Москва – 2009 - Биологический факультет МГУ
реклама
На правах рукописи ДИЖЕВСКАЯ АНТОНИНА КОНСТАНТИНОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ШАПЕРОН-ПОДОБНОЙ АКТИВНОСТИ α-КРИСТАЛЛИНА И КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ПЕПТИДОВ 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН Научные руководители: Доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович Кандидат биологических наук Муранов Константин Олегович Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Гомазков Олег Александрович Кандидат биологических наук, доцент Калинина Елена Валентиновна Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН Защита состоится 25 мая 2009 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан ____ апреля 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук 2 Медведева М.В. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. α-Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, обладает шаперон-подобной активностью и подавляет агрегацию дестабилизированных белков в клетках хрусталика, преимущественно β- и γкристаллинов. Взаимодействие α-кристаллина с β- и γ-кристаллинами в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании прозрачности и светопреломляющих свойств этого органа. Агрегация структурных белков является ключевой стадией развития стойкого помутнения патогенетическим «конформационным хрусталика, воззрениям, или катаракта заболеваниям» и катаракты. относится возникает при Согласно к так современным называемым нарушении фолдинга кристаллинов с последующей агрегацией на фоне ослабления шаперон-подобной функции α-кристаллина в клетках хрусталика (Harding, 1998; Bloemendal et al., 2004). Предотвращение или замедление агрегации цитоплазматических белков в клетках хрусталика является перспективным способом профилактики и консервативного лечения катаракты. Поэтому актуален поиск соединений, подавляющих агрегацию белков или усиливающих защитную активность α-кристаллина. В работах in vitro показано, что короткоцепочечные пептиды способны препятствовать тепловой агрегации белков (La Rosa et al., 2005), усиливать шаперон-подобную активность αкристаллина (Clark and Huang, 1996) и проявлять собственную шаперон-подобную активность (Sharma et al., 2000; Ghosh et al., 2007). По данным лабораторных и клинических исследований, природные короткоцепочечные пептиды карнозин, Nацетилкарнозин и пантетин эффективны при профилактике и лечении катаракты различной этиологии (Аветисов и соавт., 2008; Болдырев, 1999, Babizhaev et al., 2002, Clark et al., 1996, Williams and Munday, 2006). Карнозин и его производные относятся к группе гистидин-содержащих дипептидов (ГСД), пантетин – природный тетрапептид, структурный компонент кофермента А. Молекулярные механизмы антикатарактального действия этих соединений не ясны. Предполагают, что в основе действия карнозина и N-ацетилкарнозина лежит способность тормозить процессы свободно-радикального окисления в клетках хрусталика, или (и) снижать уровень 3 гликирования белков (Babizhaev et al., 2002, Boldyrev, 1999). Мы предположили, что клинический эффект короткоцепочечных пептидов может быть связан с торможением агрегации белков хрусталика. Настоящая работа посвящена исследованию влияния короткоцепочечных пептидов на агрегацию кристаллинов с использованием специально разработанных нами моделей агрегации белков in vitro. Целью работы является сравнение шаперон-подобного действия α-кристаллина и природных короткоцепочечных пептидов (карнозина, N-ацетилкарнозина, анзерина и пантетина) на агрегацию кристаллинов, основанное на анализе кинетики агрегации βL-кристаллина бычьего хрусталика Задачи исследования: 1 Разработать экспериментальные модели УФ-индуцированной и тепловой агрегации βL-кристаллина и смеси α- и βL-кристаллинов; 2 Изучить кинетику тепловой агрегации βL-кристаллина при 60ºС и УФиндуцированной агрегации βL-кристаллина при 37ºС; 3 Охарактеризовать шаперон-подобную активность нативного и УФ- облученного α-кристаллина на основании анализа кинетики агрегации смеси α- и βL-кристаллинов; 4 Оценить эффекты короткоцепочечных пептидов на кинетику тепловой и УФиндуцированной агрегации βL-кристаллина смесей α- и βL-кристаллинов; 5 Охарактеризовать взаимодействие короткоцепочечных пептидов с кристаллинами. Научная новизна. Настоящая работа представляет собой оригинальное исследование, в котором впервые количественно охарактеризовано влияние различных короткоцепочечных пептидов на кинетику агрегации βL-кристаллина и смесей α- и βLкристаллинов, и на основании экспериментальных данных предложен механизм их действия. В работе использована оригинальная установка, разработанная для регистрации кинетических кривых агрегации белка при УФ-облучении в режиме реального времени. Установлено, что N-ацетилкарнозин и анзерин дозо-зависимым образом замедляют процесс УФ индуцированной агрегации βL-кристаллина, что 4 сопровождается уменьшением размеров агрегатов белка. D-пантетин, в отличие от ГСД, дозо-зависимым образом замедляет УФ индуцированную агрегацию смеси α- и βL-кристаллинов, что связано со специфической модификацией активности αкристаллина D-пантетином. Показано, что облучение ультрафиолетом усиливает шаперон-подобную активность α-кристаллина по отношению к βL-кристаллину в связи с конформационной перестройкой α-кристаллина под действием УФ света. Практическое значение работы. Обнаруженные нами анти-агрегационные свойства короткоцепочечных пептидов позволяют рекомендовать их для дальнейшего исследования действия на кристаллины хрусталика в условиях in vivo. Выяснение структурно-функциональной взаимосвязи короткоцепочечных пептидов в отношении торможения агрегации белков может стать основой для создания нового класса антикатарактальных препаратов-антиагрегантов. Успехи в этом направлении могут стать основой для раскрытия механизмов катарактогенеза на молекулярном уровне и направленного синтеза антикатарактальных препаратов пептидной природы, способных блокировать агрегацию белков хрусталика или/и усиливать шаперонподобную активность α-кристаллина. Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы были доложены на ХII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), II Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2007), на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (2008). По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, среди которых 2 статьи в изданиях, входящих в список ВАК РФ. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 44 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 206 отечественных и зарубежных источников. 5 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ α- и βL-Кристаллины выделяли из хрусталика глаза быка по модифицированному методу Chiou et al. (1979). Кортекс хрусталика подвергали гомогенизации и центрифугированию (30 000 g 30 мин), затем проводили эксклюзионную хроматографию супернатанта, содержащего смесь растворимых белков, и собирали фракции α- и β-кристаллинов. Для дополнительной очистки βL-кристаллина проводили эксклюзионную хроматографию β-кристаллина на колонке с гелем Sephacryl S-200 (Pharmacia, Швеция), в результате которой получали βL-кристаллин с молекулярным весом, равным 35 кДа. Концентрацию α- и βL-кристаллинов определяли по поглощению при 280 нм, используя коэффициенты экстинкции 0,85 см2мг-1 и 2,3 см2мг-1 соответственно. Короткоцепочечные пептиды карнозин (β-аланил L-гистидин, C9H14N4O3 , FW - 226), N-ацетилкарнозин (C11H16N4O4, FW - 268) и анзерин (β-аланилN1-метилгистидин, C10H16N4O3 , FW - 240) производства «Hamari Chemicals Ltd.» (Япония), D-пантетин (C22H42N4O8S2, FW - 554,7) Полипептидный состав α- и βL-кристаллина - «Sigma-Aldrich» (США). контролировали с помощью электрофореза по методу Laemmli (1970) в 12,5% ПААГ в присутствии ДСН. Для индукции УФ-агрегации раствор βL-кристаллина или смеси α- и βL-кристаллинов в 40мМ фосфатном буфере (рН 6,8) помещали в кварцевую кювету и облучали при 37ºС с помощью лампы ДРШ-1000, снабженной светофильтром УФС-2 (260–310 нм). Суммарная мощность световой энергии поглощенной образцом в указанном диапазоне была определена с помощью оптического спектрометра AvaSpec-2048 (Нидерланды) и составляла 255,6 + 25,5 мкВт. Для индукции тепловой агрегации раствор белков помещали в кювету, термостатируемую при 60ºС. Исследуемые пептиды добавляли к раствору белков непосредственно перед индукцией агрегации. Общий объем инкубационной смеси в пробе составлял 0,4 мл. Кинетические кривые агрегации получали, регистрируя светорассеяние раствора белков при λ = 405 нм с помощью специально сконструированного нефелометра (рис. 1). Для количественной оценки параметров кривых агрегации использовали метод, разработанный Кургановым (2002). 6 Рис. 1. Схема установки для УФоблучения белков и регистрации процесса агрегации in vitro. Лампаоблучатель снабжена фильтром УФС-2, пропускающим УФ свет в интервале 260–310 нм. Изменение светорассеяния раствора регистрировали при помощи светодиода (405 нм). Участок S-образной кривой агрегации после перегиба аппроксимировали уравнением реакции псевдопервого порядка A=Alim (1-e-ki (t-to)), получая три параметра, описывающих процесс помутнения раствора: to – время лаг-фазы процесса, которое отражает скорость денатурации βL-кристаллина под действием ультрафиолета; ki константа скорости реакции, которая описывает скорость взаимодействия поврежденных молекул друг с другом; Аlim – максимальная мутность инкубационной смеси, отражающая конечный размер агрегатов. Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистического пакета Statistica 6.0 (StatSoft Inc, США). Количество карбонильных групп, образующихся при УФО кристаллинов, определяли методом Levine et al. (1994). Данные представлены в виде среднее±стандартная ошибка. Для оценки достоверности изменений применяли тест Стьюдента (достоверность при р ≤ 0,05). Измерения собственной флуоресценции растворов кристаллинов проводили на спектрофлуориметре Hitachi-850 (Япония) при длинах волн возбуждения 295 нм, испускания в интервале 300-400 нм. Для характеристики размеров молекул и агрегатов кристаллинов в растворе применяли метод динамического лазерного светорассеяния (ДЛС). Измерения проводили на установке Zetasizer Nano Series с He-Ne лазером (633 нм), снабженной пакетом программ полидисперсного анализа Dispersion Technology Software 4.2 (Malvern Instrument Ltd, Великобритания), проводящих обработку автокорреляционных функций и расчёт гидродинамического диаметра частиц. 7 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ кинетических кривых тепловой агрегации βL-кристаллина. Кинетику тепловой агрегации βL-кристаллина мы исследовали в интервале концентраций 0,2-2,0 мг/мл. Зависимости параметров теоретических кривых агрегации от концентрации приведены на рис. 2. Рис. 2, А - Кинетические кривые тепловой агрегации βL-кристаллина при 60ºС, А концентрация белка: 0,2 (1), 0,4 (2), 1,0 (3) и 2,0 мг/мл (4) и параметры кинетики тепловой агрегации βL-кристаллина ki (Б), t0 (В), Alim (Г), полученные при различных концентрациях белка. Параметры ki и Alim линейно зависят от концентрации (рис. 2, Б, Г), что согласуется с данными по тепловой агрегации других белков (Курганов, 2002; Wang, Kurganov, 2003). При этом зависимость величины ki от концентрации белка указывает на то, что реакция имеет псевдопервый порядок. Зависимость лаг-периода t0 от концентрации имеет логарифмический характер (рис. 2, В). 8 Кинетика тепловой агрегации βL-кристаллина в присутствии α- кристаллина. При анализе кинетических кривых тепловой агрегации βL-кристаллина (0,5 мг/мл) в присутствии α-кристаллина (0,025-0,125 мг/мл) установлено, что с увеличением количества α-кристаллина в смеси увеличивается лаг-период агрегации и снижается скорость процесса (рис. 5, А, Б). Полное подавление тепловой агрегации βLкристаллина в течение наблюдаемого периода происходит при массовом соотношении βL: α, равном 4:1. Уменьшение константы скорости в присутствии α-кристаллина свидетельствует о снижении скорости процесса взаимодействия белковых агрегатов. Удлинение лаг-фазы обусловлено увеличением количества βL-кристаллина, связанного с α-кристаллином и исключенного из процесса агрегации. Рис. 3 Влияние α-кристаллина на кинетику агрегации βL-кристаллина (0,4 мг/мл) при 60°C. Зависимость величины гидродинамического радиуса (Rh) от времени полученная при концентрации α-кристаллина 1 - 0 мг/мл, 2 - 0,075 мг/мл и 3 - 0,15 мг/мл. Кривые I и II относятся к суперагрегатам и комплексам стартовых агрегатов с αкристаллином, соответственно. Механизм шаперон-подобной активности α-кристаллина при тепловой агрегации βL-кристаллина. Механизм защитного действия α-кристаллина при тепловой агрегации βL-кристаллина был предложен нами в совместной работе с Б.И.Кургановым (лаборатория ферментных систем Института биохимии им. А.Н. Баха РАН) (Тимофеева и соавт., 2005, Khanova et al., 2005, Markossian et al., 2006). Предложенный механизм включает в себя стадии образования стартовых агрегатов и дальнейшей их ассоциации с образованием агрегатов высшего порядка. Было установлено, что начальные участки зависимостей интенсивности светорассеяния (I) от гидродинамического радиуса частиц (Rh) линейны. Размер стартовых агрегатов 9 (Rh,0) можно определить как отрезок, отсекаемый на оси абсцисс линейной зависимостью I от Rh. Размер стартовых агрегатов не зависит от начальной концентрации белка. Стартовые агрегаты βL-кристаллина имеют размер 84 ± 4 нм. Линейное соотношение зависимостей Rh от времени выполняется до определенного значения времени (t0). При t > t0 зависимость Rh от времени описывается степенной функцией: Rh=Rh,0[1+K1(t-t0)]1/df ,где K1 - константа, df - фрактальный размер агрегатов. Параметр df, полученный для разных концентраций βL-кристаллина, приближался к значению 1,8, которое является универсальным для режима агрегации «diffusionlimited cluster-cluster aggregation» (DLCA), при котором скорость агрегации определяется только диффузией взаимодействующих частиц (Weitz and Lin, 1986). В присутствии низких концентраций α-кристаллина (0,025 мг/мл, 1:16 α:βL) размер стартовых агрегатов уменьшается до 31+3 нм, при этом распределение белковых агрегатов по размерам остается унимодальным на протяжении всего измерения. С увеличением концентрации α-кристаллина (0,05 мг/мл 1:8 α:βL) размер стартовых агрегатов продолжает уменьшаться, а унимодальный рост агрегатов в определенный момент времени (при t > 25 мин) переходит в бимодальный и регистрируются два типа частиц (рис. 3). В дополнение к непрерывно растущим во времени агрегатам крупного размера (суперагрегаты) (рис. 3, кривая II) в системе образуются агрегаты конечного размера (рис. 3, кривая I). В присутствии избытка α-кристаллина (0,8 мг/мл, 2:1 α:βL) расщепления агрегатов на две популяции не происходит, а гидродинамический радиус базовых агрегатов при длительной инкубации приближается к предельному значению. Зависимость Rh от времени t в присутствии α-кристаллина удовлетворяет условиям уравнения: Rh = Rh,0exp[K2(t-t0)], где K2 - константа; что свидетельствует о переключении процесса агрегации в кинетический режим «reaction-limited clustercluster aggregation» (RLCA), при котором вероятность слипания агрегатов при столкновении меньше единицы. Таким образом, защитное действие α-кристаллина при тепловой агрегации βL- кристаллина связано с формированием стартовых агрегатов меньшего размера и сниженной реакционной способности, чем в отсутствие этого шаперон-подобного белка. 10 Рис. 4 Анализ кинетики УФ-агрегации βL-кристаллина. Зависимости параметров кривых агрегации кристаллина ki (А) и Alim (Б) от концентрации белка. Анализ кинетических кривых УФ-агрегации βL-кристаллина. УФ- индуцированную агрегацию βL-кристаллина изучали в диапазоне концентраций 0,254,0 мг/мл. На рис. 4 видно, что скорость агрегации растет линейно с увеличением концентрации белка в диапазоне 0,25-1,0 мг/мл, а при более высоких концентрациях начинает снижаться. βL-кристаллин характеризуется значительным поглощением в УФ-В диапазоне (коэффициент экстинкции 2,3 см2мг-1). Уменьшение скорости агрегации при повышении концентрации белка связано с эффектами экранирования одних молекул другими при УФ-облучении, что уменьшает вероятность фотоповреждения и денатурации белка. Кинетика УФ-агрегации βL-кристаллина в присутствии α-кристаллина. Изучена кинетика УФ-агрегации βL-кристаллина (1 мг/мл) в присутствии αкристаллина в ряду концентраций 0,06-1 мг/мл. Степень подавления агрегации зависит от концентрации α-кристаллина, как и в случае тепловой агрегации. Полное подавление УФ-агрегации в наблюдаемом интервале времени происходит при массовом соотношении βL-кристаллина и α-кристаллина, равном 1:1, а при тепловой агрегации - 4:1. Вид зависимостей параметров агрегации βL-кристаллина ki и t0 от концентрации α-кристаллина представлен на рис. 5, В, Г. 11 Рис. 5. Зависимости параметров ki и t0 от концентрации α-кристаллина при тепловой агрегации смеси α- и βL-кристаллинов (А, Б) и УФ-индуцированной агрегации смеси α- и βLкристаллинов (В, Г). Оценка “экранирующего эффекта” в защитном действии α-кристаллина. Проведена экспериментальная оценка светофильтрующего эффекта α-кристаллина в зависимости от массового соотношения α:βL (шаперон : субстрат). Данные эксперимента показали, что роль светофильтрующей составляющей в защитном действииα-кристаллина уменьшается при увеличении количества α-кристаллина по отношению к βL–кристаллину (рис. 6) При массовом соотношении 1:1 (α:βL) «экранирующий механизм» составляет около 30% защитного эффекта α-кристаллина. Влияние УФ-облучения на шаперон-подобную активность α-кристаллина. α-Кристаллин облучали УФ светом в течение 120 мин при 37°С и регистрировали кривые УФ агрегации смесей βL- и α-кристаллинов в разных концентрациях. 12 Рис. 6 «Эффект экрана» в защитном действии α-кристаллина. А –схема установки для регистрации кинетических кривых УФ-агрегации, Б - Влияние α-кристаллина на скорость УФ-агрегации βL-кристаллина при условии, что: α-кристаллин находится в передней кювете I как светофильтр (1), α-кристаллин находится в кювете II в смеси с βL-кристалином (2). Для каждой агрегационной кривой был проведен анализ завершающей фазы процесса агрегации и рассчитаны параметры ki, Alim и t0. (рис. 7, табл.). При соотношении белков (β:α) 16:1 доминирующая роль в защите от агрегации принадлежит экранирующему эффекту α-кристаллина. Усиление защитной активности Рис. 7. Кривые УФ-агрегации: 1 –βL–кристаллин в присутствии необлученного α-кристаллина (в массовом соотношении 16:1 β:α), 2 - βL–кристаллин в присутствии облученного αкристаллина (в массовом соотношении 16:1 β:α), 3 - βL–кристаллин в присутствии необлученного α-кристаллина (в массовом соотношении 4:1 β:α), 4 - βL–кристаллин в присутствии облученного α-кристаллина (в массовом соотношении 4:1 β:α) В таблице справа указаны параметры кривых УФ-агрегации βL–кристаллина в присутствии необлученного и УФ-облученного в течение 120 мин α-кристаллина 13 облученного α-кристаллина становится явным при возрастании связывающей роли αкристаллина по отношению к βL–кристаллину (β:α) 4:1. Следовательно, УФ-облучение в примененной нами дозе (поглощенная энергия облучения 1,8 Дж) активирует шаперон-подобные свойства α-кристаллина. Известно, что α-кристаллин становится более эффективным шапероном при воздействиях, приводящих к частичной денатурации (Srinivas et al., 2003). Мы предполагаем, что УФ в определенных дозах вызывает изменение структуры α-кристаллина, усиливающее его шаперон-подобную активность. Рис. 8. Хроматограммы растворов βL-кристаллина (А) и α-кристаллина (В): сплошная линия необлученный белок; пунктирная линия - облученный УФ светом 30 мин; точечная линия – белок, облученный 60 мин. На врезке (А): 1-стандарты, 2- необлученный βL-кристаллин; 3- βLкристаллин, облученный 30 мин; 4 - βL-кристаллин, облученный 60 мин. На врезке (В): 1стандарты, 2 - необлученный α-кристаллин; 3- α-кристаллин, облученный 60 мин; 4- αкристаллин, облученный 120 мин, Б - спектры флуоресценции (λex = 295 нм) необлученного βL-кристаллина (1), облученного 30 мин (2) и 60 мин (3). Г- спектр флуоресценции необлученного α-кристаллина (1) и α-кристаллина, облученного 60 мин (2) и 120 мин (3). 14 Влияние короткоцепочечных пептидов на кинетику УФ-агрегации βLкристаллина. Исследуемые соединения добавляли в инкубационную смесь в виде концентрированного раствора, приготовленного на фосфатном буфере. В таблице 1 представлены параметры кривых УФ-индуцированной агрегации βL-кристаллина в присутствии карнозина, N-ацетилкарнозина, и анзерина. Как следует из представленных в таблице 1 данных, N-ацетилкарнозин и анзерин в интервале концентраций 10-20 мМ эффективно тормозят процесс фотоагрегации βL-кристаллина. Таблица 1. Изменение параметров кривой УФ-индуцированной агрегации βLкристаллина в присутствии гистидин-содержащих дипептидов. Повышение концентрации NAC до 40 мМ не приводит к дальнейшему усилению защитного эффекта. В то же время карнозин в концентрации 20-40 мМ не замедляет агрегацию βL-кристаллина, а, напротив, ускоряет ее. Поскольку величина ki характеризует скорость взаимодействия агрегатов, то ее возрастание отражает ускорение образования агрегатов достаточно большого размера. В таблице видно, что NAC и анзерин в определенных концентрациях уменьшают величину ki, то есть препятствуют этому процессу. Различие в эффективности тестируемых ГСД можно объяснить их неодинаковой относительной гидрофобностью, влияющей на сродство к фотоповрежденному βL-кристаллину. Относительная гидрофобность ГСД была количественно охарактеризована O’Dowd et al. (1988) на основании времени элюции 15 различных дипептидов с помощью обращено-фазной ВЭЖХ, которое составило 2,78±0,01; 3,09±0,01 и 8,46±0,12 мин для карнозина, анзерина и NАС. По-видимому, дипептиды связываются с гидрофобными и экспонированными в раствор участками УФ-поврежденного βL-кристаллина, и, образуя «заплатки», частично блокируют агрегацию. Это предположение согласуется с полученными нами данными по антиагрегационной активности дипептидов при действии на βL-кристаллин. В присутствии D-пантетина концентрационно-зависимо уменьшается скорость агрегации βL- кристаллина (данные не представлены), что позволяет связать уменьшение скорости агрегации с экранирующим эффектом пантетина. Влияние короткоцепочечных пептидов на разделенную УФ-агрегацию βLкристаллина. Для выявления стадии, на которой эффективны дипептиды, мы разработали метод разделения во времени процессов УФ-повреждения и агрегации кристаллинов. βL-Кристаллин облучали УФ светом при 15°С, а затем прекращали облучение и индуцировали агрегацию, нагревая образец до 37°С. Во время УФоблучения низкая температура раствора препятствует агрегации белковых молекул, поскольку скорость агрегации зависит от скорости диффузии частиц. Рис. 9 Кинетика агрегации (37°С) предварительно βLкристаллина, облученного УФ при низкой температуре (15°С). А - дипептиды добавлены после УФО, Б - дипептиды добавлены перед началом УФО. 1 - βLкристаллин, 2 - βL-кристаллин в присутствии 20 мМ NAC, 3 - βLкристаллин в присутствии 20 мМ анзерина. 16 Нативный βL-кристаллин не агрегирует при 37°С, поэтому агрегация УФоблученного белка свидетельствует о его фотоповреждении. На рис. 9, А показаны кинетические кривые агрегации белка, полученные при добавлении дипептидов перед индукцией агрегации при 37°С. На графике видно, что NAC в концентрации 20 мМ ускоряет агрегацию предварительно облученного βL-кристаллина, в то время как анзерин в той же концентрации снижает скорость и увеличивает лаг-фазу процесса агрегации. На рис.9, Б представлены кривые агрегации, полученные при добавлении дипептидов перед началом УФО при 15°С. В этом случае βL-кристаллин, облученный в присутствии 20 мМ NAC агрегирует медленнее, чем контрольный белок. Анзерин, как и в первом случае, замедляет скорость и увеличивает лаг-фазу процесса агрегации белка. Влияние короткоцепочечных пептидов на кинетику тепловой агрегации βLкристаллина. Исследуемые вещества мы добавляли в кювету с раствором βLкристаллина при 60°С и анализировали кривые агрегации белка. В таблице 2 показаны Таблица 2. Изменение параметров кривых тепловой агрегации βL-кристаллина в присутствии короткоцепочечных пептидов (20 мМ) Инкубационная смесь, 60ºС Параметры кривых агрегации ki, мин-1 t0, мин Аlim, ОЕ βL 0,134 ± 0,003 7,86 ± 0,11 1,125 ± 0,03 βL + карнозин 0,150 ± 0,002 7,10 ± 0,14 1,190 ± 0,02 βL + NAC 0,192 ± 0,002 7,77 ± 0,16 1,058 ± 0,02 βL+ анзерин 0,161 ± 0,002 6,77 ± 0,13 1,200 ± 0,02 βL + пантетин 0,19 ± 0,006 8,76 ± 0,09 1,14 ± 0,01 параметры кривых тепловой агрегации βL-кристаллина в присутствии КЦП. Как следует из представленных данных, все исследуемые вещества в концентрации 20 мМ действуют с одинаковой направленностью – ускоряют тепловую агрегацию, о чем свидетельствует увеличение ki по сравнению с контролем. Добавление пантетина, в отличие от ГСД, продлевает лаг-фазу агрегации белка. 17 Влияние короткоцепочечных пептидов на количество карбонильных групп в βL-кристаллине при УФ-облучении. Появление карбонильных групп в аминокислотных остатках белков является маркером окислительной модификации (Berlett, Stadtman, 1997). Известно, что УФ-облучение вызывает повреждение белка, протекающего по механизму свободно-радикального окисления. В то же время имеются обширные данные по антирадикальной активности ГСД (Boldyrev, 2006). Данные таблицы 3 показывают, что при освещении раствора βL-кристаллина УФ светом в течение 40 мин количество карбонильных групп повышается, примерно, на порядок. Это свидетельствует о повреждении белка по механизму свободнорадикального окисления. Однако ни N-ацетилкарнозин, ни карнозин, ни анзерин существенного влияния на количество карбонильных групп не оказывали. Таблица 3. Содержание карбонильных групп в βL-кристаллине при действииУФ-света в присутствии гистидин-содержащих дипептидов (20мМ) Образец Количество карбонильных групп (нмоль/мг белка) после УФ-облучения в течение: 0 мин 40 мин βL-кристаллин 0,53±0,13 5,96±0,27 βL + карнозин 0,52±0,11 5,16±0,25 βL + NAC 0,51±0,14 5,10±0,65 βL+ анзерин 0,52±0,14 5,20±0,45 Это означает, что исследованные дипептиды не предупреждают окислительного повреждения βL-кристаллина в используемой нами модели. Влияние короткоцепочечных пептидов на размеры частиц βL-кристаллина при УФ-облучении. Общим эффектом для активных дипептидов (NАС, анзерин) оказалось их действие на стадии УФ облучения, то есть на стадии формирования агрегирующих частиц. Такое воздействие, вероятно, реализуется посредством единого механизма. Мы предполагаем, что причиной торможения УФ-индуцированной агрегации βL-кристаллина в присутствии дипептидов может быть встраивание ГСД в 18 Рис. 10. Распределение частиц по размерам в растворе βL-кристаллина при 15°С. 1 - βLкристаллин (сплошная линия); 2 βL-кристаллин + УФ 60 мин (пунктирная линия); 3 - βLкристаллин + 20 мМ Nацетилкарнозина + УФ 60 мин (линия точками); 4 - βLкристаллин + 20 мМ анзерина + УФ 60 мин (линия штрихпунктиром). поврежденную молекулу βL-кристаллина. Такое встраивание предупреждает конформационные перестройки в белке, которые приводят к экспонированию наружу молекулы гидрофобных участков, обычно скрытых в глубине молекулы. На рис. 10 представлено распределения частиц по размерам в растворах βL-кристаллина: контрольном, облученном УФ, и растворе, облученном УФ в присутствии гистидинсодержащих дипептидов. Гидродинамический диаметр частиц в растворе βLкристаллина при 15°C варьирует от 2,33 до 15,7 нм, со значением моды 5,62 нм. Такой разброс значений – результат как особенностей метода ДЛС, так и того, что βLкристаллин в норме образует ассоциаты (Hejtmancik et al., 2004). Добавление дипептидов к нативному βL-кристаллину не влияет на размеры ассоциатов. УФ облучение βL-кристаллина вызывает образование популяции более крупных частиц, размером порядка 20–50 нм, и распределение частиц становится бимодальным. Облучение ультрафиолетом βL-кристаллина в присутствии дипептидов предотвращает образование таких крупных частиц. Средний диаметр частиц в случае добавки анзерина или N-ацетилкарнозина равен 6,89 и 6,27 нм, соответственно. Полученные данные позволяют заключить, что механизм действия дипептидов связан с уменьшением размеров агрегатов, формирующихся на начальной стадии агрегации УФ-денатурированного белка. Такой же механизм предложен нами для объяснения шаперон-подобной активности α-кристаллина (Markossian et al., 2006). 19 Исследование действия короткоцепочечных пептидов на УФ-агрегацию смеси α- и βL-кристаллинов. Для эксперимента было выбрано соотношение α- и βкристаллинов 1:16 по массе (0,06:1мг/пробе), и получены совпадающие кривые агрегации для разных ГСД и контроля (данные не представлены), что позволяет говорить об отсутствии специфического влияния ГСД на шаперон-подобную активность α-кристаллина при физиологических значениях концентрации и температуры. В отличие от ГСД, пантетин дозо-зависимо подавляет УФ-агрегацию смеси белков (рис. 12, А). Снижение скорости агрегации можно было бы объяснить только светофильтрующим эффектом, однако линейный рост лаг-фазы в присутствии пантетина указывает на специфическое влияние пантетина на активность αкристаллина. На рис. 12, Б показана зависимость лаг-фазы t0 УФ-агрегации смеси белков от концентрации пантетина. В интервале концентраций 5-25мМ лаг-фаза Рис. 12. А - шаперон-подобная активность α-кристаллина в присутствии пантетина на модели УФ-агрегации. 1-кривая агрегации βL-кристаллина и α-кристаллина в массовом соотношении 16:1 (контроль), 2-5 - кривые агрегации βL-кристаллина и α-кристаллина в присутствии 5, 10, 20, 25 мМ пантетина, соответственно. Б - Зависимость параметра t0 (лагфазы процесса) от концентрации пантетина при УФ- агрегации βL-кристаллина растет линейно, при повышении концентрации до 30 мМ лаг-фаза сокращается, то есть эффект пантетина достигает насыщения. Действие пантетина в смеси α- и βLкристаллинов по характеру влияния на кинетику агрегации сходно с действием αкристаллина (увеличение t0 и снижение ki). На основании этих данных мы заключаем, что пантетин активирует шаперон-подобные свойства α-кристаллина. 20 ВЫВОДЫ 1. Разработана экспериментальная модель УФ-индуцированной агрегации белков, позволяющая анализировать кинетику агрегации белков хрусталика. 2. Показано, что константа скорости процесса агрегации βL-кристаллина, индуцированной как ультрафиолетом, так и повышением температуры, линейно зависит от концентрации белка, что свидетельствует о псевдопервом порядке реакции. Однако, при УФ-индуцированной агрегации линейный рост константы скорости характерен только для области низких концентрации белка (0,25-1,00 мг/мл). 3. Дана количественная оценка эффективности α-кристаллина как шаперонподобного белка на моделях УФ-индуцированной и тепловой агрегации βLкристаллина. Показано, что шаперон-подобная активность α-кристаллина в отношении агрегации βL-кристаллина, поврежденного теплом, существенно (примерно в 4 раза) превышает шаперон-подобную активность α-кристаллина в отношении агрегации УФ поврежденного βL-кристаллина, что совпадает с полученными ранее данными о тепловой активации α-кристаллина. 4. Показано, что роль светофильтрующей составляющей в защитном действии αкристаллина уменьшается при росте массового соотношения α:βL. При массовом соотношении 1:1 (α:βL) 30% защитного эффекта α-кристаллина приходится на его экранирующий эффект, тогда как при соотношении 1:8 (α:βL) на экранирующий эффект приходится 93% защитного эффекта α-кристаллина. 5. УФ облучение усиливает шаперон-подобную активность α-кристаллина по отношению к βL-кристаллину, что, по-видимому, связано с конформационной перестройкой α-кристаллина под действием УФ света. 6. Разработан метод исследования УФ-индуцированной агрегации белков, который позволяет, разделяя во времени процесс повреждения белка и его агрегации, анализировать механизмы влияния шаперон-подобных соединений на агрегацию белков хрусталика. 7. Показано, что N-ацетилкарнозин, анзерин и D-пантетин дозо-зависимым образом замедляют процесс УФ-индуцированной агрегации βL-кристаллина. 8. Торможение УФ-индуцированной агрегации βL-кристаллина в присутствии Nацетилкарнозина и анзерина сопровождается существенным снижением размеров агрегатов. 9. Торможение УФ-индуцированной агрегации смеси α- и βL-кристаллинов в присутствии D-пантетина обусловлено как светофильтрующим действием соединения, так и активацией шаперон-подобных свойств α-кристаллина. 21 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. 1. Тимофеева А.К., Болдырев А.А. Влияние природных гистидин-содержащих дипептидов на шаперон-подобную активность бычьего α-кристаллина. // Научные труды МБЦ МГУ, 2003, М., с. 42-46. 2. Тимофеева А.К., Ханова Е.А., Маркосян К.А., Муранов К.О., Островский М.А., Курганов Б.И.. Кинетика тепловой агрегации β-кристаллина хрусталика глаза быка в присутствии α-кристаллина. // Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», Тюмень, 2005, с. 29-32. 3. Ханова Е.А., Тимофеева А.K., Самойлов А.М., Маркосян К.А., Муранов К.О., Островский М.А., Левицкий Д.И., Курганов Б.И.. Кинетика тепловой агрегации дрожжевой алкогольдегидрогеназы в присутствии α-кристаллина. // Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», Тюмень, 2005, с. 80-82. 4. Ханова Е.А., Тимофеева А.K., Самойлов А.М. Влияние α-кристаллина на кинетику тепловой агрегации β-кристаллина. // XII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005», Москва, 2005. Тезисы докладов, с.239-240. 5. Khanova H.A., Markossian K.A., Kurganov B.I., Samoilov A.M, Kleimenov S.Yu., Levitsky D.I., Yudin I.K., Timofeeva A.C., Muranov K.O and Ostrovsky M.A. Mechanism of chaperone-like activity. Suppression of thermal aggregation of βL-crystallin by αcrystallin. // Biochemistry, 2005, v. 44, p. 15480-15487. 6. Markossian K.A., Kurganov B.I., Levitsky D.I.,. Khanova H.A, Chebotareva N.A., Samoilov A.M., Eronina T.B., Fedurkina N.V., Mitskevich L.G., Merem’yanin A.V., Kleymenov S.Yu., Makeeva, V.F., Muronetz V.I., Naletova I.N., Shalova I.N., Asryants R.A., Schmalhausen E.V., Saso L., Panyukov Yu.V., Dobrov E.N., Yudin I.K., Timofeeva A.C., Muranov K.O. and Ostrovsky M.A. Mechanism of chaperone-like activity.// Protein Folding: New Research. Nova Science Publishers, Inc., New York, USA (Obalinsky T.R., Ed.), 2006, p. 89-171. 7. Муранов К.О., Дижевская А.К., Болдырев А.А., Карпова О.Е., Шеремет Н.Л., Полунин Г.С., Аветисов С.Э., Островский М.А. Поиск шаперон-подобных антикатарактальных препаратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза. Сообщение первое. Шаперон-подобное действие дипептида N-ацетилкарнозина: исследование in vitro на модели УФ-индуцированной агрегации βL-кристаллина. // Вестник офтальмологии, 2008, т.124(2), с.3-6 8. Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Макаров И.А., Федоров А.А., Карпова О.Е., Муранов К.О., Дижевская А.К., Соустов Л.В., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Сапогова Н.В., Немов В.В., Болдырев А.А., Островский М.А. Поиск шаперонподобных антикатарактальных препаратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза. Сообщение четвёртое. Изучение воздействия смеси ди- и тетра-пептидов на «пролонгированной» модели ультрафиолет-индуцированной катаракты у крыс. // Вестник офтальмологии, 2008, т.124(2), с.12-16. 22 9. Дижевская А.К., Полянский Н.Б., Муранов К.О., Болдырев А.А., Островский М.А. Молекулярный механизм действия гистидин-содержащих пептидов на агрегацию βLкристаллина. // Молекулярная медицина, 2009, (в печати). СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: ГСД – гистидин-содержащие дипептиды ДЛС – динамическое лазерное светорассеяние ДСН – додецилсульфат натрия КЦП – короткоцепочечные пептиды ПААГ– полиакриламидный гель УФ – ультрафиолетовый свет УФО – ультрафиолетовое облучение NAC – N-ацетилкарнозин DLCA – diffusion-limited cluster-cluster aggregation, диффузионно-ограниченная кластерная агрегация FW – молекулярная масса PBS – фосфатный буфер RLCA – reaction-limited cluster-cluster aggregation, реакционно-ограниченная кластерная агрегация 23 24
