Синтез и изучение конформационно

АКАДЕМИЯ НАУК СССР
ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ
ИНСТИТУТ ВЬIСОКОМОЛЕКУЛЯРНЬIХ СОЕДИНЕНИй
lla
правах рукописи
УДК
577.175.8'17
КОРОЛЬКОВ
Валерий Игоревич
СИНТЕЗ
И
ИЗУЧЕНИЕ
КОНФОРМАЦИОН НО-ОГРАН ИЧЕННЬIХ
АНАЛОГОВ ЭНКЕФАЛИНА
СПЕЦИАЛЬНОСТЬ
ХИМИЯ
02.00.06-
ВЬIСОКОМОЛЕКУЛЯРНЬIХ СОЕДИНЕНИй
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
ЛЕНИНГРАД
1989
www.sp-department.ru
Работа
АН СССР.
выполнена
в
институте
высокомолеку.~ярных
соединений
Научный руководитель-
доктор хи~ических наук, профессор ВЛАСОВ Г. П.
Официальные оппон"нты:
доктор химических наук, стаf>Ший научный сотрудник О. А. КА~'РОВ
кандидат химических наук, старший научный сотрудник
Л. Б. ПJЮТРОВСКИИ
Ведущая организация: кафедра химии природных соединений Ленин­
градского uрдена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени госу­
дарственного университета.
Защита диссертации состоится
«
15>>
~Ц
1989 г.
на заседании специалttЗttрованного совета Д 002.7:2.. 01 по защите щtссер­
таций на соискание ученой степени доктора наук при Институте высоко­
молекулярных соединений АН СССР (199004, Ленинrрад, Большой про­
спект, 31).
Автореферат разослан
« /
>':>
1989
г.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВС АН СССР.
Ученый секретарь
специализированного
совета
при ИВС АН СССР
кандидат
физико-математических наук
Д. А. ДМИТРОЧЕНКО
www.sp-department.ru
- 1hтJNиncn. пробgмм.
раi'Ов 8101110ICJICJI0'1'ВOЙ
СоЦ11018 вовкх .жexapc'ПieiiiDIX прева­
C'f:P1Jti'JPII
С аадеввнiе СВОIСП88
- OJU18 D
:вааеЬп про~ем совремеввой П111П. Весыв перспе&U~~П~М~~ coe.ц.­
вeiШDII( 1IJIЯ · эти цuel JIВJIJ!D!CЯ прв:роДIПiе
вol
6JIOpel'J.IJII'OPII
Dell'fц­
D:J8PO,IUI, дeЙC'fByDЦJie В ВDКП ltORЦeJI'fpaцJIЯX И ПOICU""".....
ВIIOOltJII бИQion'leCXJI) 81t'fDIIOCTЪ. 0дRaitO ОВИ об1аде11t рцом <пр8-
Ц8Т8JJЪВВХ свойств, таюа, lt81t lt])еiтковремеввосп деlстмя
poltd
• п­
спектр 6ИQIOI'ItЧeCltJIX эффек'lОв. По8'1'01q' первоо-чере.цноl за­
да-чей ПеП'l'QНОЙ Х11МП II!Wie'l'CЯ СОЗдание ceJieК'l'JIВИO Д8ЙО'f:ву111\Ц
аиалоrов пр:·;у·~ пептцов с высокой бво.nоrическоl акп:виостЫ>
11
fС!ОЙЧИВНХ К деЙСТВИD фермеНТОВ.
ОпиоiiДВне пеиапеll'fцы
точвнх
•
-
8Вlteif8,u:вн, внn<>.JI~~J~~Q~~e ро.пъ мuкле­
меаткаиевнх неlромоду-JIJ1'1'0ров
•
ооущесТUЯ~~~~Ие
pery.u-
ЦIO) целоrо ряда uэвеиво-:ваанх (WRiщd, JIВIJDIТCЯ весьма интерес
JIJDII( с
8'1'01
то'ЧКИ эревu.
Пмt. иdofll. Основиоl цeJIЬJ) дакноlt работа яu•tея сиитез
рядов аимоrов 8RR8фuJIВ8, DleDIIП orpaпчeJIJIYI) подвавооть кон­
формацп, ВОЗНИК81ЦУ1) ~аrодаря СОЗД8ИJD) МОСТDОВНХ
0'1'P11't'f1P
раЗJiичноrо т:ипа меа,цу вторнм и ПЯ'lНМ пo.nOJteRIIJDOI поСJJедователь­
косп, а тuае за с-чет введения в
IIOJ1e1t1J11
6oJIЪJDП rцрофобинх
paд11R8J!OB в JIЯ'loe ПOJIOJteDe; изу-чевие биOJiorneoRИX свойств по­
лучеиинх аиалоrов и сопостамение их со ст~й с цеJIЫ> вы­
яснения C'l'PYR'l'YPR~OHMЪRНX ОТНОЕВJIЙ,
Научим НОВJJЗВА
•
п:рактичещсм ценность работи. Наrчная
новаэка работы ~ется в разработке схем сиитеs&кокформа­
цвонио-оrраиnепнх аиалоrов энке«апина с .цисуль41\ЦНнм мостпом
и аиалоrов с крупным rи.црофобинu рад11К8JIОМ в пsrroм ПОJIОJtеиии;
сиитезе !4 ранее не описанинх аиалоr_ов эвкефu!па, в изу-чении
их 6воиоrических и конформациоивкх свойств. В исследовании вза-
www.sp-department.ru
- 2ИIIОСМ8И С'!'РУИтур8.
- &lt'l'DНOC'l'Ь В З8ВИСIDIОСП O'f размера ЦIIUia,
расПОJiоиенu рсулЪ(IIдной смзи в нем и :конформвцп амино:КИСJIО'f
во иором и Шl'l'OJI пспоиеНJUIХ в СJ11Ч88 8R8.Jloroв с дисул~ мос­
п:ком; И В 88811CIDIOCTИ O'f :КOH/fllrYpeцD И ХJ1118Ч8С:КОЙ природы aминo­
DCJIO'f в Ш1'1'0JI пспоиенп в спучае 811&11оrов с :круп~ПАt rи,црофо6вн11
OC'f8'fltOJI
В Шl'l'OJI ПОJIОИ8НИИ.
Прекпчесая цеввОС'!'ь Д8ННОI работн СJiедует из внсо:кой биOJio­
rnec:кol активвОС'!'и поиученинх coeJPIReнd
xap&lt'1'8:proro AIR
iA. 1/i.IO
и
in.\fi.tro
,а TSJCD
ряда синтезировавних сое.цJIВений специ48Чес:коrо
биOJioi'IIЧec:кoro еффе:кта, смзаииоrо с пре.цпочтвтелъвнм взаимодейст­
вием с ков:кретннм ппом рецепторов. В смзи с чем часть анuоrов
пepeJUU~a на Jr.Jiyбleввoe 6иоnоrичес:кое исспедованиее
Апоой!l!''l
J!0691:M •
щФZmПJ'I·
Результати исспедованиt, вo-
1118.JUIП в диссерт8ЦJ11), до:uвJU~МJ~ись на
по
YII
Всесоюзном симпозиуме
/T8JI.J1&, !987 r/, 5-ol Всесоюзной кон­
ференции "Метода пОJiучепя • анuиза 6иоХ1111ИЧес:ких препаратов"
/Риrа, !987 r/ и на П :конференцп ИЮ АН СССР /.ПеНJIНI'раД, !987 r/.
DIIIJII[
бел:ков и петвдов
Основине пОJiоиеНD ра60'fн имоиенн в
Офем
•
gтрукпра mgepтem,
.
ny6.Jul:кaцux,
5
ДиссертациоНН8Я работа состо­
и· из введепя, обзора лиературн, обсуждеJПIII резулиатов, э:кспе­
р:вментап.ной часп и внводов. Диссерrацu имоиена на
вицах, содерквт IЗ рисунков,
II
табаиц,
I
!28
отра
-
акт о би~оrических иc­
DН'l'aJПIIIX и список цитируемой литературн из IЗ9 наименованиt.
ООПЕРРНИ!ij РАМЫ
Omlo)(ДRНe пентапептцн
-
энке«<елинн
-
представляют 60Jiьmol
интерес в плане созданiiЯ внсокоактиввнх и се.nективно действуоцих
«армакмоrических препаратов. Дпя создано таких препаратов и DРИ"-:­
данu им устойчивосп к 6иодеrра.цации, на наш вэrля.ц, наи6о.пее
перопе:кТDНнм ЯВJIЯется синтез :конформационно-оrраниченннх анuоrов
www.sp-department.ru
-Зва основе Ц~ПtJ~ИЧеских авааоrов, coJte~ -~ ~
мецу В'l'ОРНМ
нам.
6uo
•
шwнм пожоаеИUМ8.
решено изучи:ь :впяпе на 6иoaornEIOJOJ) uтuвост:ь
И l'tORфJpмaцJIORRЪie СJЮЙС'l'Ва размеров МOC'l'D&, места P8CПOJIOUIUIЯ
,IOICfJl:Ьi{lfдкOЙ СВIIЗИ В МOCTIII'tOВOЙ СТРУI'tтур8 :В KOB(II:rypaцo ~о­
:КИСJIОТ во втором и ПЯ'l'ОМ ПOJIOJtelflfЯX в СJiе.цущей серп анмоrов
ЭНI<ефuина:
~':':""~-~
Тgr-~S-Gt!f-Ptle-Qjs-нн1
I
T!fr- djs-~ -Ptle-H~-fiHt
II
't'yr- tfeg -Gtg-Phe-tajJ-Htt 1 III
'njr- ~CIJ -&t~-Phe-tleaj -н н~ IY
1'gr- ~-~s -&ty..Phe.- нq, -нtса у
!.
'J\jr-.tHt~-6ty·Phe-Oj$-HH2
YI
1'tlr·D-tleg-Gt!~-Phe-нcg-aHt
nr.
'njr-b-~s-ety-Phe -.ыt'~-нк2 nrr
Tgr-.D·н'~-&l~ -Phe -.»-C!f--Hit2 II
T~r-.»-tfcy-Gt~ -Phe -.»-н~- НН2
х
Сртез ВИМОI'ОВ эвке«мрв Q дiiCJ.AJJfмПJ• W)OТIIOМ,
СИвтез ЦIПWIЧеских анмоrов ЭНI<ефuина вен в соответствп
со схемой /рис.!/ методом пентафrорфеиаиовнх &фвров. Д1я эащвты
амвноrрупп в ходе сиНтеза испQ.IIьзова.u трет-<~у'r~Ulокс:икар6оиu:ьиую
защи!rf. Т:воrруппн
цистеива и rомоцистеина dlо:кирова.uсь 6ен­
эв.nьной защитой. :ВЫ6ор бенэв.nьных защит 6Н11 OOyCJIOВitB, не в
пoCJieдEIIII очередь, ме'l'одом получения .S-бевsu-rомоцистевка из
метиовива. Трет-6утмоксикар6оВJIШ:ьиую защи!r)" си:вм&~И трифrоРУI't­
сусвой кислотой.Циклизацию осущесТВ4ЯЖИ на стадви с-концевого
Тр8'1'-6УТJIJ10КСИК8р00ВU-38111ИЩ8ННОГО тетрапептида ЙОДОМ В М8'1'aROJ1e
пOCJie удаления бевэJLJ1ЬННХ защит действием натрия в DдltOМ аммиа­
ке. ПoCJie окиСJiения ЦIIМИЧеский тетрапептц дedloupo!IUJI и к вe­
IIY
присоедt1ИЯJ1И тирозиа. Д1я присое,101Неквя тирозина к :цик.пчес­
ким те'l'рапепти.цам пользо:ва.nись R81t кар6о.цJD~М~~.ЦИЫМ методом, так
И методом пен'!'афrорфеиuовых эфlров. ТИрозJIЙ испо.uзо:ва.nи в виде
N-трет-6утиnокс:икар6оиu-
иnи
· O,N -ди-треt-6утв.nокса:ар6о­
им-производных. Сущес'l'веииых различий и:в в :внходе, п в мчест-
www.sp-department.ru
.
-4ве про.цухта в sавиСJIМОсП O'f метода присоеДIИеиия отмечено не бы­
ло. В качестве дeбiOКifP1Dile.ro аrевта на пoCJie.aвet ст8ДП такае
испоп.эовап ~ф1'ОРJКС7С1111'
Т" r
Х
DCJIO'rf.
А1е
Gt!l
Вое.
Воев.t
6ot.- ~oPW
&С;
~t
-OPjf
У
r-OP.Fp
н
'*н
- OPfp
8Ot.
/811
111
/&it
)W М
6ot
N
_,a~t
N
~t N
~.
&ос.
,..Вit 11
··н
"
н
н
/
1+
R
Рвс.I. Cxe~ИII'l'eзa ЦИ!UIИЧес:кп авмогов эВRе(8Jlвва с ДJiсу.IЪ(вд­
вым МОС'l'ИКОМ, г.це Х :uи7
=L·Ccj$;,0-Gjs; L·Hflj;IJ-Hey.
0ЧИС'!'R1 П0117ЧеRВшt трифrорацетатов ЦИКJJИЧес:кп рсу.IЪ(вдсо­
деращп певтапептидов провоДВJUt ~тодом .ко.поночвой хроматоrрщfии
на сефцексе
G- -Is· в I в уксусной кислоте. ГомогеRВость по.пучев­
вых авалогов провервиась методами высоковоиьтвого аиектрофореэа,
'l'OIIROCJIOЙВOЙ
хромато~ И М8ТОДОМ ШП
В разпчвшt СИСтемах
•
и при ра8Jlичвъrх .цJ~ииах BOJJИ. Идентичность про,цукто:а доказывалась
амиио.кислО'l'RЪIМ и апемен'l'JПIМ анализами,
а таuе масс-спектромет­
рически.
2.
Исследование коисfК?рмациоRВшt характеристик дисульсi~о~содеР-
иеm ана.погов энм«мw,
дu изучения конформациоRВшt характерис'l'ИК синтезированных
цимичес:кп аналогов 6кnи сняты спектры кругового дихроизма в
www.sp-department.ru
- 52
2 .
toO
,'
,,"
;
1
/•
:- . . . ./ .1
-2
\
18]
у
1
\\ •i
. /·ю+-l~'н2
~
/:8J·I(>'
Рис.2. Спектры кд дисульifiщоодержащих аиuоrов эпефuииа с
\..-аминокислотами во втором положении в водном растворе.
ffJJ·/0-3
2
~.-
. \·:~:·, ~..... ....
2
··~
...
" ....
"'\
-2
Рис .3. Спектры кд дисульфlдсодераащвх ака.nоrов ЭВitефutива с
t)-амииокислотами во втором положенив в водном растворе.
www.sp-department.ru
- 6-
' ' ----.."'
_, "' "'
,
......\
......
..........
.\
'
"" ,,~
"\
-
,)(
.._ ~-
--
.....
-2
hc.4. Спектри КJ[ .цисульфlдсодержащих авмоrов энкеlfапина в 0,05
М ВСI /спиоmвая J1ВИ1Я/ и в 0,05 М HCI, содерващей rsxro-3 м доде­
ЦIIJiсулЬ(ета натрия /пувв.пр/.
о6аасти
240-320
им.
В во.цннх рас'l'ВОрах у всех сиитезировавних
888Jloroв основной вкпад в спехтр в этой области давала дисульфид­
Иая связь. Круrов6й дихроизм тирозина и феНИJlмавина, характер­
ннй ДПЯ ЭНRеlfапИНОВ, проЯВJIЯJIСЯ TOJIЬKO В Виде ТОНКОЙ структурн
на ф:>не широюа пиков поrлощения .цисульtfll,цной связи, что не поз­
ВОJIЯет сравнивать спектрн круrовоrо дихроизма дисуль4Идсодераа­
щих авмоrов со спектрами энкеlfапинов.
При сопоставлении сnектров кд авмоrов
/YII/
и /Х/ в водном
растворе и в раотворе, содерuщем додецилсулъфат натрия, быnо
показав о, что в случае обоих авмоrов энкеlfапина переход в более
липсфшьвуl) «<аэУ, эксперимектмьно nодтверJЕДеккнй .циф}ере1ЩИ8J1ь­
внми спектрами aв8Jloroв в мицeJIJlax додецилсульфе.та, сопровождает-
www.sp-department.ru
-7ся вэмевепем :ковфо]11о18.1J;аоввоt поnавосп ни авааоrоа.
870
rо­
ворвт О 'fOII, ПО C'lPJ!t'l'JP& П8П'l'ЦОВ С .цJicy.t~ 810СПКОМ, вe­
CIIO'fPR ва IUПWI88ЦIII), COxpaJIJiet Э8ме'rВJI) ПOJI,UJUI~Ъ.
З. ИзJЧМ•• Оимоmе01111 gвolgzв 1
8ИIМQQD 1
pm
ПlltJIПSQIIII
"901'91
U'I!!\QIIII MQfAПIW, мgcipw с IIRDЪ'iiD*
МОСЖПОМ•
Оценка бв0Jiо1'11Ческоt акrиввосtв сивtеэвроВ811В1iХ авuоrов
omrrax
проводаась при разJПIЧВП JIY'l'ЯX в:ведепJ! в
ва
11188%
ва
анапьrезп /тест "rорячм nиас'!ввка"/ в на вэмевепе двп'В!'е.IЪ­
воt активиоми. которое оцевиваJ~ось по способнооtв авопнх
xpaiOI'fЬ прJJД8ВВое а вертИК8Jiъиое пОJiоаепе тuа в теч:епе
при первмещено переднп лап пвопоrо на хубu внсо't'ой
5
coсек
20
см.
БиОJiоrическм активиос.ть .il. v~tr& оцеНD8J1ась по споеобиосп
;vrae-
тarъ :внзванвне U&К't'POCTJDifJIЯЦI[&й оохрцевu се~та подвздош­
ной IOIIDlUt морской cВIIRltИ
IDII
/rPI -!ест/
и се11111нводящеrо протока
......
/Н'Ф-ТеОТ/, lWt ПО1С8З8'1'8Л8Й B8aJIIIOД8~0'1'8JUI О Jl- И ~ .:0патвн-
11И рецепторами соответствевво.
При иэучевп вэааосвяэи размер цвUа
-
ность бшо похазаво, ч:то в CJiyчae авuоrов,
6л01tJ1PY1111811 актив­
оодеращп·
t,-амино­
uслотн в ПJI'l'Oм ПОJlоаенви, основной тенденцией бшо уве.о:чение
активвости с увеличением размеров ЦD.1I8
1
анаnоrи
/I/-/!71
и
/11-
/ЛI/1. В случае анаnоrов, содерuщп ~-амииоuсло'l'Н в пято~
положении, видно, ч:то. ШUt и в пре.1tЫдУJЦем случае, ·нaи60Jiъmyl) ак­
тивность проJ~В~U~ет aвanor
/I/
с наибольшим I6-1JJ!евиым размером
цикла. Однако в случае анаnоrов с I5-Ч11еввым ЦIU(JlOM актiiВНостъ
по отношеНJII)
IC }!-рецепторам снаается, причем в случае aвanora
/YIII/ она уменьшается 60Jiee. ч:ем в ЗО раз. '"по сравнено с оп­
санным в литературе (.t.с.~;~эн.кёФ.uивамцом.
РассмаТРивая зависимостЪ 6ло.кируuцей активности от места
www.sp-department.ru
-8Та6.111Ц8.
I.
БJiоквру~~ЦМ активность
ila. vitro
ана.иоrов 8ВIС8«во­
ва С ДIIOJJI~ МOC'l':IКOII.
Соедивеве
ICso±m.
·
GPl,ВII
HVAВII
HV-"GPI
'J'!Ir-~~- Gtq-Phe-Cgs- нн2.
/1!/ 1\jr·Qj$- Gly·Phe· Hcg ФNН 2
::87.tiЗ8
2!9±8!
0,56
248,t46
9,0З,t0,27
о.оз
/III/ 'Пjr- Hty·&I~-Phe-Oj~-NH2
1З2.t1З
II5,t20
0,87
/П/
23,5,t9,5
I6,4,t3,5
0,69
/7/ T!lr-.8-~$-6l~-Pfte-нclj-нн1
/71/ 'Г!fr.I)-H~-fil~-Phe.-r.}S-NH1
0,446,±0,085
0,57,tO,I2
1,27
I,I6,tO,З8
0,91,±0,21
0,'78
/1II/ T~r-.e-ttEi-И~-Phe-H~-NH2
0,452,±0,089
О, ЗI8.t0, II3
0,70
/1I1I/I'!Jt.ФOr4}$-Gt9-Jihe-~tl&y-KII1
/II/ 'Г!f·!-lf~-Gty-Phe,f)-QjИtH 1
31,4,±!4,6
3,35
O,II
0,94,tO.II
4,2З,t0,7I
4 ,5
0,257,tО,ОЗ5
0,68
2,6
-
-
/I/
~r- HQJ -&l~-Phe·Hcy-NH~
/I/ 'Чfr-~·G1g-Phe-Ф-H~-HH2
т11 r-~·d).нty-Phe-~$-NHt
T~r-.9-~S-Gl!f-Phe,t-q/S-NH2
Метиовви-зикефвлин
I,51,t0,3
О, '78,t0,01
172
!3,2
0,076
располоаепя дисул~(lщllой смэи в ЦИJtJie, мо:оо заметить, что в
случае ана.иоrов с
L-амивокислотами во втором положении введение
rомоцистеина в пятое полоаение вместо цистеива привоДКIIо к увеJIJt­
чению активности к
о-рецепторам, а введение rомоци~теина во вто­
рое положение приводило к уве.пиченD активности к
В случае ана.иоrов с
,р!.-рецепторам.
~-аминокислотами во втором положении введе­
ние rомоцистеина в пятое положение привоДИ/Iо таю~е к повншенИD
активности по отвоmенИD к
~-рецепторам, а введени+'омоцистевиа
во второе положение мало сказывается на активности по отношению
к }'--рецепторам, но повншает активность к
~-рецепторам. В слу-
www.sp-department.ru
- 9чае ава.поrов с
i> -амииокиСJlотами
R81t во в'l'ором, тu и :в ПЯ1'ОМ по­
Jiоаениях корре.uцп мецу распОJiо:аением дису~ой связи
•
бlо­
кирупцей активиостЬJ) уставоuево не было.
При рассмотрении влияния кон~ амивокис.а0'1' во иором
И ПЯТОМ ПОJIОЖеНИЯХ
8e
на 6nОкируJЩУI> 81tТИВВОСТЬ ВИДНО, Ч'rО ~C:SO.U.-
uиmпte оказывает модифпцщвя 8МИВОКИСJ10'1' во воrором пОJiоаевп.
ИJтересво мметить, что ава.поrи с
1.-амивокис.аотами во втором по­
Jiоаении 06naд8JIИ акТИВКОСТЬJ), сравнимой С акТИВВОС'l'ЬJ) И&'l'ИВВОrо
эвкефшина ИJ1И превосхо.цящей ее, что ве характерно мя .IQейвкх
ава.поrов энкефшива, rде подобная моди~ приводаа обнчво к
потере активности. Тем ве менее. в с.аучае И811111Х авuоrов, Jt81t •
в случае .11инейннх aн8Jloroв, введение
i>-амивокис.иот :во второе
пможение приводи'l' к резкому увеличенИII активности i.ll. vi.tro
ко.
можно заметить.
•
Одна­
что возрастание активно сп по оТRошеНDI к раз­
JlИЧИШI рецепторам происходит в разной степени. Так, возрастаиие
6nокирупцей активносТи по отношеИИII к рецепторам, :в среднем, ва
порядок вЬDПе,
чем возрастание активности по отношевв к
-рецеп-
торам.
Моди({lп<ация пятого пОJiожения
~-амивокиС.Jlотами сказывается
неодиозначно. Из сопостаuения aн8Jloroв. содерuщих
3)-aiQIИOJOIC­
Jioтн во втором и пятом пОJiожениях, с анмоrами. содер118ЩИМИ .»-ами­
нокиС.Jlоты т0.11ько во втором ПОJiожении. видно. что т~ модиq.ка­
ция приводит к падению активности по отношению к
возраставИIО активности по отноmенИIО к
6-рецепторам и
~-рецепторам. О.п,иако :в
случае авмоrа /YТ.II/ подобная моди~ привеJlа к падеВИI> ак­
тивности по отношению к ~рецепторам
60Jlee.
чем в ?О раз. С.Jlедс­
твием чеrо было повЬIШение сеJiективиости по отношению к
&-рецеп-.
торам.
Изучение би0.11оrической активности
i.h. vi:ll'o
показ8Jlо. что авмо-
www.sp-department.ru
Табmща 2. BиoJiorкчectw~ 8.К'f11ВНОС'I'Ь il\.11'~11'0
8R8Jioroв 8НКефullна. с .цwсу~ МОС'I'ПОМ прW
внyorpИЦIIC'l'eJif8JIЬHOM (В/Ц), 8JfY'I'PJI8eiOIOM (В/В) J1 ПОДКОJIИОМ (D/К) JJ1'1'П 884Щ8НU.
~l't\.
Соединение
в
(1)
50,0
25,0
не апиа..
(11)
100,0
25,0
не акоrиа.
(111)
50,0
25, О
не акпа.
100,0
25,0
не 8.К'f11а.
(1У)
(У)
(YI)
(YI1)
O,OOIIjp,OOOб 2,~,47
о.~,ОО2б
-
-
-
15,0
50,0
25, О
не 81Ct'U.
100,0
25.,0
не U'J'U.
50,0
25,0
не 8.К'!'IЬ.
100,0
25,0
не аnив
о' 005.;t0. 000~
2,2_t0,42
10,0
-
5,15,±1,12
25,0
0,0016
12,5
He·U'fiiB.
12,5
jр,ОООб
о' 006.1Q, о29
(YIII)
O,I4:tt0,~
2,~.47
15;0
(1Х)
0,01~001
1,~,35
8,15;10,35 0,009i0,0029
2,87,±2,4
5,74j:1,22
7,07j;I.~
7,3J:I,б
(Х)
Морфин
-
,02jp,re
-
I,28j;0,9I
www.sp-department.ru
не
aun.
-
12,5
не &JC'1'
з.~.75
0,58z0,14
1,34jp.~
I,2:tt0,3б
б,54j:I,39
0.89_t(),3I
4,4.1Q,9&
1,?6j:(),50
З•blzO·~
ii,1,!2,2
4,3б;t0,92
- II rи с
il-8111111окиСJiотами, как и мепоИJIК-~{fаов. п:рахпчес:ки не
активин при периферическом введении, Чi'О, пo-Вif.ЦIIIIOМy. odъlt~
ся их быстрой ферментативной деrрадацвей. Авааоrи с
0
-8111111ОDс­
лотами во втором положении оказаuсь високоакfl[ВВJDО[ как прв Qен­
тра~~ьиом, tак и при еветемном введенп. Кромфоrо, авuоrи
и
/I/
зах
/JII/
оказs.псь тахzе акпввiDIИ в ОПН'J.'ах на крысах, ВНЗ1i8811 в до­
IO JII!/r.a:o и 5 мr/r.ao соответствевво .uпuьную 811&1Ы'еэD в
воздействие на двигательную активность. Эп фвкти, no-ВJr,ЦIDIOIIf,
О6ъя:СВЯD'l'СЯ как ВИСОКОЙ акТИВВОСТЫI Э'1'П 8R8JIOrOB ПО O'l'ROIIIeRВ 1t
метить, что д.J1Я 6о.nьmинства аналоrов бша характерна векоторвя
избирательность к воэдействD ва двиrатuьвую активность, по~ВQ­
лmцая в векоторах СJiучаях, вапр11118р, в случае авалоrа
дить арепарат в дозах,
внэн:ваDЦIIХ,
в основном,
/1II/,
вво­
изменение двп'а­
тельиой активности.
4,
ИсСJiедОЩИе ВQЗМОIНОСТВ синтеза sшуогов IJIКeifмpo со
CJlOIROвiflmнOй СМЗЫ!
W!JW
ВТ9р111 1 ПЯТNМ ПQЦОI!ШJЯМИ.
Изучение связи структура
-
активность в .ря,пу ЦИ1t11ИЧесl'tИХ ди­
суль(flщсодерzащих аиалоrов эвкефшина, моuфщироваввнх по В'l'Opo­
rq
и пятому положениям, покаэало, что такие аиалоrи с
.е-амиво­
:киСJiотами во втором полоаеИJИ о6Jlадаи определенной селективвостщ
внсокой активностью и устойчивостью к ферментативной деrрадацкв.
Однако, иесМОТР11 на попнт·i<в закрепления конформации, они ве о6Jlа­
двли внсокой селективностью по отноmеИИJ) к
Jl-
или
о -рецепто­
рам. :=iтот (fsRт, по-видимому, о6ъя:сияется довольно високой подва­
ностью конформации этих пептидов, что подтвер8Дается изучением
спектров кд.
Для тоrо, чтоби 6oJJЬIIIe закрепить ковформацию молекула эвке(fа­
лина, нами было решено получить аиалоrи эвкеqаnина с более "жест-
www.sp-department.ru
-I2кой" маиаркой с.попоэqириой СВJIЗЬЮ меа.цу вторым и пятым положе­
ИJIЯМII общей форму.ин:
'1'!fr~ .trsw-~!1- Рhе-нн-сн-соnн 2
· L-to
(!на)"'
,где
1\.=
!;2
СИНтез анаиоrов проводвж. по схеме /рис.б/
~t!:l
.1>-Ser
Ph е
х
Вое- r- ОР/р
-
Н>Рfр
OPJp
/8at
NH~
l/Bat
Вое.
8~- ~
н
/Bat
н
/Вit
н
11821
/он
Рис. 6 • Схема синтеза аналогов энке4wtина со СJiожноэфиринм
мостихом, где Х
= t.·д$р; .&-Asp;
L-Gtu.; !1-Glu..
По этой схеме на первом этапе методом пентафrорфениnовнх эфи­
ров полочался линейннй предmествеННИR
-
N-трет-бутиnоксихар­
боииn С-концевой тетрапептид, которнй можно было бн з8ЦИitЛизо­
вать с образованием СJiожноэфирной связи и к полученному тетра­
пептиду присоединить тирозин. При синтезе линейннх предJIIЕiствен­
нихов использовали в качестве временной защиты аминогруппы трет-
www.sp-department.ru
-
IЗ
-
6УТВ110КСDар6оВИJ1!.11УЮ защиту, А11Я З8ЩJI'l'H р
-
ИЛИ ( -кар6оксвпь­
НЫХ rрупп испо.пьзо:ва.nи бевзильвую З8ЩIIТУ. I'идроксвпьвуD ГРУIШ1
серива не з8ЩIIЩ8JIИ. Де6покироваиие амииоrруппн ocyщecТIWI.IJI 'fРИ­
фrору~tсусной DCJioтoй, бевзвпьную З8ЩJI'l'Y' yдa.IIЯJiи катаиитическим
rи.црироваиием.
ПoCJie у,цалеНШI бензилъиой защитн с
~- uи
t -кар6оксuъвоl
rруппн С-концевой аминокиСJiотн мы пнта.пись ЦИКJiизовать по.nучев­
нне тетрапептидн, создавая СJiожноэqирную связь ме-.ду rи.цроксuь­
ной группой серива и карбоксилЪВой группой С-концевой амвнокисло­
тн. В качестве методов конденсации избр&Jiи методн, при которых,
как считается, подобная реакция проходи'l' с ваибо.n:ьшим выходом и
сопровождается образованием ваимен:ывеrо числа побочных продуктов.
А именно: метод с испо.nъзоваиием в качес:rве ковденсирупцеrо аген­
та
N, N•-кар6оНИJIДИИМИДазо.nа, метод аКтивированвп э(lqюв с до­
бавкой имидазо.nа, кар6оДИИМJЩНнй метод с добамением димети.nами­
нопиридина и.пи пиридина.
При испо.nьзовании карбонм,циимидазо.nъноrо метода изучение хо­
да реакции ЦИltJiизации показа.по, что образования желаемых продук­
тов ЦИl(Jlизации не происхоДВ11о,
в е зависимо от системы растворите­
лей и от продОJIЖИтелъиости времени реакции. При испо.nъзовании
метода активированных певтафrорфевиnовнх эфиров с добавЛением
имидазо.nа оказа.пось, что через
!5
мин.
noCJie
добавЛения ими.цазо­
ла пентафторфениловый эфир тетрапептида превращался в соответст­
вущий имидазо.nид и на этом реакция заканчива.пась, не зависимо от
растворителя и от длительности реакции.
Использование карбодиимидноrо метода с добавЛением катали­
тических ко.n~-tчеств димети.nаминопиридина В11И
20 эквива.пентов пи­
ридина в диметилф:>рмамиде привело к образованию продукта,
отлич­
ного от исходных:. Полученине таким образом пеnтидн бЫ11И де6поки-
www.sp-department.ru
- 14ро:sавн трифrоРJКС)"СВОI КВСJIОТОЙ, ПOCJI8 чеrо К 1П1М бКI присоеДIIНеВ
тирозвв с 11СПОl1Ъзо:вавием певтафrорфеВВJlо:воrо 8ф1ра
O,N
-.ци-трет­
бутuокси:карбоJОI,I-тирозива. ПOC.IIe )'.UJleRJIII защп с пОJiуЧевннх пев­
'l'апептцов тр•фrоРJКсусвой uCJioтol продук'l'Н ОЧВ1Q8118 методом
rе.п.-(lшътрацп на
TSt<-rue-40,
испОJiьзуя в :качестве ЭJD)еата ме­
таноа. Гомоrеввость пОJiуЧеввнх coe,цJIReвиl про:веря.аи методом товко­
СJiоlвой хроматоrра(ви в ра8ЛJ1Ч11НХ системах, методом внсокоВОJiьт­
воrо uектрофореза и методом
IOIX.
ИcCJieдoii&Пie CTPJК'f1PH ПОJiученннх сое.цввеиий
ПСJiопоrо
с помощъю амино­
и uемевтноrо 8В8Jiизов и масс-спектрометричесп по:ка­
зuо, что З'l'И сое.цввевия не ЯВJUII)ТСЯ ЦВIUiодепсиаиuоrами эвке(а­
.uиа, а пре,~~;ст&ВJJS~Т собой пеJiтидн, содерzащие ifраrмевт .цицимо­
rекси.пмочевивн на С-конце, общей формула:
'l'yr-J>-ser-Gl~- Phe·Ntf-~-CO NH1
(tкa>n.
еьн ••
1
::;..-
•
to- N-со-нн-с.нu
rде
1\..
= 1;2.
ПОJiучевнне пепти.цн ЯВJIJШ'l'СЯ веобНЧВНIIИ 8R8Jioraми эвкефа.nива,
.
coдepnЩJIМII 60Jlьmoй rи.црофоСSвнl заместпеJJъ в пятом пОJiоаении, что
моает привести в опредеJJеивой степени
к закреnпению ковформации
позто., 6нпо решено сивтезировать серию подобных пептидов и исс.~е­
довать биоnоrические
•
конформациоивне свойства aнaJJoroв энкефапи­
на~ мо.ци!JiщИр<>:ванвнх по пятому пОJiоаению фраrментом .цицимоrекси.л­
мочевинн.
Быпа пОJiучена с.1е.цупцая а серия 8R8JIOroв ЗНRефапива:
Tgr-!-Ser-6Щ-Phe-RSp(R)·NH 2 /XI/ 'Гur-.fJ-Ser-~Щ-Phe·Gtu(R) • КН2.
/XIII/
'l'ljr-~·Ser-lihj -Phe-!>-Asp(~·Нif/XII/ Tvr-л-ser-IJЩ-Phe-Э-vtu(R) -NHt/XIY/
rде
1
R = еьн.сN-tО-NН,"Нн
www.sp-department.ru
- !5 -
5е
ИQQ18ПOМRJA xgвifpтwiii'9uп СJОiртв 'UI01'9J 'П'«мп•
1
мo!II!!!rп!ммmWJ «ипmпом N е N -JIJIJJJJIOГПQН!Ю!AJИe
1
[8]·10
1
r"'Ve<мl
ANO/IЬ
5
Pllc.G. СпеИJ&IШ авuоrов 8Иltефвпиа, мо~В811ВП рr­
меитом ,JtiЩIIIfЛoreкcaмoчeВJIRн в воде
и в ДIIII8TИJicy.uфo1tcцe
1- •
1
-
~/, а
-
/ - /,
спектра
в метавоие
/-- 1
t»>IC..'=.,Н.t.5]8JIIt8фв.UIВ-
,
.
81!111,U..
д.JUI nучения коиф)РNВЦ~~овнвх характеристп, по.иуче~~~~~а
1181111
1
аимоrо:в эпе«апша, мо.ци~:ваиивх сWеrмеRТом Н, N -дв:ц~ПU~оrек­
сИJ1110че:впв, CSWJИ СНЯ'l'Н спектра кд :в резпчввх раоТ80рП8Jlю.:.
При рассмотрении спектров :кд, сиRrВХ :в воде, метеиоие
•
Д11118-
'1'ИJIСУJIЬФОксиде, :видно, что хотя вид ип спектров 8ТП авааоrов
ПOXQI;
ua :ВИД СП.""9К'!'рО:В
КД М8ТИОВIIВ-8111t8фв.uва В
tHiat;dкt'\t1$]-
8Вlt8(8JIИН81!111,U., :в ароматической о6Jtасти они с,.есttевво раз.цича­
mся. В этой о6.11асти д.1Я аимоrо:в, мо.ци{f8ц11роВ8111111Х
N. N' -.ци­
ЦИКJ.tоrексJWЮче:виноi, характерен ярко :внрааеввнй П01011И8J1ЫIНЙ
www.sp-department.ru
- !6 двxpoiiSJI, СВЯЗ8ВННЙ
с уве.иичевием доu: тирозеовнх остатков,
JJМeDЦJIX ПО.ПОП'l'МЬВНЙ КJI.
6
3
-3
Рис. 7. СПектры кд ан&иоrов энкефшина, модифщироввнинх
фрагментом
N, N' -дицiП<Jlоrексилмочевивн в воде 1-1 и в
растворе додеЦИJiсульtе.та натрия /--- -1, а - спектры 1))-Jita~des~
эltКефшинамида.
Изучение
спектров КД, снятых в 20-ммо.пярном растворе доде­
ЦИJiсуJIЪ(fата натрия, показа.ло, что такой переход существенно ска­
зывается на К,1{ ароматических остатков, а именно, он си.nьно умень­
шается,
причем .ц.ля разных ана.лоrов такое изменение происходит в
разной степени, в то время как кд (f>-Aroz; desHet.sJ энкефшинамида в
зтой о6Jlасти не значительно увеличивается. :-то rоворИ'l' о том.
что ·переход в 6о.пее липофи.лькую среду приводит к существенному
изменению конф:>рмационноrо равновесия мо.пекуп ана.лоrов, модифи-
www.sp-department.ru
-rtцвро:ванинх ёfраrмеиом N, N'-Д11Ц11КJ1оrексИJ040чевивн, во в завиои­
мости от вида мо.Ц.ФПUЩП это изменеиве раэJUIЧВО. СJiедовате.п.ао.
мо;р((llкацJIЯ пaroro пм08111111Я молеку.1111 ЭJПteфl.u&a крупв• rцро­
фо6внм остапом приводп к отбору опредмеввых ковф:>Р~~ВЦ~~оiiВНХ
струхтур.
ИаучмиА dJ9DOГJЧ8QIП QВQicD и ВЗАИМQQМЭИ C'lPDПJVI,­
6.
wиввосu в рщ апмоrов ММNIRI!. М2ЛИ1Jеттим"ПН! «иr­
мевтом
N.Н'-ЛИПИR'QГексипмрчеввнм.
Для изучения бимоrических свойств аналоrи 6Н11И подверrву'fн
тем ае испнтанияu, что и .цисулъ(flщсодерuщие аналоrи /см.раздм Э/
При сопоста&~евии ве.~~ичив значений биокирующей активности
Ln. v~t.ro
таткв
/см •.,абi.З/ видно, что в CJIY'Ч8e аналогов, содерqщп ос­
1..-аuивокиСJiот в пятом пмоаевп, _переход от аспараrповой
uCJioтн к rлтrемивовой киСJiоте прJIIВОдит к сущес~веввом.r па,цеВJII)
6имоrической uтиввости по отвошеВJП) к
как uтиввост:ь по отвошенв к
ки неизменной.
J.'-рецепторам, тоrда
6 -рецепторам
остается правчес­
В CJiyЧae аналоrов, содерuщих остатки
~-амао­
киСJiот в том ае пмоаевии, переход от аспараrиновой DCIO'!'н к
r~амииовой КИСJiоте. наоборот. пpJIIВO.цn к ·yмeн:ьmetull) ак'lИВНости
по отношевв к
нв к
6 -рецепторам
и уве.личеНИII активвосn по отвоше­
J&.-рецепторам.
Таким образом, активность по отвошевв к paэJIJIЧIIНМ uаосам
рецепторов зависит от таких ф:utторов, lt8.1t ков~ и ХIМR&с­
кая природа аминокиСJiот в пятсw пмоаении. При этом весьма мuне
изменения химической структуры могут привести к peзJUIII изменен­
ям 6имоrических свойств.
Изучение 6имоrической активности
i.n. VL vo
покаЭ8Ло. чtо
эти аналоrи при ВИУ'l'Рицистернал:ьном введении внзн:ваm как аналь­
rетическии эффект; так и изменение двиrате.~~:ьной активности. при-
www.sp-department.ru
TaбJDitla
3.
BIIOJUII'IIЧecкaя &К'I'IIBHOC'l'Ь 8Н8Jioroв енхефuкна
,
мо.цlф!цмрованннх фparмetrroм
.цмцккжоrексмлмочевииы.
Соед11Иениеl
Fдpot 1t..
1
,
Aиa.lьl'e'l'IIЧecxaa U'I'JIB- 1 Иэмеиеtп1е .цвиrам.п.ноА
ICrottt&.
В..OJCIIP1IIIIIall &JmiВНOC'fЬ
~I.
(XI)
20
(XII)
8,73;t3,29
1,56,±1,30
25,0
не акт.
10
б, 25,±2, OI
1,23
I,2I
0,98
не акт.
27,5'
6,62
0,24
1,31,±1,2
25,0
нм
(XIII)
20,8,±4,8
25,0
не ак'l'.
I4,3;t3,04
25,t
I8,4
1,53
0,0<82
(XIY)
6, 79j;2,I2
25,0
не акт.
4,31,±1,29
12,0
IЭ,I
I0,8
0,82
I72
I3,2
0,00?6
MopfiШf
МетионШf-
4,02,±0,00
-
7 ,07,±!,00
I,28,±Q,9'
-
-
4,35;±0,~
-
энкефмик
www.sp-department.ru
- 19 чем Вотпlе на дu:ra'1'8JlbliYI) активность внзнвuось мeнЪIJIIIМII доза­
ми, чем дозн, иеобхоДDIНе uя аиuъrепчесиоrо 8ффек'l'а. При ВВ)"l'­
ривевном введеRИИ то.nько образец, содераащd остаток
а, -acпapa­
I'IIROВOI КИСJIОТН, ИII8JI акТИВНОСТЬ, пpeВOCXOДJIQYII акТВВВОС'l'Ь IЮР­
«-в&• Вnияиве на аиа.пьrетвчесlt1Ю и двиrательвую актвввос'l'ь
RЯJIOCЬ в течение
48
coxpa-
часов пoCJie введения преперета. Интересно от­
метить, что изучение спектров КЖ этоrо aиuora показuо сущест­
венвое отличие его от .цруrп аиuоrов при перех.,оде вода
- p&e'l'IIOP
додецuсульфl.та натрия. По -:видимому, этот aиuor моает реа.uзо­
вать такую конф:>рмацiD), которая не свойственна .цруrо аиuогам,
JШ11ШЫ
I
.с целью установления структурно~ова.пьннх отвоmевd в
ряду ковф:>рмациовно-оrраииченннх аиuоrо;В энке~ииа путем
(икацИ:и первичной структуры сивтезировано
из них
2.
на,
IO
14
110.11.11-
аиuоrов энкефВJJвиа,
ЦИI(JlИЧеских. Все аиа.поrв пмучены впервые.
Разработана ориrина.пьная схеме: синтеза анмогов энкефВJJв­
состоящая в предварительном сивтезе тетрапепти.ца-пре.ЦJПествен­
ника с после.цупцей его ЦИRJiиэацией вли мо.цифоtацией и прис081JР1Не­
нием тироэина на последней стадии.
з. Установлено, что в серии ЦИRJiических аимогов эВJtефВJJина
с ,цисуль~ым мостиком бимоrическая активность
шению к
S-
и
U\. v~~ro по отно­
~-рецепторам является сложной фуикцией, завися­
щей от размера мостика, места распмоаения .цисульqидllой связи в
мостике и от кон~ аминокислотних ocтa'l'Itoв во втором
пятом пможениях. Покаэано, что анмоги,
содерzащие
лоты во втором nОJJоаении, омадают активност.Ьl)
L. -амивокис­
Ul. vi.tto
мой с активностью метионин-энкеф:utива. Авмоги с
•
,
еравив­
1) -аминокисло­
тами во втором пОJJожении являются высокоактивными как in, 11~ 110
так и
i.n. \1\.t.ro ,
соедивениями. Поlt8Эано, что некоторые аиuоrв
www.sp-department.ru
,
- 20 в.иияи на двиrате.пъвую активиооть в доэах,меВЬ11111Х,
чем дозн,
ве­
о6ходВМНе д4R цроявпения аваиьrетическоrо эффекта.
4. По:казаво. что В8JJJIЧJie в ПJ!'l'OM пОJiоженп МOJieкyJitfmкeфми- ·
на об'ЬеМНJа JUIПoфiJIЬВВX pa.дlll(8JIOB ПОЗВОJIЯ&Т ПОJiучltТЬ :ВНСО:КО8RТD­
ВНе ИJIИ сuе:ктивине аваиоrи по отношеJID) к
~рецепторам и к
&-рецепторам.
5. на основании сопоставJiения 6иаnоrичео:кой активности и :ков­
формациовннх свойств по.nученннх ава.поriJВ показаво. что Знаиоrи с
дисуJiьс{идRым мости:ком ве o6JI:aдam' веткой отруiСтурой. а та:ае
•
что моди~ ПJ!'l'oro положения МOJieqJiн эн:ке(аlива :крупным riJД-
poфo6Jmм paдJ!JC8JIOM
N, N' -Д11ЦИМоrе:ксИJiмочевИНН ведет :к отбору
опредмевннх конформацвй.
6.
В резуJiьтате проведеиного исСJiедованИя отобрав ряд ава.поrов
эв:кефwlиа, перспеRтивннх для поСJiедущеrо yrJiy6JI:eвнoro исСJiедо­
вавия с це.n:ью пмучеиия фiрмако.лоrичесJ<ИХ препаратов.
Основное содержание диссертации иЗJiожено в СJiедующи:х работах.
I.
Кормь:ков В.И., Вnасов Г .П., Георrианова Е.К., Денисов И.Г.,
И/IJlарионова Н.Г., КожевНИIСова Н.Ю., Jlнчаков А.В., IlaвJioв В.Н.,
Петров А.Н., Шевчух м.к.
"Синтез и изучение связи СТРУR'l'УРfl-ЗR­
тивность в ряду циклических серусо.цераащих анаnоrов эн:кефалина.
ТеЗисы докладов
тидов, Таnлин,
2.
YII Всесоюзного
!937, с. I96 •.
-
симпозиума по химии бе.n:ков и пеп­
Кормь:ков В. И., Кожевникова Н.Ю., Илларионова Н.Г., Денисов
И.Г., Вnасов Г .П. Синтез и изучение конформационно-закремевных
ава.поrов энкефаnива с дисуJiьФИДRым мости:ком.
-
Тезиен домадов
5
Всесоюзной :конференции "Методн пмучения и ава.пиза биохимичесJ<ИХ
препаратов", Риrа,1937,
274
с.
З. Кормь:ков В.И., Власов Г .П., Денисов И.Г., ВесеJП<ИНа О.С., Шпа­
ков А.О., Георrиавова Е.К., Шевчух М.К., Лычаков А.В., Петров А.Н.
www.sp-department.ru
- 21 nauoв в.н.
Ава.nоrи эвкеilаИИ&а. моди«ащиро:ваинне rи.цроф)6ным ра­
дикалом по пятому поnоаен~m.
4.
KopOJIЬROB в. и
11/пaJtOB А.О.
м.к
.•
•
••
ВJiасов
-
r .п ••
10.Х,т.59, вьш.5, c.I236-I2З',.
KopOJiiltoвa с.в
••
Вес8J1Ю1На о .с
I989.
••
Денисов И.Г., ИJшарионова Н.Г., Петров А.Н., Шевчук
rеорrианова Е.К •• дычаJtо:в А. В •• Пав.ио:в в.н.
ЦиluшчесRИе ана­
лоrи энкефалииа с дисуль~нм мостиком между вторым и пятым nоnо­
аениями.
-
Биоорrан. химия,I989, т.I5,
1
Э, с.ЗIЭ
- 324.
5· Vlasov G.P., Korolkov V.I. • Deniaov I.G., Illarionova N.G.
Synthesis and
stu~
of
contorшa~ional~
restricted an&logues ot
aet-enkephalin conta1ning disulf1de bridge.Eur.Pept.Byap.,
ТUЪingen,
1988,
AЪstracts
р.144.
www.sp-department.ru
ot 20th
M-З!Iб/tJ. llo,IIIJиcaнo к nеча'l'и /Р, р.у,
Тираж
ПО-
tt?c>
3
191 104
,
89
форма'!' бумаги б0х84 1/Iб,
•
Заказ .Jф.Z
1, Гnеч.л.
"Ленуnриэда'l'а".
Ленинrрад, ЛитеiЬtНй пр., дом
f 55.
www.sp-department.ru
ВecnJI&'l'Нo.