типу обратной связи, когда избыток цистеина ингибирует активность фермента собственного биосинтеза – SAT (Kredich, 1992, 1996). Предотвращение аккумуляции избыточного количества Lцистеина в клетке может также обеспечиваться работой фермента L- цистеиндесульфгидраза (CD), которая отщепляет аминогруппу от цистеина, образуя пируват. У E. coli идентифицировано 5 различных CDs (MetC, MalY, CysK, CysM, TnaA) (Awano et al., 2005). Включение цистеина в состав глутатиона может рассматриваться как еще один способ регуляции его внутриклеточного уровня для защиты микробной клетки от окислительного стресса. Гены биосинтеза цистеина и гены, чьи продукты отвечают за поступление цистина, совместно образуют цистеиновый регулон, находящийся под контролем транскрипционного фактора CysB. Регулон включает в себя также белки, ответственные за поступление и восстановление окисленных источников серы, таких как сульфаты или тиосульфаты (Berger, Heppel, 1972). Для активации белка CysB необходим индуктор – N-ацетил-L-серин (NAS), который формируется из О- ацетил-L-серина (OAS) (Kredich, 1996). Еще один ген, cbl вовлечен в регуляцию второго пути биосинтеза цистеина из органических соединений серы. Его экспрессия находится под контролем транскрипционного фактора cys-регулона, а аминокислотная последовательность Cbl на 40% идентична таковой у CysB (Iwanicka-Nowicka, Hryniewicz, 1995). В клетках E. coli гены fliY, yecS и yecC кодируют белки, которые совместно образуют L-цистин/L-цистеиновый комплекс транспортеров АВС суперсемейства, осуществляющий импорт цистеина. FliY – периплазматический связывающий белок (Butler et al., 1993), а YecC и YecS – АТФ-связывающая и мембранная субъединицы, соответственно (Kertesz, 2001). Quadroni с коллегами показали, что экспрессия первого гена данного комплекса переносчиков, значительно индуцируется при сульфатном голодании (Quadroni et al., 1996). Кроме того, идентифицирован второй, более специфичный, цистеиновый транспортер, кодируемый геном ydjN, который отвечает за поступление цистеина в момент 17 роста микроорганизмов на минимальной среде (Berger, Heppel, 1972). Недавно установлено, что YdjN способен транспортировать такие токсичные соединения как L-селенопролин и L-селеноцистин (Deutch et al., 2014). За экспорт цистеина отвечает другая транспортная система, а именно CydDC, которая, как и система импорта цистеина, принадлежит к суперсемейству АВС-кассетных переносчиков. Помимо цистеина данные белки осуществляют перенос глутатиона из цитоплазмы, что делает данный комплекс переносчиков важным инструментом в поддержании редокс-баланса периплазматического пространства (Pittman et al., 2002, 2005). Другие неспецифические цистеиновые переносчики-импортеры локализованы как во внутренней мембране (YdeD, YfiK, Bcr) (Daßler et al., 2000; Franke et al., 2003), так и наружной (TolC) (Wiriyathanawudhiwong et al., 2009). Полипептид TolC никак не связан с транспортерами во внутренней мембране, что свидетельствует о первоначальном накоплении экспортируемого цистеина в периплазматическом пространстве (Wiriyathanawudhiwong et al., 2009). 1.2.2 Глутатион 1.2.2.1 Свойства и синтез глутатиона Глутатион (GSH) – низкомолекулярный тиол, который присутствует в клетках всех эукариот (Meister, Andersen, 1983) в концентрациях от 0.5 до 10 мМ (наибольшее содержание отмечено в клетках печени животных). При этом основная часть внутриклеточного GSH, а именно, 80-85% сосредоточена в цитозоле, 10-15% в митохондриях и незначительная доля тиола приходится на эндоплазматический ретикулум (Meredith, Reed, 1982; Yuan, Kaplowitz, 2009). В миллимолярных концентрациях GSH присутствует в клетках всех грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий (Fahey et al., 1978), где играет ключевую роль в защите от окислительного, осмотического, теплового стрессов, воздействия некоторых антибиотиков, соединений хлора и токсинов (метилглиоксаль) (Смирнова и др., 2001; Ferguson, Booth, 1998; Smirnova, Oktyabrsky, 2005). Как биологически активное соединение, глутатион 18 широко используется при производстве фармпрепаратов и пищевых продуктов (Valencia et al., 2001). Фирмы, продающие глутатион, рекламируют его как «суперантиоксидант» и «универсальное лекарство природного происхождения без неблагоприятных побочных эффектов». В биотехнологии в качестве продуцентов глутатиона часто используются генно-инженерные штаммы Saccharomyces cerevisiae и Candida utilis (Li et al., 2004). Глутатион представляет собой трипептид - L-γ-глутамил-L- цистеинилглицин с молекулярным весом 307 г/моль. При физиологических значениях рН трипептид имеет две отрицательно заряженных карбоксильных группы и положительно заряженную аминогруппу. Благодаря наличию в молекуле сульфгидрильной группы GSH может выступать в качестве донора электронов, т.е. проявлять функции восстановителя. Одноэлектронная реакция GSH со свободными радикалами приводит к образованию тиильного радикала GS-. Димеризация GS- с другим GS- радикалом дает дисульфид глутатиона GSSG. Глутатион принимает участие в реакциях тиол-дисульфидного обмена, которые приводят к синтезу смешанных дисульфидов с белками (GSSR) (Kosower, Kosower, 1978). При двухэлектронном окислении GSH происходит образование интермедиата, который реагирует со второй молекулой, идентичной или отличной от первой. При этом в первом случае образуется дисульфид глутатиона (GSSG), а во втором – смешанный дисульфид. GS‾ + I2 → GSI + I ˉ GS‾ + GSI → GSSG + I ˉ Благодаря наличию двух карбоксильных групп, одной аминогруппы и одной тиольной, глутатион хорошо растворим в водных растворах и полярных растворителях. γ-глутамильная пептидная связь между глутаминовой кислотой и 19 цистеином защищает трипептид от деградации внутриклеточными протеазами. Одним из известных в настоящее время ферментов, осуществляющих гидролиз этой связи, является γ-глутамилтранспептидаза (GGT), находящаяся с наружной стороны цитоплазматической мембраны. Терминальный карбоксильный остаток глицина защищает молекулу GSH от разрезания внутриклеточной γ- глутамилциклотрансферазой. Таким образом, GSH защищен от внутриклеточной деградации и метаболизируется преимущественно во внеклеточном пространстве (Sies, 1999). Глутатион синтезируется в ходе двух последовательных реакций: L-Glu + L-Cys + ATP ↔ L- γ -Glu-L-Cys + ADP + Pi (1) L- γ -Glu-L-Cys + Gly + ATP ↔ GSH + ADP + Pi (2) В клетках Escherichia coli 1 и 2 реакции катализируются продуктами генов gshA и gshB, соответственно. gshA кодирует цитозольную АТФ-зависимую γглутамилцистеинсинтетазу (γ-GCS), которая катализирует образование пептидной связи между γ-карбоксильной группой глутамата и α-аминогруппой цистеина (Meister, Anderson, 1983). В клетках прокариот и эукариот эта реакция регулируется по типу обратной связи. Работа фермента блокируется глутатионом, который входит в активный центр γ-GCS и занимает глутамат-связывающий сайт. В животных и растительных организмах γ-глутамилцистеинсинтетаза является димером, в то время как γ-GCS, выделенная из клеток E. coli, представляет собой одну полипептидную цепь с молекулярным весом 58,3 кДа (Huang et al., 1988). Продукт гена gshB – цитозольная АТФ-зависимая GSH-синтетаза (GS), образующая пептидную связь между α-карбоксильной группой цистеина в составе γ-глутамилцистеина и α-аминогруппой глицина. Фермент представляет собой тетрамер, состоящий из идентичных субъединиц по 35,6 кДа (Yamaguchi et al., 1993). Активность GSH-синтетазы полностью ингибируется р-хлоро- меркурийбензоатом и Hg2+, что свидетельствует о наличии тиоловой группы в активном центре (Murata, Kimura, 1990). 20 1.2.2.2 Восстановление глутатиона (глутатионредуктаза) Ключевым функциональным элементом в молекуле GSH является остаток цистеина, обеспечивающий наличие реакционноспособной тиольной группы. Окисление глутатиона с образованием дисульфида глутатиона GSSG происходит в неферментативных реакциях с дисульфидами, металлами, АФК и в реакциях, катализируемых пероксидазами. Так как GSSG токсичен для биомолекул из-за способности легко вступать в реакцию со свободными SH-группами, клетки поддерживают высокое соотношение GSH/GSSG (Meister, Anderson, 1983). GSSG восстанавливается до глутатиона при участии фермента глутатионредуктазы (GOR), которая осуществляет перенос восстановительных эквивалентов от НАДФН на дисульфид (Schirmer et al., 1989). NADPH + GSSG + H+ → 2GSH + NADP В клетках E. coli глутатиоредуктаза, кодируемая геном gor, состоит из двух субъединиц по 55 кДа каждая (Greer, Perham, 1986). Бактерии, мутантные по этому ферменту, сохраняют нормальную способность к росту на богатых и бедных средах в жидкой культуре и на агаризованной среде (Davis et al., 1982; Tuggle, Fuchs, 1985). Мутанты по gor поддерживают высокий внутриклеточный уровень восстановленного глутатиона, что указывает на возможность альтернативного пути для восстановления GSSG, независимого от GOR (Tuggle, Fuchs, 1985). Эту функцию могут осуществлять глутаредоксиновая или тиоредоксиновая системы (Russel, Holmgren, 1988). В клетках E. coli ген gor входит в состав OxyR регулона, контролирующего защиту от окислительного стресса, вызванного перекисью водорода (Michan et al., 1999). Активность gor также независимо контролируется глобальным регулятором общего стрессового ответа RpoS (Becker-Hapak, Eisenstark, 1995; Hengge-Aronis, 2002), что указывает на важную роль глутатионредуктазы в защите бактерий от различных неблагоприятных факторов. 21 1.2.2.3 Турновер глутатиона (γ-глутамилтранспептидаза и γглутамильный цикл) Как указывалось, выше, важную роль в деградации глутатиона играет γглутамилтранспептидаза (GGT). GGT присутствует в клетках всех живых организмов от бактерий до млекопитающих (Tate, Meister, 1981). В клетках млекопитающих GGT расположена на наружной стороне цитоплазматической мембраны. У бактерий E. coli GGT – это растворимый периплазматический белок (Suzuki et al., 1986), кроме того, эти бактерии способны усваивать экзогенные γглутамильные пептиды исключением, где (Suzuki GGT et al., 1993). ассоциирована с Единственным внутренней известным поверхностью цитоплазматической мембраны, является Neisseria meningitides (Takahashi, Watanabe, 2004). GGT взаимодействует с глутатионом и другими γ-глутамильными соединениями, образуя γ-глутамильный остаток, связанный с ферментом, и Lцистеинилглицин. С участием дипептидазы цистеинилглицин затем разлагается на цистеин и глицин, которые поглощаются клеткой. γ-Глутамильная форма транспептидазы может взаимодействовать с аминокислотами, водой или с другой молекулой глутатиона. Если акцептором γ-глутамильной группы является вода, происходит гидролиз (Meister, Anderson, 1983; Suzuki et al., 2001; Tate, Meister, 1981). Транспептидация: GSH+ L-amino acid → L- γ-Gly-L-amino acid + L-Cys-Gly Автотранспептидация: 2 GSH → L- γ-Gly-GSH + L-Cys-Gly Гидролиз: GSH + H2O → L-glutamate + L-Cys-Gly Хорошими акцепторами γ-глутамильной группы являются цистин, глутамин, метионин, аланин и другие нейтральные аминокислоты и некоторые дипептиды. На следующем этапе γ-глутамильный остаток γ- 22 глутамиламинокислоты циклизуется ферментом γ-глутамилцикло-трансферазой в 5-оксопролин: L- γ-Gly-L-amino acid → L-amino acid + 5-oxo-L-proline Фермент имеет такую же специфичность, как GGT, что указывает на последовательное функционирование этих ферментов в клетке. 5-оксопролин далее гидролизуется в АТФ-зависимой реакции до глутаминовой кислоты (Meister, Anderson, 1983). 5-oxo-L-proline + ATP + 2 H2O → L-glutamate + ADP + Pi Гидролиз 5-оксопролина, катализируемый 5-оксопролиназой, по-видимому, является лимитирующим этапом на пути деградации глутатиона в клетках млекопитающих. Пути деградации и синтеза глутатиона Мейстер объединил в единый цикл, который назвал γ-глутамильным циклом, и определил его главную функцию транспорт аминокислот (Thompson, Meister, 1977; Meister, Anderson, 1983). Согласно этой идее, при взаимодействии GGT, глутатиона и аминокислоты на наружной стороне клеточной мембраны образуется γ-глутамиламинокислота, которая транспортируется в клетку, где конвертируется в соответствующую аминокислоту и 5-оксопролин. 5-оксопролин затем преобразуется в глутамат и используется при синтезе глутатиона (Meister, Anderson, 1983). Гипотеза Мейстера подвергалась интенсивной критике. Дальнейшие исследования, однако, подтвердили ключевую роль GGT в турновере глутатиона и участие этого фермента в транспорте, по крайней мере, одной аминокислоты, цистина, которая является наиболее активным акцептором для γ-глутамильного остатка глутатиона. Образующийся при этом γ-глутамилцистин прямо поглощается клетками, где восстанавливается в γ-глутамилцистеин и цистеин, затем γ-глутамилцистеин может использоваться для синтеза GSH при участии GSH-синтетазы (Meister, Anderson, 1983). При этом клеткам удается обойти первую лимитирующую стадию биосинтеза глутатиона, катализируемую γ-GCS. Таким образом, обеспечивая клетки цистеином или γ-глутамилцистеином, GGT 23 играет важную роль в поддержании внутриклеточного уровня GSH в клетках, которые не могут прямо поглощать GSH из среды. 1.2.2.4 Транспорт глутатиона Вход глутатиона у большинства клеток животных происходит с помощью GGT, которая разлагает его с наружной стороны мембраны и возвращает в клетки в виде фрагментов. У растений деградация экстраклеточного глутатиона может происходить без участия GGT, путем прямого поглощения глутатиона из наружной среды цитоплазматической (Rennenberg, мембране, 1982). Кроме обнаружена транспортных система транспорта систем в GSH во внутренней мембране митохондрий. Для поддержания GSH в матриксе и для его транспорта внутрь митохондрий необходим протонный градиент, процесс стимулируется АТФ. Этот процесс играет важную роль в защите клеток от окислительного повреждения и индуцируемой цитокинами клеточной смерти (Matsumaru et al., 2003; Lash, 2006). Было показано, что мутант E. coli, дефектный по синтезу GGT, накапливал в среде больше GSH по сравнению с родительским штаммом, но сохранял, хотя и в меньшей степени, способность снижать концентрацию внеклеточного глутатиона в стационарной фазе роста. Это свидетельствовало о том, что GGT не является единственным механизмом, возвращающим глутатион в клетки (Suzuki et al., 1987). Позднее был обнаружен комплекс белков-импортеров GSH, представленный АТФ-связывающим кассетным транспортером GsiABCD, где GsiA – АТФ-связывающий компонент, GsiB – периплазматический белок, а GsiC и GsiD компоненты цитоплазматической мембраны (Suzuki et al., 2005). Parry и Clark обнаружили также, что у E. coli в транспорт глутатиона вовлечен ген ybiK. С помощью репортерного генного слияния ybiK::lacZ, было показано, что этот ген находится под контролем cysB, кодирующего транскрипционный активатор цистеинового регулона. Мутанты ybiK и cysB были не способны использовать GSH в качестве единственного источника серы, что указывает на участие ybiK в транспорте глутатиона (Parry, Clark, 2002). На основе генетических и 24 биохимических методов показано, что у грамположительной бактерии Streptococcus mutans импорт тиола GSH осуществляется при участии белка GshT через L-цистиновый АВС транспортер TcyBC, который ранее рассматривался исключительно как переносчик L-цистина (Vergauwen et al., 2013). Практически все типы клеток экспортируют GSH, GSSG и GS-конъюгаты наружу. Этот процесс имеет большое значение для детоксикации различных липофильных веществ и ксенобиотиков, и поддержания внутриклеточного редоксстатуса (Meister, Anderson, 1983). Механизмы экспорта глутатиона изучены намного слабее, чем его импорт в клетки. Было обнаружено, что АТФ-зависимый кассетный переносчик CydDC, который обеспечивает сборку периплазматического цитохрома с и цитохрома bd хинолоксидазы (Poole et al., 1994), участвует в транспорте GSH (но не GSSG) через цитоплазматическую мембрану в периплазму (Pittman et al., 2005). Этот факт, а также открытая ранее функция cydDC как экспортера аминокислоты цистеина из цитоплазмы (Pittman et al., 2002), подтверждают важную роль данных переносчиков в поддержании редокс-гомеостаза периплазматического пространства. Также как и клетки млекопитающих, бактерии способны транспортировать глутатион-S-конъюгаты в среду (Kaluzna, Bartosz, 1997). В геноме E. coli имеются гомологи АТФ-зависимого транспортера Р-гликопротеина из клеток человека, который относится к транспортерам с широкой субстратной специфичностью (multidrug transporters). Однако его роль в транспорте GSH или его производных из клеток E. coli не показана (Putman et al., 2000). Точно также неизвестно, участвует ли в выходе GSH какой-либо из девяти известных для E. coli транспортеров с широкой субстратной специфичностью, использующих в качестве движущей силы транспорта трансмембранный электрохимический градиент протонов (Nikaido, 1996; Puttman et al., 2000). 1.2.2.5 Трансмембранная циркуляция глутатиона Было показано, что в растущей аэробной культуре E. coli постоянно происходит циркуляция глутатиона между клетками и средой. В результате 25 динамического баланса между входом и выходом этого тиола поддерживается постоянная концентрация внеклеточного глутатиона в пересчете на единицу биомассы. Величина этой концентрации строго зависит от значений рН среды. Обработка клеток протонофорами, ионофорами и слабыми кислотами, а также изменение экстраклеточного рН приводят к стимуляции выхода глутатиона. Отмечена тесная связь между экспортом глутатиона и доступностью неорганического фосфата (Smirnova et al., 2012). Авторы предположили, что циркуляция глутатиона может быть включена в регуляцию редокс-статуса периплазмы, защиту этого компартмента от окислительного стресса и регуляцию трансмембранных ионных потоков. 1.3 Тиол-зависимые редокс-системы клетки 1.3.1 Глутаредоксины и тиоредоксины Среди редокс-зависимых процессов, протекающих в бактериальных клетках, особый интерес представляет регуляция с участием двух систем, глутаредоксиновой и тиоредоксиновой. Первая система включает глутаредоксины (Grx), глутатион (GSH), неферментативно восстанавливающий окисленные глутаредоксины, и глутатионредуктазу (GOR), которая в свою очередь восстанавливает окисленный глутатион (GSSG) с использованием НАДФН (Holmgren, 1985; Holmgren, Aslund, 1995). Вторая система, кроме тиоредоксинов (Trx), включает НАДФН-зависимую тиоредоксинредуктазу (TrxR), восстанавливающую окисленную форму тиоредоксина. У E. coli глутаредоксины и тиоредоксины – это небольшие белки, содержащие характерную для суперсемейства тиоредоксинов окислительно-восстановительные структуру реакции (Trx с fold) и катализирующие использованием редокс-химии цистеиновых остатков. Глутаредоксин обнаружен во всех таксономических группах живых организмов, где представлен в нескольких изоформах, которые катализируют восстановление дисульфидов или смешанных дисульфидов (Holmgren, Aslund, 1995). E. coli содержат три глутаредоксина, Grx1, Grx2 и Grx3, кодируемых 26 генами grxA, grxB, grxC, (Aslund et al., 1994) и два Grx-подобных белка (Grx4, кодируемый grxD, и NrdH, кодируемый nrdH) (Vlamis-Gardikas 2008; Meyer et al. 2009). В отличие от других Grxs, окисленный NrdH восстанавливается TrxR, тогда как Grx4 восстанавливается TrxR или Grx1. Глутаредоксины используют два каталитических механизма, моно- и дитиоловый, с участием, соответственно, одного или двух остатков цистеина в активном центре. По монотиоловому механизму могут восстанавливаться только смешанные дисульфиды, а по дитиоловому – дисульфиды в белках и смешанные дисульфиды (Bushweller et al., 1992). Мутанты по одному или нескольким глутаредоксинам, за исключением Grx4, сохраняют жизнеспособность. Монотиол Grx4 аккумулируется в стационарной фазе под контролем гуанозинтетрафосфата (ppGpp) и выполняет уникальные функции, связанные с построением FeS кластеров (Vlamis-Gardikas 2008). Grx1 может восстанавливать дисульфиды рибонуклеотидредуктазы (RR) и фосфоаденилилсульфат редуктазы (PAPS редуктазы). Grx3 имеет лишь 5 % каталитической активности глутаредоксина 1 для RR (Lillig et al., 1999). Grx2 не способен восстанавливать RR. Глутаредоксины функционально связаны с глутатионредуктазой соотношением GSH/GSSG, которое является важным индикатором клеточного редокс-статуса, и определяет редокс-потенциал клетки (Schafer, Buettner, 2001). Важной функцией Grx является их участие в тиол-дисульфидных превращениях в реакциях, связанных с передачей внутриклеточных регуляторных сигналов и редокс-регуляцией активности транскрипционных факторов и ключевых ферментов. В клетках E. coli Grx1 находится под контролем транскрипционного регулятора OxyR и участвует в его восстановлении (Zheng et al., 1998; Aslund et al., 1999). Тиоредоксин (Trx) – полифункциональный низкомолекулярный белок, имеющий в своей структуре активный участок Cys-Gly-Pro-Cys, и обладающий оксидоредуктазной активностью. Обнаружен во многих про- и эукариотических клетках (Holmgren, 1985). В клетках E. coli идентифицировано два тиоредоксина: Trx1 (trxA) и Trx2 (trxC). Оба способны восстанавливать рибонуклеотидредуктазу 27 (RR) и 3΄-фосфоаденилсульфатредуктазу (PAPS-редуктаза) in vitro (MirandaVizuete et al., 1997; Lillig et al., 1999). Нуклеотидная последовательность наиболее изученного тиоредоксина 1 несет сайт связывания для белка-активатора катаболитной репрессии (СRP) (Matsumoto et al., 1986). Trx2 имеет дополнительную N-концевую последовательность из 30 аминокислот, которая обладает сходством с Zn-содержащими ДНК-связывающими структурами, обеспечивающими термостабильность (Burlacu-Miron et al., 1998) или участвующими в активации шаперона теплового шока Hsp33 (Jakob et al., 2000). Окисленный тиоредоксин восстанавливается с помощью фермента тиоредоксинредуктазы, состоящей из двух одинаковых субъединиц, связывающих ФАД (Williams, 1995). Структурный анализ тиоредоксинредуктазы E. coli показал, что перенос восстановительных эквивалентов с НАДФН-связывающего домена, на домен, содержащий дисульфид, сопряжен с конформационным изменением (поворотом) первого (Lennon et al., 2000). Тиоредоксинредуктаза может инактивироваться оксидантами, например, Н2О2, что позволяет рассматривать этот фермент как внутриклеточный редок-сенсор (Sun et al., 1999). Тиоредоксин обладает многими функциями: осуществляет регуляцию активности ряда транскрипционных факторов (Schenk et al., 1994), способствует сохранению фолдинга белков и поддержанию их тиолового статуса в цитоплазме (Stewart et al., 1998). Редокс-системы глутатиона и тиоредоксина функционально взаимосвязаны и дополняют друг друга в процессе контроля клеточного редокс-баланса, благодаря системе перекрестной регуляции. Однако они не обмениваются восстановительными эквивалентами между собой (Potamitou et al., 2002a). Главные ферменты-мишени тиоредоксинов и глутаредоксинов у E. coli могут восстанавливаться различными Trxs и Grxs, поэтому отсутствие одного или даже нескольких редоксинов может быть компенсировано другими (Meyer et al., 2009). Рибонуклеотидредуктаза (RNRI), ключевой фермент синтеза ДНК, восстанавливается Trx1, Trx2, Grx1 и, с меньшей эффективностью, Grx3. RNRII восстанавливается с участием NrdH. PAPS- редуктаза, фермент катализирующий 28 ключевой этап в ассимиляции сульфата и биосинтезе цистеина, эффективно восстанавливается Trx1 and Grx1. При окислительном стрессе PAPS-редуктаза инактивируется путем глутатионилирования своего редокс-активного цистеинового остатка, реактивация которого осуществляется при участии Grx3. К числу других ферментов, в восстановлении которых участвуют Trxs и Grxs, относятся метионинсульфоксидредуктаза, периплазматический редокс-белок DsbD, арсенатредуктаза, шаперон Hsp33 и регулятор ответа на пероксидный стресс OxyR (Meyer et al., 2009). Глутаредоксин- и тиоредоксин-зависимые системы участвуют в защите клетки от окислительного стресса (Carmel-Harel, Storz, 2000; Ritz, Beckwith, 2001). Уровень всех типов Grxs повышен в двойном мутанте katGkatE (Vlamis-Gardikas et al., 2002). 1.3.2 Периплазматические редокс-системы Отличительная черта грамотрицательных бактерий – это наличие наружной пористой мембраны, которая вместе с цитоплазматической внутренней мембраной, формирует особый компартмент, называемый периплазматическим пространством. Через внешнюю мембрану неспецифически диффундируют различные молекулы до 600-900 Да, что затрудняет поддержание постоянного редокс-потенциала в периплазме в постоянно меняющейся среде обитания. Периплазма характеризуется более окисленной средой, в отличие от цитоплазмы, где поддерживаются восстановительные условия. Большая часть периплазматических белков требует образования дисульфидных связей для формирования правильной третичной структуры и адекватного функционирования. В клетках E. coli этот процесс происходит при участии продуктов двух генов dsbA и dsbC. DsbA содержит редокс-активную дисульфидную связь (Cys30-Cys33), которая каталитически переносится на белки периплазмы в процессе их фолдинга (Rietsch, Beckwith, 1998). DsbC – периплазматическая дисульфидоксидоредуктаза с изомеразно-редуктазной и шаперонной активностью. Функцию окисления DsbA выполняет связанный с мембраной белок DsbB, который в восстановленном состоянии передает 29 электроны далее в дыхательную цепь (Missiakas et al., 1993). DsbC активен, когда фрагмент Cys-X1-X2-Cys, находится в восстановленном состоянии, в которое переходит при помощи локализованного в мембране белка DsbD. Донором электронов для DsbD является цитоплазматический тиоредоксин 1 (Ritz, Beckwith, 2001). E. coli содержит еще три периплазматических тиоловых редокс-белка: CcmG (DsbE), CcmH и DsbG. Первые два участвуют в биогенезе цитохрома С (Thony-Meyer, 1997). DsbG обладает шаперонной активностью и функционирует как вторая цитоплазматическая дисульфидизомераза (Bessette et al., 1999). Таким образом, цитоплазма и периплазма E. coli обладают несколькими путями, обеспечивающими поддержание тиол-дисульфидного равновесия. Их важность для жизнедеятельности клетки подтверждается тем, что многие из них, сохраняя известную специфичность, имеют перекрывающиеся функции. Тиолредокс реакции в клетке являются каталитическими процессами. Большинство из белков, функционирующих как редуктазы, оксидазы или дисульфидизомеразы, обладают сходной третичной структурой, близкой к тиоредоксину. Редокспотенциал этих белков изменяется в широких пределах: от –125 mV у наиболее окисленного DsbA, до –270 mV у наиболее восстановленного тиоредоксина 1. Способность тиол-редокс белков функционировать в качестве редуктаз или оксидаз определяется окислительно-восстановительными условиями компартмента клетки, в котором они находятся, и наличием или отсутствием редокс-партнеров, способных поддерживать их в окисленном или восстановленном состоянии. Экспрессия некоторых компонентов редокс-систем регулируется в ответ на изменение условий окружающей среды и редокссостояния клетки. 1.4 Eh в бактериальных культурах и низкомолекулярные тиолы Окислительно-восстановительный потенциал (ОВП, редокс-потенциал, Eh) относится к числу интегральных физико-химических параметров, характеризующих состояние микробных культур. В культурах аэробных 30 микроорганизмов основной причиной изменений Eh в процессе культивирования является изменение pH среды и содержания таких редокс-активных газов как O2, H2 и H2S (Работнова, 1950; Hewitt, 1950; Jacob, 1970). Было показано, что в аэробных культурах ряда бактерий наблюдаются скачки редокс-потенциала (до 150 мВ), сопровождающие различные стрессовые ситуации (тепловой и осмотический шок, стресс голода, облучение УФ-светом, обработка антибиотиками). Эти скачки Eh не были прямо связаны с изменениями параметров, которые обычно определяют значение редокс-потенциала микробной культуры (рН, рO2 и др.). Дальнейшие исследования показали, что у E. coli и B. subtilis наиболее существенный вклад в изменения Eh в этих ситуациях вносят изменения уровней внеклеточных тиолов, в том числе, глутатиона, как растворенных в культуральной жидкости, так и ассоциированных с наружной поверхностью клеток. Описываемые выше скачки Eh наблюдались только при росте бактерий на синтетических минеральных средах. На средах более сложного состава с добавлением белковых гидролизатов изменения Eh при стрессах не коррелировали с изменениями экстраклеточных тиолов (Октябрьский, Cмирнова, 2012). 31 ГЛАВА 2. РОЛЬ РЕДОКС-РЕГУЛЯЦИИ ПРИ АДАПТАЦИИ E. COLI К СТРЕССАМ 2.1 Окислительный стресс 2.1.1 Пероксидный стресс Одним из наиболее изученных примеров редокс-регуляции c участием тиолов у бактерий является ответ E. coli на действие пероксида. При обработке клеток E. coli низкими концентрациями H2O2 активируется экспрессия ряда генов, часть из которых находится под контролем транскрипционного фактора OxyR. Среди этих белков: гидропероксидаза I (каталаза, katG), алкилгидропероксид редуктаза (ahpCF), глутаредоксин I (grxA), глутатионредуктаза (gorA), Fur репрессор (fur) и др. (Hidalgo, Demple, 1996). Регуляторный белок OxyR относится к семейству транскрипционных факторов LysR и имеет ДНК-связывающий участок в N-терминальном домене. Согласно модели, предложенной Г. Сторз с сотрудниками, активация происходит OxyR при образовании внутримолекулярной дисульфидной связи, а восстановление этой связи переводит белок в неактивную форму (Storz, Imlay, 1999). Окисленная форма OxyR связывается с промоторами регулируемых генов и стимулирует их транскрипцию при взаимодействии N-терминального домена с α-субъединицей РНК- полимеразы, при этом собственная продукция OxyR ингибируется. При активации OxyR под действием H2O2 происходит образование интрамолекулярной дисульфидной связи между Cys199 и Cys208 (Zheng et al., 1998). Очень высокая чувствительность OxyR к H2O2 связана с особым положительно заряженным окружением Cys199. Образование дисульфидной связи вызывает конформационные изменения в регуляторном домене OxyR, которые придают белку способность активировать транскрипцию. Восстановление этой дисульфидной связи под действием глутаредоксина 1 в присутствии GSH или Trx1 инактивирует OxyR in vitro и in vivo. Важно, что OxyR проявляет чувствительность как к H2O2, так и к изменению внутриклеточного тиолдисульфидного статуса (Zheng et al., 1998; Aslund et al., 1999). 32 Позднее другой группой исследователей был предложен более сложный механизм регуляции активности OxyR (Hausladen et al., 1996; Kim et al., 2002). Они представили доказательства, что активность OxyR контролируется путем различных модификаций Cys199 в ответ на различные стрессы: при окислительном стрессе образуется устойчивое производное сульфеновой кислоты (C199-SOH), при воздействии нитрозотиолов возникает C199-SNO, а при дисульфидном стрессе формируется смешанный дисульфид с глутатионом (C199S-S-G). Авторы предположили, что эти модификации Cys199 активируют OxyR в различной степени, что позволяет индуцировать экспрессию различных групп подконтрольных генов при действии разных стрессов (Hausladen et al., 1996; Kim et al., 2002). Поскольку Grx1 (grxA), катализирующий восстановление дисульфидной связи и деактивацию OxyR, также как и GOR (gor), включены в OxyR регулон, система регулируется по типу отрицательной обратной связи (Imlay, 2008). В отличие от клеток млекопитающих, где GSH при посредстве глутатионпероксидазы прямо участвует в детоксикации пероксида, у E. coli GSH играет в этом процессе косвенную роль как кофактор для восстановления глутаредоксина, регулирующего активность OxyR. Примечательно, что OxyR является одновременно сенсором, «чувствующим» H2O2, и транскрипционным регулятором. Кроме Grx1 и GOR, в OxyR регулон включен также тиоредоксин 2 (trxC) (Ritz et al., 2000). Таким образом, белок OxyR участвует в поддержании гомеостаза внутриклеточной H2O2 и в регуляции тиол-дисульфидного статуса клеток. 2.1.2 Супероксидный стресс В ответ на действие супероксидного радикала, запускается экспрессия группы генов, находящихся под контролем транскрипционных регуляторов SoxR и SoxS. Регуляция этого регулона опосредуется конститутивно экспрессируемым белком SoxR, состоящим из двух субъединиц, каждая из которых содержит [2Fe2S] кластер. [2Fe-2S] кластеры SoxR могут обратимо окисляться и 33 восстанавливаться, но только окисленная форма SoxR является активатором транскрипции, специфичным для soxS промотора. Увеличение синтеза SoxS активирует экспрессию soxRS регулона. Таким образом, редокс-состояние кластеров [2Fe-2S] регулирует активность SoxR как транскрипционного фактора. В присутствии генераторов супероксида происходит быстрое обратимое окисление SoxR (Hidalgo, Demple, 1996; Pomposiello, Demple, 2001). Центральная роль в защите от окислительного стресса принадлежит марганецсодержащей супероксиддисмутазе (MnSOD, sodA), которая осуществляет реакцию дисмутации супероксида с образованием перекиси и молекулярного кислорода. Экспрессия sodA находится под контролем нескольких глобальных регуляторов, вклад которых определяется условиями среды (Compan, Touati, 1993). В анаэробных условиях ген sodA репрессируется двумя регуляторными белками Fnr и ArcAB, репрессия снимается при переходе к аэробным условиям. Дальнейшая активация sodA в аэробных условиях происходит под действием окислительного стресса и регулируется системой SoxRS. Клетки E. coli имеют дополнительно два изофермента SOD – цитоплазматическую железосодержащую супероксиддисмутазу (FeSOD, sodB) и периплазматическую медно-цинковую SOD (CuZnSOD, sodC), но их экспрессия не находится под SoxRS контролем (Fridovich, 1995). До настоящего времени не ясно, какую роль выполняет периплазматическая SOD. Предполагается, что она защищает периплазму от не идентифицированных источников супероксида, а также помогает некоторым бактериальным патогенам выдержать окислительный взрыв, вызванный макрофагами в организме хозяина (De Groote et al., 1997). Помимо sodA, в SoxRS-регулон входят эндонуклеаза IV (nfo), участвующая в системе репарации ДНК, О2- - резистентные изоферменты фумараза (fumC), аконитаза (acnA) и др. (Storz, Imlay, 1999). 34 2.2 ArcAB и FNR системы Для факультативных анаэробных микроорганизмов кислород является одним из сигналов, контролирующих экспрессию генов. В клетках бактерий и архей идентифицировано два типа О2-сенсоров. Сенсоры первого типа напрямую распознают уровень кислорода, благодаря наличию О2-реакционных групп, например, FeS-кластеров, ФАД и др. (Bauer et al., 1999). Сенсоры второго типа реагируют на кислород опосредованно, за счет изменений в активности дыхательной цепи или продукции соответствующих метаболитов. Этот тип представлен такими сенсорами как ArcB в клетках E. coli или PrrB у микобактерий (Oh, Kaplan, 2000). ArcB – трансмембранная сенсор-киназа двухкомпонентной сигнальной системы ArcB/ArcА, которая регулирует генную экспрессию в зависимости от редокс-состояния растущей бактериальной культуры. ArcА является цитоплазматическим ДНК-связывающим белком-регулятором (Iuchi, Lin, 1988). Механизм сигнальной трансдукции, посредством которого ArcB осуществляет мониторинг окислительно-восстановительного статуса клетки, связан с непосредственным взаимодействием белка с хинонами цитоплазматической мембраны. При анаэробных или микроаэробных условиях ArcB подвергается аутофосфорилированию, после чего оказывается способным катализировать реакцию трансфосфорилирования белка-регулятора. Фосфорилированный ArcА (ArcА-P) подавляет экспрессию оперонов, вовлеченных в дыхательный метаболизм, но запускает транскрипцию генов, продукты которых задействованы в ферментативном метаболизме (Liu, Wulf, 2004). В течение аэробного роста или при переходе от анаэробных условий к аэробным происходит окисление двух локализованных в цитозоле редоксактивных цистеиновых остатков ArcB, которые участвуют в образовании внутримолекулярной дисульфидной связи. В этой реакции убихиноны (Eh° +100 mV) (а возможно и другие эффекторы) действуют как прямые оксиданты. 35 Результатом тиол-дисульфидного перехода является ингибирование киназной активности ArcB. Для восстановления дисульфидных связей и, соответственно, активации ArcB в микроаэробных условиях или при переходе к анаэробным условиям требуется менахинон (Eh° -74 mV) (Georgellis et al., 2001). Редокспотенциал ArcB около –41 mV (Alvarez et al., 2013). Chang с коллегами, исследуя генно-экспрессионный профиль E. coli в момент остановки роста, вызванной глюкозо-лактозной диауксией и действием H2O2, обнаружили сверхэкспрессию гена хиноноксидоредуктазы qor, относящегося к генам аэробного метаболизма. Было предположено, что алармон (p)ppGpp напрямую индуцирует белок Qor, который восстанавливая хиноны, способствует репрессии генов аэробного метаболизма фосфорилированной формой белка регулятора ответа ArcА (Chang et al., 2002). Идентифицировано несколько десятков энергетический ArcAB-регулируемых метаболизм, транспорт, оперонов, ответственных выживаемость, катаболизм за и транскрипционную регуляцию. Примечательно, что ArcB относится к большой группе белков, содержащих в своем составе так называемые PAS-домены. Эти белки, как правило, участвуют в трансдукции сигналов при ответе клеток самых разных типов на изменения в редокс-состоянии, концентрации кислорода, энергетическом метаболизме и т.д. (Taylor, Zhulin, 1999). FNR (fumarate and nitrate reductase regulator) является одним из главных транскрипционных регуляторов, контролирующий у E. coli переключение с аэробного на анаэробный метаболизм (Spiro, Guest, 1990; Unden et al., 2002). В анаэробных условиях FNR образует димер и содержит по одному кластеру [4Fe4S]2+ в каждом мономере. В этом состоянии FNR, связываясь с ДНК, репрессирует транскрипцию генов, требуемых для аэробного метаболизма, и активирует экспрессию генов, включенных в анаэробный транспорт электронов и метаболизм. В присутствии кислорода происходит инактивация FNR, вследствие прямого взаимодействия кластера с кислородом и его конвертирования в состояние [2Fe-2S]. Этот процесс происходит даже при очень низкой внутриклеточной концентрации O2 (1 мкМ). В этом состоянии FNR не способен к 36 димеризации и неактивен (Lazazzera et al., 1996). Установлен механизм контроля функционального состояния FNR с помощью кислорода и глутатиона. Согласно представленной модели функциональное состояние FNR определяется его быстрой инактивацией кислородом и медленной реактивацией глутатионом, выступающим в роли редуктанта (Tran et al., 2000; Unden et al., 2002). In vitro показано, что глутатион служит в качестве восстановителя дисульфидных остатков apoFNR и SH- группы цистеина при участии цистеиндисульфуразы (IscS). Кроме того предполагается, что, помимо глутатиона, в формировании активного FNR, задействованы ионы железа и, вероятно, другие факторы (Unden et al., 2002). Показано взаимодействие и перекрывание функций FNR и ArcBA (Liu, Wulf, 2004). Накопленные данные указывают на то, что cистема ArсBA наиболее значима в микроаэробных условиях, тогда как FNR - в строго анаэробных. Оба регулятора (FNR и ArcA) являются модуляторами экспрессии SoxRSрегулируемых генов. Кроме того, FNR контролирует периплазматическую CuZnSOD (sodC) (Gort et al., 1999; Compan, Touati, 1993). Это указывает на наличие у бактерий множества связей между глобальными транскрипционными сетями, что позволяет им эффективно адаптироваться к изменениям в окружающей среде. 2.3 Общий стрессовый ответ и строгий ответ При воздействии стрессора на бактериальную клетку происходит активация экспрессии генов специфических белков, участвующих в ее защите. Для запуска транскрипции необходим малый пептид - σ-фактор, который обратимо связывается с кор-ферментом РНК-полимеразы, образуя холофермент (Ishihama, 2000). У Е.coli обнаружено 7 различных видов сигма-субъединиц, которые конкурируют за связывание с РНК-полимеразой. Итог конкуренции обусловливает характер ответа микроорганизма на стрессовые условия. При переходе в стационарную фазу, а также при ответе клетки на различные типы стресса быстро и на высоком уровне индуцируется транскрипционный фактор σS 37 (RpoS) (Hengge-Aronis, 2002). Прямо или опосредованно белок RpoS регулирует 10% генома кишечной палочки, что составляет приблизительно 500 генов, которые относятся к разнообразным функциональным группам (метаболизм, транспорт, адаптация) и образуют глобальный регулон общего стрессового ответа (Weber et al., 2005). Регуляция RpoS при действии различных стимулов осуществляется на всех возможных уровнях (транскрипции гена, трансляции, протеолиза и активности белка) при посредстве множества факторов, включая малые молекулы, малые регуляторные РНК и белки (Hengge, 2008). Транскрипция RpoS активируется при снижении скорости роста бактерий по механизму, использующему алармон строгого ответа гуанозинтетрафосфат (ррGрр). Более того, ррGрр может опосредованно запускать транскрипцию rpoS, через аккумуляцию полифосфата (Traxler et al., 2008). В активации транскрипции RpoS участвует также cAMP-CRP и двухкомпонентная система BarA/UvrY (Hengge, 2008). Негативные транскрипционные регуляторы, которые могут напрямую блокировать промотор rpoS в экспоненциально растущей культуре, представлены такими ДНК-связывающими белками как Fis Salmonella enterica и фосфорилированная форма белка ArcA (ArcA-P) (регуляторный белок двухкомпонентной сигнальной системы ArcB/ArcA) у E.coli. Регуляция трансляции осуществляется на уровне вторичной структуры мРНК rpoS. Протяженная 5` нетранслируемая (UTR) область мРНК при сворачивании в петельную структуру изолирует рибосом-связывающий сайт и препятствует трансляции. Данная ингибиторная шпилька открывается при комплементарном спаривании с 5`UTR мРНК rpoS с малыми РНК (sRNAs) DsrA, RprA, ArcZ, для функционирования которых необходим шаперон Hfq (Brennan, Link, 2007). sРНК OxyS напротив негативно регулирует трансляцию RpoS (Zhang et al., 1998). σS белок быстро деградирует в момент экспоненциального роста бактериальной культуры в оптимальных условиях. Протеолиз останавливается, либо замедляется при входе в стационарную фазу или действии стрессовых факторов (голодание по C, Mg, P) (Hengge, 2008). Деградацию белка 38 осуществляет ClpXP АТФ-зависимая протеаза стационарной фазы при участии регуляторного белка-адаптора RssB в фосфорилированном состоянии. Антиадапторные белки IraP, IraM и IraD, взаимодействуя с RssB, препятствуют деградации RpoS in vivo и in vitro при неблагоприятных условиях. ArcB/ArcA/RssB трехкомпонентная система координирует экспрессию и протеолиз белка RpoS с энергетическим метаболизмом клетки в ответ на изменения редокс-состояния дыхательной цепи (Hengge, 2008). Как отмечено выше, фосфорилированный ArcA действует как прямой репрессор транскрипции rpoS путем связывания с двумя сайтами, фланкирующими его промотор. Сенсорная киназа ArcB фосфорилирует не только регуляторный белок ArcA, но и RssB, фосфорилированная форма которого стимулирует протеолиз RpoS. Сигнал, прямо воспринимаемый ArcB, – это редокс-состояние хинонов дыхательной цепи. Окисление хинонов приводит к инактивации ArcB, снижению фосфорилированных форм ArcA и RssB и, в конечном итоге, к дерепрессии транскрипции rpoS и снижению протеолиза белка RpoS. Повышенный уровень RpoS, в свою очередь, индуцирует экспрессию генов общего стрессового ответа. Интересно, что изменения регулировать уровень редокс-потенциала среды (Eh) также могут RpoS, хотя механизм данного процесса остается неизвестным (Komitopoulou et al., 2004). В трансляционной и посттрансляционной регуляции RpoS значительная роль принадлежит алармону гуанозинтетрафосфату (p)ppGpp – уникальной молекуле строгого («стринджент») ответа на стресс (Magnusson et al., 2005; Potrykus, Cashel 2008). Первоначально данный механизм адаптации был обнаружен при аминокислотном голодании бактериальных клеток (Cashel et al., 1996). Сегодня термин «стринджент» ответ используется для обозначения широкого ряда стрессовых ответов, протекающих с аккумуляцией нуклеотида (p)ppGpp, который напрямую связываясь с β и β′ субъединицами кор-фермента РНК-полимеразы, приводит к согласованному торможению синтеза РНК, ДНК, белка и пептидогликана (Chang et al., 2002). 39 E. coli использует два различных способа продукции (p)ppGpp: RelA- и SpoT-зависимые механизмы. Данные белковые факторы являются синтазами и имеют по два домена на N-конце белковой молекулы, синтазный и гидролазный. В RelA активен только синтазный домен, тогда как в SpoT активны оба. Поэтому SpoT проявляет двойную функцию, отвечая и за синтез, и за гидролиз (p)ppGpp (Xiao et al., 1991). При аминокислотном голодании возрастает количество незаряженных тРНК в аминоацильном центре рибосом, что является сигналом для RelA синтезировать гуаниловые нуклеотиды путем переноса пирофосфатной группы с АТФ на ГТФ или ГДФ (Сashel et al., 1996). Бифункциональный SpoT распознает состояние дефицита по источникам углерода, фосфата, железа и жирных кислот, запуская синтез алармона (Xiao et al., 1991; Seyfzadeh et al., 1993; Vinella et al., 2005). 2.4 Другие примеры участия тиолов в редокс-регуляции Обнаружен ряд других редокс-чувствительных белков, окисление которых является сигналом для активации подконтрольных систем. Среди них транскрипционные регуляторы OhrR, PpsR/CrtJ, PerR, шаперон Hsp33 и другие. Активация этих белков достигается путем различных механизмов: цистеиновый остаток OhrR образует производное сульфеновой кислоты (C15-SOH), репрессоры PpsR/CrtJ формируют обратимую дисульфид, а Hsp33 окисляется с образованием двух дисульфидных связей и освобождением цинка с последующей димеризацией белка (Paget, Buttner, 2003). Регуляция путем глутатионилирования существенных SH- групп, обычная у эукариот, возможна и в клетках прокариот. Одним из прокариотических белков, для которых показана возможность регуляции путем образования смешанного дисульфида с глутатионом, является PAPS-редуктаза E. coli (Vlamis-Gardikas et al., 2002). Недавно было показано, что в клетках E. coli тиоредоксин способен связываться с 80 белками, участвующими в различных клеточных процессах (Kumar et al., 2004). Наличие среди этих белков транскрипционных регуляторов 40 указывают на потенциальную возможность участия тиоредоксина в редоксрегуляции активности бактериальных клеток. 2.5 Роль GSH в регуляции транспорта К+ К числу важных функций глутатиона у грамотрицательных бактерий относится его участие в регуляции внутриклеточного уровня ионов К+. Клетки всех живых организмов аккумулируют К+. У бактерий этот катион играет центральную роль в поддержании клеточного тургора, гомеостаза цитоплазматического рН и передачи информации из среды в клетку (Booth, 1985; Epstein et al., 1993). У E. coli в поглощении К+ участвуют три системы: конститутивная TrkG/H, индуцибельная Kdp, обладающая высоким сродством к ионам К+, и Kup (TrkD) (Epstein et al., 1993). Для выхода К+ из клеток важное значение имеют продукты конститутивно экспрессируемых генов kefB и kefC, представляющих собой два независимых К+ канала. Мутации в этих двух генах предотвращают поддержание клетками высокого трансмембранного градиента калия и требуют высоких концентраций калия для роста (Bakker et al., 1987; Meury, Kepes, 1982; Epstein et al., 1993). Быстрый выход К+ из клеток наблюдается при обработке бактерий N-этилмалеимидом (NEM) и другими тиоловыми реагентами (Meury et al., 1980; Elmore et al., 1990). Одновременно было показано, что клетки E. coli, дефицитные по синтезу глутатиона, быстро теряют К+ при переносе в среду, не содержащую К+, и не могут расти на среде с низким содержанием К+, в отсутствие экзогенного GSH или его аналога, офтальмовой кислоты (Meury, Kepes, 1982; Meury, Robin, 1985). Показано также, что GSHопосредуемое открытие К+-каналов зависит от окислительного метаболизма, оксиданты и редуктанты модифицируют скорость выхода калия в стационарном состоянии. При этом восстановительные условия (воздействие цианида, редуктантов и анаэробиоз) ингибируют выход калия в клетках дикого типа, что соответствует закрытому К+ каналу; окислительный метаболизм субстратов переводит каналы в физиологически открытое состояние; а действие оксидантов (перекись водорода и t-бутил-гидропероксид) и тиоловых реагентов (диамид, 41 NEM, p-хлормеркурибензоат, HgCl2) вызывает полное открытие каналов и вытекание К+ из клеток («leaky» фенотип) (Meury, Robin, 1990). На основании приведенных выше данных была предложена гипотеза о том, что продукты генов kefB и kefC образуют калиевые каналы, а глутатион участвует в их регуляции, закрывая каналы (Meury, Kepes, 1982). Кроме того, было высказано предположение, что выход К+ через эти каналы контролируется редокс-состоянием клетки. Предполагалось также, что редокс-состояние глутатиона прямо или косвенно может влиять на открытие калиевых каналов, поэтому в растущих бактериях соотношение GSH/GSSG может быть одним из факторов, контролирующих скорость выхода К+ (Meury, Robin, 1990). Последующие исследования дали дополнительные доказательства в пользу гипотезы об участии глутатиона в регуляции калиевых каналов KefB и KefC, однако предположение о регуляторной роли редокс-состояния клетки в активности каналов не получило дальнейшего экспериментального развития. KefB и KefC являются большими белками (более 600 аминокислот) и состоят из каналообразующего N-терминального мембранного домена и Стерминального домена, соединенных экстремально гидрофильным линкером. Стерминальный домен содержит центр связывания глутатиона и отвечает за регуляцию каналов трипептидом (Munro et al., 1991; Ness, Booth, 1999). KefB и KefC содержат дополнительные субъединицы, необходимые для их полной активности (YabF и YheR для KefC и KefB, соответственно) (Miller et al., 2000). Гомологи KefB и KefC обнаружены у многих грамотрицательных бактерий, что свидетельствует о важности выполняемых ими функций (Booth et al., 1996). Было показано, что глутатион-S-конъюгаты электрофильных веществ (NEM, p-хлормеркурибензоат, метил-глиоксаль и др.) могут взаимодействовать с К+ каналами KefB и KefC, приводя к вытеканию К+ из клеток. Добавление редуктантов обращает процесс, вызывая распад конъюгатов. Канал поддерживается в закрытом состоянии как восстановленным глутатионом, так и мембранным потенциалом (отрицательным внутри). 42 Вызванный глутатион-S-конъюгатами выход К+ из бактерий сопровождается входом протонов, закислением цитоплазмы и повышением выживаемости бактерий (Bakker, Mangerich, 1982; Ferguson et al., 1995, 2000). На основании рассмотренных выше данных Booth с коллегами заключили, что основной функцией KefB и KefC является защита клеток бактерий от токсического действия эндогенных (метилглиоксаль) и экзогенных электрофилов (Booth et al., 1996). Более детальные исследования последних лет выявили, что GSH и его конъюгаты (GSX) располагаются в KefC в перекрывающихся «карманах», при этом связывание с GSX вызывает значительные конформационные изменения, приводящие к активации KefC (Roosild et al., 2010). Показано, что конъюгаты обладают более высоким сродством к сайтам связывания, чем GSH, поэтому даже при очень высокой концентрации GSH в цитоплазме, конъюгаты способны активировать выход калия через KefC (Healy et al., 2014). Кроме того, KefC содержит нуклеотид-связывающий домен (KTN), присоединение к которому NADH инактивирует KefC (Fujisawa et al., 2007). Примечательно, что белок TrkA, включенный в транспорт калия в клетки E. coli, также имеет два сайта для связывания NAD(H) (Schlösser et al., 1993). Важность этой связи подтверждается тем, что калиевые каналы животных также регулируются пиридиновыми нуклеотидами (Kilfoil et al., 2013). Пиридиновым нуклеотидам принадлежит важная роль как донорам/акцепторам электронов в различных процессах, включая энергетику, биосинтез, антиоксидантную защиту. Соотношение NAD(P)H/NAD(P), как и GSH/GSSG, определяет редокс-статус цитоплазмы. Накапливается все больше нуклеотидов. Таким данных образом, о два регуляторной компонента, роли пиридиновых обеспечивающих трансмембранную циркуляцию К+ у бактерий, могут находиться под контролем двух важных редокс-систем, что обеспечивает интеграцию транспорта калия в клеточный метаболизм и адаптацию к изменениям в окружающей среде. Cледует отметить, что участие пиридиновых нуклеотидов в регуляции К+-выходных 43 каналов соответствует концепции, предполагающей, что выход К+ через эти каналы контролируется редокс-состоянием клетки (Meury, Robin, 1990). Недавно было обнаружено еще одно важное свойство KefC, связанное с наличием у его компонента KefF оксидоредуктазной активности. Как оказалось, KefF использует NADH и NADPH как доноры электронов, а хиноны (в числе другие соединения) - как акцепторы. Показано, что, будучи электрофилами, хиноны способны активировать KefС, образуя S-конъюгаты с глутатионом (GSQ), однако энзиматическая активность не требуется для активации KefC, поскольку удаление KefF не лишает способности KefC осуществлять экспорт калия. Авторы предположили, что в данной ситуации KefF, катализируя образование GS-Q, выполняет параллельно две функции: снижает редоксактивность электрофильных хинонов и активирует выход калия через KefC систему (Lyngberg et al., 2011). Механочувствительные каналы (MS-каналы) являются еще одним примером связи между транспортом ионов и глутатионом. Эти каналы играют важную роль в регуляции тургорного давления у бактерий и представляют собой мембранные белки, реагирующие на растяжение мембраны увеличением своей способности находиться в открытом состоянии и пропускать ионы по их электрохимическому градиенту (Booth et al., 1996; Blount et al., 1996). Показано, что у E. coli GSH снижает способность MS-каналов открываться в ответ на растяжение мембраны (Koprowski, Kubalski, 1999). Авторы предположили, что глутатион может действовать как редуктант, восстанавливающий дисульфидную связь в молекуле MS-канала или в ассоциированном регуляторном белке (Koprowski, Kubalski, 1999). Рассмотренные выше данные указывают на несомненную роль глутатиона в контроле над калиевыми каналами. Однако накапливаются данные, показывающие, что эта связь является лишь частью сложного молекулярного механизма, который связывает трансмембранную циркуляцию глутатиона, калия и протонов. На это указывают результаты исследований, в которых показана тесная связь между уровнями внутри- и внеклеточных низкомолекулярных тиолов 44 и калия при переходных процессах, сопровождающихся изменениями мембранного потенциала и ΔрН. Примечательно, что при этом в культурах бактерий наблюдались характерные изменения Eh (Oktyabrsky, Smirnova, 1993a,b; Smirnova, Oktyabrsky, 1995; Октябрьский, Смирнова, 2012; Smirnova et al., 2012). 2.6 Транспорт фосфата Фосфор и его соединения входят в состав различных биомолекул и играют ключевую роль в биоэнергетике и сигнальной трансдукции. Большинство организмов в качестве источника фосфора используют преимущественно фосфат. У E. coli гены фосфатного регулона (Pho) включены в восемь отдельных оперонов, совместно регулируются экстраклеточным фосфатом (Pi) и включают гены, необходимые для транспорта и ассимиляции фосфора (Wanner, 1993). Для сигнальной трансдукции при участии неорганического фосфата требуется семь белков, которые взаимодействуют с ассоциированными в мембранах сигнальными комплексами. Эти сигнальные белки включают: сенсорную гистидинкиназу PhoR (интегральный мембранный белок), ДНК-связывающий регулятор PhoB (транскрипционный фактор), четыре компонента АВС транспортера Pst (phosphate-specific transport) и шаперонподобный белок PhoU, функционирующий как ингибитор PhoR/PhoB (Hsieh, Wanner, 2010). При концентрации фосфата менее 4 µM, PhoR, взаимодействуя с фосфатной транспортной системой, распознает уровень периплазматического ортофосфата, автофосфорилируется и переносит фосфорильную группу на белок регулятор ответа PhoB, который, связываясь с ДНК-мишенью, запускает транскрипцию подконтрольных генов (Wanner, 1996). В отсутствие функциональной гистидинкиназы PhoR, белок-регулятор фосфорилируется CreC (или PhoM), неродственной гистидинкиназой двухкомпонентной системы CreC/CreB, что указывает на наличие перекрестной системы регуляции, позволяющей максимально эффективно отвечать на внеклеточный стресс (Makino et al., 1985). Когда Pi присутствует в избытке, PhoR, Pst, PhoU совместно выключают Pho регулон посредством дефосфорилирования регуляторного белка (Wanner, 1993). 45 Четыре белка, PstS, PstC, PstA, PstB, образуют АВС транспортер, осуществляющий высокоаффинный захват периплазматического Pi и его медленный перенос в цитозоль. Гены синтеза этих белков вместе с PhoU образуют единый оперон pstSCAB-phoU. PstS – периплазматический полипептид, связывающий неорганический фосфат. PstC и PstA образуют канал внутри клеточной мембраны для поступления Pi. PstB – АТФ-зависимая пермеаза, которая обеспечивает энергией процесс переноса. При избытке фосфата, Pst система формирует ингибиторный комплекс с белком PhoR, предотвращая, тем самым, активацию регулятора PhoB. PhoU и PstB также требуются для дефосфорилирования активного PhoB в момент избытка фосфата в среде (Wanner, 1997). PitA и PitB являются низкоаффинными переносчиками Pi, не входящими в Pho-регулон (Willsky, Malamy, 1980). PitA служит также в качестве транспортера дивалентных катионов металлов, в частности Zn2+, которые переносятся в комплексе с неорганическим фосфатом (Beard et al., 2000). Показана зависимость pitB от Рho-регулона и от наличия доступного фосфата, в отличие от РitA, который экспрессируется конститутивно (Harris et al., 2001). Обе системы фосфатных переносчиков транспортируют арсенат, однако Pit является основной системой для переноса арсената (Rosenberg et al., 1977; Willsky, Malamy, 1980). Выявлена взаимосвязь между компонентами pho-регулона и глобальным регулятором стрессового ответа rpoS (Taschner et al., 2004). Активность Pit переносчиков (но не Pst) полностью ингибируется разобщителями, что указывает на использование протон-движущей силы для энергизации транспорта. Транспорт фосфата с участием Pst утилизируют энергию фосфатной связи и идентичен в этом отношении другим системам, которые включают периплазматические связывающие протеины (Rosenberg et al., 1977; Willsky, Malamy, 1980). Важно отметить, что существует тесная связь между транспортом фосфата, ионов калия (K+) и протонов (H+). Активность обеих транспортных систем фосфата (Pit или Pst) зависит от присутствия в среде K+. Оба иона поступают в 46 клетки бактерий одновременно, при этом для транспорта калия обе транспортные системы Pi равнозначны (Russell, Rosenberg, 1979). Чтобы объяснить наличие строгой связи между входом в клетки K+ и Pi, было предположено, что переносчики обоих ионов ассоциированы в мембране таким образом, что их транспортные активности тесно связаны. Альтернативная гипотеза предусматривает, что вход K+ и Pi может быть связан циркуляцией протонов. Чтобы сбалансировать электрический заряд, Pi входит в клетки в симпорте с протоном, что приводит к закислению цитоплазмы. Чтобы предотвратить этот нежелательный процесс, протоны откачиваются из цитоплазмы в обмен на K+. В конечном итоге сохраняется электронейтральность процесса при минимальном нарушении внутриклеточного рН гомеостаза (Russell, Rosenberg, 1979, 1980). Роль глутатиона в сопряжении транспорта Pi и калия практически не исследована. Примечательно, что, как и транспорт калия, обе системы транспорта фосфата чувствительны к сульфгидрильному реагенту N-этилмалеимиду (Willsky, Malamy, 1980). Как показано выше, этот реагент существенно модулирует активность транспорта калия, и в этот процесс включен глутатион. Это указывает на то, что NEM может воздействовать на транспорт фосфата косвенно, через влияние на транспорт калия. В заключение литературного обзора следует отметить, что имеющиеся к настоящему времени данные свидетельствуют о важной роли редокс-регуляции во всех аспектах жизнедеятельности бактериальной клетки, включая транспорт субстратов, передачу внутриклеточных сигналов, регуляцию активности ферментов и транскрипционных факторов. Многие глобальные регуляторы (OxyR, SoxR, RpoS, ArcAB и др.) прямо или косвенно воспринимают изменения редокс-ситуации в среде и клетках и согласованно отвечают на эти изменения, обеспечивая адаптацию к новым условиям среды. Сигнальными молекулами, воздействующими на редокс-чувствительные сайты регуляторных белков, часто выступают активные формы кислорода и низкомолекулярные тиолы, важнейшим из которых является глутатион. Однако характер изменения АФК и тиолов внутри и снаружи клетки и их взаимодействие с ионными потоками и регуляторными 47 факторами при переходных процессах, связанных с изменением доступности кислорода и субстратов, требует дальнейших исследований. 48 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 Объекты исследования Использованные в настоящей работе штаммы E. coli с указанием их генотипических свойств и источника получения перечислены в таблице 1. Все одиночные делеционные мутанты получены из библиотеки Keio collection (Baba et al., 2006), кроме штамма AN2343 (cydD1), предоставленного проф. Poole (Poole et al., 1989). Двойные мутанты и штаммы, содержащие одновременно соответствующие мутации и слияния промоторов генов katG, sodA и rpoS со структурным геном lacZ были сконструированы в лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов ИЭГМ на основе мутантов из Keio collection, используя трансдукцию с фагом РI и трансформацию плазмид. Таблица 1. Штаммы E. coli, используемые в экспериментальной работе Штамм Генотип BW25113 (WT), (araD-araB)567, lacZ4787(::rrnB3), -, rph-1,(rhaD-rhaB)568, родительский hsdR514 Источник Coli Genetic Stock Center (CGSC) JW3467-1 Как BW25113, но Δgor756::kan CGSC JW3412-5 Как BW25113, но Δggt777::kan CGSC JW3901-1 Как BW25113, но ΔmenA789::kan CGSC JW1638-1 Как BW25113, но ΔsodC724::kan CGSC JW2755-3 Как BW25113, но ΔrelA782::kan CGSC JW2663-1 Как BW25113, но ΔgshA769::kan CGSC JW0046-1 Как BW25113, но ΔkefC760::kan CGSC JW0045-1 Как BW25113, но ΔkefF759::kan CGSC JW3313-1 Как BW25113, но ΔkefB758::kan CGSC 49 JW3460-5 Как BW25113, но ΔpitA749::kan CGSC JW2955-1 Как BW25113, но ΔpitB760::kan CGSC JW3704-1 Как BW25113, но ΔpstA757::kan CGSC JW5437-1 Как BW25113, но ΔrpoS746::kan CGSC JW5536-1 Как BW25113, но ΔarcB738::kan CGSC JW4364-1 Как BW25113, но ΔarcA726::kan CGSC JW0389-1 Как BW25113, но ΔphoB763::kan CGSC JW0390-2 Как BW25113, но ΔphoR764::kan F-, glnV42(AS), λ-, cydD100, rpoS396(Am), rph-1 CGSC NM3001 Как BW25113, но sodA::lacZ Лаб. музей NM3031 Как BW25113, но katE::lacZ Лаб. музей NM3041 Как BW25113, но rpoS (katF)::lacZ Как BW25113, но ΔgshA769::kan, sodA::lacZ Как BW25113, но ΔgshA769::kan, rpoS (katF)::lacZ Как BW25113, но ΔrelA782gshA769::kan Лаб. музей AN2343 NM3104 NM3141 NM4861 Проф. Poole Лаб. музей Лаб. музей Лаб. музей 3.2 Питательные среды и условия культивирования Бактерии E. coli выращивали в аэробных условиях на синтетической минимальной среде М9 (Na2HPO4 · 12H2O – 15.13 г/л; KH2PO4 – 3 г/л; NH4Cl – 1 г/л; NaCl – 0.5 г/л; MgSO4·7H2O – 0.246 г/л; CaCl2 – 0.011 г/л) (Miller, 1972) с добавлением 0.15% глюкозы или на среде MOPS (3-[N-Морфолино]Пропансульфоновая кислота – 8.37 г/л; Трицин – 1.79 г/л; FeSO4·7H2O – 0.0028 г/л; NH4Cl – 0.51 г/л; K2SO4 – 0.048 г/л; CaCl2 – 0.0014 г/л; MgCl2·6H2O – 0.107 г/л; NaCl – 2.92 г/л) (Neidhardt et al., 1974) с 0.15% глюкозы и заданной концентрацией фосфата. Селективный отбор бактерий, несущих определенный набор мутаций, осуществляли с помощью антибиотиков, к которым устойчив исследуемый штамм. 50 Клетки из ночной культуры центрифугировали и ресуспендировали в 100 мл свежей среды до оптической плотности OD600 = 0.2 и подращивали при 37° в колбах объемом 250 мл в термостатируемом орбитальном шейкере при 150 об/мин. По достижению OD600 = 0.5 клетки разбавляли подогретой средой и выращивали в колбах объемом 250 или 50 мл в аналогичных условиях. В некоторых случаях режим культивирования или состав среды были изменены, о чем в тексте сделаны соответствующие примечания. Изменение биомассы бактерий определяли по изменению светорассеяния при длине волны 600 нм на спектрофотометре КФК-3-01 («ЗОМЗ», Россия) при длине светового пути кюветы 10 мм. При выращивании клеток E. coli на твердых средах использовали стандартный LB-агар или агаризованные среды М9 и MOPS (15 г/л агара). 3.3 Определение удельной скорости роста Удельную скорость роста культуры (μ) определяли по формуле: ln OD600 (t 2 ) ln OD600 (t1 ) t 2 t1 где OD600(t2) и OD600(t1) – оптическая плотность культуры, измеренная при длине волны 600 нм, во время t2 и t1. 3.4 Колониеобразующая способность Пробы отбирали через определенные интервалы времени и проверяли на способность к формированию колоний (выживаемость на твердых средах). Каждую отобранную аликвоту подвергали серии разведений в 0.85 % растворе NaCl. Затем по 1-му мл от каждого разведения вносили в пробирку с расплавленным при 42°С 0.8%-м LB-агаром, интенсивно перемешивали и быстро выливали на чашку Петри с твердым агаром (1.5%). После застывания верхнего слоя агара, чашку оставляли в термостате при 37°С на 24 часа, по истечению которых, подсчитывали количество образовавшихся колоний. 51 3.5 Определение живых и мертвых клеток (live-dead test) Отобранные пробы бактериальной культуры в объеме 0.5 мл, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость и осажденные клетки промывали физиологическим раствором NaCl. Осадок растворяли в 0.5 мл 0.9% NaCl и добавляли флуоресцирующие красители, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами: SYTO 9 до конечной концентрации 10 мкМ и пропидиум йодид (PI) до конечной концентрации 5 мкМ. Полученную пробу оставляли в темноте на 15 мин при комнатной температуре. По истечению указанного времени 10 мкл образца наносили на предметное стекло, покрытое 1% агарозой, приготовленной на минимальной среде М9. После наложения покровного стекла флуоресценцию препарата смотрели под микроскопом Leica DM2000 («Leica Microsystems GmbH», Германия). Для детекции флуоресценции SYTO 9 использовалась фильтр-система I3 (возбуждение – λ 450-490 nm, эмиссия – λ ≥ 515 nm, дихроичное зеркало – λ 510 nm). Для детекции флуоресценции PI использовалась фильтр-система N2.1 (возбуждение – λ 515-560 nm, эмиссия – λ ≥ 590 nm, дихроичное зеркало – λ 580 nm) (Biggerstaff et al., 2006). 3.6 Определение окислительно-восстановительного потенциала (Eh) и pH в среде культивирования Величину pH в среде культивирования регистрировали с помощью комбинированного pH-электрода InLab Expert Pro-ISM (Mettler Toledo, Швейцария) и комплекта измерительной аппаратуры NBS «BioFlo 110» (Германия). Окислительно-восстановительный потенциал в среде культивирования определяли в режиме реального времени потенциометрическим методом с с непрерывной использованием регистрацией редоксметрического комбинированного электрода ЭРП-105 («ИТ», Россия) и pХ-метра cpX-2 ИБП РАН (Россия) с выводом на компьютер. Значения Eh выражали в зависимости от 52 полярности (±) в милливольтах. Базовое значение Eh определяли в среде, не содержащей клеток. 3.7 Измерение парциального давления кислорода Парциальное давление кислорода (рО2) в среде культивирования определяли полярографическим методом с использованием электрода Кларка InPro 6800 (Mettler Toledo, Швейцария) и комплекта измерительной аппаратуры NBS «BioFlo 110» (Германия). Значения рО2 выражали в % от максимального насыщения, которое определялось в среде без клеток. 3.8 Выявление изменений мембранного потенциала Для выявления проникающий изменений флуоресцентный мембранного краситель потенциала DiBAC использовали ([DiBAC4(3)], бис-(1,3- дибутилбарбитуратовая кислота)-триметиноксонол), относящийся к категории медленных флуорохромов (Wickens et al., 2000). DiBAC4(3) растворяли в 70% этаноле до концентрации 1 мг/мл, а затем в деионизированной воде до конечной концентрации 100 мкг/мл. Бактериальную культуру (180 мкл) смешивали с 20 мкл раствора DiBAC4(3) 100 мкг/мл (финальная концентрация красителя 10 мкг/мл) и оставляли в темноте при 37°С в течение 10 минут, после чего готовили микропрепарат. Для этого образец в объеме 10 мкл наносили на предметное стекло с 1 %-ной агарозой (приготовленной на средах MOPS или M9) и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM2000 (фильтр-система I3, возбуждение – λ 450-490 нм, эмиссия – λ 515 нм). Общее количество клеток подсчитывали в проходящем свете на определенной площади с помощью программного пакета Leica Application Suite (v.3.4.0). Для каждого образца в сумме подсчитывали не менее 800 клеток в трех независимых экспериментах. 53 3.9 Скорость продукции супероксида Продукцию экстраклеточного супероксида в среде определяли по реакции восстановления супероксидом цитохрома С, который был добавлен в клеточную суспензию (Korshunov, Imlay, 2006). Бактериальную культуру выращивали на минимальной среде М9 с добавлением 0.15% глюкозы при 37°С (150 об/мин). Для измерения общей продукции супероксида клетки экспоненциальной фазы роста (OD600 = 0.5) центрифугировали и отмывали свежей средой культивирования. Пробу разделяли на две части и доводили до оптической плотности OD600 = 0.2, каждая колба в конечном объеме содержала по 10 мл подогретой среды М9 с 0.15% глюкозы и 20 мкМ цитохрома С. В одну из колб добавляли фермент Mnсупероксиддисмутазу до конечной концентрации 30 Е/мл. Поскольку при восстановлении цитохрома С появляется характерная окраска, искажающая истинную оптическую плотность при длине волны 600 нм, готовили третью колбу с бактериальной культурой в аналогичных условиях, но без добавления цитохрома и фермента, в которой определяли OD600. Колбы инкубировали при 37°С в термостатируемом орбитальном шейкере при 150 об/мин. Через установленные промежутки времени, клеточную суспензию в объеме 1.5 мл из каждой колбы, пропускали через ацетат-целлюлозный мембранный фильтр МФАС-ОС-2 («Владипор», Россия) с диаметром пор 0.45 мкм. Фильтраты помещали на холод и определяли количество восстановленного цитохрома С по изменению спектра поглощения между λ 550 нм и λ 556.5 нм. Затем окисляли цитохром С добавлением 0.2 мМ феррицианида калия к фильтрату с повторным снятием спектра поглощения при тех же длинах волн. Количество восстановленного цитохрома С рассчитывали, используя индуцированное феррицианидом изменение поглощения при λ 550 нм относительно λ 556.5 нм. Общее количество восстановленного цитохрома (ОКВЦ) определяли по формуле: ОКВЦ = Колба - SOD ( A550восст A556.5 восст ) Колба SOD( A550 окисл A556.5 окисл ) 21 , где Aλ восст – оптическая плотность в нм в колбе с восстановленным цитохромом, Aλ окисл – оптическая плотность в нм в колбе с окисленным цитохромом. 54 Фракцию цитохрома С, восстановление которой опосредованно только супероксидом, определяли путем сравнения парных образцов из двух колб, содержащей и не содержащей SOD. Скорость продукции супероксида ( v ) определяли по формуле: v ОКВЦ / 0.1 OD600 t , где t – время в минутах. Результат выражали в пмоль/0.1 OD600 мин. 3.10 Определение концентрации перекиси водорода в среде и в клетке Перекись водорода измеряли спектрофлуориметрическим методом с красителем Amplex Red (AR) и пероксидазой хрена (HRP). Бактериальную культуру выращивали на среде М9 с добавлением 0.15 % глюкозы при 37°С на орбитальном термостатируемом шейкере до оптической плотности OD600 = 0.5. Через определенные интервалы времени отбирали пробы и пропускали через мембранный фильтр МФАС-ОС-2 с диаметром пор 0.45 мкм. 0.45 мл полученного фильтрата инкубировали с 0.25 мл флуорофора Amplex Red (200 мкМ) и 0.25 мл HRP (0.02 мг/мл) в течение 5 мин. Содержание H2О2 в образцах измеряли на спектрофлуориметре Shimadzu RF-1501 (Япония) при длине волны облучения 563 нм и эмиссии - 587 нм (Seaver, Imlay, 2001). Для расчета концентрации использовали калибровочный график, построенный с использованием стандартных растворов H2O2. 3.11 Определение концентрации глутатиона Концентрацию глутатиона измеряли с помощью модифицированного метода Титца (Tietze, 1969). Для определения экстраклеточного количества GSH и GSSG отбирали 2.5 мл культуральной пробы и пропускали через мембранный фильтр МФАС-ОС-2 с диаметром пор 0.45 мкм, полученный фильтрат использовали в реакции. Сущность метода заключается во взаимодействии GSH с сульфгидрильным реагентом 5,5′-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) (DTNB, реактив Эллмана) с образованием окрашенного продукта, поглощающего в 55 области 412 нм. Окисляющийся в ходе этой реакции глутатион вновь восстанавливается до GSH благодаря присутствию в реакционной смеси НАДФН и глутатионредуктазы (GOR). Восстановленный глутатион снова взаимодействует с DTNB с образованием окрашенного продукта, количество которого зависит от времени реакции и пропорционально концентрации глутатиона в реакционной смеси. Циклический характер ферментативной реакции сообщает данному методу высокую чувствительность и специфичность, позволяя определять до 1 10-9 г глутатиона в пробе. Реакционная смесь содержала 0.6 мкМ DTNB, 10 мкг GOR и 0.2 мкМ НАДФН в 1 мл 0.1 М Na-фосфатного – 0.005 М ЭДТА буфера с рН 7.5. Перед началом реакции, измеряли базовое поглощение при λ=412 нм на спектрофотометре Bio-Rad SmartSpec Plus (США). Реакция начиналась сразу после добавления НАДФН. Через 6 минут после инкубации при 25°С измеряли поглощение при λ 412 нм. В контрольную кювету добавляли все реагенты, кроме глутатиона. Калибровочные расстворы содержали от 1 до 100 нг GSH или GSSG. В ходе описанной реакции определяется суммарное количество GSH и GSSG. Для раздельного определения GSH и GSSG, восстановленный глутатион предварительно связывали избытком сульфгидрильного реагента N- этилмалеимида (NEM), который добавляли к пробе до конечной концентрации 2 мМ. После 40-минутной инкубации избыток NEM удаляли в ходе 10-кратной экстракции эфиром. Реакционную смесь от следов эфира освобождали продувкой воздухом под давлением. Концентрацию GSH определяли по разности между концентрациями общего и окисленного глутатиона. При подготовке пробы для определения внутриклеточного GSH культуру E. coli центрифугировали 5 минут при 8000 об/мин. Осадок ресуспендировали в охлажденном 0.02 М ЭДТА и разрушали ультразвуком (6 циклов по 30 секунд). Белок удаляли путем добавления к 2 мл гомогената 200 мкл 5М HClO4. После 15минутной инкубации и последующего 15-минутного центрифугирования при 8000 об/мин супернатант нейтрализовали 5М КОН до рН 7.5. Нейтрализованный раствор замораживали для более полного осаждения KClO4 и центрифугировали 5 56 минут при 8000 об/мин. Полученный супернатант использовали для определения концентрации внутриклеточного GSH. Концентрацию глутатиона выражали в мкМ или мкМ/OD600. 3.12 Определение концентрации внутриклеточного калия Концентрацию калия в клетках определяли на атомно-адсорбционном спектрометре AA-6300 (Shimadzu, Япония) по методу Meury и Kepes (Meury, Kepes, 1982). Клеточную суспензию (0.5 мл) быстро фильтровали с помощью ацетат-целлюлозных мембранных фильтров МФАС-ОС-2 с диаметром пор 0.45 мкм, клетки на фильтре промывали 2.5 мл 0.3 М NaCl. Высушенные фильтры помещали в пробирку с 5 мл 0.1 М HNO3, инкубировали на орбитальном шейкере в течение 5-ти минут и анализировали на содержание калия. Концентрацию калия рассчитывали, используя калибровочные графики. Результаты выражали в мкМ/OD600. 3.13 Определение β-галактозидазной активности Активность β-галактозидазы в клетках E. coli, несущих слияния гена lacZ с промоторами исследуемых генов, определяли по методу Миллера (Miller, 1972). Для этого суспензию клеток 0.5 мл вносили в 1.5 мл восстановительного буфера, содержащего 0.1 М Na-фосфатный буфер (рН 7), 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO4, 0.1 мМ MnSO4·5H2O, 50 мМ меркаптоэтанола и 50 мкг/мл хлорамфеникола. В реакционную смесь добавляли по 15 мкл толуола и дезоксихолата, перемешивали и инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Затем добавляли 0.5 мл 13.3 мМ раствора о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (ОНФГ). Через 3 минуты реакцию останавливали добавлением 0.5 мл 1N K2CO3. Поглощение измеряли при длине волны 420 нм, что соответствует суммарному поглощению окрашенного продукта реакции о-нитрофенола и рассеянию света обломками клеток, и на длине волны 550 нм, когда присутствует только рассеяние света обломками клеток. Используя коэффициент рассеяния, равный 1.75 OD550, вычисляли истинное поглощение о- 57 нитрофенола. Активность β-галактозидазы выражали в относительных единицах Миллера и рассчитывали по формуле: Ед.Миллера , активность 3 1000 OD420 1.75 OD550 , t V OD600 где OD420 и OD550 – измеренные значения для реакционной смеси; OD600 – плотность клеточной суспензии перед определением, измеренная при длине волны 600 нм; t – время реакции в минутах; V – объем культуры, взятой для определения, в мл. 3.14 Определение концентрации цистеина Концентрацию цистеина определяли спектрофотометрическим модифицированным методом Гайтонде (Gaitonde, 1967). Реагент Гайтонде (250 мг нингидрина, растворенные в смеси 4 мл соляной и 16 мл ледяной уксусной кислот) специфически реагирует с цистеином при нагревании, изменяя спектр поглощения при λ 560 нм. Поскольку количество свободного цистеина в клетках крайне мало, пробы концентрировали на ротационном вакуумном испарителе IKA RV-HB-10 (Германия) при температуре 65°C. Для определения общего количества цистеина, восстанавливали его окисленную форму (L-цистин), который не определяется в ходе специфической реакции. Для этого 0.5 мл пробы помещали в 50 мМ водный раствор дитиотреитола (DTT), после чего смесь титровали KOH до pH = 8.5. Белок осаждали добавлением к 1 мл восстанавливаемой смеси 80 мкл 5М HClO4. Раствор замораживали для более полного осаждения HClO4 и центрифугировали 5 минут при 8000 об/мин. Супернатант использовали для определения концентрации экстраклеточного цистеина. Для этого к 0.5-ти мл полученного супернатанта добавляли 0.5 мл реагента Гайтонде. Реакцию проводили при нагревании до 95°C на водяной бане в течение 10 мин с последующим быстрым охлаждением смеси. Далее измеряли светопоглощение при λ 560 нм. Для построения калибровочного графика и расчета концентрации использовали стандартные растворы цистеина. Результат выражали в мкМ или мкМ/OD600. 58 3.15 Статистическая обработка полученных результатов Обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excell (версия 11.8 SP3 для Windows) и Statistica 6.0, вычисляя среднее значение, стандартную ошибку и доверительный интервал. Каждый результат показан как среднее значение из не менее, чем трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий между средними величинами оценивали согласно критерию Стьюдента, различия считались значимыми при р < 0.05. На графиках достоверно различающиеся величины обозначены символом *. 3.16 Материалы Реагенты, которые использовались для проведения экспериментов: GOR, DiBAC4(3), DTNB, DTT, NADPH, GSH (GSSG), NEM, DCCD, CCCP, LB, SYTO 9, Mn-SOD, Amplex Red, ОНФГ, ЭДТА, пероксидаза хрена, агар, меркаптоэтанол, дезоксихолат, нингидрин, ксантин, ксантиноксадаза, цитохром С, цистеин, Lцистин, пропидиум йодид были получены от Sigma Chemical Co. и AppliChem GmbH Panreac. Все остальные реагенты, используемые в данной работе для приготовления растворов и сред, аналитической градации стандарта ХЧ. были отечественного производства, 59 ГЛАВА 4. ТРАНСМЕМБРАННАЯ ЦИРКУЛЯЦИЯ ГЛУТАТИОНА ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ПАРАМЕТРОВ СРЕДЫ В ПЕРИОДИЧЕСКИХ КУЛЬТУРАХ ESCHERICHIA COLI Ранее было показано, что в аэробно растущих культурах E. coli внутриклеточный восстановленный глутатион (GSH) подвергается непрерывной трансмембранной циркуляции между клетками и средой. Циркуляция GSH осуществляется только в дышащих клетках, нарушается при изменениях уровней ∆μH+ и АТФ и прекращается при переходе в стационарное состояние (Smirnova et al., 2012). Известно, что в процессе периодического культивирования факультативных анаэробов, накопление биомассы сопровождается постепенным изменением физиологического состояния культуры и параметров среды. Наиболее значительные изменения в среде культивирования связаны со снижением концентрации O2 в среде (pO2) и, соответственно, падением окислительно-восстановительного потенциала (редокс-потенциала, Eh) в область отрицательных значений (Hewitt, 1950; Jacob, 1970). Это дает возможность исследовать связь между этими параметрами, а также физиологическим состоянием клеток, с одной стороны, и интенсивностью циркуляции глутатиона, с другой. 4.1 Изменение удельной скорости роста у различных штаммов E. coli при переходе к микроаэробным условиям Объектами исследования служили бактерии E. coli родительского штамма (wt) и мутанты ΔgshA (первый фермент синтеза GSH), Δgor (глутатионредуктаза), cydD1 (субъединица АТФ-зависимого транспортера GSH CydDC), ΔmenA (дигидроменахинон), ΔsodC (периплазматическая Cu,Zn-SOD), ΔarcA и ΔarcB (компонентам регуляторной системы ArcAB), ΔrpoS (регулятор общего стрессового ответа), ΔrelA (синтетаза (p)ppGpp), а также ΔkefС (K+/H+антипортер). 60 Бактерии E. coli, предварительно адаптированные к аэробному росту, выращивали на минимальной среде М9 с глюкозой (0.15%) при 37ºС в колбах в орбитальном термостатируемом шейкере при 150 об/мин с начальной плотностью OD600 = 0.1. В течение периодического культивирования в этих условиях клетки E. coli BW25113 (родительский тип) сохраняли высокую удельную скорость роста (µ), равную ~ 0.7 (0.72±0.01), до достижения OD600 = 0.75, после чего скорость роста начинала резко снижаться, достигая к концу наблюдения при OD600 = 1.2 значения 0.46±0.007 (рисунок 1). Регистрация парциального давления кислорода показала, что по мере увеличения биомассы в диапазоне OD600 от 0.1 до 0.75 происходило линейное снижение pO2 от 100% до 10% (рисунок 1). При дальнейшем росте бактерий содержание O2 падало до нуля, то есть весь поступающий кислород потреблялся клетками. В наших условиях начальное значение Eh равнялось + 200 мВ и изменялось незначительно до OD600 = 0.4, что соответствовало значению pO2 55%. Далее следовало постепенное падение Eh до 360 мВ (рисунок 1). В ходе роста величина pH изменялась незначительно (от 7.2 до 7.0) (не показано), что может быть обусловлено высокой буферностью среды M9. В настоящей работе кроме BW25113 использовали бактерии других штаммов E. coli, характеристики которых будут даны ниже. На рисунке 2 показаны максимальные значения µ (µmax) для всех используемых штаммов. Характер изменений удельной скорости роста в процессе периодического культивирования (данные не представлены) и значения µmax у разных мутантов был подобен, тем, которые наблюдались у клеток родительского типа. Исключение составляет штамм AN2343 (cydD), несущий мутацию в транспортере CydDC, участвующем в трансмембранном экспорте глутатиона. Эти мутанты показывали более низкую скорость роста (µmax = 0.61±0.01 час-1), чем родительский штамм. 61 1.2 200 pO2 OD600 1 150 100 pO2, ед; OD600; µ, 1/час µ Eh 50 0.8 -50 0.6 Eh, мВ 0 -100 -150 0.4 -200 -250 0.2 -300 -350 -400 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Время, мин Рисунок 1. Изменения ростовых параметров, pO2 и Eh в периодической культуре E. coli BW25113. Линиями обозначен переход от аэробных к микроаэробным условиям культивирования. pO2 представлено в единицах (1 ед. = 100%). 0.8 Удельная скорость роста, 1/час 0.75 0.7 0.65 * 0.6 0.55 0.5 0.45 kefC relA cydD arcB arcA menA gor rpoS sodC gshA WT 0.4 Рисунок 2. Максимальная удельная скорость (µmax) у различных мутантов E. coli. 62 4.2 Изучение экспрессии rpoS::lacZ и sodA::lacZ как маркеров индукции RpoS и ArcAB регулонов В первом случае использовался штамм E. coli NM3041, несущий слияние промотора гена rpoS со структурным геном lacZ, кодирующим β-галактозидазу. Ген rpoS (katF) кодирует σs – глобальный регулятор общего стрессового ответа. В процессе периодического роста наблюдалось постепенное возрастание экспрессии слияния rpoS::lacZ в 1.5 раза по сравнению с базовым уровнем. Экспрессия этого слияния в штамме NM3141 (ΔgshA, rpoS::lacZ) дефектном по синтезу глутатиона, была заметно ниже, чем в родительском штамме (рисунок 3). Во втором случае использовался штамм E. coli NM3001, несущий слияние промотора гена sodA со структурным геном lacZ, кодирующим цитоплазматическую Mn-содержащую супероксиддисмутазу. Экспрессия sodA в аэробных условиях регулируется с участием двухкомпонентной системы ArcAB (Compan, Touati, 1993). Активность слияния постепенно снижалась в фазе аэробного роста и поддерживалась на относительно постоянном уровне в фазе микроаэробного роста. Экспрессия этого слияния в мутанте NM3104 (ΔgshA, sodA::lacZ) была несколько выше, чем в родительском штамме (рисунок 4). 7000 Активность, Ед. Миллера 6000 5000 4000 3000 2000 WT (rpoS::lacZ) 1000 gshA (rpoS::lacZ) 0 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 OD600 Рисунок 3. Экспрессии rpoS::lacZ в периодической культуре E. coli. 63 2000 WT (sodA::lacZ) 1800 gshA (sodA::lacZ) Активность, Ед. Миллера 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 OD600 Рисунок 4. Экспрессии sodA::lacZ в периодической культуре E. coli. 4.3 Продукция экстраклеточного супероксида в периодической культуре E. coli В наших условиях все исследуемые штаммы продуцировали супероксид. На рисунке 5 показаны средние значения скорости продукции экстраклеточного О2·для родительского штамма E. coli и мутантов по наиболее интересующим нас генам. По этому показателю не было значительных отличий между родительским штаммом и мутантами gshA и sodC. В то же время, у мутантов menA средняя скорость продукции супероксида была снижена в 3.4 раза по сравнению с клетками родительского штамма. У relA мутанта этот показатель был снижен в 1.8 раза по сравнению с родителем. 64 7 V, пМоль/0.1*OD600*мин 6 5 * 4 3 * 2 1 0 WT gshA sodC menA relA Рисунок 5. Скорость продукции экстраклеточного супероксида у штаммов E. coli. 4.4 Статус глутатиона в растущей культуре E. coli В процессе роста уровень внутриклеточного глутатиона (GSHin) возрастал у всех изученных штаммов, хотя и в различной степени. Содержание GSHin в мутантах arcA и arcB было заметно выше, чем в клетках родительского типа в течение всего периода культивирования, тогда как в мутантах rpoS, menA и kefC содержание внутриклеточного глутатиона становилось выше, чем в родительском типе только на второй фазе роста (в микроаэробных условиях). Обращает на себя внимание низкий уровень GSHin в мутанте relA, в котором концентрация трипептида была в среднем в 1.5 раза ниже, чем в родительском штамме. В остальных штаммах содержание GSHin достоверно не отличалось от значения в родительском штамме (рисунок 6 А, Б). Исследуемые штаммы отличались также по содержанию экстраклеточного общего глутатиона (GSHout + GSSGout) (рисунок 7 А, Б). Среди всех штаммов по этому показателю заметно выделялся мутант gor, дефектный по синтезу глутатионредуктазы окисленного (GOR), глутатиона фермента, (GSSG) до катализирующего GSH. Количество восстановление экстраклеточного глутатиона в этом штамме было в два раза выше, чем в родительском штамме 65 (рисунок 8). Уровень GSH в среде у E. coli, мутантных по гену sodC периплазматическую (кодирующему супероксиддисмутазу SodC) и контролирующему его экспрессию гену rpoS, был также выше (примерно в 1.5 раза), чем у клеток родительского штамма. Мутанты menA, arcB, kefC и relA, напротив, экспортировали в 1.5 раза меньше глутатиона в сравнении с родительским штаммом. В процессе роста уровень экстраклеточного глутатиона у всех штаммов возрастал в той или иной мере. Исключение составил мутант cydD, у которого накопление биомассы сопровождалось снижением уровня GSHout, кроме этого у него отмечен самый низкий уровень GSHout (рисунок 7 Б). 10 11 WT WT sodC rpoS 9 arcA 8 relA 7 6 5 arcB kefC 8 cydD 7 6 5 4 4 3 А menA 9 GSH(in), мкМ/OD600 GSH(in), мкМ/OD600 10 0.5 0.7 OD600 0.9 1.1 0.5 0.7 Б OD600 0.9 1.1 Рисунок 6 А, Б. Изменение внутриклеточного глутатиона (GSHin) в штаммах E. coli. 1.8 rpoS arcA 1.4 relA 1.2 1 0.8 0.2 0.9 1.1 Б kefC 0.6 0.4 OD600 arcB 0.8 0.4 0.7 cydD 1 0.6 0.5 menA 1.2 Общий GSH(out), мкМ Общий GSH(out), мкМ WT sodC 1.6 А 1.4 WT 0.5 0.7 0.9 1.1 OD600 Рисунок 7 А, Б. Содержание экстраклеточного общего глутатиона (GSHout ) в штаммах E. coli. 66 3 WT GSH(out) 9.5 gor GSH(out) GSH(out), мкМ/OD600 gor GSH(in) 8.5 2 7.5 1.5 6.5 1 GSH(in), мкМ/OD600 WT GSH(in) 2.5 5.5 0.5 4.5 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 OD600 Рисунок 8. Изменение GSHin и GSHout у мутантов по глутатионредуктазе (gor). В аэробных условиях определенная часть экстраклеточного глутатиона находится в окисленном состоянии. Для определения редокс-статуса GSHout в растущей культуре была измерена концентрация GSSGout и соотношение GSH/GSSG. Последний показатель является чувствительным индикатором окислительного стресса у бактерий (Smirnova et al., 2005). Мутанты sodC и rpoS накапливали в 1.4 раза больше GSSG, чем клетки дикого типа (рисунок 9 А, Б). 0.23 0.21 0.21 sodC 0.19 rpoS arcA WT ArcB 0.17 relA 0.17 0.15 0.13 0.11 cydD 0.15 0.13 0.11 0.09 0.09 0.07 0.07 0.05 А menA 0.19 GSSG(out), мкМ GSSG(out), мкМ WT 0.05 0.5 0.7 0.9 OD600 1.1 1.3 Б 0.5 0.7 0.9 OD600 1.1 Рисунок 9 А, Б. Накопление GSSG при культивировании бактерий E. сoli. 1.3 67 Наибольший уровень экстраклеточного GSSG наблюдался у мутанта, лишенного способности синтезировать GOR (на рисунках не представлен). Накопление GSSG у этого штамма осуществлялось с высокой скоростью (от 0.27±0.025 до 0.57±0.02 мкМ) в течение всего времени эксперимента. В первой фазе роста, характеризующейся высоким содержанием кислорода в среде, соотношение GSH/GSSG изменялось от 4.8 у клеток родительского штамма до 1.8 у мутанта cydD. По сравнению с родительским штаммом, пониженные значения этого параметра были также у мутантов sodC, arcB и gor (рисунок 10). При переходе бактерий в фазу микроаэробного роста соотношение GSH/GSSG у родительского штамма и у мутантов rpoS, arcА, arcB, relA и sodC увеличивалось в 1.42 раза, тогда как у мутантов gor и cydD значение этого показателя снижалось в 1.5 и 1.9 раза, соответственно (по сравнению с уровнем в первой фазе). При снижении доступности кислорода, у мутантов по гену menA соотношение восстановленного к окисленному глутатиону не изменялось (рисунок 10). 9 OD600~0.55 OD600~1.1 8 7 5 4 3 2 1 cydD gor arcB sodC arcA relA menA rpoS WT cydD gor arcB sodC arcA relA menA rpoS 0 WT GSH/GSSG, ед. 6 Рисунок 10. Соотношение GSH/GSSG в аэробной и микроаэробной фазах роста у различных мутантов E. coli. 68 4.5 Взаимосвязь трансмембранной циркуляции GSH с глобальными регуляторными системами клетки Полученные результаты позволяют выделить в периодической культуре E. coli две фазы, первая из которых характеризуется высоким значением удельной скорости роста и наблюдается при OD600 не более 0.7 – 0.8, pO2 – от 100 до 5-10% и Eh от +200 до 0 мВ. Во второй фазе происходит резкое снижение скорости роста. Судя по значениям pO2 и Eh, в этой фазе клетки находятся в микроаэробных условиях. Это подтверждается резким сдвигом соотношения GSH/GSSGout в сторону восстановительных значений у родительского штамма и у четырех мутантов (рисунок 10). Значения pO2 и Eh, ниже которых в наших условиях начинался микроаэробный рост, являются критичными для физиологии E. coli, в этой области происходит переключение активности двух глобальных регуляторов ArcAB и FNR, контролирующих адаптацию бактерий к аэробноанаэробным переходам (Alvarez et al., 2013; Levanon, 2005). Согласно рассмотренным данным в этой главе, уровни внутриклеточного глутатиона и редокс-статус экстраклеточного глутатиона значительно варьируют у разных штаммов и зависят от фазы роста. В то же время, по такому интегральному физиологическому показателю как удельная скорость роста статистически значимые различия между штаммами отсутствовали. Исключение составил штамм cydD, скорость роста которого была заметно ниже, чем у всех остальных штаммов (рисунок 2). Этот мутант, лишенный мембранного белка, транспортирующего GSH в среду, имел, как следствие, самый низкий уровень экстраклеточного общего глутатиона и самое низкое значение соотношения GSH/GSSGout на обеих фазах роста. Таким образом, даже в отсутствие стрессовых воздействий, поддержание определенного редокс-статуса экстраклеточного глутатиона, по-видимому, является необходимым для нормального роста бактерий. Ген cydD находится под контролем системы ArcAB. Представляет также интерес поведение мутанта kefC, у которого не функционирует транспортер (KefC), участвующий у E. coli в экспорте K+. По 69 сравнению с родительским штаммом, этот мутант имел более высокий уровень внутриклеточного глутатиона на второй фазе роста и более низкий уровень экстраклеточного глутатиона в течение всего периода культивирования. Это указывает на то, что KefC может участвовать в экспорте глутатиона. Как указывалось выше, KefC негативно регулируется GSH и активируется аддуктами глутатиона с электрофилами, в том числе и хинонами (Booth et al., 1996; Lyngberg et al., 2011). Наши данные указывают на более широкую связь между KefC и глутатионом. KefC может выступать не только как мишень регуляции глутатионом, но прямо или косвенно участвовать в его экспорте. Штамм, лишенный глутатионредуктазы (GOR), отличался самым высоким уровнем экстраклеточного общего и окисленного глутатиона. Повышенный уровень GSSGout приводил к значительному снижению соотношения GSH/GSSGout, особенно в микроаэробных условиях. Отсутствие GOR в этом штамме должно приводить к накоплению GSSG в цитоплазме. Дисульфид GSSG является сильным оксидантом, поэтому, интенсивный экспорт GSSG в среду можно рассматривать как способ защиты цитоплазмы от окислительного (дисульфидного) стресса. Следует отметить, что, несмотря на существенный сдвиг редокс-статуса экстраклеточного глутатиона в сторону окисленной формы, мутант gor рос с такой же скоростью, как и родительский штамм (рисунок 2). Вероятно, отсутствие GOR компенсировалось повышением активности других тиоловых редокс-систем. Перекрывание функций тиоловых редокс-систем – хорошо установленный факт (Carmel-Harel, Storz, 2000). Известно, что, как и у других бактерий, аэробный рост E. coli сопровождается образованием супероксидного радикала (О2·-), который образуется не только в цитоплазме, но и в периплазме, где он может продуцироваться при аутоокислении дигидроменахинона (компонента цепи переноса электронов) и вызывать окислительный стресс в этом компартменте. Поскольку цитоплазматическая мембрана не проницаема для супероксида, то считается, что О2·-, определяемый в культуральной жидкости, генерируется, в основном, с внешней стороны цитоплазматической мембраны (Korshunov, Imlay, 70 2006). Было предположено, супероксиддисмутазы (SodC), что кодируемой функцией геном периплазматической sodC, является защита периплазмы от экстраклеточного супероксида (Korshunov, Imlay, 2002, 2006). Рассматривалась также возможность участия экстраклеточного глутатиона в этом процессе (Smirnova et al., 2012). Однако все еще нет полной ясности в этом вопросе. В нашей работе показано, что мутанты, дефектные по синтезу SodC, обладали более высоким уровнем экстраклеточного глутатиона (рисунок 7 А). Повышенный уровень экстраклеточного редуктанта (GSH) может компенсировать отсутствие активности SodC. Полученный результат можно рассматривать как один из дополнительных аргументов в пользу участия глутатиона в защите периплазмы от действия АФК. Примечательно, что до плотности OD600 = 1.0 уровень экстраклеточного GSH в мутанте sodC изменялся также, как в мутанте rpoS. Ген rpoS кодирует сигма-субъединицу РНК-полимеразы RpoS – глобального регулятора общего стрессового ответа у E. coli (Hengge, 2008). Поскольку экспрессия sodC находится под контролем гена rpoS (Gort et al., 1999), неудивительно одинаковое поведение этих двух штаммов в отношении GSHout. Мутант rpoS, но не sodC, имел самый высокий уровень внутриклеточного глутатиона из всех исследуемых штаммов и более высокий, чем у родителя, уровень экстраклеточного GSH. Это свидетельствует о том, что у E. coli RpoS может выступать в качестве негативного регулятора статуса глутатиона по обе стороны цитоплазматической мембраны. Мутант relA отличался от всех испытанных штаммов самым низким уровнем GSHin. Одновременно, у этого мутанта уровень GSHout и скорость продукции супероксида были примерно в два раза ниже, чем у родительского штамма. Эти данные свидетельствуют о том, что у E. coli при нормальных условиях уровни глутатиона по обе стороны цитоплазматической мембраны и уровень супероксида в среде находятся под контролем глобального регулятора relA-зависимого пути синтеза (p)ppGpp. По сравнению с родительским штаммом у мутантов по синтезу менахинона (menA) был более высокий уровень GSHin и более низкий уровень GSHout. Кроме 71 того, в отличие от родительского штамма, у мутанта menA при переходе к микроаэробным условиям не наблюдалось повышения соотношения GSH/GSSGout в сторону восстановительных значений. Из всех испытанных штаммов мутант menA показывал самую низкую скорость накопления супероксида. Последний результат был ожидаем, поскольку ранее было показано, что у аэробно-растущих бактерий E. coli одним из основных источников продукции супероксида в периплазме может быть аутоокисление хинона в электронной цепи (Korshunov, Imlay, 2006). Наши результаты подтверждают эти данные. У E. coli система ArcAB контролирует переход от аэробных к микроаэробным условиям (Alvarez et al., 2013). В наших экспериментах мутанты arcA и arcB показывали более высокие уровни GSHin, а мутант arcB (контролирующий сенсорный белок) – более низкий уровень GSHout. Поскольку для активации ArcB в микроаэробных условиях или при переходе к анаэробным условиям требуется менахинон, логично, что мутанты menA и arcB идентичны по уровню экспортируемого GSH. В свою очередь, под контролем ArcAB находится рассмотренный выше ген cydD, продукт которого осуществляет экспорт глутатиона в среду. Полученные результаты позволяют предположить, что при переходе к микроаэробным условиям происходит переключение экспорта GSH с еще не идентифицированной транспортной системы на транспортер CydDC. В совокупности, описываемые в этой главе результаты позволяют сделать следующие выводы: Статус глутатиона (уровни внутри- и экстраклеточного глутатиона) при переходе E. coli от аэробных к микроаэробным условиям находится под контролем глобальных регуляторов ArcAB, RpoS и синтетазы гуанозинтетрафосфата RelA, при этом (p)ppGpp и RpoS действуют противоположным образом, что может обеспечивать более тонкую регуляцию. Поскольку все глобальные регуляторы связаны между собой тем или иным образом, трансмембранная циркуляция глутатиона также включена в общую регуляторную сеть бактериальной клетки. 72 Через сигнальную цепь «менахинон → ArcB → СydDC» статус глутатиона и интенсивность его трансмембранной циркуляции может контролироваться состоянием дыхательной цепи и уровнем продукции экстраклеточного супероксида. К+-выходная система KefC не только мишень для регуляции глутатионом, но и прямой или косвенный компонент системы экспорта GSH. При снижении активности периплазматической супероксиддисмутазы GSH может участвовать в защите периплазмы от АФК. 73 ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ АФК НА ЭКСПОРТ ГЛУТАТИОНА В прошлой главе обсуждался вопрос о возможном участии экстраклеточного глутатиона в защите периплазмы от супероксида. Результаты наших исследований показали, что в мутантах по генам rpoS и подконтрольному ему sodC, наблюдался повышенный уровень экстраклеточного GSH, что может компенсировать отсутствие активности SodC. Такой результат свидетельствует в пользу участия глутатиона в защите периплазмы от действия АФК. 5.1 Влияние экзогенных АФК, генерируемых ксантиноксидазой, на рост и циркуляцию GSH у бактерий E. coli В этой серии экспериментов бактерии выращивали на минимальной среде М9 с глюкозой (0.15%) или на среде MOPS с заданной концентрацией фосфата при 37ºС в колбах в термостатируемом орбитальном шейкере при 150 об/мин. При проведении экспериментов на среде MOPS, ночную культуру и все стадии подготовки проводили на одинаковой среде. Экзогенный супероксид генерировали с помощью фермента ксантиноксидазы (в дальнейшем XO) и ксантина в качестве субстрата. При этом клеточную суспензию переносили в среду M9 (OD600 = 0.1) или MOPS (OD600 = 0.25), доведенную до рН=8 при помощи КОН и снабженную 0.15% глюкозы, 1 мМ ЭДТА и 50 мкМ ксантина. Ксантиноксидазу добавляли в культуру при достижении оптической плотности OD600 = 0.5. В бесклеточной среде (М9) реакция в смеси ксантин + ХО протекает с очень высокой скоростью, ксантин исчерпывается через несколько минут, и короткоживущий супероксидный анион быстро конвертируется в более стабильную перекись водорода. В наших условиях быстрая фаза супероксидопосредуемого восстановления цитохрома С заканчивалась через 2.5 мин и затем, восстановленный цитохром С постепенно окисляется перекисью водорода. В присутствии каталазы восстановление цитохрома С продолжается, однако скорость этой реакции существенно снижается (рисунок 11). 74 16 Восст. цитохром С, ед. 14 12 XO 10 XO+каталаза 8 6 4 2 0 0 10 20 30 40 Время, мин Рисунок 11. Продукция супероксида в реакции ксантина с ксантиноксидазой в среде М9 без клеток. Обработка экспоненциально растущих клеток E. coli BW25113 (родительский штамм) смесью АФК, генерируемых ксантином и XO, приводила к ингибированию роста бактерий и стимуляции выхода GSH из клеток в среду. Степень ингибирования роста и выхода GSH зависела от концентрации фермента, то есть от скорости образования АФК (рисунок 12). Рисунок 12. Эндогенные АФК стимулируют экспорт глутатиона и ингибируют рост E. coli BW25113. 75 Следует отметить, что оба эффекта носили обратимый характер. Удельная скорость роста резко снижалась при внесении XO и восстанавливалась до максимальной через 40 мин после начала обработки, уровень экстраклеточного GSH возвращался к базовому значению через 60 мин. Действие смеси производимых АФК вызывало повышение уровня экстраклеточного GSH в 1.9 раза относительно базового уровня. Для того чтобы разделить эффекты, производимые супероксидом и Н2О2, эксперименты выполняли в присутствии экзогенной супероксиддисмутазы или каталазы. Супероксиддисмутаза, добавленная одновременно с XO, предотвращала выход GSH. Внесение SOD через 15 мин после ХО вело к быстрому снижению экстраклеточного добавленная глутатиона одновременно (рисунок 13 А). Следует до с базового ХО, отметить, уровня. существенно что Экзогенная снижала присутствие SOD каталаза, выход или GSH каталазы одновременно с ХО влияло на степень ингибирования роста и укорачивало время восстановления роста (рисунок 13 Б). Оба фермента, добавленные без ХО, не стимулировали выход GSH и не оказывали эффекта на рост бактерий (не показано). А Б Рисунок 13. Экзогенные SOD и каталаза модулируют индуцируемый ХО выход GSH (А) и скорость роста E. coli BW25113 (Б). ХО (0.04 Е/мл) был добавлен во время 0. SOD (60 Е/мл) был добавлен до или через 15 мин после ХО. Каталаза (500 Е/мл) добавлялась перед ХО. 76 При проверке действия Н2О2 в отсутствие ксантина и ХО, мы обнаружили, что пероксид может также стимулировать выход глутатиона при концентрациях от 10 мкМ до 1 мМ. Выход GSH зависел от концентрации Н2О2 и прекращался немедленно после восстановления скорости роста до контрольного уровня (рисунок 14). Эти данные показывают, что супероксид и Н2О2 могут стимулировать выход глутатиона, который совпадает с периодом медленного роста. Рисунок 14. Изменения в экспорте глутатиона у бактерий E. coli BW25113, обработанных экзогенной Н2О2. Ранее было показано, что в голодающих по фосфату E. coli К12 ингибируется экспорт глутатиона и аккумулируются высокие уровни GSH в цитоплазме (Smirnova et al., 2012). Представляло интерес исследовать влияние экзогенных АФК на голодающие по фосфату E. coli. В этих условиях сильно ингибируется рост бактерий, но сохраняется клеточное дыхание (Moreau, 2004). В нерастущей культуре эффекты, оказываемые АФК, генерируемыми ксантин-ксантиноксидазой, оказались сходными по кинетике с теми, которые наблюдались в растущей культуре, однако заметно отличались по амплитуде изменений (рисунок 15). Действие экзогенных АФК вызывало достоверное повышение уровня GSHout в 1.25 раза. Супероксиддисмутаза, добавленная перед 77 ХО, так же полностью снимала эффект, как и в растущих клетках, экспорт GSH при этом прогрессивно снижался в 1.36 раза к 75-ой минуте. Наблюдаемый эффект может свидетельствовать о способности супероксида инициировать выход глутатиона в периплазму. 0.90 WT контроль 0.85 WT+XO 0.80 WT+SOD+XO GSH(out), мкМ 0.75 0.70 0.65 0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0 15 30 45 60 75 Время, мин Рисунок 15. Действие экзогенных АФК на голодающую по фосфату культуру E. coli BW25113. ХО (0.04 Е/мл) был добавлен во время 0. SOD (60 Е/мл) добавлен до ХО. Действие оксидантов, генерируемых ксантином и ХО, на экспорт GSH у голодающих по фосфату бактерий родительского штамма значительно отличалось от того, которое наблюдалось в растущей культуре, снабженной фосфатом. При действии экзогенных АФК на голодающие клетки уровень GSHout был в 3 раза меньше, в сравнении с растущей культурой, несмотря на увеличение уровня внутриклеточного GSH в голодающих клетках в 2.5 раза (таблица 2). Стоит отметить, что бактерии, голодающие одновременно по фосфату и глюкозе, не экспортировали глутатион в ответ на действие АФК (не показано). 78 Таблица 2. Уровни общего глутатиона у E. coli BW25113 при нелимитированном росте и фосфатном голодании. Воздействие Общий глутатион, мкМ/OD600 Растущая культура Голодание по фосфату 9.4 ± 0.6 24.8 ± 0.6 2.7 ± 0.2 (1.0) 1.46 ± 0.03 (1.0) GSHout, XOа 5.2 ± 0.1 (1.93)* 1.81 ± 0.1 (1.24)* GSHout, Н2О2, 10 мкMб 3.6 ± 0.1 (1.33)* 1.74 ± 0.1 (1.19) GSHout, Н2О2, 50 мкMа 4.1 ± 0.3 (1.52)* 1.56 ± 0.09 (1.07) Внутриклеточный GSH, контроль Экстраклеточный GSH, контроль Индексы в скобках показывают отношение уровня GSHout в вариантах с добавлением АФК к соответствующим значениям в контроле (без добавления). (а) данные показывают значения через 30 мин после добавления АФК. (б) данные показаны через 15 мин после добавления Н2О2, когда достигался максимальный выход GSH. Белок CydDC является единственным известным кассетным транспортером, экспортирующим глутатион из цитоплазмы в периплазму (Pittman et al., 2005). Ранее было показано, что CydDC не участвует в трансмембранной циркуляции GSH в экспоненциально растущих культурах (Smirnova et al., 2012). В наших экспериментах стимулируемый оксидантами выход глутатиона наблюдался в cydD мутантах, показывая, что транспортер CydDC не включен в этот процесс (рисунок 16). Транспортная система, которая экспортирует глутатион в периплазму при этих условиях остается неизвестной. Мутанты gor и ggt, лишенные глутатионредуктазы (GOR) и γ-глутамилтранспептидазы (GGT) аккумулировали больше глутатиона в среде в ответ на действие супероксида, чем родительский штамм. Утрата GGT полностью предотвращала снижение уровня экстраклеточного GSH, показывая, что этот фермент включен в возврат GSH в цитоплазму после истощения АФК (рисунок 16). 79 Рисунок 16. Влияние мутаций в генах, включенных в турновер GSH, на индуцируемый ХО экспорт глутатиона. 5.2 Взаимодействие глутатиона с экзогенными АФК Известно, что O2- и Н2О2 могут непосредственно реагировать с GSH без участия ферментов, образуя GSSG. Скорости этих реакций намного ниже, чем те, которые проходят при участии SOD и каталазы. Однако у E. coli фермент SodC не индуцируется в периплазме в экспоненциальной фазе (Gort et al., 1999). Экзогенная Н2О2 может легко проникать через цитоплазматическую мембрану и нейтрализоваться внутриклеточными ферментами. В наших условиях, уровень экзогенных оксидантов может поддерживаться на высоком уровне в течение периода, достаточного, чтобы периплазматический GSH прореагировал с супероксидом и пероксидом. Чтобы проверить, может ли GSH участвовать в нейтрализации АФК в периплазме, мы проследили за изменениями АФК в культуральной среде, не содержащей клеток. Оказалось, что в бесклеточной среде в отсутствие ХО, окисления GSH не наблюдалось в течение 40 мин (рисунок 17, контроль). После добавления ХО в среду, содержащую 2мкМ глутатиона, в течение 40 мин инкубации около 60% GSH окислялось до GSSG. Меньшая часть 80 этого окисления супрессировалась SOD (30 Е/мл), большая – добавлением каталазы (500 Е/мл) (рисунок 17). Таким образом, в бесклеточной среде обе формы АФК могут быть включены в окисление GSH, однако вклад долгоживущей Н2О2 более значителен, по сравнению с супероксидом. \ Рисунок 17. Аккумуляция GSSG в бесклеточной среде при взаимодействии GSH с ксантином и ХО. В отличие от бесклеточной системы, АФК, генерируемые ксантином и XO, не вызывали повышения концентрации экстраклеточного GSSG в культуре бактерий родительского штамма. Такой результат может быть объяснен быстрым возвращением окисленного глутатиона в цитоплазму и его восстановлением с участием GOR, свидетельством чего является 25% повышение уровня экстраклеточного GSSG у мутантов по генам ggt и gor в обработанных АФК культурах по сравнению с родителем (рисунок 18). Другой причиной отсутствия аккумуляции GSSG при экспозиции к АФК у клеток родительского типа может выступать деструкция Н2О2 с участием цитоплазматических ферментов. Действительно, анализ экспрессии генов выявил значительную индукцию гена katG в мутанте NM3031 (katG::lacZ), кодирующего OxyR-контролируемую каталазу HPI. Замедление роста сопровождалось также 81 индукцией RpoS-регулона (NM3041 (rpoS::lacZ)), в состав которого входит каталаза HPII (рисунок 19 А). В результате, уже через 5 мин после начала экспозиции к экзогенным АФК, концентрация Н2О2 в среде не превышала 1.3 мкМ и прогрессивно уменьшалась в течение 40 мин до базового уровня (рисунок 19 Б). Таким образом, окисление GSH экзогенными АФК в культуре E. coli BW25113, скорее всего, маскируется быстрым возвращением в цитоплазму и восстановлением GSSG с участием GGT и GOR, а также деструкцией АФК цитоплазматическими антиоксидантными ферментами. Рисунок 18. Изменение уровней экстраклеточного GSSG при действии АФК на различные штаммы E. coli. 82 А Б Рисунок 19. Экспрессия антиоксидантных генов (А) и изменение уровня Н2О2 в среде (Б) при действии экзогенных АФК у E. coli BW25113. 5.3 Влияние АФК на жизнеспособность и мембранный потенциал клеток Для выяснения возможной роли трансмембранной циркуляции GSH в защите бактерий от экзогенных АФК, мы проследили за изменениями жизнеспособности клеток и мембранного потенциала (Δѱ) в родительском штамме и gshA-мутанте, подвергнутых окислительному стрессу. Действие оксидантов существенно снижало удельную скорость роста, но не вызывало гибели родительских клеток в растущей культуре, о чем свидетельствуют данные по колониеобразующей способности и окрашиванию клеток флуоресцентными красителями SYTO 9 и пропидий йодидом («live-dead» тест). Голодающая по фосфату культура была немного более чувствительна к АФК, количество клеток, окрашенных пропидийиодидом, увеличилось на 3% (рисунок 20 Б). Степень и продолжительность ингибирования роста у мутантов sodC, ggt и, особенно, gshA была значительно выше, чем у родительского штамма (рисунок 20 А). 83 Б А Рисунок 20. Действие окислительного стресса на жизнеспособность бактерий E. coli: удельная скорость роста (А) и количество живых клеток после воздействия АФК (Б). Сравнение E. coli BW25113 и gshA-мутанта показывает, что КОЕ повышается более медленно в мутанте (рисунок 21). Этот результат находится в согласии с данными по скорости роста и предполагает, что мутант gshA более чувствителен к экзогенным АФК, чем его родитель. Наблюдаемая задержка роста у мутанта gshA значительно сокращалась по времени, когда в культуру добавляли экзогенный GSH. Внесение глутатиона (в количестве 100 мкМ) в среду культивирования перед добавлением XO, на 40% повышало устойчивость мутантов по синтезу gshA к ингибирующему действию АФК, продуцируемых ксантином и XO. Таким образом, защитное действие проявляли как эндогенный, так и экзогенный GSH. Способность экстраклеточного GSH облегчать восстановление скорости роста позволяет сделать предположение, что глутатион принимает участие в адаптации к стрессу, вызванному действием оксидантов. 84 Рисунок 21. Колониеобразующая способность бактерий BW25113 и мутанта gshA при действии ксантин/ХО. Для оценки влияния экзогенных АФК на мембранный потенциал (Δѱ) E. coli, мы использовали потенциал-чувствительный флуоресцентный краситель DiBAC4(3). Отрицательно заряженные молекулы красителя не способны проникнуть в нормальные клетки в силу наличия отрицательного заряда с внутренней стороны мембраны. Таким образом, клетки, окрашенные DiBAC4(3), можно рассматривать как деполяризованные. В наших условиях только 1% от числа бактерий родительского штамма во время экспоненциального роста в М9 или MOPS-среде был проницаемым для DiBAC4(3) (клетки со сниженным мембранным потенциалом) (рисунок 22 А). Добавление к этим клеткам сильнодействующего искусственного протонофора СССР (20 мкМ) увеличивало число клеток, проницаемых для DiBAC4(3), до 54% (не показано). Добавление XO в растущую культуру E. coli BW25113 приводило к повышению процента окрашенных клеток до 2.5%. Отсутствие GSH не усиливало эффект от действия АФК на мембранный потенциал. Напротив, процент окрашенных клеток в ХО-обработанном gshA-мутанте был несколько ниже, чем у 85 родителя. При одинаковых условиях, экспозиция клеток E. coli к перекиси водорода также приводила к незначительным изменениям Δѱ (рисунок 22 Б). В культуре, голодающей по фосфату, наблюдалось постепенное увеличение числа окрашенных клеток. Действие АФК усиливало потерю Δѱ клетками в этих условиях (рисунок 23). Таким образом, экзогенные АФК, производимые ксантином и XO, не оказывали влияние на жизнеспособность клеток, но вносили некоторые изменения в величину мембранного потенциала. 2.8 WT контроль 2.6 WT +XO Общая флуоресценция, % gshA контроль 2.4 gshA +XO 2.2 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 А 0 10 20 30 40 Время, мин Рисунок 22 А. Процент клеток, окрашенных DiBAC4(3) (снятие мембранного потенциала), при экспозиции E. coli BW25113 к ксантин-ХО. 86 2.5 WT контроль Общая флуоресценция, % 2.3 WT 10 мкМ H2O2 М9 2.1 WT 50 мкМ H2O2 М9 1.9 1.7 1.5 1.3 1.1 0.9 0.7 0.5 Б 0 10 20 Время, мин 30 40 Рисунок 22 Б. Процент клеток, окрашенных DiBAC4(3) (снятие мембранного потенциала), при экспозиции E. coli BW25113 к Н2О2. Общая флуоресценция, % 19 17 15 13 WT контроль, голод 11 WT +XO, голод WT 10 мкМ H2O2 MOPS Piголод WT 50 мкМ H2O2 MOPS Piголод 9 7 0 10 20 Время, мин 30 40 Рисунок 23. Процент клеток, окрашенных DiBAC4(3) при экспозиции голодающих по фосфату E. coli BW25113 к ксантин/ХО. Результаты, представленные в этой главе, свидетельствуют о том, что в экспоненциально растущих клетках E. coli BW25113 экзогенный супероксид и 87 перекись водорода стимулируют экспорт GSH и его трансмембранную циркуляцию. В нерастущих клетках, голодающих по фосфату, наблюдается резкое снижение АФК-зависимого экспорта GSH в среду. Можно предположить, что в условиях длительного ингибирования роста отсутствует движущая сила для экспорта глутатиона, либо какие-то факторы, например (p)ppGpp, которые индуцируются при остановке роста, включены в ретенцию GSH в цитоплазме. Действие экзогенных АФК не оказывает эффекта на жизнеспособность бактерий, однако способно приводить к некоторым изменениям Δѱ. В наших условиях, наличие эндогенного или экзогенного GSH способствовало восстановлению роста E. coli после воздействия АФК, генерируемых ксантином и ХО, свидетельствуя о возможном участии глутатиона в защите клеток от окислительного стресса. Кроме того, трансмембранная циркуляция GSH может иметь важные регуляторные функции, помогающие клеткам нивелировать последствия окислительного стресса и восстановить скорость роста. Следует отметить, что обнаруженная нами способность экзогенного супероксида стимулировать выход GSH из бактериальных клеток может иметь большое значение при расшифровке механизмов бактерицидного действия супероксида при «окислительном взрыве» макрофагов. 88 ГЛАВА 6. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ТРАНСМЕМБРАННОЙ ЦИРКУЛЯЦИЕЙ ГЛУТАТИОНА И ИОННЫМИ ПОТОКАМИ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ДОСТУПНОСТИ ФОСФАТА И СУЛЬФАТА В СРЕДЕ В данной главе основное внимание будет сосредоточено на исследовании уровней внутри- и экстраклеточного GSH и связи его транспорта с продукцией АФК и ионными потоками при лимитировании роста недостатком фосфатов или сульфатов в среде, а так же при возобновлении нормального роста после добавления лимитирующих компонентов. 6.1 Роль неорганического фосфата и сульфата в циркуляции глутатиона у бактерий E. coli В этой серии экспериментов бактерии культивировали на среде MOPS с заданной концентрацией дигидрофосфата калия. Ночную культуру выращивали при низкой концентрации фосфата (не более 150 мкМ) и после центрифугирования переносили в колбы со средой MOPS без фосфата (Pi) или с 2 мМ KH2PO4. При отсутствии лимитации по Pi клетки родительского штамма росли на среде MOPS с той же скоростью, как на среде М9 (не показано). Однако характер изменения концентрации экстраклеточного глутатиона на этих средах значительно различался (рисунок 24). Базовый уровень глутатиона на среде MOPS был в 2.5 раза выше, чем на среде М9 и сохранялся постоянным в процессе культивирования, тогда как при росте на среде М9 происходило накопление экстраклеточного глутатиона пропорционально приросту биомассы. 89 1.8 1.6 GSH(out), мкМ 1.4 1.2 1.0 0.8 WT MOPS 0.6 WT M9 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 OD600 1.0 1.1 1.2 Рисунок 24. Уровни GSHout в периодической культуре E. coli BW25113 (wt) при нелимитируемом росте на средах MOPS и М9. При переносе клеток из ночной культуры в свежую подогретую среду, не содержащую Pi, наблюдалось постепенное снижение удельной скорости роста с 0.5±0.03 час-1 до 0.17±0.01 час-1 в течение 180 мин, и далее удерживалась на этом уровне. pO2 сохранялось в пределах 85% (не показано). В этих условиях уровень GSHout также относительно постепенно растущей снижался культуры в 1.42 (2.08±0.24 раза (1.46±0.03 мкМ/OD600) мкМ/OD600) (рисунок 25). Концентрация внутриклеточного GSH, напротив, по мере голодания продолжала возрастать. Отношение уровня внутриклеточного GSH к его концентрации в среде (GSHin/GSHout) в голодающей по фосфату культуре достигало 17, тогда как в нелимитированных по Pi растущих культурах это соотношение было равно 5.6 на М9 и 3.4 на среде MOPS. Полученные результаты показывают, что при исчерпании фосфата снижается экспорт GSH в среду и происходит его внутриклеточная аккумуляция. 90 30 М9 рост MOPS голод MOPS рост GSH, мкМ/OD600 25 20 15 10 5 0 GSH(out) GSH(in) GSH(out) GSH(in) GSH(out) GSH(in) Рисунок 25. Уровни GSHout и GSHin в растущих и голодающих по фосфату культурах E. coli BW25113 (wt). При внесении источника фосфата (150 мкМ) в длительно голодающую культуру наблюдалось возобновление роста бактерий и быстрый выход глутатиона в среду (рисунок 26). Максимум экстраклеточного GSH, превышающий базовый уровень в 11 раз, достигался на 15-ой мин. Выход глутатиона носил обратимый характер: через 60 минут после внесения Pi, количество экстраклеточного GSH возвращалось к базовому значению, характерному для растущей культуры. Возвращение GSH в цитоплазму замедлялось в мутанте, дефицитном по синтезу γ-глутамилтранспептидазы (Δggt), что указывает на важную роль GGT в транспорте глутатиона внутрь клеток. Следует отметить, что скорость роста бактерий родительского штамма полностью восстанавливалась к 30-й минуте, в то время как у бактерий, мутантных по гену gshA, µmax достигалась только к 45-й минуте (рисунок 26), что может свидетельствовать о вкладе глутатиона в адаптацию E. coli к изменившимся условиям среды. Замена KH2PO4 на другие источники фосфора (глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат и их изомеры) не влияла на кинетику выхода GSH. Минимальная концентрация фосфата в среде, вызывающая стимуляцию экспорта 91 глутатиона, составляла 6 мкМ. При этой концентрации Pi отмечалось двукратное увеличение количества наружного GSH, уровень которого возвращался к 7 0.7 6 0.6 5 GSH(out) µ WT µ ΔgshA 4 0.5 0.4 3 +Pi 0.3 2 0.2 1 0.1 0 0.0 0 15 30 Время, мин 45 Удельная скорость роста, 1/час GSH(out), мкМ/OD600 базовому значению через 30 минут после внесения фосфата (не показано). 60 Рисунок 26. Изменения количества GSHout и удельной скорости роста при внесении Pi в голодающую культуру E. coli BW25113 (wt) и gshA мутантов. Для того чтобы исследовать связь между импортом Pi и экспортом GSH были использованы мутанты (pitA, pitB, pstA), лишенные различных транспортеров фосфата, а также мутанты по регуляторам фосфатного оперона phoB и phoR. Низкоаффинные PitA и PitB осуществляют транспорт Pi в цитоплазму с высокой скоростью, тогда как комплекс PstSCAB, находящийся под контролем pho-регулона, отвечает за высокоаффинный перенос Pi с низкой скоростью. Активация pho-регулона происходит при снижении концентрации фосфата в среде меньше 4 мкМ (Wanner, 1997; Hsieh, Wanner, 2010). Интересно, что это значение близко к минимальной концентрации фосфата в среде (6 мкМ), которая вызывала стимуляцию экспорта глутатиона в наших условиях. 92 Отсутствие транспортера PitA увеличивало уровень GSHout в ответ на добавление фосфата на 25% по сравнению с родительским штаммом. Не отмечено существенной разницы по этому показателю между остальными мутантами и родительским штаммом (рисунок 27). Таким образом, в описываемой ситуации не выявлено тесной связи между уровнем экстраклеточного глутатиона и скоростью входа фосфата в клетки. Выход глутатиона может стимулироваться при входе фосфата по любой из известных для него транспортных систем. * 9 GSH(out), мкМ/OD600 8 * 7 6 5 4 3 2 1 0 WT PitA PitB PstA PhoR PhoB Рисунок 27. Влияние мутаций по генам регуляторных и транспортных систем Pi на экспорт глутатиона, * - достоверные различия с WT. Мы также проверили влияние транспорта сульфат-аниона SO42- (Si) на экспорт глутатиона. Для создания дефицита сульфата в среде использовали модифицированную среду М9, в которой MgSO4 заменяли на эквимолярное количество MgCl2. Длительное голодание по источнику серы сопровождалось снижением удельной скорости роста до 0.1 час-1, при этом уровень наружного GSH приближался к нулю (~ 0.04 мкМ/OD600). При добавлении 0.5 мМ MgSO4 к голодающим клеткам, наблюдалось быстрое возобновление роста и такой же быстрый выброс GSH в среду. Максимальный уровень GSHout, в 20 раз превышающий значение в голодающей культуре, достигался через 45 минут 93 после добавления сульфата. Через 90 минут количество наружного глутатиона падало вдвое и далее удерживалось на этом уровне (рисунок 28). 0.9 0.8 GSH(out) 0.7 µ GSH(out), мкМ/OD600 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 +Si 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0.0 0.0 0 15 30 45 60 75 90 105 Удельная скорость роста, 1/час 0.8 120 Время, мин Рисунок 28. Изменения концентрации GSHout и удельной скорости роста при внесении Si в голодающую культуру E. coli родительского штамма. Известно, что PitA-транспортер фосфата способен переносить арсенат (Rosenberg, et al., 1977; Rosen, Liu, 2009). При внесении арсената натрия (100 мкМ) в длительно голодающую по фосфату культуру наблюдался необратимый линейный выход глутатиона (рисунок 29). Арсенат является токсичным для живых организмов. В наших условиях внесение его в культуру вызывало резкое снижение µ. Однако мы не наблюдали падения оптической плотности культуры, что указывает на отсутствие лизиса клеток в этих условиях. Скорее всего, наблюдаемый экспорт глутатиона при действии арсената происходит в ответ на вход анионов в цитоплазму, а не является результатом диффузии GSH из погибших клеток. 94 3.5 0.20 GSH(out) µ 0.15 Удельная скорость роста, 1/час GSH(out), мкМ/OD600 3.0 2.5 0.10 2.0 0.05 As 1.5 0.00 1.0 -0.05 0.5 0.0 -0.10 0 10 20 30 40 Время, мин 50 60 70 80 Рисунок 29. Изменение экспорта GSH и µ при внесении арсената в голодающую культуру E. coli родительского штамма. As – источник арсената. Примечательно, что активация экспорта глутатиона происходила как при стимуляции роста после добавления фосфата или сульфата, так и при ингибировании роста при обработке культуры арсенатом. Поскольку все три испытанных вещества (фосфат, сульфат и арсенат) транспортируется в виде анионов, их массированный вход в цитоплазму голодающих клеток может вызвать временный электрический дисбаланс. Этот дисбаланс может быть нейтрализован путем симпорта указанных анионов с каким-либо катионом (например, K+) или путем антипорта с другим анионом. Известно, что при физиологических условиях GSH является анионом. Учитывая вышесказанное, можно предположить, что в наших условиях движение анионов (фосфата, сульфата или арсената) в цитоплазму могло быть одним из стимулов к активации экспорта глутатиона. Полученные данные дают дополнительные аргументы в пользу высказанной ранее гипотезы о существования связи между трансмембранными потоками ионов и циркуляцией глутатиона (Smirnova et al., 2012). 95 6.2 Изменение Δψ и продукции супероксидного радикала при добавлении Pi к голодающим по фосфату клеткам Добавление Pi к клеткам E. coli, голодающим по фосфату, приводит к появлению субстрата для синтеза АТФ, что должно способствовать стимуляции транспорта электронов по дыхательной цепи и экспорта протонов. Известно, что у митохондрий возрастание ΔμH+ выше некоторого значения сопровождается усилением продукции супероксида (Skulachev, 1998). Используя флуоресцентный краситель DiBAC4(3), мы проследили за изменением мембранного потенциала (Δѱ) при росте E. coli BW25113 в присутствии и отсутствие фосфата, а также при добавлении Pi к голодающей культуре. Сразу после внесения фосфата в среду процент клеток, окрашенных DiBAC4(3), падал в 1.7 раза, по сравнению с базовым значением, что указывает на повышение уровня мембранного потенциала и возможную гиперполяризацию мембраны. Через 40 мин после добавления Pi значение Δѱ возвращалось к уровню, характерному для растущих клеток (рисунок 30). Общая флуоресценция, % 1.8 1.6 +Pi 1.4 1.2 1.0 Голодание (контроль) Голодание +Pi 0.8 Нелимитируемый рост (контроль) 0.6 0 10 20 Время, мин 30 40 Рисунок 30. Изменение количества клеток, окрашенных DiBAC4(3), при внесении Pi в голодающую культуру E. coli родительского штамма. 96 В параллельных экспериментах определялась продукция экстраклеточного супероксида клетками родительского штамма и мутанта gshA. Оба типа клеток производили супероксид с одинаковой скоростью. Скорость продукции O2·- в голодающих клетках была в 3.7 раз выше, чем в растущей культуре. Сразу после внесения Pi наблюдалось кратковременное возрастание скорости продукции супероксида в обоих штаммах в 3.3 раза, после чего уровень продукции супероксида возвращался к значению, характерному для растущих клеток. (рисунок 31). 35 WT (BW25113) ΔgshA (JW2663) V, пМоль/0.1*OD600*мин 30 25 20 15 10 5 0 Рост Голод +Pi Рост Голод +Pi Рисунок 31. Скорость продукции супероксида в культурах родительского штамма и мутанта gshA при изменении содержания фосфата в среде. Таким образом, полученные результаты показали, что вход фосфата в голодающие по этому субстрату клетки приводит к обратимому увеличению Δѱ, что сопровождается кратковременным повышением продукции эндогенного периплазматического супероксида. Как и в случае действия на растущую культуру E. coli ксантиоксидазой экзогенного (глава 5), супероксида, возрастание генерируемого концентрации ксантином эндогенного и O2·- сопровождалось резким усилением экспорта GSH в периплазму. На сновании полученных данных можно предположить следующую последовательность событий после добавления фосфата в голодающую культуру: вход фосфата в 97 цитоплазму → изменение мембранного потенциала → повышение уровня супероксида в периплазме → стимуляция экспорта глутатиона из цитоплазмы в периплазму и среду. 6.3 Влияние искусственных изменений ΔμH+ на экспорт глутатиона при добавлении фосфата в голодающую культуру Для дальнейшего изучения связи между изменениями ΔμH+ и экспортом глутатиона при добавлении фосфата, были проведены эксперименты с искусственной модуляцией электрохимического потенциала. Ранее было показано, что трансмембранная циркуляция GSH происходит только в дышащих клетках E. coli, и экспорт глутатиона прекращается при исчерпании глюкозы как единственного источника углерода и энергии (Smirnova et al., 2012). В наших условиях при комплексной лимитации бактериальной культуры по фосфату и глюкозе добавление фосфата в среду не сопровождалось выходом GSH (рисунок 32). Аналогичный эффект наблюдался в случае предобработки голодающей по фосфату культуры протонофором карбонилцианид-мета-хлорофенилгидразоном (CCCP) в количестве 20 мкМ (рисунок 32). CCCP способен осуществлять специфический перенос H+ через цитоплазматическую мембрану по градиенту концентрации, что приводит к разобщению протонного градиента ΔμH+ и деэнергизации мембраны. 98 7 +Pi 6 +CCCP+Pi GSH(out) мкМ/OD600 +Pi, без глюкозы 5 4 3 2 1 0 0 15 30 45 60 Время, мин Рисунок 32. Голодание по глюкозе и предобработка протонофором СССР предотвращают выход GSH в ответ на добавление Pi в голодающую по фосфату культуру (стрелкой обозначен момент воздействия). Добавление ингибитора АТФ-синтетазы дициклогексилкарбодиимида (DCCD) (100 мкМ) к голодающим по фосфату клеткам родительского штамма не приводило к существенному изменению уровня экстраклеточного глутатиона (не показано). Однако после внесения фосфата в эту культуру наблюдался быстрый выход GSH, амплитуда которого в 2 раза превышала уровень, достигаемый в необработанных DCCD клетках. Этот высокий уровень сохранялся на протяжении всего эксперимента (рисунок 33). Известно, что DCCD блокирует поток протонов через канал Fo АТФ-синтетазы. При работе дыхательной цепи закрытие Fo может приводить к повышению ΔμH+, т.е. СССР и DCCD действуют на ΔμH+ противоположным образом и это может объяснять различные эффекты двух соединений на экспорт глутатиона. 99 16 +Pi GSH(out), мкМ/ОD600 14 DCCD+Pi 12 10 8 6 4 2 0 0 15 30 Время, мин 45 60 Рисунок 33. Экспорт глутатиона при добавлении Pi в контрольных условиях и при действии протонофора DCCD (стрелкой обозначен момент воздействия). Полученные результаты указывают на то, что энергизация мембраны и наличие ΔμH+ являются необходимым условием экспорта GSH в ответ на добавление фосфата в голодающую по Pi культуру. 6.4 Изучение связи между экспортом GSH и К+ при добавлении фосфата и сульфата в культуры, голодающие по этим субстратам Электрохимический градиент протонов тесно связан с градиентом ионов калия, который играет важную роль в поддержании гомеостаза внутриклеточного рН (Booth, 1985). Для изучения зависимости между трансмембранными потоками ионов калия и экспортом глутатиона нами были использованы мутанты по системам выхода калия (Kef): KefB и KefC (Booth, 1996), а также по вспомогательному белку KefF, регулирующему активность транспортера KefC (Miller, 2000; Lyngberg, 2011). Для оценки вклада в экспорт GSH транспортной 100 системы глутатиона использовался мутант (cydD) по CydD субъединице АТФзависимого транспортера CydDC (Pittman et al., 2005). Быстрый выход GSH в среду в ответ на добавление фосфата в голодающую культуру наблюдался у всех изученных мутантов. У мутантов по генам cydD и kefC максимальный уровень GSHout был в 1.5 раза ниже, а у мутантов kefB и kefF – приблизительно в 1.2 раза ниже по сравнению с уровнем у родительского штамма (рисунок 34). Таким образом, в описываемых условиях, также как и при росте E. coli в микроаэробных условиях (глава 5), транспортер CydDC вносит существенный вклад в экспорт глутатиона из клеток, что может свидетельствовать о функционировании оперона CydABCD в клетках, голодающих по фосфату. В то же время, в мутантах cydD поддерживается достаточно высокая концентрация экстраклеточного глутатиона, что указывает на существование другой (других), еще не идентифицированной транспортной системы для экспорта GSH. 7 * GSH(out max), мкМ/OD600 6 * 5 * * kefC cydD 4 3 2 1 0 WT kefB kefF Рисунок 34. Сравнение максимальных уровней GSHout (GSHout max) при добавлении Pi у мутантов по экспорту калия и глутатиона. В отличие от бактерий, голодающих по фосфату, скорость и амплитуда выхода глутатиона при внесении сульфата в голодающую по Si культуру E. coli cydD не отличались от их значений у родительского штамма (рисунок 35). Однако 101 на второй фазе процесса (после 45-й мин) у мутанта cydD наблюдалось более быстрое падение GSHout, чем у родителя, что указывает на вклад транспортера CydDC в поддержание определенного уровня экстраклеточного глутатиона в этих условиях. Наиболее выраженное снижение экспорта GSH в ответ на добавление сульфата наблюдалось у kefC мутанта, где амплитуда выхода GSH была в 1.65 раза ниже, чем у родительского штамма (рисунок 35). Известно, что у E. coli обе системы (KefB и KefC), экспортирующие К+, обменивают его на Н+ и проявляют свойства каналов (Booth, 1996). Значительное снижение выхода GSH в этих мутантах, особенно в kefC (рисунки 34, 35) указывает на тесную связь экспорта GSH с экспортом ионов калия. Эта связь может быть опосредована косвенно через влияние калиевых потоков на величину ΔμH+. Как показано выше, наличие ΔμH+ является обязательным условием для стимуляции экспорта GSH в описываемых условиях. Известно также, что глутатион является регулятором Kef транспортеров и имеет на соответствующие сайты связывания (Munro et al., 1991; Ness, Booth, 1999). 0.9 k efC 0.8 WT cydD GSH(out), мкМ/OD600 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 +Si 0.1 0.0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Время, мин Рисунок 35. Экспорт глутатиона в родительском штамме и у мутантов по генам cydD и kefC при внесении источника сульфата (Si) к голодающим клеткам. них 102 С целью дальнейшего изучения связи между экспортом GSH и К+ мы провели серию экспериментов, в которых определяли уровни внутриклеточного калия (K+in) при переходе от голодания к росту у бактерий родительского штамма и мутантов kefC, cydD и gshA. Мутации по генам cydD и gshA не влияли на базовый уровень внутриклеточного калия в клетках, голодающих по фосфату, в то время как мутация kefC снижала этот уровень на 15% по сравнению с родительским штаммом. Добавление фосфата к голодающим культурам сопровождалось некоторым повышением уровня внутриклеточного K+, которое было выражено у родителя в 1.4 раза, мутантов kefC в 1.3 раза и cydD в 1.2 раза (рисунок 36). У бактерий, лишенных GSH, не выявлено достоверных изменений K+in при добавлении фосфата в среду. Повышение K+in в клетках родительского штамма имело обратимый характер и после быстрого роста в течение 5 мин сменялось снижением до нового уровня, характерного для растущей культуры после добавления фосфата. В мутанте, лишенном системы KefC, наблюдалось непрерывное накопление калия в клетках. 70 WT cydD * 60 K(in), мкМ/OD600 ΔkefC Δ gshA 50 * * * * 5' 15' ** 40 30 20 10 0 0' 5' 15' 0' 5' 15' 0' 5' 15' 0' Время, мин Рисунок 36. Изменение концентрации внутриклеточного калия (K+in) при внесении фосфата в голодающую культуру различных штаммов E. coli (*- достоверное различие внутри группы в сравнении с базовым значением, ** - достоверное различие базовых уровней в сравнении с WT). 103 Базовый уровень внутриклеточного калия в культуре E. coli BW25113, голодающей по сульфату, был в 4 раза выше, чем в клетках, растущих на среде М9 с сульфатом. Переход от голодания к росту после добавления сульфата сопровождался почти линейным снижением концентрации K+in в течение 90 минут с последующей стабилизацией на новом уровне, близком к концентрации в растущих клетках (рисунок 37). Следует отметить, что ускорение выхода калия из клеток совпадало с максимальным уровнем экстраклеточного GSH. Стабилизация GSHout на новом уровне, характерном для растущей культуры, сопровождалась прекращением выхода калия. Полученные результаты свидетельствуют о тесной связи между трансмембранными потоками GSH и К+ при переходе клеток E. coli от голодания к росту при добавлении лимитирующего субстрата. GSH(out), мкМ/OD600 K(in) 0.6 160 120 0.4 80 +Si 0.2 K(in), мкМ/OD600 GSH(out) 0.8 40 0.0 0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Время, мин Рисунок 37. Изменения уровней GSHout и Kin после внесения Si к голодающим клеткам E. coli родительского штамма. Суммируя результаты, представленные в данной главе, можно заключить, что при наличии источника энергии (глюкозы) и ΔµH+ на цитоплазматической мембране активный импорт анионов фосфата и сульфата при их добавлении к голодающим клеткам E. coli стимулирует обратимый выход GSH из цитоплазмы в периплазму и окружающую среду. В случае голодания по Pi внесение фосфата 104 активирует трансмембранный перенос протонов из цитоплазмы, что, повидимому, приводит к повышению Δψ, усилению продукции активных форм кислорода в периплазме и стимуляции редокс-чувствительного экспорта GSH, который тесно сопряжен с экспортом К+ из клеток. Выход GSH осуществляется с участием АТФ-зависимого транспортера CydDC и еще не идентифицированного переносчика, предположительно зависящего от ΔµH+. Выход К+ может происходить при посредстве GSH-регулируемых Kef систем, о чем свидетельствуют поведение мутантов kefB и kefС. Экспорт калия через эти системы сопряжен с импортом протонов (К+/Н+ обмен), что может способствовать слабому разобщению ΔµH+ на сопрягающей мембране и снижению продукции активных форм кислорода (Skulachev, 1998), и далее к ограничению экспорта GSH и К+. Такой цикл может быть частью сенсора и механизма регуляции, включенного в адаптацию бактерий к изменяющимся условиям среды. В частности, в наших экспериментах мутанты, лишенные GSH, медленнее возобновляли рост после добавления фосфата в голодающую культуру. В нормальных условиях эта система может вносить вклад в регуляцию ΔµH+. Обнаруженная нами высокая степень зависимости количества экспортируемого GSH от наличия транспортера KefC указывает на то, что в физиологических условиях эта система может играть основную роль в регуляции ΔµH+, величина которого влияет на экспорт GSH, либо KefC непосредственно участвует в транспорте GSH через этот канал. 105 ГЛАВА 7. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПОРТА ГЛУТАТИОНА ПРИ АМИНОКИСЛОТНОМ ГОЛОДАНИИ 7.1 Изменение циркуляции глутатиона и цистеина при аминокислотном голодании и возобновлении роста В главе 4 было отмечено, что у мутанта relA, дефицитного по синтезу глобального регулятора (p)ppGpp, уровень GSHout и скорость продукции супероксида были примерно в два раза ниже, чем у родительского штамма. Одновременно, этот мутант отличался от всех испытанных штаммов самым низким уровнем GSHin. Эти данные свидетельствуют о том, что у E. coli при нормальных условиях уровни глутатиона по обе стороны цитоплазматической мембраны и продукция супероксида в периплазме могут находиться под контролем (p)ppGpp. При аминокислотном голодании происходит активация RelA-зависимого пути синтеза (p)ppGpp и быстрое накопление регулятора в цитоплазме и индукция «строгого ответа». В наших экспериментах индукция «строгого ответа» достигалась путем добавления в растущую на среде М9 культуру E. coli валина, который препятствует синтезу изолейцина (валиновый блок). Голодание по изолейцину приводит к быстрому повышению в клетках уровня (p)ppGpp (Lagosky, Chang, 1980). Изучалось действие валина на бактерии E. coli родительского штамма, одиночные мутанты relA, gshA и двойной мутант relAgshA. Внесение DL-валина в среду (0.5 мг/мл или 4.3 мМ) приводило к замедлению роста у всех изученных штаммов (Leavitt, Umbarger, 1962). У бактерий родительского штамма и gshA мутантов замедление роста сопровождалось торможением дыхания, которое регистрировалось по резкому повышению pO2 в среде. Подобный эффект отсутствовал у relA мутантов (рисунок 38). 106 85 relA wt gshA pO2, % 80 +ВАЛ 75 70 65 0 15 30 Время, мин 45 Рисунок 38. Изменение pO2 в штаммах E. coli при добавлении валина. Регистрация редокс-потенциала среды выявила наличие быстрого обратимого изменения Eh в область отрицательных значений в момент добавления валина (не показано). Максимальная амплитуда скачка Eh отмечалась у relA мутантов. Наблюдаемое изменение Eh полностью снималось добавлением изолейцина или SH-реагента N-этилмалеимида (NEM), что может указывать на причастность внеклеточных тиолов (глутатиона и цистеина) к генерации скачка Eh. Добавление валина к клеткам родительского штамма приводило к 2кратному повышению уровня внутриклеточного глутатиона от 4.78±0.55 мкМ/OD600 до 10±0.9 мкМ/OD600 через 60 мин после обработки. Наблюдаемое возрастание уровня GSHin при действии валина может быть связано с ингибированием синтеза белка и повышением внутриклеточного пула цистеина (предшественника синтеза глутатиона). В аэробных условиях цистеин способен восстанавливать свободное железо в цитоплазме, способствуя образованию токсичного гидроксильного радикала в реакции Фентона (Park, Imlay, 2003), поэтому в норме бактерии E. coli поддерживают низкий уровень 107 внутриклеточного цистеина, используя глутатион в качестве депо для этой аминокислоты. При экспоненциальном росте, у всех исследуемых штаммов, в том числе у gshA мутантов, количество цистеина в среде не превышало порог чувствительности используемого метода определения (менее 0.05 мкМ). Однако при внесении валина в среду, в культурах E. coli родительского штамма и мутантов наблюдался линейный выход цистеина (рисунок 39 А), что может быть результатом повышения его уровня в цитоплазме клеток. За 90 минут инкубации с валином клетки gshA мутанта накапливали в 4 раза больше, а двойного мутанта relAgshA – в 2 раза больше экстраклеточного цистеина, чем бактерии родительского штамма и relA мутанта. Внесение эквимолярной концентрации Lизолейцина (0.5 мг/мл или 4.4 мМ) приводило к снятию валинового блока и возобновлению роста и дыхания бактерий. Одновременно наблюдалась резкая остановка выхода и последующее снижение уровня цистеина в среде культивирования у всех исследуемых штаммов (рисунок 39 Б). Полученные результаты могут указывать на существование механизма, при котором выброс цистеина в среду является частью защитного пути предотвращения окислительного стресса, связанного с аккумуляцией свободного цистеина при остановке синтеза белка, что особенно отмечается у мутантов, лишенных способности депонировать излишек цистеина с образованием GSH. Поскольку внесение дополнительной мутации relA в клетки, мутантные по gshA, приводило к снижению экспорта цистеина, можно допустить, что выход цистеина из цитоплазмы может быть частью «строгого ответа» и активируется с участием (p)ppGpp. 108 1.2 2.5 ΔgshA ΔrelA ΔgshAΔrelA 1.5 WT 1.0 +ВАЛ 0.5 ΔrelA ΔgshAΔrelA 0.8 WT +ИЛЕ 0.6 0.4 +ВАЛ 0.2 0.0 А ΔgshA контроль 1.0 ΔgshA контроль 2.0 Цистеин, мкМ/OD600 Цистеин, мкМ/OD600 ΔgshA 0.0 0 20 40 60 Время, мин 80 100 Б 0 20 40 60 80 100 Время, мин Рисунок 39. Экспорт цистеина при аминокислотном голодании (А) и при возобновлении роста после внесения изолейцина (Б) у различных штаммов E. coli. Добавление валина к клеткам родительского штамма повышало уровень экстраклеточного GSH в 2 раза в течение 60-ти минут экспозиции (рисунок 40). Обработка валином relA мутанта, не способного активировать синтез (p)ppGpp в этих условиях, вызывала быстрый выход GSH из клеток, так что через 60 минут инкубации концентрация GSHout была в 12 раз выше, чем в необработанной растущей культуре (рисунок 40). Таким образом, нарушение механизма «строгого ответа» при аминокислотном голодании приводило к неконтролируемому выходу GSH, что указывает на участие гуанозинтетрафосфата в регуляции экспорта глутатиона. Следует отметить, что экспорт цистеина и глутатиона регулируется противоположным образом: relA мутация ингибирует выход цистеина, но стимулирует выход GSH из клеток, обработанных валином. При внесении L-изолейцина в культуру relA мутантов, обработанную валином, накопление экстраклеточного GSH прекращалось, и его уровень снижался по мере роста биомассы (рисунок 40). Добавление изолейцина к бактериям родительского штамма приводило к кратковременному возрастанию концентрации GSHout в 1.4 раза с последующей стабилизацией на новом базовом уровне, что хорошо согласуется с результатами других экспериментов, где обнаруживался аналогичный ответ при переходе от голодания к росту. 109 10.5 relA +ВАЛ WT +ВАЛ relA +ВАЛ+ИЛЕ WT +ВАЛ+ИЛЕ 9.0 GSH(out), мкМ/OD600 7.5 6.0 4.5 +ИЛЕ +ВАЛ 3.0 1.5 0.0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Время, мин Рисунок 40. Экспорт глутатиона при аминокислотном голодании и при возобновлении роста у родительского штамма и relA мутанта. 7.2 Изменение продукции супероксидного радикала при добавлении валина В предыдущих главах была показана тесная связь между уровнем продукции супероксида и экспортом GSH. Мониторинг экстраклеточного супероксида в культуре E. coli родительского штамма и relA мутанта показал, что добавление валина сопровождается почти двукратным увеличением скорости продукции супероксида в обоих штаммах (рисунок 41). У клеток родительского штамма скорость образования супероксида возвращалась к базовому значению через 30 минут экспозиции с валином, тогда как у relA мутанта она оставалась повышенной в течение всего периода наблюдения (рисунок 41), что указывает на отсутствие контроля экспорта GSH в relA мутанте. Таким образом, полученные 110 данные подтверждают обнаруженную в предыдущих экспериментах связь между повышением продукции периплазматического супероксида и усилением экспорта глутатиона. 12 V, WT V, relA V, пМоль/0.1*OD600*мин 10 +ВАЛ 8 6 4 2 0 0 15 30 Время, мин 45 60 Рисунок 41. Скорость продукции супероксида в родительском штамме и relA мутанте после добавления валина. 7.3 Изменение циркуляции глутатиона при добавлении низкой концентрации валина и предобработке хлорамфениколом Известно, что малые дозы хлорамфеникола (ХАФ) – антибиотика, нарушающего синтез белков за счёт блокирования пептидилтрансферазной активности 50S субъединицы рибосомы бактерий, – вызывают ингибирование relA-зависимого синтеза (p)ppGpp (Lagosky, Chang, 1980). Добавление 1 мкг/мл ХАФ к экспоненциально растущим клеткам родительского штамма сопровождалось снижением удельной скорости роста в 1.6 раза (не показано). При этом регистрировалось повышение концентрации экстраклеточного глутатиона в 1.7 раза через 30 минут после воздействия, с последующим возвращением GSHout к базовому уровню (рисунок 42). Добавление валина к бактериям, предварительно обработанным хлорамфениколом, приводило к 111 быстрой остановке роста и необратимому выходу GSH из цитоплазмы, то есть наблюдался ответ, аналогичный ответу на валин у relA мутанта. Наблюдаемый эффект можно рассматривать как дополнительное доказательство участия relAзависимого синтеза в (p)ppGpp регуляции экспорта глутатиона при аминокислотном голодании. 3.0 WT +ХАФ WT +ХАФ+ВАЛ GSH(out), мкМ/OD600 2.5 2.0 +ВАЛ +ХАФ 1.5 1.0 0.5 0.0 0 15 30 45 60 Время, мин 75 90 Рисунок 42. Экспорт глутатиона при действии ХАФ в контроле и при индукции аминокислотного голодания у родительского штамма E. coli. Интересно отметить, что амплитуда и продолжительность выхода GSH в ответ на обработку валином зависели от концентрации валина, вносимой в среду. Низкая доза валина (1 мкг/мл) ингибировала рост клеток E. coli BW25113 в той же степени, что и высокая доза (0.5 мг/мл) на протяжении 60 минут инкубации, после чего в первом случае происходило возобновление роста в результате исчерпания валина в среде (рисунок 43). Скорость выхода GSH в клетках, обработанных низкой дозой валина была в 1.7 раза ниже, чем при обработке высокой дозой. При возобновлении роста отмечалось кратковременное возрастание уровня GSHout в 1.25 раза с последующим возвращением к базовому значению, что совпадает с динамикой GSHout при снятии валинового блока добавлением изолейцина. 112 4.5 0.5 мг/мл ВАЛ µ при 0.5 мг/мл 0.8 1 мкг/мл ВАЛ µ при 1 мкг/мл 4.0 GSH(out), мкМ/OD600 3.5 0.6 3.0 0.5 2.5 +ВАЛ 0.4 2.0 0.3 1.5 0.2 1.0 0.5 0.1 0.0 0.0 0 15 30 45 60 75 90 105 Удельная скорость роста, 1/час 0.7 120 Время, мин Рисунок 43. Экспорт глутатиона и изменения µ при действии разных концентраций валина на клетки родительского штамма. Суммируя данные, представленные в данной главе, можно заключить, что при аминокислотном голодании активация RelA-зависимого пути развития «строгого ответа» приводит к изменению циркуляции тиолов – цистеина и глутатиона. Запуск механизма адаптации к аминокислотному голоданию провоцирует усиленный экспорт цистеина из клеток в среду, особенно выраженный у мутантов по синтезу GSH – естественного депо цистеина в клетке. Вероятно, обнаруженный феномен предотвращает развитие окислительного стресса в условиях избытка внутриклеточного цистеина и повышенной продукции АФК. Полученные результаты показывают, что выход цистеина из цитоплазмы может являться частью «строгого ответа» с участием (p)ppGpp. В то же время повышение концентрации (p)ppGpp при аминокислотном голодании препятствует массированному выходу GSH из клеток E. coli, доказательством чего является неконтролируемый экспорт глутатиона в ответ на валин в ситуациях, когда 113 «строгий ответ» нарушен (relA мутация или предобработка хлорамфениколом). Таким образом, по-видимому, гуанозинтетрафосфат может противоположным образом регулировать экспорт глутатиона и цистеина в клетках E. coli. 114 ОБСУЖДЕНИЕ Практически все типы клеток, обладающие способностью синтезировать глутатион, могут экспортировать в среду GSH, GSSG и глутатион-S-конъюгаты (Meister, 1983). Ранее было показано, что бактерии E. coli накапливают GSH в среде с максимумом в ранней стационарной фазе и последующим его поглощением клетками с участием GGT в поздней стационарной фазе (Owens, Hartman, 1986; Suzuki et al., 1993; 1987). Позже было установлено, что в аэробных экспоненциально растущих культурах E. coli GSH непрерывно циркулирует между клетками и средой и его экстраклеточная концентрация является результатом динамического баланса между выходом GSH из клеток и GGTопосредуемым возвращением в цитоплазму (Smirnova et al., 2012). Этот баланс может быть нарушен различными факторами внешней среды, которые изменяют ΔµH+ и скорость дыхания бактерий. Однако механизм и функциональная значимость трансмембранной циркуляции GSH у E. coli остаются недостаточно изученными. Среди функций экстраклеточного GSH в клетках различного типа были предложены: транспорт аминокислот (Meister, 1983), защита от токсичных соединений, включая тяжелые металлы (Owens, Hartman, 1986), использование GSH в качестве нетоксичного резерва и транспортной формы цистеина (Ookhtens, Mittur, 1994), модуляция сигнальных путей вследствие «прооксидантного» действия GGT (Paolicchi et al., 2002) и другие. Вместе с тем было показано, что в аэробных условиях экспоненциально растущие клетки E. coli продуцируют в периплазму постоянный поток супероксида, который является результатом аутоокисления дигидроменахинона в электрон транспортной цепи (Korshunov, Imlay, 2006). Как выход супероксида в периплазму, так и трансмембранная циркуляция GSH осуществляются только в дышащих клетках E. coli, что позволило высказать предположение об их взаимосвязи и участии GSH в защите компонентов периплазмы от окислительного стресса (Smirnova et al., 2012). Целью настоящего исследования являлось изучение изменений редокс-статуса и трансмембранной циркуляции 115 глутатиона, их связи с продукцией АФК и роли в процессе адаптации клеток E. coli к изменениям окружающей среды. Результаты исследований показали, что в наших условиях накопление биомассы в периодической культуре E. coli до OD600 0.7 - 0.8 сопровождается снижением рО2 до нулевого уровня, падением редокс-потенциала среды (Eh) в область отрицательных значений, снижением удельной скорости роста и модуляцией экспрессии генов rpoS и sodA, что, в совокупности, свидетельствует о переходе культуры от аэробного к микроаэробному метаболизму. Отличия в динамике изменения µ и экспрессии генов rpoS и sodA в клетках родительского типа и gshA мутанта указывают на участие глутатиона в этом процессе. Характер изменения внутриклеточного и экстраклеточного GSH зависел от наличия мутаций в генах, связанных с турновером GSH (ggt, gor и cydD), продукцией супероксида и регуляцией клеточных функций. Мутанты menA и relA, продуцировавшие меньше экстраклеточного супероксида, накапливали меньше глутатиона в среде, в то время как клетки, лишенные периплазматической SodC, или неспособные ее индуцировать из-за отсутствия RpoS, экспортировали больше GSH, что подтверждает связь между экспортом глутатиона и продукцией супероксида. При переходе к микроаэробным условиям, под контролем редоксчувствительного регулятора ArcB (Shalel-Levanon et al., 2005) происходило переключение экспорта GSH с не идентифицированной транспортной системы на АТФ-зависимый транспортер свидетельствуют о CydDC. способности клеток В целом E. coli полученные регулировать данные продукцию супероксида и экспорт глутатиона и о включении этих процессов в общую регуляторную сеть бактериальной клетки. Тесная связь между продукцией периплазматического супероксида и экспортом GSH может свидетельствовать об участии глутатиона в поддержании редокс-статуса периплазмы. Периплазма E. coli является компартментом с более окисленными условиями (чем цитоплазма), при которых большая часть цистеиновых остатков периплазматических белков образует дисульфидные связи. У исследованных мутантов в экспоненциальной фазе роста соотношение 116 GSHout/GSSGout варьировало от 5/1 до 3/1, что приблизительно в 100 раз меньше, чем в цитоплазме (Smirnova et al., 2012). Интересно, что подобное низкое соотношение GSH/GSSG наблюдается в эндоплазматическом ретикулуме эукариотических клеток (от 1/1 до 3/1) (Chakravarthi et al., 2006). Это соотношение считается оптимальным для формирования нативных дисульфидных связей в белках, осуществляемого в этом компартменте. Хотя формирование белковых дисульфидных связей в периплазме E. coli катализируется редокс-ферментами семейства Dsb (Ritz, Beckwith, 2001), поддержание соответствующего редоксбаланса в периплазме с участием GSH и супероксида может играть важную роль в этом процессе. При переходе к микроаэробным условиям соотношение GSHout/GSSGout у бактерий родительского штамма и мутантов по генам rpoS, arcA, sodC значительно повышалось, в то время как у мутантов arcB и relA несколько увеличивалось, либо не изменялось (menA) или даже снижалось у мутантов gor и cydD. Подобные отклонения в изменении редокс-баланса в периплазме могут приводить к нарушениям нормальных процессов адаптации к изменяющимся условиям аэрации. Кроме поддержания редокс-баланса в периплазме, GSH может защищать ее компоненты от окислительного стресса, что особенно актуально в экспоненциально растущих культурах, где продукция супероксида максимальна, а периплазматическая супероксиддисмутаза SodC не индуцирована (Gort et al., 1999). В наших условиях, в бесклеточной системе восстановленный глутатион был способен к прямому взаимодействию с О2·- и Н2О2 с образованием GSSG. Обработка экспоненциально растущей культуры E. coli экзогенным супероксидом, генерируемым парой ксантин-ксантиноксидаза, приводила к обратимому ингибированию роста бактерий и почти двукратному увеличению уровня экстраклеточного GSH. Предобработка экзогенной каталазой или супероксиддисмутазой снижала или полностью предотвращала выход GSH, индуцированный ксантиноксидазой, свидетельствуя о том, что и супероксид, и образующаяся при его дисмутации Н2О2 вносят вклад в индукцию экспорта GSH. Эффект супероксида и низких доз Н2О2 на экспорт GSH зависел от энергизации 117 мембраны и резко снижался в клетках, голодающих по фосфату, несмотря на 2.5кратное возрастание внутриклеточного GSH в этих условиях. Снижение эффекта АФК на выход глутатиона может указывать на участие в контроле экспорта GSH других факторов, например, (p)ppGpp, уровень которого резко возрастает при голодании по фосфату (Hengge, 2008). Выход GSH, индуцированный АФК, носил обратимый характер. Возвращение глутатиона в клетки было опосредовано GGT и ингибировалось у мутантов по ggt и gor. Ранее было показано, что экспрессия ggt и gor резко возрастает в условиях пероксидного стресса (Ohtsu et al., 2010). Повышение уровня GSHout при обработке супероксидом в наших экспериментах указывает на ускорение трансмембранной циркуляции GSH при действии оксидантов. Ускорение циркуляции глутатиона и быстрая деструкция Н2О2 за счет повышения активности каталазы HPI, кодируемой геном katG, по-видимому, объясняют отсутствие накопления GSSG при действии супероксида на клетки родительского штамма. Обработка E. coli экзогенным супероксидом не вызывала гибели клеток, однако значительно ингибировала их рост. Степень и продолжительность фазы ингибирования роста у мутантов sodC, ggt и, особенно gshA, была существенно выше, чем у родительского штамма, что указывает на важную роль продуктов этих генов в защите клеток E. coli от окислительного стресса. Возобновление роста в gshA мутанте значительно ускорялось, если в культуру добавляли экзогенный GSH. Экстраклеточный GSH, по-видимому, способен непосредственно защищать компоненты периплазмы за счет снижения уровня АФК (в прямой реакции с глутатионом), но и осуществлять регуляторные функции, влияя на величину мембранного потенциала и, тем самым, на продукцию супероксида за счет изменения редокс-статуса менахинона. Наши эксперименты показали, что при экспозиции растущих клеток к экзогенным АФК наблюдается снижение мембранного потенциала, которое было менее выражено в gshA мутанте. Влияние глутатиона на Δψ может быть опосредовано его регуляторным воздействием на экспортные системы калия (Kef), которые осуществляют К+/Н+ обмен, закисляя цитоплазму и снижая ΔµH+ (Booth et al., 118 1996). Однако такой тип регуляции ΔµH+ и продукции супероксида, основанный на изменениях в скорости движения ионов H+/K+ через плазматическую мембрану, не осуществим для клеток, голодающих по глюкозе или фосфату, где трансмембранная циркуляция ионов резко замедлена, что обуславливает необходимость индукции SodC в стационарной фазе под контролем RpoS. Внесение фосфата в голодающую по нему культуру E. coli приводило к возобновлению роста, обратимому повышению Δψ, кратковременному усилению продукции супероксида и стимуляции редокс-чувствительного экспорта GSH, тесно сопряженного с транспортом К+ из клеток. Восстановление скорости роста у gshA мутанта занимало более длительный период в сравнении с родителем, что, как и в случае с обработкой экзогенными АФК, свидетельствует об адаптивной роли глутатиона. Необходимым условием выхода GSH являлась энергизация мембраны: отсутствие глюкозы и действие протонофора СССР предотвращали активацию экспорта GSH, в то время как ингибитор АТФ-синтетазы DCCD, повышающий значение ΔµH+, стимулировал этот процесс. Скорость и амплитуда выхода GSH не зависели от скорости транспорта фосфата в клетки, что подтверждается экспериментами с использованием мутантов, дефектных по генам pitA, pitB и pstA, кодирующим транспортеры фосфата, а также регуляторы фосфатного регулона phoR и phoB. Напротив, отсутствие высокоскоростного транспортера PitA стимулировало выход GSH в ответ на добавление фосфата, вероятно, за счет более длительного процесса адаптации по сравнению с клетками родительского штамма. Существование пороговой дозы (6 мкМ), ниже которой фосфат не вызывает выхода GSH, свидетельствует, скорее всего о том, что более низкие концентрации гиперполяризацию Pi не мембраны способны и, вызвать соответственно, не достаточно могут сильную активировать продукцию супероксида. Замена фосфата на арсенат, который транспортируется через те же транспортные системы (Rosenberg, et al., 1977; Rosen, Liu, 2009), но не включается в метаболизм, приводила к более медленному линейному и необратимому выходу GSH из клеток. Подобный процесс может быть связан с накоплением анионов и электрическим дисбалансом в цитоплазме, что должно 119 стимулировать выход глутатиона, также являющимся анионом при физиологических значениях рН. Альтернативным объяснением может быть участие глутатиона в детоксикации арсената, поскольку для работы арсенатредуктазы необходимы глутаредоксины, которые восстанавливают ее с участием GSH (Meyer et al., 2009). Добавление сульфата к клеткам E. coli, голодающим по источнику серы, также сопровождалось обратимым выходом GSH, длительность которого значительно превышала аналогичный ответ в экспериментах с фосфатным голоданием. Поскольку сульфат транспортируется в клетки в виде аниона, экспорт GSH может ускоряться в силу электрических причин или быть следствием возрастания внутриклеточной концентрации GSH при повышении продукции цистеина. Характерной особенностью выхода глутатиона при добавлении фосфата и сульфата к голодающим клеткам была его сопряженность с экспортом К+. Наблюдалась не только активация выхода калия в ответ на повышение экстраклеточного глутатиона, но и частичное ингибирование экспорта GSH в мутантах, лишенных транспортеров KefB и KefC, что может указывать на прямое или косвенное участие этих редокс-регулируемых систем, особенно KefC, в транспорте глутатиона. Мутация cydD также в 1.5 раза по сравнению с родителем ингибировала экспорт глутатиона в ответ на внесение фосфата, что может быть следствием индукции оперона CydABCD при голодании по фосфату. Повидимому, оба транспортера GSH: АТФ-зависимый CydDC и гипотетический ΔµH+-зависимый экспортер (возможно, KefC), при добавлении фосфата могут работать синхронно, что отличает эту ситуацию от действия экзогенного супероксида, где транспортер CydDC вносит лишь незначительный вклад. Как и в случае с обработкой клеток экзогенными АФК, функциональная значимость усиления экспорта GSH в ответ на добавление фосфата в голодающую культуру может быть связана с активацией К+/Н+ обмена через транспортеры KefB и KefC с целью снижения ΔµH+ и, как следствие, уменьшения продукции супероксида. Регуляторный цикл: повышение Δψ при активации выброса протонов → усиление продукции супероксида при участии менахинона → 120 стимуляция редокс-зависимого экспорта GSH в периплазму → активация GSHзависимого К+/Н+ обмена → снижение ΔµH+ в результате входа протонов в цитоплазму → уменьшение продукции супероксида, – может иметь универсальную природу и выполнять важные регуляторные функции, помогая клетке адаптироваться к меняющимся условиям окружающей среды. Подобный механизм обнаружен в митохондриях, где в определенных условиях активация футильного ионного транспортного цикла, например, циркуляции K+ за счет электрогенного входа K+ и K+/H+ антипорта, облегчающего выход К+ в обмен на протон, может приводить к разобщению мембранного потенциала (Skulachev, 1998). Было показано, что мягкое разобщение ΔµH+ в митохондриях может выступать в роли защитного механизма клетки, предотвращающего формирование супероксида при высоких значениях ΔµH+. Постоянный поток супероксида в периплазму и трансмембранная циркуляция глутатиона в аэробно растущих дышащих клетках E. coli могут являться компонентами сенсорно-регуляторного механизма, который активируется при изменении ΔµH+ и способен модулировать трансмембранные ионные потоки в соответствии с потребностями метаболизма в новых условиях окружающей среды. В качестве активатора регуляторного процесса, повидимому, может выступать эндогенное или искусственное изменение любого из его компонентов: ΔµH+, АФК или ионных потоков. Этот механизм, интегрируясь в единую регуляторную сеть, может прямо или через посредство редоксчувствительных сигнальных молекул влиять на активность глобальных регуляторов (RpoS, ArcB, OxyR, (p)ppGpp и др.), в свою очередь, сам находясь под контролем этих систем. Взаимосвязь отдельных компонентов предполагаемого сенсорно-регуляторного механизма представлена в схеме на рисунке 44. 121 O2* GSSG(out) GSSG(out) GSH(out) GSH(out) H+ H+ H+ H+ GS-Q O2* ? Периплазма GGT KefC Qo r QH Q el Цитоплазма KefF K+ K+ K+ K+ GS-Q GSH(in) GSH(in) GSH(in) Рисунок 44. Схема предполагаемого сенсорно-регуляторного механизма, осуществляющего регуляцию ΔµH+ в соответствии с потребностями метаболизма в меняющихся условиях среды. Возрастание Δψ при усилении экспорта H+ из цитоплазмы приводит к увеличению продукции супероксида в периплазме с участием менахинона (QH). Скорость продукции супероксида регулируется путем контроля редокс-состояния хинонов (окисленной Qel и восстановленной QH формы) посредством хиноноксидоредуктазы Qor и обладающих хиноноксидоредуктазной функцией вспомогательных белков KefG и KefF К+-транспортеров KefB и KefC. Повышение O2- стимулирует редокс-зависимый экспорт GSH в периплазму, что приводит к активации GSHзависимого К+/Н+ обмена. GSHin негативно регулирует активность систем Kef, тогда как его конъюгат с Qel – GS-Q в периплазме активирует транспорт ионов. Экспортная система калия KefC является не только мишенью для регуляции глутатионом, но прямо или косвенно (путем регуляции ΔµH+ или неизвестного транспортера GSH (?)) участвует в экспорте глутатиона. Активация редокс-активного К+/Н+ обмена приводит к мягкому разобщению ΔµH+ в результате входа протонов в цитоплазму и, как следствие, к снижению скорости продукции супероксида. 122 Особый механизма с интерес представляет универсальным связь регулятором описываемого стрессового регуляторного ответа (p)ppGpp. Отсутствие RelA, одной из двух синтетаз (p)ppGpp (RelA и SpoT) в клетках E. coli, приводило к снижению скорости продукции супероксида и уровня экстраклеточного GSH в растущей культуре по сравнению с клетками родительского штамма. С другой стороны, в условиях аминокислотного голодания, индуцированного добавлением валина, мутация relA провоцировала неконтролируемый выход GSH из клеток в среду, но ограничивала экспорт цистеина у двойного мутанта relAgshA по сравнению с мутантом, имеющим одиночную делецию gshA. Наблюдаемые эффекты указывают на участие (p)ppGpp в контроле продукции супероксида и экспорта тиолов, причем выход цистеина и GSH регулируются противоположным образом. Биологическая целесообразность такой регуляции может быть связана с необходимостью предотвращения окислительного стресса при усилении продукции АФК путем строгого контроля внутриклеточного уровня цистеина как вероятного восстановителя свободного железа в реакции Фентона (Park, Imlay, 2003). Механизм, при помощи которого (p)ppGpp может регулировать продукцию супероксида, остается неизвестным. Однако предложена гипотеза, согласно которой мишенью (p)ppGpp может выступать хиноноксидоредуктаза, кодируемая геном qor (Chang et al., 2002). Этот фермент способен менять редокс-состояние хинонов, следствием чего может быть изменение потока супероксида с этих компонентов электрон транспортной цепи. Следует отметить, что предложенный нами сенсорно-регуляторный механизм может быть мишенью для разработки новых антибактериальных препаратов или совершенствования приемов управления ростом микробных культур в биотехнологии. Мы предполагаем, что именно этот механизм бактериальной клетки подвергается атаке при окислительном взрыве в активированных макрофагах иммунной системы. 123 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Мониторинг продукции супероксида и трансмембранной циркуляции глутатиона выявил наличие общего механизма редокс-регуляции адаптивных процессов при переходе от аэробных к микроаэробным условиям, при добавлении фосфата и сульфата к голодающим культурам и при аминокислотном голодании клеток E. coli. Показана тесная положительная связь между уровнем эндогенного или экзогенного супероксида и концентрацией экстраклеточного GSH. Продемонстрировано влияние этих параметров на уровень внутриклеточного калия и величину мембранного потенциала. Обнаружена адаптивная роль глутатиона в процессах, связанных с возобновлением роста культур при изменении условий среды. На основании полученных данных предложена гипотеза, согласно которой постоянный поток супероксида в периплазму и трансмембранная циркуляция глутатиона в аэробно растущих клетках E. coli могут являться компонентами универсального сенсорно-регуляторного механизма, который активируется при изменении ΔµH+ и модулирует трансмембранные ионные потоки в соответствии с потребностями метаболизма в новых условиях окружающей среды. Регуляторная функция может быть реализована с участием экспортных систем К+ (Kef). В качестве активатора регуляторного процесса, по-видимому, может выступать эндогенное или искусственное изменение любого из компонентов: ΔµH+, АФК или ионных потоков. Этот механизм тесно интегрирован в единую регуляторную сеть и может прямо или через посредство редокс-чувствительных сигнальных молекул влиять на активность глобальных регуляторов (RpoS, ArcB, OxyR, (p)ppGpp и др.), в свою очередь, сам находясь под контролем этих систем. Полученные результаты являются важным вкладом в решение актуальной фундаментальной проблемы, связанной с изучением редокс-регуляции клеточных функций при адаптации клеток к изменению условий среды. Предложенный сенсорно-регуляторный механизм может быть мишенью для разработки новых 124 антибактериальных препаратов или совершенствования приемов управления ростом микробных культур в биотехнологии. 125 ВЫВОДЫ 1. При переходе E. coli от аэробных к микроаэробным условиям экспорт и редокс-статус глутатиона находятся под контролем глобальных регуляторов ArcAB, RpoS и синтетазы (p)ppGpp RelA, что свидетельствует о включении трансмембранной циркуляции глутатиона в общую регуляторную сеть бактериальной клетки. 2. Через сигнальную цепь «менахинон → ArcB → СydDC» статус глутатиона и интенсивность его трансмембранной циркуляции может контролироваться редокс-состоянием дыхательной цепи. 3. Обнаружено, что в растущих культурах E. coli микромолярные дозы экзогенных АФК (O2·- и Н2О2) не влияют на жизнеспособность бактерий, однако могут модулировать мембранный потенциал (Δψ) и стимулировать экспорт GSH, который оказывает антиоксидантное действие в периплазме, способствуя быстрому возобновлению роста. 4. Внесение фосфата в голодающую по нему культуру E. coli приводит к обратимому повышению Δψ, кратковременному усилению продукции супероксида и стимуляции редокс-чувствительного экспорта GSH, тесно сопряженного с экспортом К+ из клеток. Сопряженные изменения потоков GSH и К+ наблюдаются также при внесении SO4 2- в культуру, голодающую по сульфату. 5. Экспортная система калия KefC является не только мишенью для регуляции глутатионом, но прямо или косвенно участвует в экспорте GSH. 6. Индукция аминокислотного голодания в клетках E. coli приводит к ускорению продукции супероксида и стимулирует экспорт цистеина и GSH в среду. Мутация relA противоположным образом влияет на трансмембранные потоки цистеина и глутатиона, свидетельствуя об участии алармона (p)ppGpp в регуляции экспорта этих тиолов при аминокислотном голодании. 126 7. Предложена гипотеза, согласно которой периплазматический супероксид и GSH являются компонентами сенсорной и регуляторной системы E. coli, которая с участием транспортеров К+ (Kef) обеспечивает поддержание оптимального ΔµH+ на цитоплазматической мембране при изменении условий культивирования. 127 ЛИТЕРАТУРА 1. Октябрьский, О.Н. Изменения редокс-потенциала в культурах бактерий при стрессах / О.Н. Октябрьский, Г.В. Смирнова // Микробиология. – 2012. – Т. 81. – № 2. – С. 147-158. 2. Октябрьский, О.Н. Редокс-регуляция клеточных функций / О.Н. Октябрьский, Г.В. Смирнова // Биохимия. – 2007. – Т. 72. – В. 2. – С. 158-174. 3. Работнова, И.Л. Роль физико-химических условий (pH, rH2) в жизнедеятельности микроорганизмов / И.Л. Работнова // АН СССР. – 1957. – 275 с. 4. Смирнова, Г.В. Роль глутатиона при ответе Escherichia coli на осмотический шок / Г.В. Смирнова, Т.А. Красных, О.Н. Октябрьский // Биохимия. – 2001. – Т. 66. – В. 2. – С. 1195-1201. 5. Alvarez, A.F. Ubiquinone and menaquinone electron carriers represent the yin and yang in the redox regulation of the ArcB sensor kinase / A.F. Alvarez, C. Rodriguez, D. Georgellis // J. Bacteriol. – 2013. – V. 195(13). – Р. 3054-3061. 6. Aslund, F. Regulation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thiol-disulfide status / F. Aslund [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – V. 96. – P. 6161-6165. 8. Aslund, F. Two additional glutaredoxins exist in Escherichia coli: Glutaredoxin 3 is a hydrogen donor for ribonucleotide reductase in a thioredoxin/glutaredoxin 1 double mutant / F. Aslund [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. – V. 91. – P. 9813-9817. 9. Awano, N. Identification and functional analysis of Escherichia coli cysteine desulfhydrase / N. Awano [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – V. 71. – P. 4149-4152. 10. Baba, T. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection / T. Baba [et al.] // Mol. Syst. Biol. – 2006. – V. 2. – P. 111. 128 11. Bakker, E.P. Evidence for multiple K+ export systems in Escherichia coli / E.P. Bakker [et al.] // J. Bacteriol. – 1987. – V. 169. – P. 3743-3749. 12. Bakker, E.P. N-ethylmaleimide induces K+- H+ antiport activity in Escherichia coli K-12 / E.P. Bakker, W.E. Mangerich // FEBS Lett. – 1982. – V. 140. – P. 177-180. 13. Bauer, C.E. Mechanisms of redox control of gene expression / C.E. Bauer, S. Elsen, T.H. Bird // Annu. Rev. Microbiol. – 1999. –V. 53. – P. 495-523. 14. Beard, S.J. Evidence for the transport of zinc (II) ions via the pit inorganic phosphate transport system in Escherichia coli / S.J. Beard [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 2000. – V. 184. – P. 231-235. 15. Becker-Hapak, M. Role of rpoS in the regulation of glutathione oxidoreductase (gor) in Escherichia coli / M. Becker-Hapak, A. Eisenstark // FEMS Microbiol. Lett. – 1995. – V. 134. – P. 39-44. 16. Berger, E.A. A binding protein involved in the transport of cystine and diaminopimelic acid in Escherichia coli / E.A. Berger, L.A. Heppel // J. Biol. Chem. – 1972. – V. 247. – P. 7684-7694. 17. Bessette, P.H. In vivo and in vitro function of the Escherichia coli periplasmic cysteine oxidoreductase DsbG. / P.H. Bessette [et al.] // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. – P. 7784-7792. 18. Biggerstaff, J.P. New methodology for viability testing in environmental samples. / J.P. Biggerstaff [et al.] // Mol. Cell Probes. – 2006. – V. 20(2). – P. 141-146. 19. Blount, P. Towards an understanding of the structural and functional properties of MscL, a mechanosensitive channel in bacteria / P. Blount [et al.] // Biol. Cell. – 1996. – V. 87. – P. 1-8. 20. Booth, I.R. Bacterial ion channels / I. R. Booth [et al.] // Handbook of Biological Physics / Elsevier Press. – 1996. – V.2. - P.693–729. 21. Booth, I.R. Regulation of cytoplasmic pH in bacteria / I.R. Booth // Microbiol. Rev. – 1985. – V. 49. – P. 359-378. 22. Brennan, R.G. Hfq structure, function and ligand binding / R.G. Brennan, T.M. Link // Curr. Opin. Microbiol. – 2007. – V.10. – P. 125-33. 129 23. Burlacu-Miron, S. Structural and energetic factors of the increased thermal stability in a genetically engineered Escherichia coli adenylate kinase / S. BurlacuMiron [et al.] // J. Biol. Chem. – 1998. – V. 273. – P. 19102-19107. 24. Bushweller, J.H. Structural and functional characterization of the mutant Escherichia coli glutaredoxin (C14-S) and its mixed disulfide with glutathione / J.H. Bushweller [et al.] // Biochemistry. – 1992. – V. 31. – P. 9288-9293. 25. Butler, J.D. Amino acid composition and N-terminal sequence of purified cystine binding protein of Escherichia coli / J.D. Butler [et al.] // Life Sci. – 1993. – V. 52. – №14. – Р. 1209-1215. 26. Butler, C. Fast cytochrome bo from Escherichia coli binds two molecules of nitric oxide at CuB / C. Butler [et al.] // Biochemistry. – 1997. – V. 36. – P. 16259l6266. 27. Carmel-Harel, O. Roles of the glutathione- and thioredoxin-dependent reduction systems in the Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae responses to oxidative stress / O. Carmel-Harel, G. Storz // Annu. Rev. Microbiol. – 2000. – V. 54. – P. 439461. 28. Cashel, M. The stringent response / M. Cashel [et al.] // In Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and molecular biology. ASM Press, Washington D.C. – 1996. – V. 1. – P. 1458-1495. 29. Chakravarthi, S. The role of glutathione in disulphide bond formation and endoplasmic-reticulum-generated oxidative stress / S. Chakravarthi, C.E. Jessop, N.J. Bulleid // EMBO Rep. – 2006. – V. 7(3). – P. 271-275. 30. Chang, D.E. Gene expression profiling of Escherichia coli growth transitions: an expanded stringent response model / D.E. Chang, D.J. Smalley, T. Conway // Mol. Microbiol. – 2002. – V. 45. – P. 289-306. 31. Compan, I. Interaction of six global transcription regulators in expression of manganese superoxide dismutase in Escherichia coli K-12 / I. Compan, D. Touati // J. Bacteriol. – 1993. – V. 175. – P. 1687-l696. 130 32. Daßler, T. Identification of a major facilitator protein from Escherichia coli involved in efflux of metabolites of the cysteine pathway / T. Daßler [et al.] // Mol. Microbiol. – 2000. – V. 36. – P. 1101-1112. 33. Davis, N.K. Isolation and mapping of glutathione reductase-negative mutants of Escherichia coli K 12 / N. K. Davis [et al.] // J. Gen. Microbiol. – 1982. – V. 128. – P. 1631-1634. 34. De Groote, M.A. Periplasmic superoxide dismutase protects Salmonella from products of phagocyte NADPH-oxidase and nitric oxide synthase / M.A. De Groote [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – V. 94. – P. 13997–4001. 35. Deutch, C.E. Susceptibility of Escherichia coli to the toxic L-proline analogue L-selenaproline is dependent on two L-cystine transport systems / C.E. Deutch, I. Spahija, C.E. Wagner // J. App. Microbiol. – 2014. – V. 117. - № 5. – Р. 1487-1499. 36. Elmore, M.J. Activation of potassium efflux from Escherichia coli by glutathione metabolites / M.J. Elmore [et al.] / Mol. Microbiol. – 1990. – V. 4 – P. 405412. 37. Epstein, W. Multiple mechanisms, roles and controls of K+ transport in Escherichia coli / W. Epstein [et al.] // Biochem. Trans. – 1993. – V. 21. – P. 10061610. 38. Fahey, R.C. Occurrence of glutathione in bacteria / R.C. Fahey [et al.] // J. Bacteriol. – 1978. – V. 133. – P. 1126-1129. 39. Ferguson, G.P. Importance of glutathione for growth and survival of Escherichia coli cells: detoxification of methylglyoxal and maintenance of intracellular K+ / G.P. Ferguson, I.R. Booth / J. Bacteriol. – 1998. – V. 180. – P. 4314-4318. 40. Ferguson, G.P. Potassium channel activation by glutathione-S-conjugates in Escherichia coli: protection against methylglyoxal is mediated by cytoplasmic acidification / G.P. Ferguson, D. McLaggan, I.R. Booth // Mol. Microbiol. – 1995. – V. 17. – P. 1025-1033. 41. Ferguson, G.P. Protection of DNA during the exposure of Escherichia coli / G.P. Ferguson [et al.] // Mol. Microbiol. – 2000. – V. 35. – № 1. – P. 113- 122. 131 42. Filomeni, G. Cell signalling and the glutathione redox system / G. Filomeni, G. Rotilio, M.R. Ciriolo // Biochem. Pharmacol. – 2002. – V. 64. – P. 1057-1064. 43. Flint, D. The inactivation of Fe-S cluster containing hydro-lyases by superoxide / D. Flint, J. Tuminello, M. Emptage // J. Biol. Chem. – 1993. – V. 288. – P. 2236922376. 44. Franke, I. YfiK from Escherichia coli promotes export of O-acetylserine and cysteine / I. Franke [et al.] // J. Bacteriol. – 2003. – V.185. – P. 1161-1166. 45. Fridovich, I. Superoxide radical and superoxide dismutases / I. Fridovich // Ann. Rev. Biochem. - 1995. - V. 64. - P. 97-112. 46. Fujisawa, M. Three two-component transporters with channel-like properties have monovalent cation/proton antiport activity / M. Fujisawa, M. Ito, T.A. Krulwich // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2007. – V.104. – P. 13289-13294. 47. Gaitonde, M.K. A spectrophotometric method for the direct determination of cysteine in the presence of other naturally occurring amino acids / M.K. Gaitonde. // Biochem. J. – 1967. – V.104. – P. 627-633. 48. Georgellis, D. Quinones as the redox signal for the arc two-component system of bacteria / D. Georgellis, O. Kwon, E.C. Lin // Science. – 2001. – V. 292. – № 5525. – P. 2314-2316. 49. Gort, A.S. The regulation and role of the periplasmic copper, zinc superoxide dismutase of Escherichia coli / A.S. Gort, D.M. Ferber, J.A. Imlay // Mol. Microbiol. – 1999. – V. 32. - № 1. – Р. 179-191. 50. Gow, A. A novel reaction mechanism for the formation of S-nitrosothiol in vivo / A. Gow, D. Buerk, H. lschiropoulos // J. Biol. Chem. – 1997. – V. 272. – P. 28412845. 51. Greer, S. Glutathione reductase from Escherichia coli: cloning and sequence analysis of the gene and relationship to other flavoprotein disulfide oxidoreductases / S. Greer, R.N. Perham // Biochemistry. – 1986. – V. 25. – P. 2736-2742. 52. Harris, R.M. Characterization of PitA and PitB from Escherichia coli / R.M. Harris [et al.] // J. Bacteriol. – 2001. – V. 183. – P. 5008-5014. 132 53. Hausladen, A. Nitrosative stress: activation of the transcriptional factor OxyR / A. Hausladen [et al.] // Cell. – 1996. – V. 86. – P. 719-729. 54. Healy, J. Understanding the structural requirements for activators of the Kef bacterial potassium efflux system / J. Healy [et al.] // Biochemistry. – 2014. – V. 53. – P. 1982−1992. 55. Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms in control of the σS (RpoS) subunit of RNA-polymerase / R. Hengge-Aronis // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2002. – V. 66. – P. 373 - 395. 56. Hengge, R. The two-component network and the general stress sigma factor RpoS (σS) in Escherichia coli / R. Hengge // Adv. Exp. Med. Biol. – 2008. – V. 631. – P. 40-53. 57. Hewitt, L.F. Oxidation-reduction potentials in bacteriology and biochemistry / L.F. Hewitt // Baltimore: Williams & Wilkins. - 1950. - P. 215. 58. Hidalgo, E. Adaptive responses to oxidative stress: the soxRS and oxyR regulons / E. Hidalgo, B. Demple // Regulation of gene expression in Escherichia coli / Austin: RG Landes Company, 1996. – P. 435-452. 59. Holmgren, A. Glutaredoxin / A. Holmgren, F. Aslund // Methods Enzymol. – 1995. – V. 252. – P. 283-292. 60. Holmgren, A. Thioredoxin / A. Holmgren // Ann. Rev. Biochem. – 1985. – V. 54. – P. 237-271. 61. Hsieh, Y.-J. Global regulation by the seven-component Pi signaling system / Y.- J Hsieh, B.L. Wanner // Curr. Opin. Microbiol. – 2010. – V. 13. – P. 198-203. 62. Huang, C.S. On the active site thiol of gamma-glutamylcysteine synthetase: relationships to catalysis, inhibition, and regulation / C.S. Huang, W.R. Moore, A. Meis ter // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1988. – V. 85. – P. 2464-2468. 63. Imlay, J.A. Assay of superoxide production in Escherichia coli / J.A. Imlay, I. Fridovich // J. Biol. Chem. – 1991. – V. 266. – P. 6957-6965. 64. Imlay, J.A. Cellular defenses against superoxide and hydrogen peroxide / J.A. Imlay // Annu. Rev. Biochem. – 2008. – V. 77. – P. 755-776. 133 65. Imlay, J.A. Pathways of oxidative damage / J.A. Imlay // Annu. Rev. Microbiol. – 2003. – V. 57. – P. 395-418. 66. lmlay, J. Toxic DNA damage by hydrogen peroxide through the Fenton reaction in vivо and in vitro / J. lmlay, S. Linn // Science. – 1988. – V. 240. – P. 640-642. 67. Ishihama, A. Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase / A. Ishihama // Annu.Rev.Microbiol. – 2000. – V.54. – P. 499-518. 68. Iuchi, S. arcA (dye), a global regulatory gene in Escherichia coli mediating repression of enzymes in aerobic pathways / S. Iuchi, E.C. Lin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1988. – V. 85. – №.6. – P. 1888-1892. 69. Iwanicka-Nowicka, R. A new gene, cbl, encoding a member of the LysR family of transcriptional regulators belongs to Escherichia coli cys regulon / R. IwanickaNowicka, M.M. Hryniewicz // Gene. – 1995. – V. 166. – P. 11–17. 70. Jacob, H. E. Redox potential // Methods in Microbiology, Academic Press – 1970. – V. 2. – P. 92-121. 71. Jakob, U. Hsp33`s redox switch has a novel zinc-binding motif / U. Jacob, M. Eser, J.C. Bardwell // J. Biol. Chem. – 2000. – V. 275. – P. 38302-38310. 72. Kaluzna, A. Transport of glutathione S-conjugates in Escherichia coli / A. Kaluzna, G. Bartosz // Biochem. Mol. Biol. Intern. – 1997. – V. 43. – P. 161-171. 73. Kertesz, M.A. Bacterial transporters for sulfate and organosulfur compounds // Res Microbiol. – 2001. – V. 152. № 3-4. – Р. 279-290. 74. Keyer, K. Inactivation of dehydratase [4Fe-4Sl clusters and disruptlon of iron homeostasis upon cell exposure to peroxynitrite / K. Keye, J.A. lmlay // J. Biol Chem. – 1997. – V. 272. – P. 27652-27659. 75. Kilfoil, P.J. Regulation of ion channels by pyridine nucleotides / P.J. Kilfoil [et al.] // Circ. Res. – 2013. – V. 112. – P. 721-774. 76. Kim, S.O. OxyR: a molecular code for redox-related signaling / S.O. Kim [et al.] // Cell. – 2002. – V. 109. – P. 383-396. 77. Klatt, P. Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress / P. Klatt, S. Lamas // Eur. J. Biochem. – 2000. – V. 267. – P. 4928-4944. 134 78. Komitopoulou, E. Oxidation-reduction potential regulates RpoS levels in Salmonella typhimurium / E. Komitopoulou, N.J. Bainton, M.R. Adams // J. Appl. Microbiol. – 2004. – V. 96. – Р. 271-278. 79. Koprowski, P. Glutathione (GSH) reduces the open probability of mechanosensitive channels in Escherichia coli protoplasts / P. Koprowski, A. Kubalski // Eur. J. Physiol. – 1999. – V. 438. – P. 361-364. 80. Korshunov, S. A potential role for periplasmic superoxide dismutase in blocking the penetration of external superoxide into the cytosol of Gram-negative bacteria / S. Korshunov, J.A. Imlay. // Mol. Microbiol. – 2002. – V. 43. – P. 95-106. 81. Korshunov, S. Detection and quantification of superoxide formed within the periplasm of Escherichia coli / S. Korshunov, J.A. Imlay. // J. Bacteriol. – 2006. – V. 188. – P. 6326-6334. 82. Kosower, N.S. The glutathione status of cells / N.S. Kosower, E.M. Kosower // Internat. Rev. Cytol. – 1978. – V. 54. – P. 109-160. 83. Kredich, N.M. Biosynthesis of cysteine in Escherichia coli and Salmonella / N.M. Kredich // Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cell. Mol. Biol. ASM Press. – 1996. – P. 514–527. 84. Kredich, N.M. The molecular basis for positive regulation of cys promoters in Salmonella typhimurium and Escherichia coli / N.M. Kredich // Mol. Microbiol. – 1992. – V. 6. – P. 2747–2753. 85. Kumar, J.K. Proteomic analysis of thioredoxin-targeted proteins in Escherichia coli / J.K. Kumar, S. Tabor, C.C. Richardson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. –V. 101. – No. 11. – P. 3759-3764. 86. Kwon, Y.-W. Redox regulation of cell growth and cell death / Y.-W. Kwon [et al.] // Biol. Chem. – 2003. - V. 384. – P. 991 – 996. 87. Lagosky, P.A. Influence of amino acid starvation on guanosine 5′-diphosphate 3′-diphosphate basal-level synthesis in Escherichia coli / P.A. Lagosky, F.N. Chang // J. Bacteriol. – 1980. – V. 144. – P. 499-505. 135 88. Lash, L.H. Mitochondrial glutathione transport: physiological, pathological and toxicological implications / L.H. Lash // Chem. Biol. Interact. // – 2006. – V. 163. – P. 54-67. 89. Lazazzera, B.A. DNA-binding and dimerization of the Fe-S containing FNR protein from Escherichia coli are regulated by oxygen / B.A. Lazazzera [et al.] // J. Biol. Chem. – 1996. – V. 271. – P. 2762-2768. 90. Leavitt, R.I. Isoleucine and valine metabolism in Escherichia coli. XI. Valine inhibition of the growth of Escherichia coli strain K-12 / R.I. Leavitt, H.E. Umbarger // J. Bacteriol. – 1962. – V. 83. – P. 624-630. 91. Lennon, B.W. Twists in cataysis: alternating conformations of Escherichia coli thioredoxin reductase / B.W. Lennon, C.H. Jr. Williams, M.L. Ludwig // Science. – 2000. – V. 289. – P. 1190-1194. 92. Levanon, S.S. Effect of oxygen on the Escherichia coli ArcA and FNR regulation systems and metabolic responses / S.S. Levanon, K.Y. San, G.N. Bennett // Biotechnol Bioeng. – 2005. – V.89, №5. – Р.556-564. 93. Li, Y. Glutathione: a review on biotechnological production / Y. Li, G. Wei, J. Chen // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – V. 66. – № 3. – P. 233-242. 94. Lillig, C.H. New thioredoxins and glutaredoxins as electron donors of 3`- phosphoadenylylsulfate reductase / C.H. Lillig [et al.] // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. – P. 7695-7698. 95. Liu, X. Probing the ArcA-P modulone of Escherichia coli by whole genome transcriptional analysis and sequence recognition profiling / X. Liu, P.D. Wulf // J. Biol. Chemistry. – 2004. – V. 279, № 13. – P. 12588-97. 96. Lyngberg, L. KefF, the regulatory subunit of the potassium efflux system KefC, shows quinone oxidoreductase activity / L. Lyngberg [et al.] // J. Bacteriol. – 2011. – V. – 193. – № 18. – P. 4925-4932. 97. Magnusson, L. U. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli / Magnusson L.U., Farewell A., Nyström T. // Microbiol. Rev. – 2005. – V. 13. – P. 236-242. 136 98. Makino, K. Regulation of the phosphate regulon of Escherichia coli K-12: regulation and role of the regulatory gene phoR / K. Makino, H. Shinagawa, A. Nakata // J. Mol. Biol. – 1985. – V. 184. – P. 231-240. 99. Malpica, R. Identification of a quinone-sensitive redox switch in the ArcB sensor kinase / R., Malpica, B. Franco, C. Rodriguez, O. Kwon, D. Georgellis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – V. 101. – P. 13318-13323. 100. Matsumaru, K. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by glutathione depletion in murine hepatocytes / K. Matsumaru, C.Ji, N. Kaplowitz // Hepatology. – 2003. – V. 37. – No. 6. – P. 1425-1434. 101. Matsumoto, Y. Autogenous regulation of the gene for transcription termination factor RHO in Escherichia coli: localization and function of its attenuators / Y. Matsumoto [et al.] // J. Bacteriol. – 1986. – V. 166. – P. 945-958. 102. Meister, A. Glutathione / A. Meister, M.E. Anderson // Ann. Rev. Biochem. – 1983. – V. 52. – P. 711-760. 103. Meredith, M.J. Status of the mitochondrial pool of glutathione in the isolated hepatocyte / M.J. Meredith, D.J. Reed // J. Biol. Chem. – 1982. – V. 257. – P. 37473753. 104. Messner, K.R. The identification of primary sites of superoxide and hydrogen peroxide formation in the aerobic respiratory chain and sulfite reductase complex of Escherichia coli / K.R. Messner, J.A. Imlay // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. – P. 10119-10128. 105. Meury, J. A high-affinity site for glutathione in the cytoplasm of Escherichia coli and its possible role in potassium retention / J. Meury, A. Robin // Eur. J. Biochem. – 1985. – V. 148. – P. 113-118. 106. Meury, J. Glutathione and the gated potassium channels of Escherichia coli / J. Meury, A. Kepes // EMBO J. – 1982. – V. 1. – P. 339-343. 107. Meury, J. Glutathione-gated K+ channels of Escherichia coli carry out K+ efflux controlled by the redox state of the cell / J. Meury, A. Robin // Arch. Microbiol. – 1990. – V. 154. – P. 475-482. 137 108. Meury, J. Opening of potassium channels in Escherichia coli membranes by thiol reagents and recovery of potassium tightness / J. Meury, S. Lebail, A. Kepes // Eur. J. Biochem. – 1980. – V. 113. – P. 33-38. 109. Meyer, Y. Thioredoxins and Glutaredoxins: Unifying Elements in Redox Biology / Y. Meyer [et al.] // Annu. Rev. Genet. – 2009. – V. 43. – P. 335–367. 110. Michan, C. In vivo transcription of the Escherichia coli oxyR regulon as a function of growth phase and in response to oxidative stress / C. Michan [et al.] // J. Bacteriol. – 1999. – V. 181. – P. 2759-2764. 111. Miller, J.H. Experiments in molecular genetics / J.H. Miller // Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. – 1972. – 466 p. 112. Miller, S. Identification of an ancillary protein, YabF, required for activity of the KefC glutathione-gated potassium efflux system in Escherichia coli / S. Miller [et al.] // J. Bacteriol. – 2000. – V. 182. – P. 6536-6540. 113. Miranda-Vizuete, A. Cloning, expression, and characterization of a novel Escherichia coli thioredoxin / A. Miranda-Vizuete [et al.] // J. Biol. Chem. – 1997. – V. 272. – P. 30841-30847. 114. Missiakas, D. Identification and characterization of the Escherichia coli gene dsbB, whose product is involved in the formation of disulfide bonds in vivo / D. Missiakas, C. Geogopoulos, S. Raina // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1993. – V. 90. – P. 7084-7088. 115. Moreau, P.L. Diversion of the metabolic flux from pyruvate dehydrogenase to pyruvate oxidase decreases oxidative stress during glucose metabolism in nongrowing Escherichia coli cells incubated under aerobic, phosphate starvation conditions / P.L. Moreau // J. Bacteriol. – 2004. – V. 186. – P. 7364-7368. 116. Munro, A. The cloning and DNA sequence of the gene for the glutathione- regulated potassium-efflux system KefC of Escherichia coli / A. Munro [et al.] // Mol. Microbiol. – 1991. – V. 5. – P. 607-616. 117. Murata, K. Overproduction of glutathione and its derivatives by genetically engineered microbial cells / K. Murata, A. Kimura // Biotech. Adv. – 1990. – V. 8. – P. 59-96. 138 118. Neidhardt, F.C. Culture medium for Enterobacteria / F.C. Neidhardt, P.L. Bloch, D.F. Smith // J. Bacteriol. – 1974. – V. 119(3). – P. 736-747. 119. Ness, L.S. Different foci for the regulation of the activity of the KefB and KefC glutathione-gated K+ efflux systems / L.S. Ness, I.R. Booth // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. – P. 9524-9530. 120. Nikaido, H. Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria / H. Nikaido // J. Bacteriol. – 1996. – V. 178(20). – P. 5853-5859. 121. Oh, J.I. Redox signalling: globalization of gene expression / J.I. Oh, S. Kaplan // EMBO J. – 2000. – V. 19. – P. 4237-4247. 122. Ohtsu, I. L-cysteine/L-cystine shuttle system provides reducing equivalents to the periplasm in Escherichia coli / I. Ohtsu [et al.] // J. Biol. Chem. – 2010. – V. 285(23). – P. 17479-17487. 123. Oktyabrsky, O.N. Changes in intracellular potassium and thiol levels in Escherichia coli K12 under various stresses / O.N. Oktyabrsky, G.V. Smirnova // Biochem. Mol. Biol. Internat. – 1993a. – V. 30. – No. 2. – P. 377-383. 124. Oktyabrsky, O.N. Changes in redox potential of Escherichia coli culture and in extracellular glutathione status under osmotic shock / O.N. Oktyabrsky, G.V. Smirnova // Bioelectrochem. Bioenerg. – 1993b. – V. 32. – P. 287-294. 125. Ookhtens, M. Developmental changes in plasma thiol-disulfide turnover in rats: a microcompartmental approach / M.A. Ookhtens, V. Mittur // Am. J. Physiol. – 1994. – V. 267. – P. 415-425. 126. Owens, R.A. Export of glutathione by some widely used Salmonella typhimurium and Escherichia coli strains / R.A. Owens, P.E. Hartman // J. Bacteriol. – 1986. – V. 168. – P. 109-114. 127. Paget, M.S.B. Thiol-based regulatory switches / M.S.B. Paget, M.J. Buttner // Annu. Rev. Genet. – 2003. – V. 37. – P. 91-121. 128. Park, S. High levels of intracellular cysteine promote oxidative DNA damage by driving the Fenton reaction / S. Park, J.A. Imlay // J. Bacteriol. – 2003. – V. 185(6). – P. 1942-1950. 139 129. Paolicchi, A. Glutathione catabolism as a signaling mechanism / A. Paolicchi [et al.] // Biochem. Pharmacol. – 2002. – V. 64. – P. 1027-1035. 130. Parry, J. Identification of a CysB-regulated gene involved in glutathione transport in Escherichia coli / J. Parry, D.P. Clark // FEMS Microbiol. Lett. – 2002. – V. 209. – P. 81-85. 131. Pittman, M.S. A bacterial glutathione transporter (Escherichia coli CydDC) exports reductant to the periplasm / M.S Pittman, H.C. Robinson, R.K. Poole // J. Biol. Chem. – 2005. – V. 280(37). – Р. 32254-32261. 132. Pittman, M.S. Cysteine is exported from the Escherichia coli cytoplasm by CydDC, an ATP-binding cassette-type transporter required for cytochrome assembly / M.S. Pittman [et al.] // J. Biol. Chem. – 2002. –V. 277(51). – Р. 49841-49849. 133. Pomposiello, P.J. Redox-operated genetic switches: the SoxR and OxyR transcriptional factors / P. J. Pomposiello, B. Demple // Trends Biotechnol. – 2001. – V. 19. – P. 109-114. 134. Poole, R.K. Mutations affecting the cytochrome d-containing oxidase complex of Escherichia coli K12: identification and mapping of a fourth locus, cydD / R.K. Poole [et al.] // J. Gen. Microbiol. – 1989. – V. 135. – P. 1865-1874. 135. Poole, R.K. The cydD gene product, component of a heterodimeric ABC transporter, is required for assembly of periplasmic cytochrome c and of cytochrome bd in Escherichia coli / R.K. Poole, F. Gibson, G. Wu // FEMS Microbiol. Lett. – 1994. – V. 117. – Р. 217-223. 136. Potamitou, A. Protein levels of Escherichia coli thioredoxins and glutaredoxins and their relation to null mutants, growth phase, and function / A. Potamitou, A. Holmgren, A. Vlamis-Gardikas // J. Biol. Chem. – 2002. – V. 277. – P. 1856118567. 137. Potrykus, K. (p)ppGpp: Still Magical? / K. Potrykus, M. Cashel // Annu. Rev. Microbiol. – 2008. – V. 62. – P. 35-51. 138. Putman, M. Molecular properties of bacterial multidrug transporters / M. Putman, H.W. Van Veen, W.N. Konings // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2000. – V. 64(4). – P. 672-693. 140 139. Quadroni, M. Analysis of global responses by protein and peptide fingerprinting of proteins isolated by two dimensional gel electrophoresis: application to the sulphate starvation response of Escherichia coli / M. Quadroni [et al.] // J. Biochem. – 1996. – V. 239. – P. 773-781. 140. Rennenberg, H. Glutathione metabolism and possible biological roles in higher plants / H. Rennenberg // Phytochemistry. – 1982. – V. 21. – P. 2771-2781. 141. Ritz, D. Roles of thiol-redox pathways in bacteria / D. Ritz, J. Beckwith // Annu. Rev. Microbiol. – 2001. – V. 55. – P. 21-48. 142. Ritz, D. Thioredoxin 2 is involved in the oxidative stress response in Escherichia coli / D. Ritz [et al.] // J. Biol. Chem. – 2000. – V. 275, № 4. – P. 25052512. 143. Roosild, T.P. Mechanism of ligand-gated potassium efflux in bacterial in bacterial pathogens / T.P. Roosild [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. – 2010. – V. 107. – P. 19784-19789. 144. Rosen, B.P. Transport pathways for arsenic and selenium: a minireview / B.P. Rosen, Z. Liu // Environ. Int. – 2009. – V. 35. – P. 512-515. 145. Rosenberg, H. Two systems for the uptake of phosphate in Escherichia coli / H. Rosenberg, R.G. Gerdes., Chegwidden K. // J. Bacteriol. – 1977. – V. 131. – P. 505511. 146. Russel, M. Construction and characterization of glutaredoxin-negative mutants of Escherichia coli / M. Russel, A. Holmgren // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1988. – V. 85. – P. 990-994. 147. Russell, L.M. Linked transport of phosphate, potassium ions and protons in Escherichia coli / L.M. Russell, H. Rosenberg // Biochem. J. - 1979. – V. 184. - P. 1321. 148. Russell, L.M. The nature of the link between potassium transport and phosphate transport in Escherichia coli / L.M. Russell, H. Rosenberg // Biochem. J. – 1980. – V. 188. – P. 715-723. 141 149. Schafer, F.Q. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple / F.Q. Schafer, G.R. Buettner // Free Radic. Biol. Med. – 2001. – V. 30. – P. 1191-1212. 150. Schenk, H. Distinct effects of thioredoxin and antioxidants on the activation of transcription factors NF-kappa B and AP-1 / H. Schenk // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. – V. 91. – 1672-1676. 151. Schirmer, R.H. Glutathione reductase / R.H. Schirmer, R.L. Krauth-Siegel, G.E. Schultz // Coenzymes and Cofactors. N.Y. – 1989. – P. 553-596. 152. Schlösser, A. NAD+ binding to the Escherichia coli K+-uptake protein TrkA and sequence similarity between TrkA and domains of a family of dehydrogenases suggest a role for NAD+ in bacterial transport / A. Schlösser [et al.] // Mol. Microbiol. – 1993. – V. 9. – P. 533–543. 153. Seaver, L.C. Alkyl hydroperoxide reductase is the primary scavenger of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coli / L.C. Seaver, J.A. Imlay // J. Bacteriol. - 2001. – V. 183. – P. 7173-7181. 154. Seyfzadeh, M. spoT-dependent accumulation of guanosine tetraphosphate in response to fatty acid starvation in Escherichia coli / M. Seyfzadeh, J. Keener, M. Nomura // Proc. Natl Acad. Sci. – 1993. – V.90. – P. 11004–11008. 155. Shalel-Levanon, S. Effect of oxygen, and ArcA and FNR regulators on the expression of genes related to the electron transfer chain and the TCA cycle in Escherichia coli / S. Shalel-Levanon, K.Y. San, G.N. Bennett // Metab Eng. – 2005. – V. 7. – P. 364-374. 156. Sies, H. Glutathione and its role in cellular functions / H. Sies // Free Radic. Biol. Med. – 1999. – V. 27. – P. 916-921. 157. Skulachev, V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics / V.P. Skulachev // Biochim. Biophys. Acta. – 1998. – V. 1363. – P. 100124. 158. Smirnova, G.V. Betaine modulates intracellular thiol and potassium levels in Escherichia coli in medium with high osmolarity and alkaline pH / G.V. Smirnova, O.N. Oktyabrsky // Arch. Microbiol. – 1995. – V. 163. – P. 76-78. 142 159. Smirnova, G.V. Glutathione in bacteria / G.V. Smirnova, O.N. Oktyabrsky // Biochemistry (Moscow). – 2005. – V. 70. – P. 1199-211. 160. Smirnova, G.V. Transmembrane glutathione cycling in growing Escherichia coli cells / G.V. Smirnova, N.G. Muzyka, O.N. Oktyabrsky // Microbiol. Res. – 2012. – V. 167. – P. 166-172. 161. Spiro, S. FNR and its role in oxygen-regulated gene expression in Escherichia coli / S. Spiro, J.R. Guest // FEMS Microbiol. Rev. – 1990. – V. 75. – P. 399-428. 162. Stewart, E. J. Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins / E.J. Stewart, F. Aslund, J. Beckwith // EMBO J. – 1998. – V. 17. – P. 5543-5550. 163. Storz, G. Oxidative stress / G. Storz, J.A. Imlay // Curr. Opin. Microbiol. –1999. –V. 2. P. – 188-194. 164. Sun, Q.A. Redox regulation of cell signalling by selenocysteine in mammalian thioredoxin reductases / Q.A. Sun [et al.] // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. – P. 2452224530. 165. Suzuki, H. -Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12: formation and localization / H. Suzuki, T. Koyanagi, S. Izuka, A. Onishi, H. Kumagai // J. Bacteriol. – 1986. – V. 168. – P. 1332-1335. 166. Suzuki, H. Aminopeptidases A, B, and N and dipeptidase D are the four cysteinylglycinases of Escherichia coli K-12 / H. Suzuki [et al.] // J. Bacteriol. – 2001. – V. 183. – P. 1489-1490. 167. Suzuki, H. Escherichia coli K-12 can utilize an exogenous gamma-glutamyl peptide as an amino acid source, for which gamma-glutamyltranspeptidase is essential / H. Suzuki, W. Hashimoto, H. Kumagai // J. Bacteriol. – 1993. – V. 175. – P. 60386040. 168. Suzuki, H. Isolation, genetic mapping, and characterization of Escherichia coli K-12 mutants lacking -glutamyltranspeptidase / H. Suzuki, H. Kumagai, T. Tochikura // J. Bacteriol. – 1987. – V. 169. – P. 3926-3931. 143 169. Suzuki, H. The yliA, -B, -C, and -D genes of Escherichia coli K-12 encode a novel glutathione importer with an ATP-binding cassette / H. Suzuki [et al.] // J. Bacteriol. – 2005. – V. 187. – P. 5861-5867. 170. Takahashi, H. Post-translational processing of Neisseria meningitides gamma- glutamyl aminopeptidase and its association with inner membrane facing to the cytoplasmic space / H. Takahashi, H. Watanabe // FEMS Microbiol Lett. – 2004. – V. 234. – P. 27-35. 171. Тaschner, N.P. A differential effect of σS on the expression of the PHO regulon genes of Escherichia coli / N.P. Тaschner, E. Yagil, B. Spira // Microbiology. – 2004. – V. 150. – P. 2985-2992. 172. Tate, S.S. Gamma-glutamyl transpeptidase: catalitic, structural and functional aspects / S.S. Tate, А. Meister // Mol. Cell. Biochem. – 1981. – V. 39. – P. 357-368. 173. Taylor, B.L. PAS domains: internal sensors of oxygen, redox potential, and light / B.L. Taylor, I.B. Zhulin // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 1999. – V. 63. – P. 479506. 174. Thompson, G.A. Interrelationships between the binding sites for amino acids, dipeptides, and -glutamyl donors in -glutamyl transpeptidase / G.A. Tompson, А. Meister // J. Biol. Chem. – 1977. – V. 252. – P. 6792-6798. 175. Thony-Meyer, L. Biogenesis of respiratory cytochromes in bacteria / L. Thony- Meyer // Mol. Biol. Rev. – 1997. – V. 61. – P. 337-376. 176. Tietze, F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues / F. Tietze // Anal. Biochem. – 1969. – V. 27. – P. 502-522. 177. Tran, Q.H. Role of glutathione in the formation of the active form of the oxygen sensor FNR ([4Fe-4S];·FNR) and in the control of FNR function / Q.H. Tran [et al.] // Eur. J. Biochem. – 2000. – V. 267. – P. 4817-4824. 178. Traxler, M.F. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli / M.F. Traxler [et al.] // Mol. Microbiol. – 2008. – V. 68(5). – P. 1128-1148. 144 179. Tuggle, C.K. Glutathione reductase is not required for maintenance of reduced glutathione in Escherichia coli K-12 / C.K. Tuggle, J.A. Fuchs // J. Bacteriol. – 1985. – V. 162. – P. 448-450. 180. Unden, G. Control of FNR function of Escherichia coli by O2 and reducing conditions / G. Unden [et al.] // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – V. 4. – № 3. – P. 263-268 181. Valencia, E. Glutathione – Nutritional and Pharmacologic Viewpoints: Part IV / E. Valencia, A. Marin, G. Hardy // Nutrition. - 2001. – V. 17. – P. 783–784. 182. Vergauwen, B. Molecular and structural basis of glutathione import in Gram- positive bacteria via GshT and the cystine ABC importer TcyBC of Streptococcus mutans / B. Vergauwen [et al.] // Mol. Microbiol. – 2013. – V. 89. - № 2. – P. 288-303. 183. Vinella, D. Iron limitation induces dependent accumulation of ppGpp in Escherichia coli / D. Vinella [et al.] // Mol. Microbiol. – 2005. – V.56. – P. 958-970. 184. Vlamis-Gardikas, A. Characterization of Esherichia coli null mutants for glutaredoxin 2 / A. Vlamis-Gardikas [et al.] // J. Biol. Chem. – 2002. – V. 277. – P. 10861-10868. 185. Vlamis-Gardikas, A. The multiple functions of the thiol-based electron flow pathways of Escherichia coli: Eternal concepts revised / A. Vlamis-Gardikas // Biochim. Biophys. Acta – 2008. – V. 1780. – P. 1170-1200. 186. Vliet, A. Formation of S-nitrosothiols via direct nucleophilic nitrosation of thiols by peroxynitrite with elimination of hydrogen peroxide / A. Vliet [et al.] // J. Biol. Chem. – 1998. – V. 273. – P. 30255-30262. 187. Voehringer, D.W. BCL-2 and glutathione: Alteration in cellular redox state that regulate apoptosis sensitivity / D.W. Voehringer // Free Radic. Biol. Med. – 1999. – V. 27. – P. 945-950. 188. Wanner, B.L. Gene regulation by phosphate in enteric bacteria / B.L. Wanner // J. Cell Biochem. – 1993. – V. 51. – P. 47-54. 189. Wanner, B.L. Phosphate signaling and the control of gene expression in Escherichia coli / B.L. Wanner // Metal Ions in Gene Regulation. Chapman and Hall. N.Y. – 1997. – P. 104–128. 145 190. Wanner, B.L. Phosphorus assimilation and control of the phosphate regulon / B.L. Wanner // Cellular and molecular biology. ASM Press. Washington D.C. – 1996. – V. 1. – P. 1357–1381. 191. Weber, H. Genome-wide analysis of the general stress response network in Escherichia coli: sigmaS-dependent genes, promoters, and sigma factor selectivity / H. Weber [et al.] // J Bacteriol. –2005. – V. 187(5). – P. 1591-1603. 192. Wickens, H.J. Flow cytometric investigation of filamentation, membrane patency and membrane potential in Escherichia coli following ciprofloxacin exposure / H.J. Wickens [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2000. – V. 44. – P. 682-687. 193. Williams, C.H.Jr. Mechanism and structure of thioredoxin reductase from Escherichia coli / C. H. Jr. Williams // FASEB J. – 1995. – V. 9. – P. 1267-1276. 194. Willsky, G.R. Characterization of two genetically separable inorganic phosphate transport systems in Escherichia coli / G.R. Willsky, M.H. Malamy // J. Bacteriol. – 1980. – V. 144. – P. 356-365. 195. Wiriyathanawudhiwong, N. The outer membrane TolC is involved in cysteine tolerance and overproduction in Escherichia coli / N. Wiriyathanawudhiwong [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2009. – V. 81. – P. 903-913. 196. Xiao, H. Residual guanosine 3,5-bispyrophosphate synthetic activity of relA null mutants can be eliminated by spot null mutations / H. Xiao [et al.] // J. Biol. Chem. – 1991. – V.266. – P. 5980-5990. 197. Yamaguchi, H. Three-dimensional structure of the glutathione synthetase from Escherichia coli B at 2.0 A resolution / H. Yamaguchi [et al.] // J. Mol. Biol .- 1993. – V .229. – P. 1083-1100. 198. Yuan, L. Glutathione in liver diseases and hepatotoxicity / L. Yuan, N. Kaplowitz // Mol. Asp. Med. – 2009. –V. 30. – P. 29-41. 199. Zhang, A.X. The OxyS regulatory RNA represses rpoS translation and binds the Hfq (HF-I) protein / A.X. Zhang, S. Altuvia, A. Tiwari, et al. // EMBO J. – 1998. – V. 17. – P. 6061-6068. 146 200. Zheng, M. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation / M. Zheng, F. Aslund, G. Storz // Science. – 1998. – V. 279. – P. 17181721.
