колориметрическая детекция точечных мутаций при

КОЛОРИМЕТРИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ
ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИИ
ФРАГМЕНТА АНАЛИЗИРУЕМОЙ ДНК
С ПРОДУКТОМ ЛИГИРОВАНИЯ НА НЕМ
ТАНДЕМА КОРОТКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
М.P.Кабилов1, Г.М.Дымшиц1, Д.В.Пышный2, Е.М.Иванова2,
В.Ф.Зарытова2, Н.М.Гашникова3, А.Г.Покровский3
1
Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, Новосибирск, просп. ак. Лаврентьева, 10
Лаборатория структуры генома, Института цитологии и генетики СО РАН
тел.: (3832) 33–23–27, факс: (3832) 33–12–78
еmail: dimshits@niboch.nsc.ru
2
Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН
3
ГНЦ ВБ «Вектор»
В настоящее время в практике детекции мутаций при наследственных заболеваниях используется ряд подходов, которые позволяют выявлять мутации на продуктах ПЦР геномной ДНК. Одним из подходов к выявлению точечных мутаций является метод, в основе которого лежит ферментативное лигирование на ДНКматрице олигонуклеотидных зондов, комплементарных последовательности анализируемой ДНК в области предполагаемой нуклеотидной замены. Лигирование «мини-зондов» – трех коротких олигонуклеотидов: окта-, тетра- и октамеров – позволяет
с высокой достоверностью определять однобуквенные замены в сайте связывания
центрального тетрамера [1].
Нами предложен новый метод колориметрической детекции точечных мутаций, основанный на лигировании трех коротких олигонуклеотидов (трехкомпонентного тандема), один из которых несет остаток биотина, и детекции с помощью биотин-стрептавидиновой системы продукта лигирования, гибридизующегося с анализируемой ДНК-матрицей, иммобилизуемой на капроне УФ-облучением.
Исследование проводили, используя в качестве анализируемой ДНК продукт
ПЦР (135 bp) ДНК ВИЧ I.
В результате лигирования тандема pN8+pN4+pN’8Bio на матрице анализируемой ДНК происходит образование биотинсодержащего двадцатизвенного продукта
pN20Bio, который может быть выявлен колориметрически за счет связывания остатка биотина с конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза, инициирующим цветную реакцию. Для разделения биотинилированных олигонуклеотидов – 20-звенного
продукта лигирования pN20Bio и компонента тандема – октануклеотида pN’8Bio – был
использован метод иммобилизации протяженных молекул ДНК на капроне при УФоблучении. Мы предположили, что при облучении нанесенной на капрон реакционной смеси после лигирования из-за разницы в молекулярных весах в основном
должна происходить иммобилизация анализируемой ДНК [2]. Длинная матрица, в
свою очередь, должна удерживать на мембране 20-звенный продукт pN20Bio за счет
прочного комплексообразования, в то время как октамер pN’8Bio, образующий существенно менее стабильный комплекс, будет легко удаляться во время отмывок.
Первоначально была проверена возможность однозначного специфического
выявления продукта лигирования тандема трех коротких олигонуклеотидов
(pN8+pN4+pN8Bio) на ДНК-матрице. Выявление продукта лигирования проводили по
следующей схеме. Тандем олигонуклеотидов и ДНК матрицу – продукт ПЦР – нагревали до 100°С для денатурации двуцепочечной структуры и резко охлаждали при
0оС. При этом часть молекул одноцепочечной ДНК оказываются связанными в комплементарном комплексе с тандемом. После лигирования олигонуклеотидов с помощью ДНК-лигазы фага Т4 реакционную смесь наносили на капроновую мембрану
и иммобилизовали УФ-светом. Капрон промывали буфером, содержащим детергент,
инкубировали с конъюгатом «стрептавидин-щелочная фосфатаза», а затем с субстратами, образущими в результате реакции нерастворимый темно-синий осадок.
Изменение окраски точек нанесения на мембране при проявлении продукта лигирования с помощью субстратов регистрировали сканированием (Microtek), данные обрабатывали с помощью программы «Gel-Pro», определяя интенсивность оптической
плотности.
Из данных, представленных на рисунке 1, видно, что после «проявления» в
точке нанесения реакционной смеси, содержащей 20-звенный продукт pN20Bio, происходит интенсивное окрашивание (точка 1). В то же время в контрольной точке 2, в
которой была нанесена та же смесь, но без этапа лигирования, развитие окраски
практически не происходит. Это свидетельствует о том, что октамер, содержащий
биотин, в результате отмывок не удерживается на мембране.
фрагмент ДНК
5'
3'
GCATCAAGCAGCTCCAGGCA
CGTAGTTCGTCGAGGTCCGT
денатурация
охлаждение
+ pN8+pN4+pN8'Bio
pN4
T4 ДНК-лигаза
сигнальный продукт
лигирования pN20Bio
3'
3'
pN8
pCAGC
pN'8Bio
pTCCAGGCApBio
pGCATCAAG
CGTAGTTCGTCGAGGTCCGT
pGCATCAAGCAGCTCCAGGCApBio
CGTAGTTCGTCGAGGTCCGT
УФ-иммобилизация
3'
pGCATCAAGCAGCTCCAGGCApBio
CGTAGTTCGTCGAGGTCCGT
хромогенные
субстраты
+
Е
BCIP
NBT
конъюгат
стрептавидинщелочная фосфатаза
3'
окрашивание
капрона
Е
pGCATCAAGCAGCTCCAGGCApBio
CGTAGTTCGTCGAGGTCCGT
Изменение условий промывки мембраны: повышение температуры, способствующее разрушению комплементарного комплекса иммобилизованной ДНК и 20звенного продукта лигирования, – приводит к резкому падению интенсивности окраски при проявлении (точка 5). Отсутствие окраски на мембране наблюдается и при
лигировании тандема на олигонуклеотиде М(20-мер) (точка 3).
1
3
2
4
5
Рис. 1. Сканированное изображение капрона после «проявления» соиммобилизованного с ДНК-матрицей продукта лигирования:
1 – pN8+pN4+pN’8Bio + ДНК (135 bp) + Т4 ДНК-лигаза;
2 – pN8+pN4+ pN’8Bio + ДНК (135 bp);
3 – pN8+pN4+pN’8Bio + M (20-мер) + Т4 ДНК-лигаза;
4 – pN8+pN4+pN’8Bio +M (20-мер);
5 – pN8+pN4+pN’8Bio + ДНК (135 bp) + Т4 ДНК-лигаза (капрон
отмыт при 80°С после иммобилизации ДНК-матрицы).
-5
M,
Условия лигирования: 45 мин, 25°С, [pN8]=[pN4]=10
-7
[pN’8Bio]=[ДНК-матрица]=10 М; 0,1 M NaCl, 0,01 M дитиотреит,
0,01 M MgCl2, 0,02 M трис-HCl (рН 7,5), 0,001 M ATP.
Эти данные свидетельствуют о том, в условиях УФ-облучения лигируемый октамер pN’8Bio и 20-звенный продукт лигирования pN20Bio, в отличие от протяженной
ДНК-матрицы, не иммобилизуются на капроне, и проявление продукта лигирования
происходит специфично вследствие избирательного удерживания его на капроне за
счет комплексообразования с ДНК-матрицей.
Поскольку эффективность иммобилизации возрастает с повышением дозы УФ,
увеличение времени облучения может приводить к повышению количества соиммобилизованного на капроне детектируемого продукта pN20Bio, что должно приводить к повышению скорости проявления и интенсивности окрашивания мембраны
в точке нанесения лигированной смеси. Поэтому на следующем этапе работы мы
определили оптимальное время облучения для выявления специфического продукта лигирования на фрагменте ДНК ВИЧ I.
Как видно из рисунка 2, с увеличением времени облучения до 2 минут интенсивность окраски существенно возрастает только в точках нанесения лигируемых
смесей, т.е. содержащих продукт pN20Bio. В контрольных экспериментах без проведения этапа лигирования изменения интенсивности пятен практически не происходит. В дальнейших экспериментах использовали 2 минутное облучение, при котором наблюдается оптимальное соотношение специфического и неспецифического
сигналов.
1
2
10
30
45
интенсивность окрашивания (%IOD)
100
ДНК-фрагмент
80
N20-матрица
60
40
120
20
300
0
5
10
30
45
120
300 сек
Рис. 2. Интенсивность окрашивания после «проявления» смесей, иммобилизованных на
капроне УФ-облучением в течение 10, 30, 45, 120 и 300 сек, содержащих продукт
лигирования и непрошедших этап лигирования (условия лигирования см. рис. 1):
1 – pN8+pN4+pN8Bio + ДНК-фрагмент (135 bp) +T4 ДНК-лигаза;
2 – pN8+pN4+pN8Bio + ДНК-фрагмент (135 bp).
Возможность выявления точечных мутаций в геномных ДНК проводили на модельных системах, вводя все возможные однонуклеотидные замены в последовательность тетрамера. Матрицей во всех случаях выступал фрагмент (135 bp) ДНК
ВИЧ I. Было проведено лигирование 13 систем, 12 из которых содержали мисматчи
в комплексах тетрамеров и ДНК-матрицы. Как видно из рисунка 3, интенсивная окраска наблюдается только в случае использования тетрануклеотида pCAGC, полностью комплементарного анализируемому ДНК-фрагменту. При использовании тетрамеров с однобуквенной заменой интенсивность окрашивания хотя и зависит от
типа мисматча, однако во всех случаях во много раз слабее, чем в совершенном
комплексе.
N
(pCAGC)
1A
1G
1T
2G
2C
2T
3A
3C
3T
4A
4G
4T
pXAGC
pCXGC
pCAXC
pCAGX
ДНК-фрагмент
CGTAGTTCGTCGAGGTCCGT
pTCCAGGCA-bio
pGCATCAAG
pCAGC pN4(N)
pXAGC pN4(X1), X=A,G,T
pCXGC pN4(X2), X=G,C,T
pCAXC pN4(X3), X=A,C,T
pCAGX pN4(X4), X=A,G,T
Рис. 3. Сканированное изображение капрона после проявления продуктов лигирования,
гибридизующихся с ДНК-матрицей, иммобилизуемой УФ-облучением.
Таким образом, предлагаемый метод позволяет тестировать однобуквенные
несоответствия между последовательностью тетрамера и сайтом его связывания на
анализируемой ДНК, а также однозначно определить, в каком месте сайта связывания тетрамера имеется мутация и какая именно замена произошла.
Разработанный подход был использован для различения двух штаммов ВИЧ
при использовании их ПЦР продуктов. Один из этих фрагментов ДНК (135 bp) –
штамм mn – был использован в предыдущих экспериментах. Последовательность
штамма rf (180 bp) отличается от первого одним нуклеотидным звеном (C→A). При
этом следует отметить, что замена находится в сайте связывания октамерного компонента тандема pN8 в точке лигирования. Из рисунка 4 видно, что типы штаммов
даже в этом случае легко различаются по интенсивности окрашивания после проявления. Следовательно, использование разработанного нами подхода позволяет выявлять мутации в сайте связывания не только тетрануклеотида, но и октамера, когда замена обуславливает наличие мисматча на стыке лигируемых олигонуклеотидов.
Таким образом, в работе предложен колориметрический метод достоверной
детекции точечных мутаций в ДНК, основанный на лигировании на ней тандема трех
коротких олигонуклеотидов, один из которых содержит остаток биотина, и последующей иммобилизации на подложке анализируемой ДНК с комплементарным продуктом лигирования.
ДНК-фрагмент штамма mn
C
G
Bio
pN4
ДНК-фрагмент штамма rf
A
G
Bio
pN4
Рис. 4. Сканированное избраже-ние капрона после проявления продуктов лигирования тандема pN8+pN4+pN8’Bio в присутствии ДНК-фрагментов штаммов mn и rf ВИЧ I.
Список литературы
1. Пышный Д.В., Кривенко А.А., Лохов С.Г. и др. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами VI. Дискриминация комплексов, содержащих мисматч, при лигировании тандема коротких олигонуклеотидов
на ДНК-матрице // Биоорган. химия. 1998. Т. 24. С. 32–37.
2. Калачиков С.М., Адаричев В.А., Дымшиц Г.М. Иммобилизация ДНК на микропористых мембранах с помощью УФ-облучения // Биоорган. химия. 1992. Т. 18. С. 52–62.