020220 B1 020220 B1 (11) 020220

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
020220
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2014.09.30
(21)
Номер заявки
201101665
(22)
(51) Int. Cl. C07K 14/57 (2006.01)
C08G 73/00 (2006.01)
A61K 31/25 (2006.01)
A61K 38/21 (2006.01)
Дата подачи заявки
2011.12.21
(54)
КОВАЛЕНТНЫЙ КОНЪЮГАТ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ С ПОЛИПЕПТИДОМ,
ИМЕЮЩИМ АКТИВНОСТЬ ИНТЕРФЕРОНА-ГАММА
B1
(72)
Изобретатель:
(57)
Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата
полиэтиленгликоля с полипептидами, имеющими биологическую активность интерферона-гамма
(IFN-γ), формулы (I)
Шереметьев Сергей Викторович,
Коровкин Сергей Анатольевич,
Катлинский Антон Викентьевич,
Семченко Андрей Викторович,
Катлинский Владимир Антонович
(RU)
где n - целое число в интервале от 100 до 1200, А - аминокислотный фрагмент тирозина
или гистидина, РР - полипептид с активностью IFN-γ, и способа его получения. Изобретение
позволяет расширить арсенал лекарственных средств, увеличив при этом длительность циркуляции
активного вещества в крови с сохранением значительной части биологической активности
немодифицированного полипептида.
B1
020220
(56) RU-A-93050376
KR-A-1020050083677
WO-A1-2004099245
020220
(43) 2013.06.28
(96) 2011000182 (RU) 2011.12.21
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ
ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ
"ФОРТ" (ООО "ФОРТ") (RU)
020220
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с полипептидами, имеющими биологическую активность интерферона-гамма (IFN-γ), в котором полимер присоединён к полипептиду посредством азогруппы.
Сведения о предшествующем уровне техники
Интерферон-гамма (IFN-γ) является димеризованным растворимым цитокином с молекулярной
массой около 17 кДа и единственным представителем интерферонов II типа [Gray P.W., Goeddel D.V.
Structure of the human immune interferon gene. Nature. Vol. 298 (5877) (August 1982). P. 859-863]. В отличие
от интерферона-α и интерферона-β, которые могут экспрессироваться всеми клетками, IFN-γ производится только Th1-, Т- и NK-клетками.
IFN-γ необходим для врожденного и адаптивного иммунитета к вирусным и внутриклеточным бактериальным инфекциям, а также для контроля опухолей. Роль IFN-γ в иммунной системе состоит, в частности, в его способности ограниченно подавлять репликацию вируса как таковую. Но основными активностями IFN-γ являются иммуностимулирующая и иммуномодулирующая активности [Schoenborn J.R.,
Wilson С.В. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv. Immunol.
Vol. 96 (2007). P. 41-101]. Аберрантная экспрессия IFN-γ связана с рядом воспалительных и аутоиммунных заболеваний.
Интерферон-гамма применяют для лечения хронических гранулематозных заболеваний [Todd P.A.,
Goa K.L. Interferon gamma-1b. A review of its pharmacology and therapeutic potential in chronic granulomatous disease. Drugs. Vol. 43(1) (January 1992). Pp. 111-122], остеопороза [Key L.L., Ries W.L., Rodriguiz
R.M., Hatcher H.C. Recombinant human interferon gamma therapy for osteopetrosis. J. Pediatr. Vol. 121(1)
(July 1992). P. 119].
В комплексной терапии хронических вирусных гепатитов В и С, ВИЧ/СПИД-инфекции, туберкулеза, онкологических заболевания, урогенитального хламидиоза и генитальной герпес-вирусной инфекции
применяют препарат ″Ингарон″ (производитель - НПП ″Фармаклон″, РФ), который представляет собой
лиофилизат рекомбинантного интерферона-гамма человека с молекулярной массой 16,9 кДа, состоящего
из 144 аминокислотных остатков, в начале последовательности которых первые три Cys-Tyr-Cys заменены на Met. Препарат получен микробиологическим синтезом в рекомбинантном штамме Escherichia coli
и очищен колоночной хроматографией.
Тем не менее, применение препаратов IFN-γ в медицине ограничено рядом факторов, среди которых наиболее существенным является недостаточная энзиматическая стабильность в организме [Cantell
K. et al. Pharmacokinetic studies with human and rat interferons in different species. J. Interferon Res. Vol.6
(1986). P.671-675; Dobeli H., Gents R., Jucker W., Garotta G., Hartmann D.W., Hochuli E. Role of the carboxyterminal sequence of the biological activity of human immune interferon. J. Biotechnol. Vol.7 (1988). P.199216; Rutenfranz I., Bauer A., Kirchner H. Pharmacokinetic study of liposome-encapsulated human interferongamma after intravenous and intramuscular injection in mice. J. Interferon Res. Vol. 10(3) (June 1990). P.337341], которая приводит к необходимости увеличения дозы и частоты введения препарата, что, в ряде
случаев, сопряжено с побочными эффектами, например, аллергией. Так, например, препарат ″Ингарон″
вводятся ежедневно или через день. В связи с этим возникает необходимость в химическом модифицировании молекулы интерферона-гамма с целью преодоления указанных недостатков.
Одним из путей является изменение аминокислотной последовательности и получение более стабильных полипептидов с активностью IFN-γ. В патенте RU 2326944 (опубл. 20.06.2008) предложен рекомбинантный аналог IFN-γ человека - дельтаферон с молекулярной массой 16,2 кДа, который имеет
делецию 10 аминокислотных остатков на С-конце молекулы и замену кластера KRKR на KGSA по сравнению с природным IFN-γ. В результате данной модификации у молекулы-аналога IFN-γ (дельтаферона)
появилась устойчивость к протеолизу.
В другом случае для модифицирования различных полипептидов известно применение монометоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ), который представляет собой нейтральный полиэфир с различной молекулярной массой [Никитин И.Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственные препараты: современное
состояние проблемы и перспективы, в сборнике ″Вирусные гепатиты: достижения перспективы″. №3 (13)
(2001). С. 3-8].
Как правило, в ковалентных конъюгатах полимерный фрагмент присоединен к полипептиду через
одну из свободных аминогрупп последнего [Kozlowski A., Charles S.A., Harris J.М. Development of Pegylated Interferons for the Treatment of Chronic Hepatitis C. BioDrugs.; Vol. 15(7) (2001). P. 419-429].
В патенте US 5109120 (опубл. 28.04.1992) предложен конъюгат рекомбинантного INF-γ, в котором
полиэтиленгликолевый фрагмент присоединен к полипептиду через N-терминальную аминогруппу или
концевую аминогруппу одного из фрагментов лизина.
Такие препараты представляют собой смеси позиционных изомеров, химическая структура которых
отличается местом присоединения полимера к полипептиду. Теоретически число позиционных изомеров
в данном случае равно количеству свободных аминогрупп в полипептиде [Блохин Н.П., Никитин И.Г.
Особенности фармакологической динамики и кинетики пегилированного α-интерферона (40 кДа)
-1-
020220
″Пегасис″: новые возможности терапии хронического гепатита С в сборнике ″Материалы VII Российской
конференции ″Гепатология сегодня″. РЖГГК. 2002. С. 6.].
Известно, что позиционные изомеры полипептидов имеют различную биологическую активность
(US 2004/0223950, опубл. 11.11.2004). Это создаёт предпосылки для расширения арсенала таких средств
за счёт различных вариантов модифицирования молекул протеинов. Например, изменение положений и
способов присоединения ПЭГ к протеину позволяет изменить соотношения позиционных изомеров, а
также получить новые типы конъюгатов, в которых, например, не затронуты аминогруппы полипептидов.
В патенте US 6958388 (опубл. 25.10.2005) и международной заявке WO 2002/081507 (опубл.
17.10.2002) раскрыты полипептидные варианты интерферона-гамма, имеющие способность связываться
с рецептором IFNG, содержащие от 1 до 10 модификаций его аминокислот, предпочтительно - введение
звена цистеина, ковалентно присоединённого к неполипептидному фрагменту, которым является, например, линейный или разветвлённый полиэтиленгликоль, причем в качестве пегилирующих агентов использованы ортопиридилдисульфидные (ПЕГ-OPSS) и малеимидные (ПЕГ-MAL) производные ПЕГ.
При использовании ПЕГ-OPSS в образующемся конъюгате полимер связан с цистеиновым фрагментом полипептида малостабильной дисульфидной связью, а при использовании ПЕГ-MAL полимер
связывается как с тиольными, так и с аминогруппами полипептидов, образуя смесь соответствующих
позиционных изомеров [Гершкович А.А., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. Киев, ″Наукова
Думка″. 1992; Shan S. Wong. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. CRC Press, Inc. 1993].
В патенте US 179337 (опубл. 18.12.1979) раскрыты физиологически активные конъюгаты инсулина,
содержащие в молекуле фрагмент пара-фенилендиазония и имеющие строение аминоазопроизводного
формулы
где R представляет PEG-O-CH2-, PEG-O-CH2-CH(OH)-CH2-O- или PEG-O-C(=O)-, а
представляет пептидную цепь, которые можно рассматривать в качестве ближайших аналогов.
Недостатками таких производных являются относительно большое количество возможных вариантов позиционных изомеров вследствие присоединения полимерной части к аминогруппам полипептидов
и их невысокая стабильность в организме и, как следствие, связанные с этим возможности неконтролируемого изменения структуры и отщепления реакционноспособных частиц, в частности - диазосоединений.
Таким образом, существует потребность в новых конъюгатах полипептидов с активностью IFN-γ.
Сущность изобретения
Авторы изобретения неожиданно установили, что недостатки известного уровня техники можно
преодолеть, синтезировав монопегилированные полипептиды с активностью IFN-γ, имеющие общую
структуру (I)
где n - целое число в интервале от 100 до 1200,
А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина,
РР - полипептид с активностью IFN-γ,
в которых полимер присоединен к тирозиновым или гистидиновым фрагментам полипептида посредством азогруппы.
Техническим результатом такого модифицирования химической структуры является увеличение
длительности циркуляции активного вещества в крови при сохранении им значительной части биологической активности немодифицированного полипептида.
В соответствии с изобретением в качестве полипептида с активностью IFN-γ можно применять интерферон-гамма (INF-γ) или дельтаферон.
-2-
020220
Таким образом, первым объектом изобретения является ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля
с полипептидом, имеющим активность интерферона-гамма (IFN-γ) формулы (I)
где n - целое число в интервале от 100 до 1200,
А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина,
РР - полипептид с активностью IFN-γ.
Ковалентный конъюгат получают азосочетанием 4-([метоксиполэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония (М.м. 30 кДа) с гистидиновыми и тирозиновыми фрагментами полипептидов, выступающими в данной реакции в качестве азосоставляющих.
Для доказательства строения конъюгата как азосоединения применяют, в частности, электронную
спектроскопию поглощения (ЭСП), сравнивают спектральные характеристики (интенсивность, ширину и
положение максимумов полос поглощения) растворов исходных и модифицированных полипептидов с
активностью IFN-γ и интерпретируют полученные закономерности с позиций теории цветности органических соединений, необязательно, с привлечением адекватных методов квантово-химического моделирования. Характеристики максимумов полос поглощения приведены в табл. 1.
Таблица 1. Характеристики максимумов полос поглощения IFN-γ, дельтаферона
и их монопегилированных аналогов (вода, рН 6,5, l 1,0 см)
- поглощение 1% (мас./об.) раствора при l 1 см.
* - проявляется в виде плеча.
Появление полос поглощения у монопегилированных IFN-γ и дельтаферона с максимумами при
344,414 и 346,412 нм может быть объяснено, например, с позиций теории цветности органических соединений, локальными электронными переходами в хромофорных системах не связанных сопряжением
диарилазогрупп, IFN-γ образовавшихся в результате ковалентного присоединения ПЭГ-агента к тирозиновыми и гистидиновыми звеньями молекул полипептидов. Уширение полос обусловлено наличием нескольких позиционных изомеров с близкими энергиями электронно-колебательных переходов.
Достижение технического результата, заключающегося в увеличении времени циркуляции в кровотоке ковалентных конъюгатов (пегилированных полипептидов) с активностью IFN-γ, подтверждают в
сериях исследований на мышиной модели. Результаты сравнительных исследований in vivo приведены в
табл. 2.
-3-
020220
Таблица 2. Относительные концентрации IFN-γ и дельтаферона и их конъюгатов
в соответствии с изобретением в крови мышей
Полученные данные показывают, что конъюгаты IFN-γ и дельтаферона в соответствии с изобретением обладают большим временем циркуляции в кровотоке по сравнению с непегилированными полипептидами.
Достижение технического результата, заключающегося в сохранении ковалентными конъюгатами
значительной части биологической активности исходных полипептидов, подтверждается результатами
определения остаточной активности пегилировнных полипептидов с активностью INF-γ.
Таблица 3. Активность INF-γ, дельтаферона и их конъюгатов (остаточная активность)
Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с полипептидом, имеющим активность интерферонагамма (IFN-γ) формулы (I)
где n - целое число в интервале от 100 до 1200,
А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина,
РР - полипептид с активностью IFN-γ, можно получить способом, включающим стадии, на которых:
а) метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты
где n принимает значения от 100 до 1200, диазотируют нитритом щелочного или щелочноземельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С, молярном соотношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому
эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 1000:1 и молярном соотношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты 3:1 до 10000:1 с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента - 4-([метоксиполиэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония
-4-
020220
где n - принимает вышеуказанные значения;
б) активированный пегилирующий агент без выделения из реакционной смеси вводят в реакцию
азосочетания с полипептидом, имеющим активность INF-γ в водной или водно-органической среде с рН
от 7,0 до 10,0 при температуре от 0 до 30 °С; по достижении степени превращения по меньшей мере 70%
реакцию останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей с получением смеси монопегилированного, дипегилированого и немодифицированного полипептида с активностью интерферона гаммма и блокированного ПЭГ-агента, и
в) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с получением монопегилированого полипептида, имеющего активность INF-γ.
При реализации указанного способа обеспечивается повышение выхода пегилированного полипептида, имеющего активность INF-γ, и расширение арсенала лекарственных средств для борьбы с вирусными и некоторыми бактериальными инфекциями.
Повышение выхода пегилированного полипептида, имеющего активность INF-γ, достигается за
счет количественного переведения ПЕГ-агента в активную форму непосредственно перед конъюгацией,
исключая деградацию активной группировки - диазогруппы при транспортировке и хранении.
Увеличение времени циркуляции пегилированного полипептида с активностью INF-γ в кровотоке
возможно за счёт способности тирозиновых и гистидиновых звеньев INF-γ вступать в реакцию азосочетания с активными диазосоединениями с образованием биологически активных азопроизводных полипептидов с активностью INF-γ.
В случае необходимости, повышение устойчивости пегилирующего агента при хранении достигается в результате применения для активации пегилирующего агента органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, что дополнительно позволяет расширить температурный диапазон проведения реакции диазотирования.
В предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят нитритом натрия
в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой
кислотой.
В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии HCl в тетрагидрофуране.
В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии б) для создания и поддержания
рН применяют боратно-карбонатный буферный раствор, степень превращения полипептидов с активностью INF-γ составляет 80-85%, а в качестве низкомолекулярной азосотавляющей применяют тирозин.
В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии в) смесь разделяют ионообменной
хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М NaCl.
На стадии а) диазотирование метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты осуществляют прибавлением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или
водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С.
В первом варианте диазотирования применяют нитрит щелочного или щелочно-земельного металла
в кислой водной или водно-органической среде. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от 0 до 5°С. Кислую среду создают с помощью органических кислот, например, с
помощью уксусной кислоты или ее галогенпроизводных, таких как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также лимонной или винной кислот, или неорганических кислот, например хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной или фосфорной кислот, а также смесью органических и/или нерганических кислот. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно - от 1,1:1 до 10:1. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1. Реакцию предпочтительно проводят в присутствии
катализатора диазотирования, в качестве которого используют бромид-ионы, вносимые в реакционную
смесь в виде бромоводородной кислоты или ее растворимых солей, например бромидов щелочных металлов. Наиболее предпочтительно создавать кислую среду раствором бромисто-водородной кислоты.
Во втором варианте диазотирование проводят с применением органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40
до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от -20 до 0°С.
Предпочтительными органическими нитритами являются бутилнитриты или амилнитриты, более предпочтительно - трет-бутилнитрит. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому
эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. Кислую
среду в полярной органической среде создают растворами HCl или HBr в алифатическом эфире, например диэтиловом эфире, или циклическом эфире, например диоксане или тетрагидрофуране. Молярное
соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от
3:1 до 10000:1.
По завершении диазотирования активированный ПЭГ-агент можно хранить при пониженной температуре в течение не более 2 ч в водной или водно-органической среде, или не более 24 ч в полярной
-5-
020220
органической среде без существенной потери его способности к азосочетанию. Термин ″пониженная
температура″ означает температуру от -2 до 5°С в случае применения водной или водно-органической
среды и от -40 до 0°С в случае применения полярной органической среды. Перед применением активированного ПЭГ-агента для пегилирования интерферона требуется удаление избытка нитрит-ионов, для
чего к его раствору добавляют мочевину или сульфаминовую кислоту. Альтернативно применяют азиды
щелочных или щелочно-земельных металлов.
На стадии б) пегилирование полипептида с активностью INF-γ достигается в результате протекания
реакции азосочетания диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты
с интерфероном α-2b в нейтральной или слабощелочной водной или водно-органической среде при температуре от 0 до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал рН при пегилировании составляет от 9 до
10. Поддержание рН обеспечивают применением подходящего буферного раствора, например боратнокарбонатного буферного раствора. Выбор раствора находится в рамках компетенции среднего специалиста в данной области. Молярное соотношение диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира
4-аминобензойной кислоты к полипептиду с активностью INF-γ составляет от 1:1 до 20:1, наиболее
предпочтительно от 3:1 до 8:1.
Контроль процесса пегилирования осуществляют эксклюзионной или обращено-фазовой ВЭЖХ.
По достижении требуемой степени превращения полипептида реакцию пегилирования останавливают
добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосотавляющей. Для этого в качестве низкомолекулярной азосотавляющей применяют вещества фенольной природы или их эфиры, вещества, имеющие природу ароматических аминов, или вещества, имеющие гетероциклическую природу, у которых
гетероцикл способен выступать в качестве азосотавляющей в реакции азосочетания. Наиболее предпочтительными являются тирозин и гистидин, более предпочтительно - тирозин. Предпочтительно степень
превращения полипептида, вычисленная по результатам ВЭЖХ-анализа, составляет 80-90%.
Выделение монопегилированного полипептида с активностью INF-γ из реакционной смеси осуществляют обычными методами ионообменной хроматографии, последовательно используя буферные растворы с возрастающей ионной силой. Концентрацию полипептида с активностью INF-γ определяют методом ВЭЖХ или спектрофотометрически, используя соответствующее значение А280 для раствора с
концентрацией полипептида 1 мг/мл.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, подтверждающими возможность его осуществления с достижением указанного в описании технического результата.
Пример 1. Диазотированный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты
(активированный ПЭГ-агент с м.м. 30 кДа).
К охлажденному до 1°С раствору 0,077 г (2,5 мкмоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира
4-аминобензойной кислоты (м.м. 30 кДа) в 1 мл 0,1 М HBr приливают 1 мл охлажденного 0,01 М NaNO2
и выдерживают в ледяной бане 20 мин, после чего приливают 1 мл 0,01 М H2NSO3H и сразу же используют для пегилирования или хранят в холодильнике не более 2 ч.
ЭСП (вода, рН 4) λ, нм (lg ε): 203 (4,86), 256 (4,51), 275 (4,43, плечо).
Пример 2. Диазотированный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты
(активированный ПЭГ-агент с м.м. 30 кДа).
К охлажденному до -35°С раствору 0,077 г (2,5 мкмоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира
4-аминобензойной кислоты (м.м 30 кДа в 0,5 мл 0,2 М раствора HCl в тетрагидрофуране приливают 0,5
мл 0,01 М трет-бутилнитрита в тетрагидрофуране и оставляют при -35°С не менее чем на 30 мин (но не
более чем на 24 ч), после чего прибавляют 0,5 мл 0,01 М H2NSO3H и сразу же используют для пегилирования.
Пример 3а. Получение монопегилированного полипептида, имеющего активность INF-γ (интерферона-гамма).
К охлажденному до 3°С раствору 0,5 мкмоль полипептида с активностью интерферона INF-γ в боратно-карбонатном буфере с рН 9,5 приливают охлажденный раствор 0,077 г (2,5 мкмоль) диазотированного монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (м.м. 30 кДа), полученный в
соответствии с примером 1 или 2, поддерживая рН реакционной смеси 9,5±0,3. Реакционную смесь при
охлаждении перемешивают приблизительно 3 ч, контролируя протекание превращений обращенофазовой ВЭЖХ (колонка Kromasil 300-5C4, 250×4,6 мм, спектрофотометрическое детектирование при
220, 280, 340 и 400 нм, градиентное элюирование: от 30% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ до 80% водн.
ацетонитрил+0,2% ТФУ). По достижении степени превращения соответствующего полипептида, равной
80-85%, приливают раствор тирозина, перемешивают 5 мин и уксусной кислотой доводят рН до 5,0-6,5.
Далее реакционную смесь, содержащую смесь дипегилированого, монопегилированного и немодифицированного полипептида с активностью INF-γ, а также блокированный пегилирующий агент, разделяют
ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02
до 1,0 М NaCl.
-6-
020220
Выход очищенного монопегилированного IFN-γ 44% (считая на IFN-γ).
ЭСП (вода, рН 6,5, l 1,0 см), λмакс, нм (E1%1 см): 224 (75,0), 281 (10,2), 344 (2,7), 414 (3,0).
Пример 3б. Получение монопегилированного полипептида, имеющего активность INF-γ (дельтаферона).
В условиях, приведённых в примере 3а, получают очищенный монопегилированный дельтаферон с
выходом 51% (считая на дельтаферон).
ЭСП (вода, рН 6,5, l 1,0 см), λмакс, нм (E1%1 см): 208 (71,7), 278 (9,3), 346 (2,9), 412 (3,1).
Пример 4. Определение времени циркуляции монопегилированных IFN-γ и дельтаферона в крови
на мышиной модели.
Самцам мышей линии СВА внутримышечно вводят по 1 мкг пегилированного полипептида с активностью IFN-γ в соответствии с изобретением (30 кДа), после чего собирают кровь в первый день через
2 ч после инъекции и далее через каждые 24 ч в течение 10 дней. В качестве контроля используют соответствующий немодифицированный полипептид, который вводят по той же схеме. Взятые пробы крови
инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С,
полученную сыворотку центрифугируют и сохраняют при -65°С до проведения тестов. Содержание полипептидов (пг/мл) в сыворотках крови определяют с помощью иммуно-ферментного анализа, результаты усредняют. Вычисляют относительное содержание полипептида (в %), при этом за 100% принимают
среднюю максимальную концентрацию белка в крови в каждой группе животных.
Пример 5. Определение активности монопегилированных и немодифицированных IFN-γ и дельтаферона.
Противовирусную активность определяют микрометодом в 96-луночных планшетах с плоским
дном по подавлению цитопатического действия тест-вируса в диплоидной культуре клеток Л-68 (200000
кл/мл). Для этого используют тест-вирус ЕМС штамм ″Колумбия″ в дозе 100 ЦПД50 и питательную среду
Игла MEM с добавлением 10% сыворотки КРС. Остаточную активность конъюгатов выражают по отношению к результатам параллельного титрования активности стандартного раствора соответствующего
полипептида, имеющего биологическую активность IFN-γ.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с полипептидом, имеющим активность интерферонагамма (IFN-γ) формулы (I)
где n - целое число в интервале от 100 до 1200;
А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина;
РР - полипептид с активностью IFN-γ, выбранный из группы, состоящей из IFN-γ и дельтаферона.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-7-