Êîëëåêòèâ àâòîðîâ, 2010 Å. Â. Äîðîæêî, Å. È. Êîðîòêîâà ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÀÍÒÈÎÊÑÈÄÀÍÒÍÛÕ ÑÂÎÉÑÒ ÁÈÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈ ÀÊÒÈÂÍÛÕ ÑÅÐÓÑÎÄÅÐÆÀÙÈÕ ÑÎÅÄÈÍÅÍÈÉ ÂÎËÜÒÀÌÏÅÐÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÈÌ È ÑÏÅÊÒÐÎÔÎÒÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÈÌ ÌÅÒÎÄÀÌÈ Òîìñêèé ïîëèòåõíè÷åñêèé óíèâåðñèòåò, Òîìñê, Ðîññèÿ, elena-dorozhko@yandex.ru, eikor@mail.ru. Áèîëîãè÷åñêè-àêòèâíûå ñåðóñîäåðæàùèå ñîåäèíåíèÿ (ÁÀÑÑ) ïðîÿâëÿþò âûðàæåííûå àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà. Îñîáîå ìåñòî ñðåäè ýòèõ ñîåäèíåíèé çàíèìàþò ãëóòàòèîí, öèñòåèí, öèñòèí, ìåòèîíèí, òàóðèí è ëèïîåâàÿ êèñëîòà.  ðàáîòå èñïîëüçîâàëñÿ âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèé ìåòîä äëÿ èññëåäîâàíèÿ àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀÑÑ. Ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèé ìåòîä èñïîëüçîâàëè äëÿ ñðàâíåíèÿ ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ. Âñå èññëåäóåìûå ÁÀÑÑ â òîé èëè èíîé ñòåïåíè ïðîÿâèëè àíòèîêñèäàíòíóþ àêòèâíîñòü. Ëèïîåâàÿ êèñëîòà è ãëóòàòèîí ïîêàçàëè íàèáîëüøèå çíà÷åíèÿ, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò ëèòåðàòóðíûì äàííûì. Ìåòèîíèí ïðîÿâèë ìèíèìàëüíóþ àíòèîêñèäàíòíóþ àêòèâíîñòü îòíîñèòåëüíî äðóãèõ èññëåäóåìûõ ñåðóñîäåðæàùèõ àíòèîêñèäàíòîâ. Äëÿ ñðàâíåíèÿ ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ áûë ïðèìåíåí ìåæäóíàðîäíûé êðèòåðèé àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ÁÀÑÑ, âûðàæåííûé â åäèíèöàõ ORAC (oxygen radical absorbance capacity), îòíîñèòåëüíî ãëóòàòèîíà, êàê ñòàíäàðòíîãî âåùåñòâà. Ðåçóëüòàòû, ïîëó÷åííûå âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèì è ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèì ìåòîäàìè, êîððåëèðîâàëè ìåæäó ñîáîé. Êëþ÷åâûå ñëîâà: ñåðóñîäåðæàùèå ñîåäèíåíèÿ, àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà, ñïåêòðîôîòîìåòðèÿ, âîëüòàìïåðîìåòðèÿ Âàæíóþ ðîëü â ðåãóëÿöèè ñâîáîäíî-ðàäèêàëüíûõ ïðîöåññîâ îðãàíèçìà èãðàþò áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûå ñåðóñîäåðæàùèå ñîåäèíåíèÿ (ÁÀÑÑ), àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà êîòîðûõ ïðîÿâëÿþòñÿ çà ñ÷åò íàëè÷èÿ òèîëîâûõ ãðóïï â ñòðóêòóðàõ ìîëåêóë [1, 2]. Îñîáîå ìåñòî ñðåäè ýòèõ ñîåäèíåíèé çàíèìàþò ãëóòàòèîí, öèñòåèí, öèñòèí, ìåòèîíèí è ëèïîåâàÿ êèñëîòà (ðèñ. 1). Òàóðèí ñîäåðæèò âìåñòî òèîëîâîé ãðóïïû ñóëüôîãðóïïó è òàêæå îòíîñèòñÿ ê ÁÀÑÑ (ðèñ. 1). Àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà ïðåäñòàâëåííûõ âåùåñòâ ïîçâîëÿþò èñïîëüçîâàòü èõ äëÿ ïðîôèëàêòèêè è ëå÷åíèÿ ðÿäà çàáîëåâàíèé [3].  íàñòîÿùåå âðåìÿ äëÿ îïðåäåëåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè (ÀÎÀ) ÁÀ ñóùåñòâóåò íåñêîëüêî ìåòîäîâ. Áîëüøèíñòâî èç íèõ îñíîâàíî íà îöåíêå ñòåïåíè èíãèáèðîâàíèÿ ìîäåëüíûõ ñâîáîäíî-ðàäèêàëüíûõ ðåàêöèé, âûçâàííûõ ðàäèêàëàìè ïåðåêèñíûõ ëèïèäîâ, â ïðèñóòñòâèè àíòèîêñèäàíòîâ õåìèëþìèíåñöåíòíûì (ÕË), êèíåòè÷åñêèì, ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèì è äðóãèìè ìåòîäàìè [4 – 7].  ïîñëåäíåå âðåìÿ äëÿ äàííûõ öåëåé ñòàëè èñïîëüçîâàòüñÿ ýëåêòðîõèìè÷åñêèå ìåòîäû àíàëèçà: êóëîíîìåòðè÷åñêîå òèòðîâàíèå, ïîëÿðîãðàôèÿ, âîëüòàìïåðîìåòðèÿ, àìïåðîìåòðèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì áèîñåíñîðîâ è ò.ä. Îíè õàðàêòåðèçóþòñÿ âûñîêîé ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ, ýêñïðåññíîñòüþ è ïðîñòîòîé â àïïàðàòóðíîì îôîðìëåíèè [8 – 11]. Îäíàêî, íåñìîòðÿ íà ìíîãîîáðàçèå ìåòîäîâ îïðåäåëåíèÿ ÀÎÀ âåùåñòâ, ìíîãèå âîïðîñû îñòàþòñÿ íåðåøåííûìè: íåñîïîñòàâèìîñòü ðåçóëüòàòîâ èññëåäîâàíèé, âûïîëíåííûõ ðàçíûìè ìåòîäàìè íà ðàçíûõ ìîäåëüíûõ ñèñòåìàõ, íåîäíîçíà÷íîñòü ìåõàíèçìîâ àíòèîêñèäàíòíîãî äåéñòâèÿ âåùåñòâ, âëèÿíèå ðÿäà ôàêòîðîâ íà àêòèâíîñòü èññëåäóåìûõ âåùåñòâ, îòñóòñòâèå åäèíîãî Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 44, ¹ 10, 2010 êðèòåðèÿ è ðàçìåðíîñòè äëÿ êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ ÀÎÀ îáúåêòîâ èññëåäîâàíèÿ.  äàííîé ðàáîòå ïðåäëàãàåòñÿ èñïîëüçîâàòü âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèé ìåòîä äëÿ èññëåäîâàíèÿ àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀÑÑ, îñíîâàííûé íà ìîäåëüíîé ðåàêöèè ýëåêòðîâîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà [12]. Äëÿ îáúåêòèâíîñòè ïîëó÷åííûõ äàííûõ è ñðàâíåíèÿ ðåçóëüòàòîâ èñïîëüçîâàëñÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèé ìåòîä [13]. Ýêñïåðèìåíòàëüíàÿ ÷àñòü Äëÿ ñúåìêè âîëüòàìïåðîãðàìì èñïîëüçîâàëñÿ àâòîìàòèçèðîâàííûé âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèé àíàëèçàòîð “Àíàëèçàòîð ÀÎÀ” (“ÍÏÏ Ïîëèàíò”, Òîìñê) ñ ïîäêëþ÷åííîé ê íåìó ýëåêòðîõèìè÷åñêîé ÿ÷åéêîé (10 ìë), ñîñòîÿùåé èç èíäèêàòîðíîãî ýëåêòðîäà — ñòåêëîãðàôèòîâîãî, õëîðèä-ñåðåáðÿíîãî ýëåêòðîäà ñðàâíåíèÿ è âñïîìîãàòåëüíîãî ýëåêòðîäà. pH ðàñòâîðîâ èçìåðÿëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ñòàíäàðòíîãî pH-ìåòðà ìàðêè Ì-150. Äëÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíèÿ èñïîëüçîâàëè ñïåêòðîôîòîìåòð “ÑÔ-46”. Èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëèñü â êþâåòå äëèíîé 1 ñì. Äëÿ ïðèãîòîâëåíèÿ èññëåäóåìûõ ðàñòâîðîâ èñïîëüçîâàëè ñòàíäàðòíûå îáðàçöû ãëóòàòèîíà, öèñòåèíà, öèñòèíà, ìåòèîíèíà, ëèïîåâîé êèñëîòû è òàóðèíà — ïîðîøêîîáðàçíûå âåùåñòâà áåëîãî öâåòà (Sigma). Ðàñòâîðû ãëóòàòèîíà, öèñòåèíà, ìåòèîíèíà, öèñòèíà, ëèïîåâîé êèñëîòû è òàóðèíà ãîòîâèëèñü ñ èñïîëüçîâàíèåì ôîñôàòíîãî áóôåðà 0,025 ìîëü/ë pH = 6,86 (ýêâèìîëÿðíàÿ ñìåñü Na3PO4 è KH2PO4). Ðàñòâîðû öèñòèíà è ëèïîåâîé êèñëîòû äëÿ ïîëíîãî ðàñâîðåíèÿ ïîäêèñëÿëè íåñêîëüêèìè êàïëÿìè àçîòíîé êèñëîòû (1:1). Äëÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíèÿ ãîòîâèëè ðåàêöèîííóþ ñìåñü íà 10 ìë ôîñôàòíîãî áóôåðà 53 OH CH HS HO C CH2 OH C O O NH2 Öèñòåèí CH2 CH NH2 CH2 S S C CH O NH2 OH H3C CH2 CH2 2 3 30 1 4 Öèñòèí 20 HO S I, ìêÀ 40 C CH O NH2 Ìåòèîíèí CH2 (CH2)4 OH C CH2 CH O S S Ëèïîåâàÿ êèñëîòà C O NH2 OH NH C CH NH CH2 O C (CH2)2 O CH C CH2 O SH Ãëóòàòèîí O CH2 NH 2 HO S CH2 O Òàóðèí Ðèñ. 1. Ñòðóêòóðíûå ôîðìóëû öèñòåèíà, öèñòèíà, ìåòèîíèíà, ãëóòàòèîíà, ëèïîåâîé êèñëîòû è òàóðèíà. pH = 6,86. Ñìåñü ñîñòîÿëà èç 0,1 ìã ôåíàçèíìåòàñóëüôàòà (ÔÌÑ, Sigma), 14,2 ìã âîññòàíîâëåííîé ôîðìû íèêîòèíàìèäàäåíèíäèíóêëåîòèäà (ÍÀÄÍ, Sigma) è 4 ìã íèòðîñèíèÿ òåòðàçîëèÿ (ÍÑÒ, Sigma). Çàòåì îòáèðàëè àëèêâîòó (0,1 ìë) ðåàêöèîííîé ñìåñè è âíîñèëè â êþâåòó. Èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëè ïðè äîáàâëåíèè â êþâåòó 0,9 ìë ôîñôàòíîãî áóôåðà pH = 6,86 [13]. Ìåòîäèêà îïðåäåëåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ÁÀÑÑ ìåòîäîì âîëüòàìïåðîìåòðèè. 10 ìë ôîñôàòíîãî áóôåðà ïîìåùàëè â ýëåêòðîõèìè÷åñêóþ ÿ÷åéêó. Èññëåäîâàíèå àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀÑÑ îñóùåñòâëÿëè ïðè ïîìîùè ðåãèñòðàöèè âîëüòàìïåðîãðàìì êàòîäíîãî âîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà áåç è ñ ïîñëåäóþùèì äîáàâëåíèåì ðàñòâîðîâ èññëåäóåìûõ âåùåñòâ ïðè ïîñòîÿííîòîêîâîé âîëüòàìïåðîìåòðèè ïðè ñëåäóþùèõ óñëîâèÿõ: èíäèêàòîðíûé ýëåêòðîä — ñòåêëîãðàôèòîâûé, ýëåêòðîä ñðàâíåíèÿ — õëîðñåðåáðÿíûé, âñïîìîãàòåëüíûé — õëîðñåðåáðÿíûé, îáëàñòü ïîòåíöèàëîâ E = îò 0 äî –1,2 Â. Ñêîðîñòü ðàçâåðòêè ïîòåíöèàëà — 0,04 Â/ñ. Ìåòîäèêà îïðåäåëåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ÁÀCC ìåòîäîì ñïåêòðîôîòîìåòðèè. Èññëåäîâàíèå àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀCC îñóùåñòâëÿëè 10 5 0 0 0,2 0,4 0,6 E,  0,8 1,0 1,2 Ðèñ. 2. Âîëüòàìïåðîãðàììû òîêà Ý Î2: (1) — â ôîíîâîì ýëåêòðîëèòå (ôîñôàòíûé áóôåð pH 6,86) è â ïðèñóòñòâèè ãëóòàòèîíà C = 1 × 10 – 5 ìîëü/ë (2 ), C = 5 × 10 – 5 ìîëü/ë, (3 ) C = 8 × 10 – 5 ìîëü/ë (4 ); ëèíèÿ îñòàòî÷íîãî (ôîíîâîãî) òîêà â îòñóòñòâèå êèñëîðîäà â ðàñòâîðå (5 ). Ñêîðîñòü ðàçâåðòêè ïîòåíöèàëà — 0,04 Â/ñ. ïóòåì èçìåðåíèÿ îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè ðåàêöèîííîé ñìåñè áåç äîáàâëåíèÿ è ñ ïîñëåäóþùèì äîáàâëåíèåì èññëåäóåìûõ âåùåñòâ ïðè äëèíå âîëíû 540 íì. Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå Äëÿ èññëåäîâàíèÿ àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀÑÑ ìåòîäîì âîëüòàìïåðîìåòðèè èñïîëüçîâàëàñü ìîäåëüíàÿ ðåàêöèÿ ýëåêòðîâîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà (Ý O2), ïðîòåêàþùàÿ íà ñòåêëîãðàôèòîâîì ýëåêòðîäå â îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ îò 0 äî –1,2  ïî ìåõàíèçìó, àíàëîãè÷íîìó âîññòàíîâëåíèþ êèñëîðîäà â æèâûõ êëåòêàõ [14]. k O2 + e– D k O2·– (1) O2·– + H+ D HO2· (2) HO2·– + Í+ + e– D H2O2 (3) H2O2 + 2H+ + 2e– D 2H2O (4) Ïðè ââåäåíèè ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé â ýëåêòðîõèìè÷åñêóþ ÿ÷åéêó òîê Ý O2 ïåðâîíà÷àëüíî âîçðàñòàåò â ñâÿçè ñ ðåçêèì ñìåùåíèåì ðàâíîâåñèÿ â ñòîðîíó îáðàçîâàíèÿ ñóïåðîêñèä àíèîí ðàäèêàëà O2·–, à çàòåì óìåíüøàåòñÿ ïðè ïîñëåäóþùèõ äîáàâêàõ âåùå- Òàáëèöà 1 Çíà÷åíèÿ êîýôôèöèåíòîâ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé è íåêîòîðûõ ñòàíäàðòíûõ àíòèîêñèäàíòîâ (n = 3) Ñîåäèíåíèå Àñêàðáèíîâàÿ êèñëîòà Äèãèäðîêâåðöåòèí Ñåëèíèò íàòðèÿ Ãëóòàòèîí Öèñòåèí Öèñòèí Ìåòèîíèí Ëèïîåâàÿ êèñëîòà Òàóðèí 54 K, ìêìîëü/ë × ìèí 1,15 ± 0,04 0,65 ± 0,03 1,28 ± 0,02 4,35 ± 0,03 3,44 ± 0,05 2,81 ± 0,03 1,02 ± 0,03 4,86 ± 0,02 2,30 ± 0,04 Òàáëèöà 2 Çíà÷åíèå % áëîêèðîâàíèÿ ñóïåðîêñèä àíèîí-ðàäèêàëîâ êèñëîðîäà ñåðóñîäåðæàùèìè àíòèîêñèäàíòàìè è êðèòåðèÿ IC50 (n = 3) Ñîåäèíåíèå Ãëóòàòèîí Öèñòåèí Öèñòèí Ìåòèîíèí Ëèïîåâàÿ êèñëîòà Òàóðèí % áëîêèðîâàíèÿ 17,80 ± 0,04 12,87 ± 0,02 8,33 ± 0,03 2,65 ± 0,02 19,32 ± 0,05 8,34 ± 0,07 IC 50 × 10 – 3 , ìîëü/ë 2,80 ± 0,05 3,88 ± 0,02 6,00 ± 0,05 10,88 ± 0,03 2,58 ± 0,06 5,99 ± 0,08 Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 44, ¹ 10, 2010 ñòâà â ðàñòâîð, ÷òî ñâÿçàíî ñ âçàèìîäåéñòâèåì ÁÀÑÑ ñ àíèîí-ðàäèêàëîì êèñëîðîäà ïî ìåõàíèçìó: Î2 + 2RSH D O2·– + R-SS-R + H+, (5) O2·– + 2RSH D R-S-S-R + HO2·–. (6) C0 æ I ö ç 1 - ÷, t è I0 ø (7) ãäå I — òîê ýëåêòðîâîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà â ïðèñóòñòâèè èññëåäóåìûõ âåùåñòâ â ðàñòâîðå, ìêÀ, I0 — òîê ýëåêòðîâîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà â îòñóòñòâèå èññëåäóåìûõ âåùåñòâ â ðàñòâîðå, ìêÀ, C0 – èñõîäíàÿ êîíöåíòðàöèÿ êèñëîðîäà â ðàñòâîðå, ìêìîëü/ë, t — âðåìÿ ïðîòåêàíèÿ ðåàêöèè, ìèí. Ïî ðåçóëüòàòàì îïðåäåëåíèé ñòðîèëè ãðàôèê çàâèñèìîñòè ôóíêöèè (1 – I/I0) îò âðåìåíè (t ), çàòåì ïî ôîðìóëå (7) îïðåäåëÿëè êîýôôèöèåíò ÀÎÀ èññëåäóåìûõ âåùåñòâ K [15].  òàáë. 1 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíèÿ êîýôôèöèåíòîâ ÀÎÀ äëÿ èññëåäóåìûõ ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé è ñòàíäàðòíûõ àíòèîêñèäàíòîâ â èõ íàèáîëåå ýôôåêòèâíûõ êîíöåíòðàöèÿõ (C = 1 × 10 – 3 ìîëü/ë).  êà÷åñòâå ñòàíäàðòíûõ àíòèîêñèäàíòîâ âûáðàíû àñêîðáèíîâàÿ êèñëîòà, äèãèäðîêâåðöåòèí è ñåëåíèò íàòðèÿ [16]. Êàê âèäíî èç òàáë. 1, ÁÀÑÑ ïðîÿâèëè õîðîøóþ ÀÎÀ îòíîñèòåëüíî ñòàíäàðòíûõ àíòèîêñèäàíòîâ. Ëèïîåâàÿ êèñëîòà è ãëóòàòèîí ïîêàçàëè íàèáîëüøèå çíà÷åíèÿ, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò ëèòåðàòóðíûì äàííûì [17]. Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 44, ¹ 10, 2010 1 0,3 2 3 0,2 Ïðè ýòîì ïîòåíöèàë ïîëóâîëíû êèñëîðîäà ñäâèãàåòñÿ â ïîëîæèòåëüíóþ îáëàñòü (ðèñ. 2). Íåîáõîäèìî îòìåòèòü, ÷òî â îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ 0 äî –1,2  íà ñòåêëîãðàôèòîâîì ýëåêòðîäå èññëåäóåìûå âåùåñòâà îêàçàëèñü ýëåêòðîõèìè÷åñêè íå àêòèâíûìè. Êðîìå òîãî, îòñóòñòâèå åìêîñòíûõ òîêîâ â äàííîé îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ ïðè óâåëè÷åíèè êîíöåíòðàöèé ÁÀÑÑ ñâèäåòåëüñòâóþò îá îòñóòñòâèè àäñîðáöèè èññëåäóåìûõ âåùåñòâ íà äàííîì ýëåêòðîäå.  ëèòåðàòóðíûõ èñòî÷íèêàõ òàêæå îòñóòñòâóåò èíôîðìàöèÿ îá àäñîðáöèè ÁÀÑÑ íà ñòåêëîãðàôèòîâîì ýëåêòðîäå â óêàçàííîé îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ. Ïàðàëëåëüíûå ðåàêöèè äèñóëüôèäíûõ ôîðì òèîëîâûõ ñîåäèíåíèé (R-S-S-R) â ðàáîòå íå ðàññìàòðèâàëèñü ââèäó ýëåêòðîõèìè÷åñêîé íåàêòèâíîñòè äàííûõ âåùåñòâ â èññëåäóåìîé îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ íà ñòåêëîãðàôèòîâîì ýëåêòðîäå. Ýòî ïîçâîëèëî èññëåäîâàòü àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà ÁÀÑÑ ìåòîäîì âîëüòàìïåðîìåòðèè.  ðàáîòå ïðîâåäåíà îöåíêà àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé ïðè íàèáîëåå èõ ýôôåêòèâíîé êîíöåíòðàöèè C = 1 × 10 – 3 ìîëü/ë ñ èñïîëüçîâàíèåì êèíåòè÷åñêîãî êðèòåðèÿ [15], îòðàæàþùåãî êîëè÷åñòâî àêòèâíûõ êèñëîðîäíûõ ðàäèêàëîâ, ïðîðåàãèðîâàâøèõ ñ àíòèîêñèäàíòîì çà ìèíóòó âðåìåíè, K (ìêìîëü/ë × ìèí): K = À 0,4 4 5 0,1 6 7 0 0 1 2 3 t, ìèí 4 5 6 Ðèñ. 3. Çàâèñèìîñòü îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè ðàñòâîðîâ (A ) îò âðåìåíè ïðîöåññà (t, ìèí) áåç àíòèîêñèäàíòà â ðåàêöèîííîé ñìåñè (1 ) è â ïðèñóòñòâèè ÁÀÑÑ ñ êîíöåíòðàöèåé C = 1 × 10 – 3 ìîëü/ë: ìåòèîíèíà (2 ); öèñòèíà (3 ); òàóðèíà (4 ); öèñòåèíà (5 ); ãëóòàòèîíà (6 ); ëèïîåâîé êèñëîòû (7 ). Ìåòèîíèí ïðîÿâèë ìèíèìàëüíóþ àíòèîêñèäàíòíóþ àêòèâíîñòü. Ìåòîä ñïåêòðîôîòîìåòðèè ÿâëÿåòñÿ êëàññè÷åñêèì äëÿ îïðåäåëåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ÁÀÂ. Ïîýòîìó îí áûë âçÿò â êà÷åñòâå ñðàâíåíèÿ äëÿ ïîëó÷åíèÿ äîñòîâåðíîé èíôîðìàöèè îá àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâàõ ÁÀÑÑ. Êðîìå òîãî, è â ìåòîäå âîëüòàìïåðîìåòðèè, è â ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîì ìåòîäå èñïîëüçóåòñÿ îäíà è òà æå ìîäåëüíàÿ ñèñòåìà: ãåíåðàöèÿ ñóïåðîêñèä àíèîí-ðàäèêàëîâ êèñëîðîäà. Ìåòîä îñíîâàí íà ñïîñîáíîñòè ñåðóñîäåðæàùèõ àíòèîêñèäàíòîâ êîíêóðèðîâàòü ñ íèòðîñèíèì òåòðàçîëèåì (ÍÑÒ) çà ñóïåðîêñèä àíèîíû êèñëîðîäà, îáðàçóþùèåñÿ â ðåçóëüòàòå àýðîáíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ âîññòàíîâëåííîé ôîðìû (ÍÀÄÍ) è ôåíàçèíìåòàñóëüôàòà (ÔÌÑ).  ðåçóëüòàòå ýòîé ðåàêöèè ÍÑÒ âîññòàíàâëèâàåòñÿ ñ îáðàçîâàíèåì ãèäðàçèíòåòðàçîëèÿ.  ïðèñóòñòâèè ñåðóñîäåðæàùèõ àíòèîêñèäàíòîâ ïðîöåíò âîññòàíîâëåíèÿ ÍÑÒ óìåíüøàåòñÿ [13]. ÁÀÑÑ áûñòðî âçàèìîäåéñòâóþò ñ ñóïåðîêñèä àíèîí-ðàäèêàëàìè îòíîñèòåëüíî ÍÑÒ, ÷òî âèçóàëüíî îòðàæàåòñÿ â óìåíüøåíèè îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè ðåàêöèîííîé ñìåñè (ðèñ. 3). Îöåíêà ÀÎÀ ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé ïðè èõ íàèáîëåå ýôôåêòèâíûõ êîíöåíòðàöèÿõ 1 × 10 – 3 ìîëü/ë Òàáëèöà 3 Çíà÷åíèÿ ÀÎÀ ÁÀÑÑ â åäèíèöàõ K*(ORAC), äëÿ âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêîãî è ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî ìåòîäîâ K*, ORAC Ñîåäèíåíèå Ãëóòàòèîí Öèñòåèí Öèñòèí Ìåòèîíèí Ëèïîåâàÿ êèñëîòà Òàóðèí âîëüòàìïåðîìåò- ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèé ìåòîä ðè÷åñêèé ìåòîä 1,00 0,79 0,64 0,23 1,11 0,53 1,00 0,72 0,58 0,26 1,08 0,47 D, % 1,00 9,27 9,83 12,24 2,74 12,00 55 îñíîâûâàëàñü íà èñïîëüçîâàíèè % áëîêèðîâàíèÿ ñóïåðîêñèä àíèîí-ðàäèêàëîâ. Ðàñ÷åò âåëè ïî ôîðìóëå [13]: A 0 - A ïð A0 ×100 % = % áëîêèðîâàíèÿ, (8) ãäå A0 — îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü ðåàêöèîííîé ñìåñè â îòñóòñòâèå àíòèîêñèäàíòà â ðàñòâîðå â ñîñòîÿíèè ðàâíîâåñèÿ, íì; Aïð — îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü ðåàêöèîííîé ñìåñè â ïðèñóòñòâèè èññëåäóåìûõ âåùåñòâ â ñîñòîÿíèè ðàâíîâåñèÿ, íì. Ïî ðåçóëüòàòàì èññëåäîâàíèé áûë ðàññ÷èòàí êðèòåðèé IC50, îòðàæàþùèé êîëè÷åñòâî àíòèîêñèäàíòîâ (ìîëü/ë), èíãèáèðóþùèõ ñèãíàë íà 50 % â ðåàêöèîííîé ñìåñè. Ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíèÿ ïðåäñòàâëåíû â òàáë. 2. Êàê âèäíî èç òàáë. 2, èññëåäóåìûå ñåðóñîäåðæàùèå âåùåñòâà â òîé èëè èíîé ñòåïåíè ïðîÿâèëè ÀÎÀ. Ìèíèìàëüíûì çíà÷åíèåì êðèòåðèÿ IC50, èç ïðåäñòàâëåííûõ, îáëàäàþò ëèïîåâàÿ êèñëîòà è ãëóòàòèîí, ÷òî ãîâîðèò î âûñîêîé ÀÎÀ äàííûõ ñîåäèíåíèé. Äëÿ ìåòèîíèíà êðèòåðèé IC50 èìååò ìàêñèìàëüíîå çíà÷åíèå, ÷òî ñâèäåòåëüñòâóåò î íåáîëüøîé ÀÎÀ äàííîãî ñîåäèíåíèÿ îòíîñèòåëüíî äðóãèõ èññëåäóåìûõ ñåðóñîäåðæàùèõ àíòèîêñèäàíòîâ. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû õîðîøî ñîãëàñóþòñÿ ñ ðåçóëüòàòàìè âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèõ èçìåðåíèé. Äëÿ ñðàâíåíèÿ ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ áûë ïðèìåíåí ìåæäóíàðîäíûé êðèòåðèé ÀÎÀ ÁÀÂ, âûðàæåííûé â åäèíèöàõ ORAC (oxygen radical absorbance capacity), îòíîñèòåëüíî ãëóòàòèîíà, êàê ñòàíäàðòíîãî âåùåñòâà, K*, ðàññ÷èòàííûé ïî ôîðìóëå: K* = I 0 - I â - âà , I 0 - I ñò (9) ãäå I0 — àíàëèòè÷åñêèé ñèãíàë (ýëåêòðîõèìè÷åñêèé èëè îïòè÷åñêèé) â îòñóòñòâèå àíòèîêñèäàíòà â ðàñòâîðå; Iâ-âà — àíàëèòè÷åñêèé ñèãíàë ïðè äîáàâëåíèè èññëåäóåìûõ âåùåñòâ â ðàñòâîð; Iñò — àíàëèòè÷åñêèé ñèãíàë â ïðèñóòñòâèè ñòàíäàðòíîãî âåùåñòâà â ðàñòâîðå. Ðåçóëüòàòû ïðåäñòàâëåíû â òàáë. 3. Èç òàáë. 3 âèäíî, ÷òî ðåçóëüòàòû, ïîëó÷åííûå 2 ìåòîäàìè, êîððåëèðóþò ìåæäó ñîáîé. Îòêëîíåíèå ìåæäó ðåçóëüòàòàìè íå ïðåâûøàåò 13 %. Òàêèì îáðàçîì, èñïîëüçîâàíèå âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêîãî è ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî ìåòîäîâ ïîçâîëèëî íàèáîëåå ïîëíî èññëåäîâàòü àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà ÁÀÑÑ, âûÿâèòü íàèáîëåå àêòèâíûå ñîåäèíåíèÿ, ñðàâíèòü ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû, èñïîëüçóÿ ìåæäóíàðîäíûé êðèòåðèé ORAC, ïðåäïîëîæèòü âåðîÿòíûé ìåõàíèçì âçàèìîäåéñòâèÿ ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé ñ àêòèâíûìè ôîðìàìè êèñëîðîäà. Ë È Ò Å ÐÀ Ò Ó ÐÀ 1. S. Ñhevion, M. Roberts and M. Ñhevion, Free Red. Biol. Med., 28, 860 – 870 (2000). 2. R. Singh, G. M. Whitesides, S. Patai and Z. Rappoport, The Chemistry of Sulphur-containing Functional Group, John Wiley and Sons, Chichester, UK (1993), pp. 82 – 89. 3. G. Atmaca, Yonsei Med. J., 45(5), 776 – 788 (2004). 4. Í. Ã. Õðàïîâà, Èññëåäîâàíèå ñèíòåòè÷åñêèõ è ïðèðîäíûõ àíòèîêñèäàíòîâ in vitro è in vivo, Íàóêà, Ìîñêâà (1992), cc. 110 – 114. 5. Â. Ô. Öåïàëîâ, Èññëåäîâàíèå ñèíòåòè÷åñêèõ è ïðèðîäíûõ àíòèîêñèäàíòîâ in vitro è in vivo, Íàóêà, Ìîñêâà (1992), cc. 112 – 118. 6. Ã. È. Êàëèíêèíà, Ñ. È. Ïèñàðåâà, Õèì.-ôàðì. æóðí., 26(1), 65 – 66 (1992). 7. V. Fogliano, V. Verde, G. Randazzo and A. Ritieni, Agric. Food Chem., 47(3), 1035 – 1040 (1999). 8. È. Ô. Àáäóëèí, Å. Í. Òóðîâà, Ã. Ê. Áóäíèêîâ, Æóðí. àíàëèò. õèìèè, 56(6), 627 – 629 (2001). 9. À. À. Áóìáåð, È. Â. Êîðíèåíêî, È. À. Ïðîôàòèëîâà è äð., Æóðí. îáù. õèìèè, 71(8), 1387 – 1390 (2001). 10. J. Psotova, J. Zahalkova, J. Hrbac, et al., Biomed. Pap., 145(2), 81 – 83 (2001). 11. L. Campanella, A. Bonanni, B. Bellantoni, J. Pharm. Biomed. Anal., 35(2), 303 – 320 (2004). 12. Å. È. Êîðîòêîâà, Þ. À. Êàðáàèíîâ, Î. À. Àâðàì÷èê, Èçâ. âóçîâ. Õèìèÿ è õèì. òåõíîë., 45(3), 110 – 112 (2002). 13. Ñ. ×åâàðè, È. ×àáà, É. Ñåêåé, Ëàá. äåëî, 11, 678 – 681 (1985). 14. E. I. Korotkova, Y. A. Karbainov, A. V. Shevchuk, J. Electroanal. Chem., 518, 56 – 60 (2002). 15. Å. È. Êîðîòêîâà, Î. À. Àâðàì÷èê, Ì. Ñ. Þñóáîâ è äð., Õèì.-ôàðì. æóðí., 37(9), 55 – 56 (2003). 16. E. I. Korotkova, O. A. Avramchik, T. M. Angelov, et al., Electrochim. Acta, 36(5), 1246 – 1248 (2005). 17. Â. Ç. Ëàíêèí, À. Ê. Òèõàçå, Þ. Í. Áåëåíêîâ, Ñâîáîäíîðàäèêàëüíûå ïðîöåññû â íîðìå è ïðè ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèÿõ, Ìîñêâà (2001), ññ. 278 – 290. Ïîñòóïèëà 06.10.08 STUDYING ANTIOXIDANT PROPERTIES OF SULFUR-CONTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES BY VOLTAMMETRY AND SPECTROPHOTOMETRY TECHNIQUES E. V. Dorozhko and E. I. Korotkova Tomsk State Polytechnical University, Tomsk, Russia; e-mail: elena-dorozhko@yandex.ru; eikor@mail.ru. Sulfur-containing biologically active substances demonstrate pronounced antioxidant properties. Special positions among sulfur-containing antioxidant compounds belong to glutathione, cysteine, cystine, methionine, taurine and lipoic acid. The antioxidant properties of these sulfur-containing biologically active substances have been characterized and analyzed using the data of voltammetry and spectrophotometry. All the studied substances showed more or less pronounced antioxidant activity. Lipoic acid and glutathione exhibited the maximum antioxidant activity, which agrees with data published in the literature. Methionine showed a minimum antioxidant activity in the group of investigated substances. The antioxidant activity was compared on the basis of the international criterion of antioxidant properties of sulfur-containing biologically active substances – oxygen radical absorbance capacity (ORAC) with respect to a reference antioxidant (glutathione). Correlation between the results of voltammetric and spectrophotometric analysis has been found. Key words: sulfur-containing biologically active substances, antioxidant activity, spectrophotometry, voltammetry 56 Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 44, ¹ 10, 2010