1 `* „і.».`і i-^J

003469207
На правах рукописи
Шерин Пётр Сергеевич
ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ТРИПТОФАНА
И ЕГО ПРИРОДНОГО МЕТАБОЛИТА КИНУРЕНИНА
01.04.17 - химическая физика,
в том числе физика горения и взрыва
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Новосибирск - 2009
1 '* „і.».'і
i
-^J
Работа выполнена в Институте «Международный томографический центр» Сибирского
отделения Российской Академии наук
Научный руководитель
доктор химических наук,
Центаловііч Юрии Павлович
Официальные оппоненты
доктор физико-математических наук, профессор
Соколова Ирина Владимировна
кандидат физико-математических наук,
Глебов Евгений Михайлович
Ведущая организация
Институт биохимической физики
им. Н.М. Эмануэля РАН
Защита состоится "_3_" июня 2009 г. в 16-30 на заседании диссертационного совета
Д 003.014.01 при Институте Химической Кинетики и Горения СО РАН по адресу: 630090,
Новосибирск 90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и
горения СО РАН.
Автореферат разослан " 24 " апреля 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор химических наук
ft"**
•у/
Онищук А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
работы. Исследование
первичных
фотореакций
с участием
аминокислот - структурных единиц белков - является важной задачей для понимания
механизмов фотопроцессов, протекающих в живой природе. Аминокислота триптофан,
присутствующая в составе многих белков, обладает наибольшим поглощением в диапазоне
длин волн 260-310 нм среди всех аминокислот. Фотоионизация триптофана считается
одним из важнейших каналов фотоиндуцированного окисления белковых молекул и может
являться начальной стадией развития многих заболеваний. Фотохимия триптофана широко
изучалась на протяжении нескольких последних десятилетий, однако до сих пор остаются
открытыми несколько фундаментальных вопросов, касающихся фотоионизации триптофана.
Прежде всего, остаются невыясненными механизм однофотонной ионизации, а также
природа возбужденного состояния, являющегося предшественником этой фотореакции.
Таким
образом, детальное
исследование
механизма
фотоионизации
триптофана
представляется важной и актуальной задачей.
Кинуренин и его производные, обнаруженные в хрусталике глаза, являются
природными метаболитами аминокислоты триптофан. Фотохимические реакции этих
соединений мало изучены. Было показано, что эти соединения обладают поглощением в
диапазоне 300-400 нм и являются очень слабыми фотосенсибилизаторами. На этом
основании был сделан вывод, что кинуренины являются молекулярными УФ фильтрами,
предохраняющими хрусталик и сетчатку глаза от фотоповреждений. Механизм
эффективной УФ защиты в настоящее время остается невыясненным. Недавно было
сообщено, что кинуренин может выступать в роли фотовосстановителя и фотоокислителя
ряда биологически значимых соединений, однако механизмы этих реакций остаются
неизвестными. Исследования термических реакций кинуренинов показали, что эти
соединения являются нестабильными при физиологических условиях; спонтанное
дезаминирование приводит к образованию реакционных соединений, которые могут
ковалентно связываться с белками хрусталика. Белки, модифицированные молекулами УФ
фильтров, демонстрируют заметную фотохимическую активность и способны образовывать
реакционные формы кислорода при аэробном фотолизе. Эти сообщения показывают, что
кинуренины могут участвовать в реакциях фотоповреждения белков хрусталика, что, в
свою очередь, может давать существенный вклад в развитие катаракты. Таким образом,
исследование механизмов фотореакций кинуренинов является актуальной задачей для
фотохимии, биологии и медицины.
3
Настоящая работа посвящена исследованию динамики и механизмов фотофизических
и фотохимических процессов, протекающих в молекулах триптофана и кинуренина,
изучению спектральных и фотохимических свойств короткоживущих промежуточных
частиц, образующихся в результате фотолиза этих соединений, и исследованию возможных
реакций этих частиц с молекулами, содержащимися в хрусталике глаза.
Целями данной работы являются:
(1)
Исследование
(2)
Исследование
влияния
параметров
среды
(температура,
рН среды,
растворитель) на механизм однофотонной ионизации триптофана.
механизма
ультрабыстрой
дезактивации
возбужденных
состояний кинуренина, а также механизма фотоионизации. Определение
влияния внешних условий (растворитель, изотопное замещение, рН среды,
температура) на исследуемую фотофизику кинуренина.
(3)
Изучение реакционной активности триплетного состояния кинуренина,
образующегося под действием УФ излучения, по отношению к ряду
соединений, содержащихся в хрусталике глаза.
(4)
Исследование фотохимической активности ковалентно связанных аддуктов
кинуренина с аминокислотами и антиоксидантами, присутствующими в
хрусталике глаза.
Научная новизна работы. Впервые разделены вклады в однофотонную ионизацию
триптофана от нерелаксированного предфлуоресцентного *S и релаксированного нижнего
Si синглетных возбужденных состояний. Показано, что квантовый выход фотоионизации из
состояния *S увеличивается с уменьшением температуры, что обусловлено конкуренцией
между фотоионизацией из состояния *S и колебательной релаксации *S -> Si. Релаксация
является термически активируемым процессом, при этом энергия активации не зависит от
свойств используемых растворителей.
Установлено, что ультрабыстрый безизлучательный переход Si —> So в молекуле
кинуренина обусловлен межмолекулярными взаимодействиями посредством водородных
связей между фотовозбужденным кинуренином и молекулами растворителя. Впервые
зарегистрировано триплетное состояние кинуренина, изучены фотохимические свойства
этого
интермедиата.
Показано,
что
фотоионизация
кинуренина
протекает
по
двухфотонному механизму; триплетное состояние является предшественником этой
фотореакции. Установлены механизмы и измерены константы скорости реакций тушения
триплетного состояния кинуренина рядом аминокислот и антиоксидантов, присутствующих
в хрусталике глаза. Показано, что кинуренин, ковалентно связанный с аминокислотами,
проявляет большую фотохимическую активность, чем в свободном состоянии.
4
Практическая ценность работы. Полученные результаты будут использованы для
дальнейших фундаментальных исследований фотохимических систем с участием
триптофана и кинуренина. В работе установлен механизм эффективной УФ защиты
молекулами кинуренина, что может быть использовано при разработке новых материалов с
высокой степенью защиты от УФ излучения. Данные о фотохимической активности
кинуренина могут быть востребованы при разработке лекарственных препаратов для
терапевтического лечения и/или замедления развития ранних стадий катаракты.
Личный вклад соискателя. Автор участвовал в разработке плана исследований,
обсуждении результатов, формулировке выводов и подготовке публикаций по теме
диссертационной работы. Весь объём экспериментальных исследований выполнен лично
автором или при его непосредственном участии.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на
российских и международных конференциях и симпозиумах: ХѴІ-ХѴШ, XX симпозиумах
"Современная Химическая Физика" (Туапсе, Россия, 2004-2006, 2008 г.), 9th International
Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena (Оксфорд,
Великобритания, 11-17 сентября 2005 г.), 5th Research Workshop on Diffusion Assisted
Reactions (Новосибирск, Россия, 13-19 августа 2006 г.), Porquerolles International
Conference on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (остров Поркероль, Франция, 29 сентября 2006 г.), An International Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry
(Коттаям, Керала, Индия, 8-11 февраля 2007 г.), Современные Подходы к Проблемам
Физикохимии и Катализа (Новосибирск, Россия, 16-19 мая 2007 г.), VII Voevodsky
Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" (Черноголовка, Россия,
25-28 июня 2007 г.), 6th Aegean Summer School in Visual Optics (Ираклион, Греция, 26
июня - 1 июля 2007 г.), International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual
Molecules (Аскона, Швейцария, 19-24 августа 2007 г.), I Международная Конференция
«Физико-Химические Методы Исследования Нанообъектов в Химии, Биологии и
Медицине» (Туапсе, Россия, 3-9 октября 2007 г.), Central European Conference on
Photochemistry (Бад Хофгаштайн, Австрия, 10-14 февраля 2008 г.), XXIX European
Congress on the Molecular Spectroscopy (Опатия, Хорватия, 31 августа - 5 сентября 2008 г.).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 7 статьях, а также в 22
тезисах международных и российских симпозиумов и конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав,
выводов и списка цитируемой литературы, включающего 185 наименований. Работа
изложена на 133 страницах, содержит 51 рисунок, 12 таблиц и 1 схему.
5
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении отражена актуальность темы диссертации, сформулированы основные
цели работы и дано краткое описание структуры диссертации.
Глава I представляет собой обзор литературы, посвященной фотохимическим
реакциям триптофана и кинуренина. В первом разделе рассматриваются фотофизика и
фотохимия индола, триптофана и родственных им соединений. Рассмотрены основные
фотохимические реакции, а также свойства тришгетных состояний и радикалов,
образующихся при фотолизе этих молекул. Особое внимание уделено фотоионизации
триптофана. Приведено обсуждение возможных механизмов фотоионизации (одно- или
двухфотонный процессы) и природы фотовозбужденных состояний, предшествующих этой
реакции. Во втором разделе представлен обзор термических и фотохимических реакций
кинуренина и его производных, которые могут иметь место в хрусталике глаза.
Рассмотрены известные на сегодняшний день фотохимические свойства кинуренинов;
показано, что кинуренины являются эффективными молекулярными УФ фильтрами.
Отдельное внимание уделено обзору различных механизмов, ответственных за быструю
дезактивацию
возбужденных
состояний в органических
молекулах. Рассмотрена
термическая нестабильность кинуренинов и последующие реакции с участием продуктов
распада, которые могут приводить к образованию новых УФ фильтров или ковалентному
присоединению кинуренинов к белкам хрусталика. Обсуждается связь между термическими
превращениями кинуренинов и их фотохимической активностью, а также возможная роль
этих процессов в катарактогенезе.
В главе II подробно описаны используемые в работе методы исследования
(стационарная и времяразрешенная оптическая спектроскопия) и методики проведения
экспериментов. Исследование динамики промежуточного поглощения с наносекундным
временным разрешением было проведено с помощью установки лазерного импульсного
фотолиза, созданной в МТЦ СО РАН (возбуждение: 266, 308, 355 нм; регистрация: 240-670
нм; временное разрешение 10 не), которая оборудована температурной приставкой,
позволяющей проводить эксперименты в диапазоне температур 200-360 К. Исследование
эволюции флуоресценции и промежуточного поглощения с фемтосекундным временным
разрешением было осуществлено с помощью соответствующих установок, расположенных
в университете г. Женева, Швейцария (возбуждение: 400 нм; регистрация флуоресценции
420-620 нм; регистрация промежуточного поглощения 360-750 нм; временное разрешение
200 фс).
6
Глава III настоящей диссертации посвящена исследованию влияния параметров
среды (температура, рН, растворитель) на механизм однофотонной ионизации водных
растворов триптофана.
Зависимость квантового выхода фотоионизации триптофана от энергии импульса
лазера показала, что в наших экспериментальных условиях при энергии импульса лазера
меньше 20 мДж вклад от двухфотонной ионизации становится пренебрежимо мал. В этих
условиях были получены зависимости квантовых выходов фотоионизации от температуры
для /Ѵ-ацетил-£-триптофана (/ѴАТгрН) и /--триптофана (L-TrpH). Эксперименты были
проведены
в
кислой
нерелаксированного
и
нейтральной
предфлуоресцентного
средах
*S и
с
целью
разделения
релаксированного
вкладов
Si
от
синглетных
возбужденных состояний в общий процесс ионизации. В кислых условиях фотоионизация
из нижнего синглетного состояния Si подавлена процессом протонирования индольного
кольца через растворитель, в то время как в нейтральной среде однофотонная ионизация
происходит из обоих состояний *S и Si.
-«Я
X
со
0.02
X
О
•
ІН (этанол/вода 10/1)
ТгрН (метанол/вода 10/1)
ТгрН (этанол/вода 10/1)
250
300
Температура, К
350
2.8
3.2
3.6
4.0
4.4
4.8
ІЯемпература, 103/К
Рис. З.І.я. Зависимости квантового выхода фотоионизации от температуры для ІН и і-ТгрН
в кислых растворах (рН 0.1). X: Щ в смеси этанол/вода 10/1, О: і-ТгрН в смеси
метанол/вода 10/1, Ш; L-TrpH в смеси этанол/вода 10/1. б. Зависимость 1п(1/Ф*„„„ - 1) от 1/Т
для і-ТгрН в смеси этанол/вода 10/1.
В кислых растворах с увеличением температуры наблюдается небольшое уменьшение
квантового выхода ионизации из состояния *S для L-TrpH и JVATrpH. Этот эффект может
быть отнесен к конкуренции двух ультрабыстрых процессов — ионизации из состояния *S и
релаксации *S —> Si. Для подробного исследования этого эффекта были получены
зависимости квантового выхода ионизации для индола (Ш) и L-триптофана (Z-TrpH) в
различных растворителях в широком диапазоне температур (Рис. 3.1.а). Квантовый выход
ионизации из состояния *S (Ф',„„) может быть записан следующим образом:
Ф
к'
kL+k.
(3.1)
Предполагая, что константа скорости ионизации из состояния *S ( к'ион ) является
независимой от температуры, а константа скорости релаксации (кр) зависит от температуры
согласно закону Аррениуса, было получено следующее выражение:
1п(-4
р
1) = Н~г-)
Ф
(3.2)
-
к
RT
На Рис. 3.1.6 представлена зависимость выхода ионизации Z-TrpH в смеси этанол/вода 10/1
в координатах Аррениуса. Полученные результаты хорошо описываются
линейной
зависимостью, что позволяет получить значения энергии активации Ер и Іп(Лр/ к[т ),
представленные в Табл. 3.1. Можно видеть, что для всех исследованных систем значение Ер
составляет величину около 4.5 кДж/моль и почти не зависит от свойств используемых
растворителей (Табл. 3.1). Предположительно, релаксация *S —>- Si включает в себя
образование короткоживущего комплекса, состоящего из фотовозбужденной молекулы
триптофана и молекул растворителя, в котором перенос колебательной энергии происходит
в результате столкновения молекул растворителя с индольным кольцом.
Табл. 3.1. Значения энергии активации Ер и Ы(Ар/к „0„) для константы скорости
релаксации *S -» Si для молекул Ш и І-ТгрН в различных растворителях.
Соединение
ІН
І-ТгрН
Ер, кДж/моль
1п(А,/к\т)
Метанол/вода 10/1
4.211.3
Эганол/вода 10/1
Метанол/вода 10/1
4.8 + 1.4
4.911.2
6.2+1.5
4.6 + 1.6
4.3 + 1.3
5.210.4
5.510.5
Растворитель
Этанол/вода 10/1
2-пропанол/вода 10/1
Метанол
5.510.4
6.1 ±0.6
5.4 ±0.5
5.3 ±0.5
В главе IV представлены результаты исследования фотопроцессов, протекающих в
молекуле кинуренина (KN).
В
первом
разделе
проведено
исследование
динамики
гибели
синглетных
возбужденных состояний кинуренинов на пикосекундном масштабе времени в различных
растворителях. На Рис. 4.1 .а приведены временные профили флуоресценции на синем крае,
в центре и на красном крае полосы эмиссии, наблюдаемые при фотолизе водного раствора
кинуренина. Быстрый спад сигнала в синей области и соответствующий рост сигнала в
красной области спектра являются следствием сольватационной релаксации, которая
приводит к сдвигу спектра в красную область, так называемому динамическому сдвигу
Стокса. Этот сдвиг можно явно видеть по эволюции спектра флуоресценции во времени,
8
представленной
дальнейшем
на
Рис. 4.1.6.
наблюдается
В
монотонная
гибель сигнала без изменений в форме
спектра.
Обработка
полученных
была
проведена
результатов
одновременно
для
измеренных
всех
временных
флуоресценции,
десяти
профилей
используя
свертку
суммы трех экспоненциальных функций
и
функции
Гаусса,
описывающей
профиль импульса лазера. Полученные
временные константы гі = 0.9 пс, п = 4.5
пс, гз = 27.1 пс были отнесены: ц - к
диффузионному перемещению молекул
воды
около
молекулы
геометрии
KN,
фотовозбужденной
ті
-
изменению
молекулы
KN
в
Длина волны, нм
возбужденном состоянии и гз - времени
жизни
состояния
промежуточного
Si.
Динамика
поглощения
KN,
исследованная на этом же масштабе
времени,
качественно
совпадает
с
Рис. 4.1. Фотолиз KN в Н 2 0, рН 6.6 при
комнатной температуре, а. Временные профили
флуоресценции, б. Временная эволюция спектров
флуоресценции,
нормализованных
по
интенсивности, в. Спектры промежуточного
поглощения.
эволюцией флуоресценции: начальный сдвиг спектра в синюю область вследствие
сольватационной релаксации сопровождается монотонной гибелью сигнала (Рис. 4.1.в).
Аналогичные измерения были проведены для KN в смеси МеОНЛгЬО 10/1 (по объему)
и в ДМСО. Наблюдаемая эволюция спектров флуоресценции и промежуточного
поглощения качественно совпадает с результатами, представленными на Рис. 4.1. При
переходе от воды к ДМСО время жизни состояния Si возрастает почти на два порядка, что
можно видеть по данным, представленным в Табл. 4.1 и на Рис. 4.2. Эксперименты в
дейтерированной воде показали увеличение времени жизни состояния Si в 1.6 раза по
сравнению с водой (Табл. 4.1).
Полученные значения времени жизни и квантового выхода флуоресценции были
использованы для оценки констант скорости излучательной {кф„) и безизлучательной
гибели (квг) состояния Sr.
**.=*#./*•.
(4.1)
9
*в-=С1-Ф#,)/*з
(4-2)
ДМСО
Как можно видеть из Табл. 4.1, значение
кф, не зависит от растворителя, тогда как
MeOH/KO
значение квг увеличивается на два порядка по
величине при переходе от ДМСО к воде.
Столь
существенное
увеличение
квг
в
протонных растворителях совпадает с ростом
способности
растворителя
быть
донором
водородной связи, что может быть описано
эмпирическим сольватохромным параметром
а Камлета и Тафта, приведенным в Табл. 4.1.
Наблюдаемый
изотопный
эффект
и
25
сильная зависимость от свойств растворителя
50
75
100
Время, пс
указывают
на
межмолекулярных
существенную
водородных
роль
связей
в
ультрабыстрой дезактивации состояния S).
Природа этих эффективных взаимодействий
Рис. 4.2.
а.
Временные
профили
флуоресценции KN в максимумах эмиссии.
б. Временные профили промежуточного
поглощения KN в максимумах поглощения.
заключается в наличии неподеленнои пары электронов на атоме азота анилиновой группы
кинуренина. В возбужденном состоянии происходит перераспределение электронной
плотности в молекуле кинуренина, что увеличивает кислотность аминогруппы и
основность карбонильной группы и приводит к образованию комплекса из молекул
растворителя и KN, связанного межмолекулярными водородными связями.
Табл. 4.1. Фотофизические свойства KN в различных растворителях при комнатной
температуре: а - сольватохромный параметр Камлета и Тафта; гз — время жизни состояния
Si; Ффл - квантовый выход флуоресценции; кф, и fej— константы скорости флуоресценции и
безизлучательной гибели состояния Si, соответственно. Погрешность измерений: 10 %.
Растворитель
Н20 (рН 6.6)
D20
MeOH/HjO (10/1)
EtOH
ДМФ
ДМСО
а
Г}, ПС
Ф*,, %
кф,, с'1
fcr.c1
1.17
27.1
43.5
172
480
1390
2260
0.082
0.135
0.51
З.ОхЮ7
З.ЫО 7
З.ОхЮ7
4.8х107
3.8х107
4.0x107
3.7х1010
2.3х1010
5.8х109
2.0х109
6.8x10s
4.0х108
0.93
0.83
0
0
2.3
5.3
9.0
10
СОО-
Схема. 4.1. Механизм ультрабыстрой дезактивации Si состояния кинуренина.
В предельном случае возможен межмолекулярный перенос протона, как это отражено
на Схеме 4.1. Отсутствие сигнала от протонированного состояния Si в спектрах
промежуточного поглощения не позволяет полностью отказаться от данного механизма, т.к.
этот интермедиат может быстро гибнуть в процессе обратного переноса протона с
образованием основного состояния KN.
Второй
раздел
главы
IV
посвящен исследованию фотохимических
свойств
триплетного состояния кинуренина. При фотолизе, сенсибилизированном ацетоном, были
зарегистрированы спектры промежуточного поглощения, отнесенные к суперпозиции
спектра поглощения триплетного кинуренина KN (в кислой среде T KNHj + ) и спектра
выгорания исходного соединения KN (Рис. 4.3.а). Расчет наблюдаемых временных
профилей промежуточного поглощения позволил установить значения коэффициентов
экстинкции £і(430) триплетных состояний кинуренина: 3700 М~'см~' для нейтрального и
3500 М~ см" для протонированного состояния. Зависимость отношения промежуточного
поглощения на 480 нм к поглощению на 430 нм от значения рН среды (Рис. 4.3.6) была
0.6
0.5
0.4
ДА
'as. о.з
ДА..
0.2
0.1
о.о
1 2
3
4
5
6
7
8
РН
Рис. 4.3. Фотолиз KN, сенсибилизированный ацетоном (1 х 10"4 М KN в смеси вода/ацетон
10/1). а. Спектры промежуточного поглощения при рН 7.0 (О) и рН 0.1 (М), наблюдаемые
через 3 мкс после импульса лазера, б. рН зависимость отношения поглощения TKN на 480
нм к поглощению на 430 нм, измеренным через 2 мкс после импульса лазера.
11
использована для определения значения константы кислотно-основного равновесия рКаг =
4.7, которая была отнесена к анилиновой группе кинуренина.
Прямой фотолиз водных растворов кинуренина показал, что квантовый выход
триплетных состояний KN в нейтральной среде составляет величину Фг= 0.018+0.004, в то
время как в кислой среде выход близок к единице. Столь значительная разница была
отнесена к протонированшо анилиновой группы кинуренина, что делает невозможным
частичный перенос заряда с атома азота на ароматическую систему и, как следствие,
делает
невозможным
быстрый
безизлучательный
переход
Si —>• So
посредством
межмолекулярных водородных связей. При переходе от протонных растворителей к
апротонным значение Фг увеличивается (в ДМСО Фг = 0.33±0.06), что связано с
отсутствием межмолекулярных водородных связей в апротонных растворителях.
Третий раздел главы IV посвящен изучению механизма фотоионизации водного
раствора кинуренина. В ходе проведенных исследований были получены индивидуальные
спектры поглощения короткоживущих частиц кинуренина: триплетного состояния, катион
радикала и аддукта сольватированного электрона с кинуренином (Рис. 4.4.а). Аналогично
были получены спектры интермедиатов 3-гидроксикинуренина (30HKN).
Линейная зависимость квантового выхода фотоионизации KN и 30HKN от энергии
импульса лазера (Рис. 4.4.6) указывает на двухфотонный механизм ионизации. Поскольку
синглетные возбужденные состояния KN и 30HKN обладают временем жизни много
меньшим (27.1 и 9.6 пс, соответственно), чем длительность импульса лазера (8 не), то
наиболее
вероятным
интермедиатом,
предшествующим
фотоионизации,
является
триплетное состояние.
Длина волны, нм
Энергия импульса лазера, мДж
Рис. 4.4. а. Спектры поглощения интермедиатов, наблюдаемые при фотолизе водных
растворов KN, рН 7.0. О: аддукт электрона KNH'; • : триплетное состояние TKN; А: катион
радикал KN'+. б. Зависимость квантового выхода фотоионизации от энергии импульса
лазера. • : KN, фотолиз на 266 нм; • : 30HKN, фотолиз на 266 нм; • : KN, фотолиз на 355
нм; О: 30HKN, фотолиз на 266 нм.
12
Опираясь на полученные результаты, общая схема реакций, имеющих место при
фотолизе KN и 30HKN, может быть представлена в следующем виде:
М—£_»*М
"ш > Г М — ^ М " + е ^ ,
М+е^,—Ь-»М'
(4.3)
_
(4.4)
+
M'-+H ^=>MH•
(4.5)
Глава V диссертации посвящена исследованию реакций тушения триплетного
состояния кинуренина рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза. В качестве
тушителей были использованы антиоксиданты аскорбат и глутатион, аминокислоты
триптофан, тирозин, гистидин, метиопин и цистеин, а также молекулярный кислород.
Было показано, что основными тушителями триплетного состояния кинуренина являются
аскорбат, триптофан и тирозин; полученные значения констант скорости тушения
представлены в Табл. 5.1.
Механизм
тушения
триплетного
состояния кинуренина был определен из
анализа
спектров
промежуточного
Табл. 5.1. Константы скорости тушения (кт)
триплетного
состояния
кинуренина
аминокислотами иантиоксидантами.
кт, М"'с"'
поглощения и динамики промежуточного
Соединение
поглощения, наблюдаемой в буферных и
І-аскорбат
і-глутатион восстановленный
іѴ-ацетил-і-триптофан
і-триптофан
7У-ацетил-І,-тирозин
І-цистеин
ѵѴ-ацетил-і-гистидин
ТѴ-ацетил-І-метионин
Кислород
небуферных водных растворах. В результате
было установлено, во всех исследуемых
реакциях механизм тушения заключается в
переносе электрона с молекулы тушителя на
молекулу
быстрым
радикала
кинуренина,
с
последующим
депротонированием
тушителя.
катион
Единственным
(8.5±1.2)х108
<5х10 5
(3.3±0.6)х108
(2.6±0.7)х108
(6.7±1.5)х107
<10 6
< 106
<10 6
(2.1±0.5)х109
исключением является реакция с кислородом, в которой происходит перенос триплетной
энергии на молекулу кислорода.
Глава
VI посвящена
сравнительному
анализу
фотохимической
активности
кинуренина и его аддуктов с аминокислотами гистидином (His-KN), лизином (Lys-KN),
цистеином (Cys-KN) и антиоксидантом глутатионом (GSH-KN); химические структуры
которых приведены на Рис. 6.1.
Динамика гибели фотовозбужденных состояний аддуктов в различных растворителях,
наблюдаемая методами оптической спектроскопии с фемтосекундным временным
разрешением, демонстрирует качественное согласие с эволюцией возбужденных состояний
кинуренина (см. Рис. 4.1). Единственным отличием является увеличение времени жизни
13
Р
N
соон
NH2
0
S~<NH
HN
О
2
л
NH2
СООН
NH2
COOH
NHj
Cys-KN
NH2
N
'СООН
соон
Lys-KN
tv s
,соон
^ООН
OH
NH2
His-KN
GSH-KN
Рис. 6.1. Химические структуры аддуктов KN с аминокислотами лизин (Lys-KN), цистеин
(Cys-KN) и гистидин (His-KN), а также с антиоксидантом глутатионом (GSH-KN).
состояния Si при переходе от Lys-KN к GSH-KN, что отражено в Табл. 6.1. Спектры
поглощения триплетных состояний и радикалов аддуктов качественно совпадают со
спектрами интермедиатов кинуренина, представленных на Рис. 4.4.а. Как и квантовый
выход флуоресценции, квантовый выход триплетных состояний демонстрирует увеличение
при переходе от Lys-KN к GSH-KN (Табл. 6.1). Механизм этих изменений заключается в
ослаблении и/или блокировании части межмолекулярных водородных связей между
молекулами растворителя и хромофорной частью аддуктов, что приводит к уменьшению
скорости безизлучательного перехода Si —> So.
Табл. 6.1. Время жизни состояния Sj (гз), квантовые выходы флуоресценции (Ф^) и
триплетных состояний (Фг), анаэробного (ф Аг ) и аэробного (ф0 ) фоторазложения
водных растворов УФ фильтров. Погрешность измерений: 10 %.
Соединение
KN
30HKN
Lys-KN
Cys-KN
His-KN
GSH-KN
r3, пс
27.1
9.6
27.7
44.2
48.5
47.3
Ф,/ш %
Фг, %
1.8
<0.5
1.8
2.5
3.4
3.4
0.082
0.016
0.071
0.120
0.151
0.154
ФлгУ*
Фа. Л
-3
3.8х10-3
4.8х10"2
5.1x10°
1.2x10"2
7.6х10"2
І.ІхЮ"2
l.lxlO
<ю-
3
З.ЗхЮ-3
6.9x10'3
8.4x10'3
7.6х10-3
Анаэробный и аэробный фотолиз водных растворов аддуктов кинуренина (Рис. 6.2)
приводит к фоторазложеншо исходных соединений. Как можно видеть на Рис. 6.2 наиболее
фотохимически стабильными соединениями при анаэробном фотолизе являются KN и
30HKN;
в присутствии кислорода фоторазложение всех исследуемых
соединений
ускоряется. Квантовый выход фоторазложения был определен по наклону прямой,
описывающей экспериментальные
данные; полученные результаты представлены в
Табл. 6.1. Как и в предыдущих исследованиях, выход анаэробного фоторазложения
увеличивается при переходе от Lys-KN к GSH-KN. Отметим, что значение выхода
14
анаэробного фоторазложения (фАг) на три порядка по величине меньше выхода триплетных
состояний (Фг), что еще раз подтверждает высокую эффективность кинуреиинов в качестве
молекулярных УФ фильтров.
1.0,
І0.8
|
0.8
£ 0.4
f °-2
0.0
(а)
KN
2
4
6
8
Время, часы
1.01
І0.8
|
0.6
ь 0.4
I °-2 Г
<Г>
Cys-KN
2
4
6
8
2
Время, часы
4
6
8
10
Время, часы
Рис. 6.2. Разложение УФ фильтров при 22°С, рН 7.1. (D) фоторазложеиие в анаэробных
условиях; ( • ) фоторазложение в аэробных условиях; (А) темновое аэробное окисление.
(a) KN, (б) 30HKN, (в) Lys-KN,(r) Cys-KN, (д) His-KN, (e) GSH-KN.
ВЫВОДЫ
1.
Проведено
разделение
вкладов
в
однофотонную
ионизацию
триптофана
от
нерелаксированного *S и релаксированного Si синглетных возбужденных состояний.
Квантовый выход ионизации из состояния *S возрастает с уменьшением температуры,
что обусловлено конкуренцией между фотоионизацией из состояния *S и релаксацией
*S —> S]. Определены параметры Аррениуса для константы скорости релаксации
*S -> Si; показано, что энергия активации не зависит от свойств используемых
растворителей.
2.
В протонных растворителях синглетное возбужденное состояние Si кинуренина
быстро гибнет в результате ультрабыстрой внутренней конверсии, обусловленной
межмолекулярными взаимодействиями с молекулами растворителя посредством
водородных связей. Результатом быстрой дезактивации состояния Si является малый
квантовый выход химически активного триплетного состояния Ті кинуренина,
15
которое было впервые зарегистрировано в данной работе. В апротонных
растворителях, в отсутствии межмолекулярных водородных связей, время жизни
состояния Si существенно возрастает, что приводит к увеличению выхода
реакционного состояния Ті. Использование высоких интенсивностей возбуждающего
излучения приводит к двухфотонной ионизации кинуренина с поглощением второго
кванта света триплетным состоянием Ті.
3.
Механизм тушения триплетного состояния кинуренина Ті рядом соединений,
присутствующих в хрусталике глаза, заключается в переносе электрона с молекулы
тушителя на молекулу кинуренина. Единственным исключением является реакция с
молекулярным кислородом, в которой происходит перенос триплетной энергии на
молекулу кислорода. Обнаружено, что наиболее эффективными тушителями являются
аминокислоты триптофан и тирозин, а также антиоксидант аскорбат.
4.
Ковалентное присоединение кинуренина к гистидину, лизину, цистеину и глутатиону
приводит к увеличению фотохимической активности исследуемых аддуктов:
увеличению
квантовых
выходов
флуоресценции, триплетного
состояния
и
анаэробного фоторазложения.
Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:
1.
P.S. Sherin, J. Grilj, Yu.P. Tsentalovich, E. Vauthey, Ultrafast excited-state dynamics of
kynurenine, a UVfilterof the human eye // J. Phys. Chem. B, 113 (2009) 4953-4962.
2.
P.S. Sherin, Yu.P. Tsentalovich, O.A. Snytnikova, R.Z. Sagdeev, Photoactivity of
kynurenine-derived UV filters 111 Photochem. Photobiol. B: Biol., 93 (2008) 127-132.
3.
O.A. Снытникова, П.С. Шерин, Л.В. Копылова, Ю.П. Центалович, Кинетика и
механизм реакций фотовозбужденного кинуренина с молекулами биологических
соединений // Изв. Акад. Наук. Серия Химическая, 4 (2007) 704-710.
4.
O.A. Snytnikova, P.S. Sherin, Yu.P. Tsentalovich, Biphotonic ionization of kynurenine and
3-hudroxykynurenine II J. Photochem. Photobiol A: Chem., 186 (2007) 364-368.
5.
P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, R.Z. Sagdeev, Competition between
ultrafast relaxation and photoionization in excited prefluorescent states of tryptophan and
indole II J. Chem. Phys., 125 (2006) 144511 (4 pages).
6.
Yu.P. Tsentalovich, O.A. Snytnikova, P.S. Sherin, M.D.E. Forbes, Photochemistry of
kynurenine, a tryptophan metabolite: properties of the triplet state II J. Phys. Chem: A, 109
(2005) 3565-3568.
7.
P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, Tryptophan photoionization from
prefluorescent and fluorescent states // Chem. Phys. Lett., 391 (2004) 44-49.
16
8.
P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, E. Vauthey, The excited-state dynamics
ofkynurenine - UVfiller of the human eye II Abstract of the XXIX European Congress on
the Molecular Spectroscopy (EUCMOS-2008), August 31 - September 05, 2008, Opatija,
Croatia, p. 112.
9.
P.S. Sherin, Yu.P. Tsentalovich, E. Vauthey, The ultrafast photochemistry ofkynurenine II
Abstract of the Central European Conference on Photochemistry (CECP-2008), February
10-14, 2008, Bad Hofgastein, Austria, p. 47.
10. Yu.P. Tsentalovich, O.A. Snytnikova, P.S. Sherin, L.V. Kopylova, R. Sagdeev, Thermal
and photochemical reactions ofkynurenines - implications for human cataract II Abstract of
the International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (ISR1UM2007), August 19-24, 2007, Ascona, Switzerland.
11.
P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, The influence of ultrafast relaxation on
the photoionization of tryptophan II Abstract of the International Symposium on Reactive
Intermediates and Unusual Molecules (ISRIUM-2007), August 19-24, 2007, Ascona,
Switzerland.
12. P.S. Sherin, L.V. Kopylova, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, Photoreactions of
kynurenine: implications for cataract development II Abstract of the 6th Aegean Summer
School in Visual Optics, June 26 -July 01, 2007, Heraklion, Crete, Greece.
13. П.С. Шеріш, O.A. Снытникова, Ю.П. Центалович, Исследование ультрабыстрых
процессов ионизации и колебательной релаксации методом лазерного импульсного
фотолиза II Сборник тезисов всероссийская конференции "Современные подходы к
проблемам физикохимии и катализа", 16-19 мая, 2007, Новосибирск, Россия, с. 104.
14. P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, L.V. Kopylova, R.Z. Sagdeev, The
intermediates of kynurenine formed under UV irradiation - triplet stale and radicals II
Abstract of the International Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry,
February 08-11, 2007, Kottayam, Kerala, India, pp.55-56.
15. P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, R.Z. Sagdeev, Ultrafast processes in
photoexcited tryptophan - ionization and thermal relaxation II Abstract of the International
Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry, February08-11, 2007, Kottayam,
Kerala, India, p.138.
16. П.С. Шерин, O.A. Снытникова, Ю.П. Центалович, Исследование ультрабыстрых
реакций фотовозбужденных состояний триптофана, ионизации и колебательной
релаксации II Сборник тезисов XVIII Всероссийского Симпозиума "Современная
химическая физика", 22 сентября - 03 октября, 2006, Туапсе, Россия, с. 126.
17. О.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, P.S. Sherin, M.D.E. Forbes, R.Z. Sagdeev, Primary
processes in the photochemistry of kynurenine II Abstract of the Porquerolles International
Conference on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (PICORIUM-2006),
September 2-9, 2006, Porquerolles Island, France.
18. P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, Tryptophan photoionization and thermal
relaxation in condensed phase II Abstract of the 5th Research workshop on diffusion assisted
reactions, August 13-19, 2006, Novosibirsk, Russia, 031.
17
19.
П.С. Шерин, Ю.П. Центалович, Исследование фотохимических реакций кинуренина с
участием некоторых соединений, содержащихся в хрусталике глаза II Сборник
тезисов XVII Всероссийского Симпозиума "Современная химическая физика", 18-29
сентября, 2005, Туапсе, Россия, с. 216.
20.
O.A. Snytnikova, P.S. Sherin, Yu.P. Tsentalovich, M.D.E. Forbes, Photoexcited states of
aqueous tryptophan and reaction of triplet tryptophan with nucleotides: LFP and TR-CIDN
study II Abstract of the 9th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in
Chemistry and Related Phenomena, September 11-17, 2005, Oxford, UK, p. 121.
21.
П.С. Шерин, O.A. Снытникова, Ю.П. Центалович, Исследование механизма
однофотонной фотоионизации триптофана методом лазерного импульсного
фотолиза II Сборник тезисов XVI Всероссийского Симпозиума "Современная
химическая физика", 20 сентября - 01 октября 2004, 2004, Туапсе, Россия, с. 114-115.
18
Подписано к печати 20 апреля 2009 г.
Тираж 100 экз. Заказ № 845.
Отпечатано "Документ-Сервис", 630090,
Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00