006162 Область техники, к которой относится изобретение

006162
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и, в частности, касается препарата для бесклеточного синтеза белка, содержащего клеточные экстракты, полученные из клеток и
тканей, предназначенного для синтеза белка в бесклеточной системе, причем препарат получен путем
стабилизации клеточных экстрактов, что позволяет его хранить и траснпортировать при комнатной температуре, а также касается способа и устройства для бесклеточного синтеза белка с помощью разработанного препарата.
Уровень техники
Реакции синтеза белка протекают в клетке таким образом, что генетическая информация, содержащаяся в ДНК, сначала транскрибируется в мРНК, а затем из мРНК она транслируется в рибосомах. В
настоящее время проводятся интенсивные исследования методов синтеза белка ex vivo, к примеру, in
vitro, в бесклеточной системе, при которых из живого организма выделяют рибосомы и используют их
для проведения синтеза белка in vitro (японские патентные публикации для открытого доступа Hei 698790, Hei 6-225783, Hei 7-194, Hei 9-291 и Hei 7-147992). В этом методе в качестве исходного материала
для получения рибосом используют Escherichia coli, эмбрионы, ретикулоциты кролика и т.п.
Реакционные смеси для бесклеточного синтеза белка, содержащие клеточные экстракты для системы бесклеточного синтеза белка и химические вещества, необходимые для реакции трансляции или повышения её эффективности-синтетические субстраты, за исключением матрицы для трансляции, источники энергии, различные ионы и т.д. - нестабильны при обычных температурах; стабильное хранение их
возможно лишь при сверхнизких температурах, например, -80°С и ниже.
Бесклеточная система синтеза белка является полезным методом, который способен поддерживать
точное выполнение, сравнимое с живыми клетками по скорости реакции синтеза пептидов и реакции
трансляции, при котором требуемые белки можно получать без проведения сложных стадий очистки.
Именно поэтому было опубликовано несколько изобретений по улучшению эффективности синтеза,
предназначенных для лучшего применения этой системы в промышленности. Однако для лучшего применения в промышленности необходимо обеспечить не только эффективность синтеза, но и стабильность и высокое качество различных веществ, применяемых в системе синтеза.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение имеет целью обеспечить способ поддержания стабильности и сохранения
биологической функции препарата при комнатной температуре, содержащего клеточные экстракты для
бесклеточного синтеза белка, необходимые для системы бесклеточного синтеза, и химические вещества,
необходимые для реакции трансляции или повышения её эффективности - субстраты для синтеза, за исключением матрицы, источники энергии, различные ионы и т.п.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение условий для стабильного хранения и
поставок набора, включающего препарат, содержащий клеточные экстракты для системы бесклеточного
синтеза белка, упрощая тем самым рабочие операции при бесклеточном синтезе белка.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение условий для бесклеточного синтеза белка с помощью препарата, содержащего клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, и
улучшения его производительности, результативности и простоты.
Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования для решения поставленных
задач, в результате чего было осуществлено настоящее изобретение, прежде всего, путем устранения
системы, участвующей в ингибировании реакций синтеза белка per se в клетках, используемых в качестве исходного материала для бесклеточного синтеза белка. Другое условие настоящего изобретения заключается в применении такой обработки, как лиофилизация клеточных экстрактов, предназначенных
для бесклеточного синтеза белка, или клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка вместе с
веществами, участвующими в системе реакций бесклеточного синтеза белка, с целью получения сухого
препарата, посредством которого осуществляется настоящее изобретение.
Следующим условием настоящего изобретения является метод бесклеточного синтеза белка, который заключается в применении системы бесклеточного синтеза белка, указанной выше, с применением
принципа молекулярного сита.
Еще одним условием бесклеточного синтеза белка является проведение его в непрерывном режиме
с помощью диализной мембраны, что влечет за собой применение дополнительных элементов и специального устройства.
Перечень фигур
На фиг. 1 показано сравнение активности синтеза белка с помощью лиофилизованного экстракта из
зародышей пшеницы, хранившегося при -80°С в течение 2 месяцев, и нелиофилизованного экстракта из
зародышей пшеницы, хранившегося в течение 2 месяцев в жидком азоте. Символы (□-□) означают экстракт, хранившийся 2 месяца в жидком азоте общепринятым способом, а символы (■-■) означают экстракт, хранившийся такой же срок после лиофилизации. По оси ординат - включение радиоактивности в
белок как число распадов за 1 мин (dpm) в 5 мкл реакционной смеси, по оси абсцисс - время реакции при
26°С.
На фиг. 2 показано влияние температуры хранения лиофилизованного экстракта на активность син-1-
006162
теза белка. Символы (□-□) означают экстракт, хранившийся при комнатной температуре в течение 1 месяца, символы (■-■) означают экстракт, хранившийся такой же срок при 4°С, а символы (•-•) - экстракт,
хранившийся такой же срок при -80°С, соответственно.
На фиг. 3 показана активность синтеза белка с помощью лиофилизованного бесклеточного экстракта из зародышей пшеницы в периодическом режиме. Символы (■-■) означают экстракт, хранившийся 2
месяца в жидком азоте общепринятым методом, а символы (□-□) означают экстракт, хранившийся такой
же срок после лиофилизации.
Фиг. 4А показывает собой фотографию результатов синтеза белка в бесклеточной системе на открытой колонке. На дорожке 1 показаны результаты в отсутствие матрицы и на дорожке 3 показаны результаты синтеза за 12 ч колоночным способом. В качестве сравнительного примера на дорожке 2 показаны результаты синтеза за тот же срок методом непрерывного бесклеточного синтеза белка с применением обычного диализа. Слева представлены маркеры молекулярного веса в 94 кД, 67 кД, 43 кД, 30 кД и
20,1 кД, соответственно, сверху вниз. Стрелками отмечено положение синтезированной дигидрофолатредуктазы.
Фиг. 4В показывает фотографию результатов синтеза белка в бесклеточной системе на коммерчески
доступной установке для жидкостной хроматографии. На дорожке 1 показаны, в качестве сравнительного примера, результаты синтеза за 12 ч методом непрерывного бесклеточного синтеза белка с применением обычного диализа. На дорожке 2 показаны результаты синтеза за тот же срок методом непрерывного бесклеточного синтеза белка с применением жидкостной хроматографии. Стрелками отмечено положение синтезированной дигидрофолатредуктазы.
Фиг. 5 - перспективное изображение кассетной установки.
Фиг. 6 - центральный поперечный разрез кассетной установки.
На фиг. 5 и 6 имеются следующие обозначения:
1 - камера;
2- крышка;
3 - наружная диализная жидкость;
4 - уровень наружной диализной жидкости;
5 - входное отверстие для подачи субстрата и/или источника энергии и т.п.;
6 - выходное отверстие для отвода субстрата и/или источника энергии и т.п. из камеры;
7 - канал;
8 - входное отверстие в камере для отвода наружной диализной жидкости;
9 - наружное выходное отверстие для отвода наружной диализной жидкости;
9а - наружное выходное отверстие для отвода наружной диализной жидкости;
10 - канал;
11 - входное отверстие для подачи мРНК и/или ферментов системы регенерации энергии;
12 - цилиндр для диализной мембраны;
13 - насадка впускного отверстия 11;
14 - сборка для прикрепления мембраны;
15 - нижний конец мембраны;
16 - магнитная мешалка;
17 - насадка входного отверстия 5;
18 - насадка выходного отверстия 6 в камере;
19 - насадка входного отверстия 8 в камере;
20 - насадка выходного выпускного отверстия 9;
20а - насадка наружного выходного отверстия 9а.
Фиг. 7 показывает поддержание уровня синтеза белка при дополнительном внесении мРНК и креатинкиназы. Символы о-о означают добавление САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, вместе с креатинкиназой, ∆−∆ означают дополнительное внесение только мРНК,
означают
добавление только креатинкиназы, □-□ указывает на отсутствие добавок. Стрелками отмечено время внесения добавок.
Фиг. 8 показывает поддержание уровня синтеза белка при смене наружной диализной жидкости.
Символы о-о означают, что производилась смена наружной диализной жидкости, ∆−∆ означают, что
смена не производилась, а стрелки показывают время замены.
Фиг. 9 показывает поддержание уровня синтеза белка при применении автоматической установки.
Символы о-о означают добавление САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, вместе с креатинкиназой, ∆−∆ означают отсутствие дополнительного добавления мРНК. Белыми стрелками
отмечено положение дигидрофолатредуктазы - продукта синтеза, а звездочкой - окрашенные полоски
добавленной креатинкиназы.
Раскрытие сущности изобретения
1) Удаление системы, участвующей в ингибировании реакций синтеза эндогенного белка в клетке,
для бесклеточного синтеза белка.
-2-
006162
Удаление системы, участвующей в ингибировании реакций синтеза эндогенного белка в клетках,
служащих исходным материалом для бесклеточного синтеза белка, является одним из условий настоящего изобретения и означает удаление системы, контролирущей синтез эндогенного белка, содержащегося
в этих клетках. В частности, удаление этой системы, обнаруженной авторами настоящего изобретения,
означает удаление веществ, воздействующих на рибосомы, факторов трансляции белка, мРНК и тРНК и
вызывающих ингибирование их функций.
Вещества, содержащиеся в клетках, служащих исходным материалом, и подавляющие функцию
белкового синтеза, включают тритин (Massiah A.J. and Hartely M.R. (1995) Planta, 197, 633-640), белок
тионин, содержащий много цистеина (Brummer J., Thole H., and Kloppstech К. (1994) Eur. J. Biochem, 219,
425-433), рибонуклеазу (Matsushita S., Mem. Res. Inst. Food Sci. Kyoto Univ., No. 19, 1) и им подобные,
которые, как известно, в большом количестве присутствуют, например, в эндосперме семян.
Путем полного удаления из зародышей той группы белков, что подавляет (ингибирует) бесклеточный синтез белка и присутствует в примесях эндосперма на стадии выделения зародышей - тритина,
тионина, рибонуклеазы и др., можно предотвратить инактивацию реакций синтеза белка.
Таким образом, одно из условий настоящего изобретения достигается с помощью технологии удаления тех механизмов, что подавляют реакции синтеза эндогенных белков и вступают в действие при
повреждении тканей организма или клеток, иными словами, механизмов подавления реакций синтеза
эндогенного белка, действующих в качестве физиологического механизма защиты от патогенов, и технологии нейтрализации или удаления той активности, которая подавляет реакции белкового синтеза и индуцируется при повреждении и приготовлении экстрактов для бесклеточного синтеза белка из клеток
или тканей.
В качестве исходного клеточного материала настоящего изобретения в основном могут служить зародыши, Escherichia coli, ретикулоциты, раковые клетки и т.д., которые обычно применяются в системах
бесклеточного синтеза белка, а также клетки из других организмов. В предпочтительном воплощении
исходным клеточным материалом служат зародыши пшеницы, ячменя, риса, кукурузы, шпината, гречихи
и т.п.
Получение клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка по настоящему изобретению из
этих исходных клеточных материалов можно проводить в сочетании с различными известными методами (Johnston F.B. et al. (1957) Nature, 179, 160-161). Для удаления системы, контролирующей синтез эндогенных белков, что является одним из условий настоящего изобретения, подходит обработка исходного клеточного материала поверхностно-активными веществами, в частности, неионными детергентами.
Можно использовать широкий спектр неионных детергентов, лишь бы они были неионными. Предпочтительными являются Brij, Triton, Nonidet P-40, Tween и им подобные, которые являются производными
полиоксиэтилена. Из них наиболее предпочтителен Nonidet P-40. Эти неионные детергенты применяются, к примеру, в концентрации 0,5%.
Когда в качестве исходного клеточного материала служат, к примеру, зародыши пшеницы, их обработка заключается в получении экстрактов путем размалывания, флотации и просеивания с помощью
известных методов. Экстракты зародышей промывают несколько раз детергентом для удаления эндосперма, загрязняющего экстракты. Промывку повторяют до тех пор, пока не исчезнет мутность. Эту обработку предпочтительно проводят в сочетании с обработкой ультразвуком, что обеспечивает более эффективное удаление эндосперма.
Полученные таким образом экстракты зародышей практически полностью лишены эндосперма, содержащего эндогенные специфические ингибиторы типа тритина и др., а зародыши основательно очищены. При оценке загрязнения белками эндосперма до и после ультразвуковой обработки методом иммуноблота с применением антитритиновых антител и тритина в качестве контроля было подтверждено,
что обработка ультразвуком приводит к снижению уровня тритина ниже предела определения. Это значит, что экстракты зародышей практически свободны от загрязнения белками эндосперма, а другие факторы, инактивирующие синтез белка и локализованные в эндосперме, такие как тионин и рибонуклеаза,
тоже удалены из этих экстрактов. Полученные экстракты зародышей очищены до такой степени, что рибосомы еще практически не деаденилированы: показатель деаденилирования рибосом составляет менее
7%, предпочтительно 1% или еще меньше.
2) Способ стабилизации препарата.
Следующее условие настоящего изобретения заключается стабилизации препарата клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка. Прежний способ хранения клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка - хранение при температуре от -80 до -196°С, тогда как новым способом препараты, содержащие клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, стабильно хранятся при комнатной температуре. Разработка такой технологии, при которой препараты настоящего изобретения можно
хранить при комнатной температуре, может иметь применение в промышленности.
Способ стабилизации клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка заключается в получении сухого препарата, в частности, путем лиофилизации (высушивания с замораживанием). Лиофилизация может проводиться любым известным методом. Например, клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка можно быстро заморозить в жидком азоте. Высушивание проводится в течение 3 ч с
-3-
006162
помощью обычной лиофильной сушки. После полного удаления воды получают порошкообразный препарат, который герметически закупоривают под вакуумом или в атмосфере азота; из него также получают другие формы препарата.
Полученный препарат может содержать только клеточные экстракты для бесклеточного синтеза
белка, обработанные способом настоящего изобретения, но при желании в него можно добавить отдельные вещества, необходимые для системы бесклеточного синтеза белка, например, синтетические субстраты, аминокислоты, источники энергии.
В этот препарат можно добавлять вещества, повышающие эффективность реакций системы бесклеточного синтеза белка, например, соединения различных ионов, предпочтительно ионов калия, магния и
др.
Кроме того, при желании в препарат можно добавлять вещества, повышающие растворимость - детергенты, вещества, защищающие рибосомы от деаденилирования.
Предпочтительно препарат представляет собой композицию такого состава, работа с которой заключается в простом добавлении воды. Альтернативно композиция может применяться в виде набора из
препарата и других необходимых компонентов. Естественно, при формировании набора в него можно по
отдельности включать клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, необходимые компоненты
системы бесклеточного синтеза белка, вещества, повышающие эффективность реакций системы бесклеточного синтеза белка, и другие водные растворы, необходимые для проведения реакции.
3) Способ бесклеточного синтеза белка: применение носителей со свойствами молекулярного сита.
В другом воплощении настоящего изобретения реакционную камеру для бесклеточного синтеза
белка можно заполнить носителем, обладающим свойствами молекулярного сита. Выбор носителя не
ограничен, он только должен подходить для фракционирования в диапазоне молекулярных весов от
10000 и ниже. К таким носителям относятся, например, пористые частицы для гельфильтрации, особенно
Сефадекс G10 или G25. Носитель может быть пропитан водой. Более предпочтительно носитель уравновешивают с буферным раствором перед употреблением. Подготовка носителя может проводиться после
заполнения камеры или же при формировании набора отдельно от камеры так, чтобы носитель готовился
по мере необходимости.
Предпочтительно камера должна подходить для хроматографии, более предпочтительно - для колоночной хроматографии. Диаметр и длину колонки и объем носителя следует подбирать, исходя из времени реакции и скорости хроматографии. Объем камеры выбирают в зависимости от количества синтезируемого белка. Камера должна иметь по меньшей мере два отверстия, которые можно открывать при
необходимости с тем, чтобы можно было заполнить её носителем заранее, а исходные материалы для
системы бесклеточного синтеза белка вносить туда по желанию.
Заполнять камеру носителем можно перед работой или заранее. Желательно, чтобы исходные материалы для системы бесклеточного синтеза белка, в частности, субстраты для синтеза - аминокислоты,
источники энергии - АТФ, ГТФ, креатинфосфат, а также ионные компоненты, повышающие эффективность реакций бесклеточного синтеза белка, которые добавляют по мере необходимости, были распределены равномерно во внесенном наполнителе, предпочтительно в виде оптимальной дисперсии, и особенно в виде локально-однородной дисперсии. Состояние дисперсии достигается путем расчета эффективности реакции с учетом связи между концентрацией этих веществ в подвижной фазе носителя и скоростью подачи клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка и/или транслируемой матрицы, если
их вводят раздельно.
При этом, если необходимо, носитель может состоять исключительно из носителя типа молекулярного сита, а препарат, приготовленный заранее из соответствующих клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка, субстратов для синтеза, источников энергии и, при необходимости, ионных компонентов, повышающих эффективность реакций бесклеточного синтеза белка, вводят в носитель по мере
необходимости, так же вводится и подается транслируемая матрица, и таким образом происходит бесклеточный синтез белка.
Скорость прохождения подвижной фазы через носитель типа молекулярного сита зависит от размера колонки и эффективности синтеза, но обычно она колеблется от 1/10 до 1/30 внутреннего объема колонки в час. Раствор для элюции содержит субстраты для синтеза - аминокислоты, источники энергии АТФ, ГТФ и креатинфосфат, а также необязательные ионные компоненты, повышающие эффективность
реакций бесклеточного синтеза белка, но не ограничивается ими. Элюцию предпочтительно контролируют автоматически, но не ограничиваются этим.
Реакции синтеза предпочтительно проводят в камере, заполненной носителем. Однако, в зависимости от состояния носителя, синтез можно проводить в супернатанте от носителя, или же начать его в отдельной порции, а затем продолжить при прохождении раствора через носитель.
Реакции синтеза по настоящему изобретению отличаются тем, что клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, к примеру, рибосомы, движутся в составе подвижной фазы, а побочные продукты, образующиеся в реакции синтеза, отделяются и удаляются при фракционировании в процессе
элюции, и в то же время реакции синтеза протекают с максимальной скоростью при подаче химических
веществ, необходимых для трансляции или для повышения эффективности реакции - субстратов для
-4-
006162
синтеза, источников энергии и различных ионов в оптимальных концентрациях.
Способ настоящего изобретения может осуществляться путем автоматически контролируемого заполнения и пропускания (элюции) исходных материалов системы бесклеточного синтеза белка и выделения синтезированного белка. При желании можно автоматически контролировать каждое звено процесса. Более предпочтительно поддерживать автоматический контроль скорости прохождения раствора в
подвижной фазе.
С помощью способа и устройства настоящего изобретения в комбинации с другими известными методами очистки белков - разными вариантами ионообменной или аффинной хроматографии, в зависимости от получаемого белка можно непрерывно получать большие количества белка с высокой степенью
чистоты.
Таким образом, применение устройства настоящего изобретения, описанного выше, обеспечивает
действенный способ получения требуемого белка.
Далее, применение способа настоящего изобретения, описанного выше, позволяет получить устройство для бесклеточного синтеза требуемого белка.
Кроме того, применение способа и устройства настоящего изобретения, описанного выше, позволяет получить набор, предназначенный для бесклеточного синтеза требуемого белка.
4) Способ непрерывного бесклеточного синтеза белка (дополнительное внесение компонентов).
В следующем воплощении цель настоящего изобретения достигается путем дополнительного внесения компонентов, используемых в системе бесклеточного синтеза белка.
В настоящем изобретении мРНК, служащая матрицей для синтеза белка, поступает по мере необходимости или непрерывно после запуска реакции, примерно к тому моменту времени, когда появляется
тенденция к снижению матричной активности той мРНК, что была внесена исходно. Добавление может
производиться непрерывно по мере необходимости в очень маленьком количестве или же периодически.
Количество добавленной мРНК колеблется от одной десятой части до полного эквивалента исходно внесенной мРНК. Настоящее изобретение отличается тем, что эффект от добавочной порции был впервые
подтвержден, а количество добавленной мРНК и время добавления специалисты в этой области могут
легко изменить или установить по их действию на синтез. Все это верно и в отношении других компонентов и в том же самом смысле, даже если ниже не будет дано конкретного описания.
В настоящем изобретении фермент системы регенерации энергии поступает по мере необходимости
или непрерывно после запуска реакции, примерно к тому моменту времени, когда появляется тенденция
к снижению активности той порции фермента системы регенерации энергии, что была внесена исходно.
Добавление может производиться непрерывно по мере необходимости в очень маленьком количестве
или же периодически. Количество добавленного фермента системы регенерации энергии колеблется от
одной десятой части до полного эквивалента исходно внесенного фермента. Обычно ферментом системы
регенерации энергии является креатинкиназа. Конечно, в качестве фермента системы регенерации энергии могут служить и другие вещества, обладающие такой же функцией, как фермент настоящего изобретения. Количество добавленного фермента и способ добавления можно при необходимости изменить,
исходя из уровня синтеза.
Дополнительное внесение мРНК и фермента системы регенерации энергии можно производить отдельно друг от друга, но предпочтительно вместе. Способ добавления - либо непрерывный, либо периодический. Количество добавленных мРНК и фермента системы регенерации энергии и способ добавления можно при необходимости изменить, исходя из уровня синтеза.
В настоящем изобретении, помимо дополнительного внесения мРНК и/или фермента системы регенерации энергии, можно добавить операцию для предупреждения истощения субстрата и/или источника
энергии и/или операцию для удаления побочных продуктов. Предпочтительно, чтобы производилось
дополнительное внесение различных аминокислот, АТФ, ГТФ и т.п. в качестве субстрата или источника
энергии, либо непрерывно, либо периодически. Количество добавленных компонентов следует предпочтительно поддерживать на уровне концентраций соответствующих веществ в момент запуска синтеза
или близко к этим концентрациям. Однако количество добавленных компонентов можно при необходимости корректировать и изменять, исходя из уровня синтеза.
Удаление побочных продуктов означает удаление таких метаболитов, как АМФ и ГМФ и таких
продуктов реакции, как фосфорная кислота и пирофосфорная кислота, причем такие соединения предпочтительно удаляют из системы либо непрерывно, либо периодически.
Для предупреждения истощения субстрата и/или источника энергии и/или для удаления побочных
продуктов предпочтительно применяется непрерывное или периодическое обновление реакционной среды в системе. В настоящем изобретении, к примеру, описывается метод с применением диализной мембраны. В этом случае, скажем, наружная диализная жидкость непрерывно или периодически обновляется
или заменяется.
Внесение, хранение, замену или удаление каждого компонента следует предпочтительно проводить
автоматически. Для этого устройство должно находиться под управлением компьютерной системы, которая будет проводить добавление, хранение, замену или удаление каждого компонента системным образом. Реактивы для этих операций по каждому компоненту предпочтительно следует готовить в виде
-5-
006162
набора.
5) Устройство для автоматического непрерывного бесклеточного синтеза белка.
Устройство для автоматического бесклеточного синтеза белка находится под управлением компьютерной системы, функция которой в общем заключается в создании оптимальной среды для синтеза белка, а также в осуществлении добавления, хранения, замены или удаления каждого компонента системным образом.
Например, можно поддерживать требуемую температуру в нескольких диализных камерах независимо друг от друга, поместив в каждую из них электронный охладитель и нагреватель, которые способны поддерживать температуру от 15 до 37°С, что позволит поддерживать оптимальную температуру для
синтеза данного белка.
При непрерывном или периодическом обновлении или замене наружной диализной жидкости в
диализной камере скорость обновления или замены диализной жидкости можно варьировать от 0,1 до 1
мл/ч с помощью дозатора, например, перистальтического насоса или шприцевого насоса, непрерывно
или периодически, что позволяет выбрать оптимальные условия для синтеза данного белка.
Далее, необходимые для синтеза белка вещества - матрицу из мРНК, креатиназу, фермент системы
регенерации энергии - в требуемом количестве можно вводить дополнительно в системы для синтеза
белка, находящиеся в нескольких диализных камерах, в любое время, к примеру, с интервалом от 6 до 15
ч.
В описанном выше устройстве соответствующие компоненты - матрица из мРНК, субстрат для
фермента системы регенерации энергии, источник энергии, наружная диализная жидкость и т.п. - хранятся раздельно или в виде смеси в сосудах, подсоединенных к соответствующим диализным камерам, и
поступают через соответствующие трубки, идущие от сосудов для хранения к системе синтеза белка или
к диализным камерам. Сосуды для хранения предпочтительно находятся при 4°С.
6) Конструкция устройства для непрерывного бесклеточного синтеза белка.
В качестве примера устройства для непрерывного бесклеточного синтеза белка, воплощающей настоящее изобретение, рассмотрим кассетное устройство. Однако устройство по настоящему изобретению
не обязательно должно быть кассетного типа.
Кассетное устройство - это устройство для непрерывного бесклеточного синтеза белка, конструкция которого включает камеру, в общем представляющую собой полый корпус, имеющий дно и крышку,
которая плотно закрывается. В этом устройстве имеется канал с входным отверстием для внесения субстрата и/или источника энергии и выходным отверстием, сообщающимся в камере с отсеком для наружной диализной жидкости; канал с входным отверстием, находящимся в камере в отсеке для жидкости,
которое служит для отвода метаболитов из диализной жидкости, и выходным отверстием, ведущим наружу; входное отверстие для внесения мРНК и/или фермента системы регенерации энергии; а также цилиндр для диализной мембраны, находящийся в камере в отсеке для наружной диализной жидкости.
Далее кассетное устройство настоящего изобретения будет описано подробно с привлечением чертежей. Однако представленное на чертежах устройство является лишь одним из воплощений и настоящее изобретение им не ограничивается.
Кассетная установка включает камеру 1, в общем состоящую из полого корпуса со дном и крышки
2, которая плотно закрывается, причем камера 1 заполнена наружной диализной жидкостью 3 до уровня
4. В частности, фундаментальной особенностью устройства является канал 7 со входным отверстием 5
для внесения источника энергии и т.п. и выходным отверстием 6, которое сообщается с находящимся в
камере 1 отсеком для наружной диализной жидкости 3. В этом воплощении на фиг. 5 и 6 показано кассетное устройство с камерой, имеющей цилиндрический корпус. Однако форма камеры не ограничивается цилиндрической.
Выходное отверстие 6 сообщается с наружной диализной жидкостью таким образом, что его конец
находится в верхней части камеры 1 чуть ниже уровня жидкости 4. Входное отверстие 8 сообщается с
наружной диализной жидкостью 3, а его конец находится в нижней части камеры 1. Положения концов
выходного отверстия 6 и входного отверстия 8 можно поменять местами.
Выходное отверстие 9а с насадкой 20а доходит до уровня жидкости 4 и находится чуть выше уровня жидкости 4. Выходное отверстие 9а с насадкой 20а обеспечивает вытекание жидкости самотеком. В
том случае, когда удаление метаболитов из наружной диализной жидкости 3 проводится через выпускное отверстие 9 с насадкой 20, отверстие 9а с насадкой 20а можно заглушить или же камеру производить
без выходного отверстия 9а с насадкой 20а при изготовлении. В случае, когда удаление метаболитов из
наружной диализной жидкости 3 проводится самотеком через выходное отверстие 9а с насадкой 20а,
отверстие 9 с насадкой 20 можно заглушить или же камеру производить без выходного отверстия 9 с насадкой 20 при изготовлении. В последнем случае, хотя это и не показано, насадку 19 и насадку 20а можно сделать таким образом, чтобы насадка 20а выходного отверстия 9а и насадка 19 входного отверстия 8
соединялись друг с другом. При этом конец насадки 19 входного отверстия 8 со стороны выходного отверстия 9 не подсоединяется к крышке, а соединяется с насадкой 20а выходного отверстия 9а.
Цилиндр 12, выполняющий функции диализной мембраны, может быть выполнен вместе с насадкой 13 входного отверстия 11 или прикреплен к ним с помощью сборки 14 (держателя мембраны), как
-6-
006162
показано на чертеже. Цилиндр 12 вставлен в камеру в таком положении, что он погружен в наружную
диализную жидкость 3. Тот конец цилиндра 12, который противоположен входному отверстию 11, может
находиться в камере в таком положении, что он будет погружен в наружную диализную жидкость 3 и
может быть закрытым. В данном примере он закрыт особой крышкой, образующей концевую часть 15
мембраны, либо может представлять собой мешочек, открытый только с одной стороны.
Кассетное устройство предпочтительно должно включать приспособление для перемешивания наружной диализной жидкости 3. В данном примере им служит вращательный механизм - магнитная мешалка 16, помещенная в камеру 1.
Для эффективного синтеза в камере 1 предпочтительно поддерживается гомеостаз каким-либо способом. Например, можно модифицировать конструкцию камеры 1 так, чтобы она помещалась в специальный резервуар для инкубации. Кассетное устройство обычно поставляется потребителям в таком виде, что оно не заполнено диализной жидкостью и компонентами системы синтеза, и потребители сами
заливают жидкость через входные отверстия 11 и 5 в нужное время.
Входные отверстия 11 и 5 и выходное отверстие 9 могут быть снабжены средствами автоматического контроля проходящих через них потоков. Самый легкий, и предпочтительный способ автоматизации - это автоматический контроль входных/выходных потоков из отверстия 5 в отверстие 6 и из отверстия 8 в отверстие 9, что обеспечивает постоянный уровень жидкости 4. В этом случае дополнительное
внесение веществ через отверстие 11 может проводиться вручную. В том случае, когда выпускное отверстие 9а с насадкой 20а располагается непосредственно на уровне жидкости 4 (чуть выше него), возможен
слив жидкости самотеком.
Кассетное устройство настоящего изобретения может быть полностью собрано заранее или смонтировано по желанию. В том случае, когда сборка проводится по желанию, камера 1, крышка 2 камеры 1,
насадка 13 отверстия 11, насадка 17 отверстия 5, насадка 18 отверстия 6, насадка 19 отверстия 8, насадка
20 отверстия 9, цилиндр 12 (может быть встроен заранее вместе с насадкой 13) поставляются отдельно и
подсоединяются, к примеру, с помощью ленты.
Для изготовления кассетного устройства можно использовать широкий спектр пластических материалов.
Препарат настоящего изобретения позволяет: (1) применять его с высоким качеством длительное
время без необходимости транспортировки при низких температурах типа ультранизкотемпературного
сосуда для хранения клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка или сухого льда, (2) лиофилизация клеточного препарата, содержащего экстракты для бесклеточного синтеза белка по настоящему
изобретению, полученного путем смешивания клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка с
аминокислотами, субстратами для синтеза типа АТФ и другими веществами, необходимыми для реакции
трансляции или повышения её эффективности, например, с различными ионами, позволяет хранить и
транспортировать препарат в удобной форме с сохранением высокого уровня синтеза белка.
Препарат, содержащий клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка по настоящему изобретению, не требует приготовления реакционной смеси при синтезе белка ex vivo. Согласно настоящему изобретению, практически одно лишь добавление воды и матрицы для трансляции (мРНК) обеспечивает возможность идентифицировать генные продукты и синтезировать их в больших количествах, а
также с легкостью анализировать механизм трансляции.
Настоящее изобретение обеспечивает возможность стабильного хранения и транспортировки веществ, нестабильных при комнатной температуре, например, компоненты системы реакций бесклеточного синтеза белка, включающей клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, другие субстраты
для синтеза за исключением матриц для трансляции, источники энергии и вещества, необходимые для
реакции трансляции или повышения её эффективности, например, различные ионы, необходимые для
системы бесклеточного синтеза белка. Наличие лиофилизованного препарата, содержащего клеточные
экстракты для бесклеточного синтеза белка по настоящему изобретению, облегчает работу с системой
бесклеточного синтеза белка по сравнению с обычными условиями, а отсутствие необходимости приготовления реакционной смеси сокращает процесс работы и делает эту систему пригодной для промышленного применения.
В другом способе настоящего изобретения используется принцип молекулярного сита, служащего
носителем для реакции в камере для бесклеточного синтеза белка, что позволяет увеличить объем бесклеточного синтеза белка, что было бы трудно достичь обычным способом непрерывного бесклеточного
синтеза белка с применением мембраны.
Кроме того, способ настоящего изобретения привел к открытию установки диализного типа для автоматического непрерывного синтеза белка, что упрощает процесс синтеза белка.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на примерах, относящихся к препарату, содержащему клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка из зародышей пшеницы. Однако
нижеследующие примеры следует рассматривать только как средство для получения конкретной информации о настоящем изобретении, никоим образом не ограничивая его объем этими примерами.
Пример 1. Получение экстрактов из зародышей пшеницы.
-7-
006162
Для выделения интактных зародышей (сохраняющих способность к прорастанию) из семян путем
измельчения, флотации и просеивания применяли метод Johnston et al. (Johnston F.B. et al. (1957) Nature,
179, 160-161) с незначительными модификациями. А именно, семена (нестерилизованные) пшеницы .
Chihoku, выращенной на Хоккайдо, подавали в измельчитель (Rotor Speed Mill pulverisette Type 14) со
скоростью 100 г в минуту и слегка измельчали при 8000 об/мин. Раздавленные семена измельчали еще
раз при 6000 об/мин и просеивали (размер решетки от 0,71 мм до 1,00 мм), получая неочищенную фракцию зародышей. После этого зародыши, сохраняющие способность к прорастанию, выделяли путем флотации в смеси четыреххлористого углерода и циклогексана (2,5:1) и удаляли органическую фазу высушиванием при комнатной температуре. Такие загрязнения, как семенные оболочки, удаляли из фракции
зародышей путем адсорбции на наэлектризованном предмете - полиэтиленовой пластине.
Зародыши разделяли на 3 фракции: мелких (0,71-0,85 мм), средних (0,85-1,00 мм) и легких частиц
(0,85-1,00 мм, но легкие по весу), соответственно, с помощью сита и статического электричества и окончательно сортировали визуально. Фракция мелких частиц проявляла самую высокую активность синтеза
белка. Что касается легких частиц, то они, по-видимому, были слегка повреждены при измельчении и
лопались при флотации. После этого для полного удаления компонентов эндосперма зародыши помещали в марлевый мешочек и промывали холодной бидистиллированной водой с охлаждением, суспендировали в 0,5% растворе неионного детергента NP-40 и промывали несколько раз, обрабатывая их ультразвуком до тех пор, пока не исчезала белая муть. После еще одной промывки с обработкой ультразвуком в
бидистиллированной воде зародыши пшеницы фильтровали под давлением и промывали несколько раз
холодной бидистиллированной водой, получая очищенные зародыши пшеницы.
Экстракты из зародышей пшеницы получали в соответствии с общепринятым методом (Erickson
A.H. et al. (1996) Methods Enzymol., 96, 38-50). Все последующие операции проводили при 4°С. Очищенные зародыши пшеницы замораживали в жидком азоте и измельчали в ступке. К полученному порошку
добавляли экстракционный раствор в соотношении 1 мл/г порошка. Указанный раствор содержал 80 мМ
Hepes-КОН, рН 7,8, 200 мМ ацетата калия, 2 мМ ацетата магния, 4 мМ хлорида кальция, 8 мМ дитиотреитола, 0,6 мМ каждой из 20 L-аминокислот, 1 мкМ FUT, Е-64 и PMSF (ингибиторы протеолитических
ферментов); раствор готовили по методу Patterson et al. с незначительными модификациями: Раствор перемешивали, стараясь избежать образования пены. После центрифугирования 15 мин при 30000*g собирали супернатант в качестве экстракта зародышей и подвергали гель-фильтрации на колонке из Сефадекса G-25 (coarse), предварительно уравновешенного раствором 40 мМ Hepes-КОН, рН 7,8, 100 мМ ацетата
калия, 5 мМ ацетата магния и 4 мМ дитиотреитола. Концентрацию образца доводили до 170-250 единиц
А260 нм (А260/А280 = 1,5).
Степень деаденилирования в полученном препарате всегда составляла не более 1%, при этом во
многих опытах степень деаденилирования составляла 0,01 до 0,3% (степень деаденилирования измеряли
методом элиминации с анилином в кислой среде: Endo Y. et al. (1987) J. Biol. Chem., 262, 5908-5912; Yoshinari S. et al. (1966) Eur. J. Biochem., 242, 585-591). Загрязнение тритином определяли с помощью иммуноблотинга с антителами к тритину, содержание которого было ниже предела обнаружения.
Пример 2. Диализный способ непрерывного бесклеточного синтеза белка с использованием экстрактов из зародышей пшеницы.
Способ непрерывного бесклеточного синтеза белка с использованием экстрактов из зародышей
пшеницы ранее был описан в литературе (Endo Y. et al. (1992) J. Biotech., 25, 221-230). Приготовленную
по методике примера 1 реакционную смесь вносили в диализатор Dispo Dialyzer (Spectra/Por® СЕ, предел исключения 25 кД, объем 0,5 мл) и проводили реакцию при 20°С в диализаторе против 10-кратного
(относительно реакционной смеси) объема диализного раствора (20 мМ Hepes-KOH, pH 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 4 мМ дитиотреитола, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,38 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 L-аминокислот, 0,005% NaN3, 0,05% NP-40, 1 мМ Е64 и 1 мМ PMSF).
В описанных выше условиях проводили испытания непрерывного бесклеточного синтеза белка с
использованием экстрактов из зародышей пшеницы и обнаружили, что могут синтезироваться различные
белки с молекулярным весом от 5000 до 130000, причем эффективность синтеза составила от 0,3 до 1,8
мг/мл объема реакции (табл. 1).
Таблица 1. Синтез и свойства белков, синтезированных в бесклеточной системе из зародышей пшеницы (диализный способ)
(i) DHFR (20 кД)
1,8 мг/мл (активный белок);
(ii) Митохондриальная Met-тРНК-синтетаза
человека (84 кД)
1,3 мг/мл (неактивный белок,
антиген для получения антитела)
(iii) Люцифераза (60 кД)
0,7 мг/мл (активный белок)
(iv) Зеленый флуоресцентный белок (27 кД)
0,4 мг/мл (активный белок)
(v) РНК-геликаза А человека (130 кД)
0,3 мг/мл (неактивный белок,
антиген для получения антитела)
-8-
006162
(vi) Белок-активатор протеасом α, β и γ
(28, 28 и 31 кД, соответственно)
по 0,5 мг/мл (неактивный белок,
антиген для получения антитела)
В приведенных выше примерах определение синтеза белков проводили в соответствии с Endo et al.
Включение 14С-лейцина в белок, разделение синтезированных белков методом электрофореза в SDSполиакриламидном геле и окрашивание Кумасси Brilliant Blue, а также определение профиля полирибосом при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы проводили в соответствии с Endo et al.
(Endo Y. et al. (1992) J. Biotech., 25, 221-230; Endo Y. et al. (1975) Biochim. Biophys. Acta, 383, 305-315).
Пример 3. Получение препарата из экстракта зародышей пшеницы.
Экстракт зародышей пшеницы, полученный согласно примеру 1, замораживали в жидком азоте и
высушивали в стандартной лиофильной сушке (Labconc Freeze Dry System Freezone 4.5) в течение 3 ч.
Полученный порошок хранили в пробирках, запаянных либо под вакуумом, либо в атмосфере азота.
Пример 4. Определение активности препаратов, содержащих экстракты из зародышей пшеницы.
Лиофилизированный препарат согласно изобретению, содержащий экстракт из зародышей пшеницы, хранили при -80°С в течение 2 месяцев. Параллельно нелиофилизированные замороженные экстракты из зародышей пшеницы хранили в жидком азоте (-196°С) также в течение 2 месяцев. Эти экстракты
сравнивали между собой по активности синтеза белка.
К каждому экстракту из зародышей пшеницы добавляли раствор, содержащий 30 мМ Hepes-KOH,
pH 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 2,85 мМ дитио-треитола, 0,5 мг/мл креатинкиназы,
1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,380 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 Lаминокислот, в соответствии с методом Erickson et al., затем 1000 единиц/мл ингибитора рибонуклеаз
Rnasin и NP-40 (конечная концентрация 0,05%), после чего добавляли САР-содержащую мРНК дигидрофолат-редуктазы (80 мкг/мл смеси), полученную методом, описанным ранее авторами насто-ящего изобретения (Endo Y. et al. (1992) J. Biotech., 25, 221-230), а также 50 µCi (на 1 мл объема реакции) [U-14C]лейцина (166 mCi/ммоль). Активность синтеза белка измеряли по включению [U-14 С]-лейцина. Реакцию
проводили при температуре от 20 до 30°С.
Как показано на фиг. 1, даже после хранения при температуре -80°С в течение 2 месяцев лиофилизованный препарат (■-■), содержащий экстракты из зародышей пшеницы, сохранял активность синтеза
белка, эквивалентную активности экстрактов при стандартном хранении в жидком азоте (□-□). Изучение
влияния температуры хранения лиофилизированных экстрактов на активность синтеза белка показало,
что при хранении в течение 1 месяца наибольшую активность сохранили экстракты, хранившиеся при
-80°С (•-•), однако и экстракты, хранившиеся при 4°С (■-■) или при комнатной температуре (□-□) сохранили значительную активность (фиг. 2).
Полученные результаты означают, что способ настоящего изобретения обеспечивает возможность
хранения и транспортировки клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка с сохранением их
высокой активности при температуре от -80°С до комнатной температуры, что превышает общепринятые
температуры хранения.
Пример 5. Получение препарата для бесклеточного синтеза белка, содержащего экстракты из зародышей пшеницы.
Реакционная смесь содержала по объему от 20 до 60% экстракта из зародышей пшеницы, полученного согласно примеру 1, в который добавляли 30 мМ Hepes-KOH, рН 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ
ацетата магния, 2,85 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл креатинкиназы, 1,2 мМАТФ, 0,25 мМГТФ, 16 мМ
креатинфосфата, 0,380 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 L-аминокислот, в соответствии с методом
Erickson et al., после чего смесь замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в стандартной лиофильной сушке. Полученный порошок хранили в пробирках, запаянных под вакуумом или в атмосфере
азота, чтобы его компоненты не подвергались химическим реакциям.
Пример 6. Определение активности синтеза белка.
Активность препарата для бесклеточного синтеза белка, содержащего экстракты из зародышей
пшеницы, полученного согласно примеру 5, хранившегося при -80°С в течение 2 месяцев, сравнивали с
активностью экстракта для бесклеточного синтеза белка, полученного стандартным способом и хранившегося в жидком азоте (-196°С) тот же срок. Для определения активности к экстрактам добавляли вещества из состава, полученного в соответствии с методом Erickson et al., как указано в примере 5. После
добавления 1000 единиц/мл ингибитора рибонуклеаз (RNasin) и NP-40 (конечная концентрация 0,05%)
определяли активность синтеза белка согласно примеру 4. Как следует из фиг. 3, препарат для бесклеточного синтеза белка по настоящему изобретению (□-□), содержащий лиофилизованные экстракты из
зародышей пшеницы, сохранял активность синтеза белка, эквивалентную активности препарата, полученного стандартным способом и хранившемуся в жидком азоте (■-■).
Это означает, что способ настоящего изобретения обеспечивает возможность хранения и транспортировки препарата, содержащего клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, при сохранении
его высокой активности при температурах от -80°С до комнатной температуры, что значительно превышает стандартные температуры хранения, а также упрощает проведение бесклеточного синтеза белка.
-9-
006162
Пример 7. Непрерывный бесклеточный синтез белка с помощью гель-фильтрации на колонке в качестве реактора: ручной метод с открытой колонкой.
После набухания носитель для гель-фильтрации - Sephadex G-25 (fine) фирмы Pharmacia AB уравновешивали раствором, содержащим 20 мМ Hepes-KOH, pH 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата
магния, 4 мМ дитиотреитола, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,38 мМ спермидина,
0,3 мМ каждой из 20 L-аминокислот, 0,005% NaN3, 0,05% NP-40, 1 мМ Е-64 и 1 мМ PMSF, и заполняли
им колонку (внутренний диаметр 10 мм, длина 100 мм).
На колонку наносили 0,1 мл раствора для бесклеточного синтеза белка, приготовленного согласно
примеру 1 (содержащего в качестве матрицы для трансляции 80 мкг 5'-САР-содержащей мРНК дигидрофолатредуктазы в 1 мл смеси), и инкубировали 1 ч при 23°С, после чего с помощью перистальтического
насоса добавляли необходимые для синтеза компоненты - аминокислоты со скоростью 0,5 мл/ч. Через 12
ч отбирали пробы объемом 1 мкл и анализировали электрофорезом в 12,5%-ном полиакриламидном геле
с SDS, белки окрашивали Кумасси Brilliant Blue и определяли количество синтезированного белка с помощью денситометра (Endo Y. et al. (1992) J. Biotech., 25, 221-230; Endo Y. et al. (1975) Biochim. Biophys.
Acta, 383, 305-315).
Полученные результаты показаны на фиг. 4А. На дорожке 1 показаны результаты в отсутствие матрицы, а на дорожке 3 показаны результаты синтеза колоночным способом за 12 ч. Слева нанесены маркеры в 94 кД, 67 кД, 43 кД, 30 кД и 20,1 кД, соответственно. Стрелкой отмечено положение синтезированной дигидрофолатредуктазы.
Пример 8. Непрерывный бесклеточный синтез белка с использованием колонки для гельфильтрации в качестве реакционной емкости: устройство на основе жидкого хроматографа.
Состав реакционной смеси, проведение реакции и анализа проводили согласно примеру 1, за исключением того, что использовали колонку HR 10/30 (внутренний диаметр 10 мм, длина 300 мм), заполненную Sephadex G-25 (fine) фирмы Pharmacia AB в качестве носителя, и жидкостный хроматограф
SMART® System фирмы Pharmacia Biotech, а объем реакции составлял 0,3 мл. Полученные результаты
представлены на дорожке 2 фиг. 4В.
Сравнение проводили с диализной модификацией непрерывного бесклеточного синтеза белка с использованием экстрактов из зародышей (сравнительный пример) пшеницы диализным методом. Реакционную смесь для бесклеточного синтеза белка, приготовленную согласно примеру 1, вносили в диализатор Dispo Dialyzer (Spectra/Рог® СЕ, предел исключения 25 кД, объем 0,5 мл) и проводили реакцию при
23-30°С в течение 12 ч в диализаторе против 10-кратного (относительно реакционной смеси) объема
диализного раствора, содержащего 20 мМ Hepes-KOH, pH 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата
магния, 4 мМ дитиотреитола, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,38 мМ спермидина,
0,3 мМ каждой из 20 L-аминокислот, 0,005% NaN3, 0,05% NP-40, 1 мМ Е-64 и 1 мМ PMSF. Полученные
результаты представлены на дорожке 2 фиг. 4А и на дорожке 1 фиг. 4В.
Экспериментальные результаты, полученные с использованием дигидрофолатредуктазы в качестве
модели (фиг. 4), показывают выход целевого белка в колоночном способе (0,25 мг/мл объема реакции),
как в ручной модификации с открытой колонкой, так и в модификации с жидкостным хроматографом,
близок к выходу, полученному диализным способом. Увеличение размера колонки позволяет получать
больший выход белка.
Пример 9. Повышение эффективности синтеза путем увеличения времени реакции и дополнительного внесения мРНК и креатинкиназы.
Реакцию синтеза проводили в течение 24 ч с использованием в качестве модели мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу. Реакционная смесь в соответствии с методом Erickson et al., содержала 48%
объем. экстракта из зародышей пшеницы, полученного согласно примеру 1, и 1000 единиц/мл ингибитора рибонуклеаз (RNasin), 30 мМ Hepes-KOH, pH 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 2,85
мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл креатинкиназы, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,38
мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 L-аминокислот, 0,05% NP-40, а также САР-содержащую мРНК (80
мкг/мл смеси), кодирующую дигидрофолатредуктазу и полученную согласно методу Endo Y. et al. (1992)
J. Biotech., 25,221-230.
Реакцию проводили при 23°С в диализной системе против 20-кратного объема диализной жидкости, содержащей 20 мМ Hepes-KOH, pH 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 4 мМ дитиотреитола, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатин-фосфата, 0,38 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20
L-аминокислот, 0,005% NaN3, 0,05% NP-40, 1 мМ Е-64 и 1 мМ PMSF.
Через 12 ч после начала реакции добавляли 20 мкг САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, и 200 мкг креатинкиназы (на 1 мл объема реакции). В качестве контроля добавляли либо
только 20 мкг САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, либо только 200 мкг креатинкиназы (на 1 мл объема реакции). В качестве сравнительного контроля реакцию проводили без добавления этих компонентов. Эти операции проводили вручную, а наружную диализную жидкость не меняли. Количество синтезированного белка определяли методом электрофореза полученного белка в SDSполиакриламидном геле путем окрашивания его Кумасси Brilliant Blue, измерения интенсивности окрашенной зоны и сравнения со стандартным препаратом (Endo Y. et al. (1992) J. Biotech., 25, 221-230; Endo
- 10 -
006162
Y. et al. (1975) Biochim. Biophys. Acta, 383, 305-315).
Результаты, приведенные на фиг. 7, показывают, что при дополнительном внесении мРНК и креатинкиназы (о-о) через 12 ч после начала реакции реакция протекала практически линейно. В случае дополнительного внесения одной мРНК (∆−∆) или одной креатинкиназы
реакция останавливалась,
как и без
дополнительного внесения мРНК и креатинкиназы (□-□). Полученные результаты подтверждают,
что прекращение синтеза белка вызвано падением матричной активности мРНК и истощением источников энергии вследствие снижения активности креатинкиназы, и показывает решения возможных способов этих проблем.
Пример 10. Повышение эффективности синтеза путем увеличения времени реакции с периодической заменой диализной жидкости.
Реакцию синтеза белка проводили в течение 60 ч, используя в качестве модели мРНК, кодирующую
дигидрофолатредуктазу и те же условия синтеза (состав реакционной смеси, температура и т.д.), что в
примере 9 с заменой наружной диализной жидкости через 24 и 45 ч, соответственно, после начала реакции. В качестве сравнительного контроля проводили синтез белка без замены наружной диализной жидкости. В каждой из этих систем дополнительно добавляли 20 мкг САР-содержащей мРНК, кодирующей
дигидрофолатредуктазу, и 200 мкг креатинкиназы (на 1 мл объема реакции). Количество синтезированного белка определяли как в примере 9.
Результаты, приведенные на фиг. 8, показывают, что в модификации без замены наружной диализной жидкости (∆−∆) синтез протекал практически линейно вплоть до 24 ч. Однако примерно через 30 ч
скорость реакции заметно снижалась. Тем не менее, замена наружной диализной жидкости (о-о) через
каждые 24 ч (показано стрелками) позволила продлить синтез белка почти до 60 ч. Полученные результаты подтверждают, что прекращение синтеза белка вызывается истощением исходных материалов, необходимых для синтеза белка, и накоплением побочных продуктов, и показывает возможный способ решения этих проблем.
Пример 11. Увеличение времени реакции и повышение эффективности синтеза путем автоматического добавления мРНК и креатинкиназы и автоматической замены диализной жидкости с помощью автоматической установки для непрерывного бесклеточного синтеза белка.
Синтез белка проводили в течение 60 ч, используя в качестве модели мРНК, кодирующую дигидрофолатредуктазу, и те же условия синтеза (состав реакционной смеси, температура и т.д.), что в примере 9, с использованием автоматического устройства для непрерывного бесклеточного синтеза белка. Через каждые 12 ч после начала реакции добавляли 20 мкг САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, и 200 мкг креатинкиназы (на 1 мл объема реакции) аликвотами по 5 мкл, которые хранили при 4°С, и продолжали реакцию. Наружную диализную жидкость подавали в отсек непрерывно (0,3
мл/ч) из сосуда, находившегося при 4°С, и отводили из отсека с такой же скоростью. Пробы отбирали в 1
мкл из объема, эквивалентного 0,5 мл исходной реакционной смеси, разделяли электрофорезом в SDSполиакриламидном геле и окрашивали Кумасси Blue (фиг. 9А). В качестве сравнительного контроля
проводили синтез белка в условиях, описанных выше, но с дополнительным добавлением только креатинкиназы без добавления САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу (фиг. 9В).
Кроме того, к пробе объемом 1 мкл, взятой через 0 ч после начала реакции, добавляли 1 мкг стандартного препарата дигидрофолатредуктазы и проводили электрофорез и окрашивание, как описано выше (правая дорожка на фиг. 9А). Количество синтезированного белка определяли как описано в примере 9 (фиг.
9С).
Как показывают результаты, приведенные на фиг. 9, при внесении одной креатинкиназы без добавления САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу (∆−∆), реакция прекращалась примерно через 15 ч. Подобное прекращение реакции наблюдалось (не показано) и при внесении одной
САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, без добавления креатинкиназы. С другой
стороны, при автоматическом добавлении САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, вместе с креатинкиназой через каждые 12 ч и автоматической замене наружной диализной жидкости
через каждые 24 ч (о-о) наблюдался эффективный бесклеточный синтез белка. Полученные результаты
подтверждают, что устройство настоящего изобретения работает эффективно.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Препарат для бесклеточного синтеза белка, содержащий клеточный экстракт, полученный из зародышей растений, отличающийся тем, что из зародышей полностью удален загрязняющий их эндосперм путем промывки зародышей неионным детергентом.
2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что зародыши являются зародышами пшеницы, ячменя, риса, ржи, кукурузы, гречихи или шпината.
3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что неионный детергент представляет собой производные
полиоксиэтилена.
- 11 -
006162
4. Препарат по п.3, отличающийся тем, что производные полиоксиэтилена выбирают из Brij, Triton,
Tween и/или Nonidet P-40.
5. Препарат по п.4, отличающийся тем, что производное полиоксиэтилена представляет собой
Nonidet P-40.
6. Препарат по п.1, отличающийся тем, что промывку неионным детергентом проводят в сочетании
с обработкой ультразвуком.
7. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он изготовлен в высушенной форме.
8. Препарат по п.7, отличающийся тем, что он изготовлен в лиофилизированной форме.
9. Препарат по п.7, характеризующийся тем, что он стабилен при комнатной температуре.
10. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что из него полностью удалена система ингибирования реакций синтеза эндогенного белка.
11. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что степень деаденилирования рибосом составляет
менее 7%, предпочтительно менее 1%.
12. Препарат для бесклеточного синтеза белка, содержащий клеточный экстракт, полученный из зародышей пшеницы, из которых полностью удален загрязняющий их эндосперм путем промывки зародышей пшеницы неионным детергентом до исчезновения мутности промывочного буфера, степень деаденилирования рибосом которого составляет менее 1%, стабильный при хранении в сухом виде при комнатной температуре, обеспечивающей непрерывный бесклеточный синтез белка в бесклеточный белоксинтезирующей системе при восполнении субстрата и других реагентов с постоянным выходом не менее
1 мг/мл за 24 ч в течение не менее 24 ч.
13. Способ осуществления синтеза белка в бесклеточной белок-синтезирующей системе с использованием препарата по любому из пп.1-12, характеризующийся тем, что указанная система включает реакционную камеру, содержащую носитель, обладающий свойствами молекулярного сита, а реакция бесклеточного синтеза белка протекает во время прохождения исходных веществ через носитель в качестве
подвижной фазы.
14. Способ осуществления синтеза белка в бесклеточной белок-синтезирующей системе с использованием препарата по любому из пп.1-12, характеризующийся тем, что указанная система включает реакционную камеру, обеспечивающую возможность проведения диализа, а исходные вещества и продукт
реакции бесклеточного синтеза белка разделяются диализной мембраной.
15. Способ по п.13 или 14, отличающийся тем, что синтез осуществляется непрерывно, а указанная
система обеспечивает добавление, хранение, замену и/или удаление таких компонентов, как мРНК, фермент системы регенерации энергии, субстрат и источник энергии.
16. Устройство для осуществления непрерывного бесклеточного синтеза белка согласно способу по
п.15, включающее реакционную камеру с крышкой, герметически ее закрывающей, в которой имеется
первый канал с входным отверстием, служащим для введения в систему субстрата и/или источника энергии, и выходным отверстием, ведущим в отсек для наружного диализного раствора; второй канал с входным отверстием в отсеке для наружного диализного раствора, служащим для отвода метаболитов в наружном диализном растворе, и выходным отверстием, ведущим из системы наружу; а также входное отверстие, служащее для введения мРНК и/или фермента системы регенерации энергии; и средство, обладающее свойствами диализной мембраны, находящееся в отсеке для наружного диализного раствора.
Фиг. 1
- 12 -
006162
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
- 13 -
006162
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
- 14 -
006162
Фиг. 8
Фиг. 9
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 15 -