Набор для выявления ДНК свинины и курицы

Набор для
выявления ДНК
свинины и курицы
(Вир-19-50, на 50 реакций)
Содержание
Компоненты набора .................................................. 3
Область применения ................................................. 3
Гарантия ..................................................................... 3
Описание .................................................................... 4
Меры предосторожности ......................................... 4
Необходимое оборудование .................................... 4
Важные замечания .................................................... 5
Выделение ДНК ........................................................ 5
Необходимые контрольные образцы ...................... 6
Этап I. Постановка ПЦР ........................................... 7
Этап II. Анализ результатов ..................................... 9
Проблемы и рекомендации..................................... 10
Хранение и стабильность ....................................... 11
Служба технической поддержки ........................... 11
Информация для заказов......................................... 11
2
Компоненты набора
Компоненты
ПЦР Микс
H-Taq полимераза
Внутренний контрольный образец (ВК)
Контрольный образец (К+)
Вода
количество
750 мкл
27 мкл
500 мкл
75 мкл
2 мл
Область применения
Набор предназначен для выявления ДНК свинины и
курицы с помощью анализа ПЦР в реальном времени.
Чувствительность набора до 10 копий на микропробирку
(10 мкл пробы). Набор рассчитан на проведение 50
реакций, включая контроли.
Гарантия
Фрактал Био гарантирует изготовление всех продуктов
согласно описанию в руководстве. Покупатель должен
определить соответствие продукта для конкретного его
использования. Если продукт не дает заявленного
результата по любой причине, за исключением
неправильного использования, мы бесплатно произведем
замену продукта или вернем покупателю его полную
стоимость. Мы сохраняем за собой право изменять или
модифицировать любой продукт в целях улучшения его
качеств и дизайна. Если у Вас возникли вопросы по
применению продукта или оценке результата, вы можете
3
обращаться в Службу технической поддержки (см. на
обороте).
Описание
Процедура анализа состоит из двух этапов: 1) проведение
ПЦР с флуоресцентной детекцией в реальном времени, 2)
анализ результатов.
Для детекции и анализа результатов используются три
канала, имеющиеся практически во всех амплификаторах
для ПЦР в реальном времени:
1) Канал ROX (аналог – Texas red): макс. поглощения
585 нм, макс. флуоресценции 630 нм; детекция ДНК
свинины;
2) Канал R6G (аналоги - Joe, Vic, Tet, Hex): макс.
поглощения 530 нм, макс. флуоресценции 570 нм;
детекция ДНК курицы;
3) Канал FAM (аналог - Sybr Green): макс.
поглощения 495 нм, макс. флуоресценции 520 нм;
детекция внутреннего контроля.
Меры предосторожности
При приготовлении смесей используйте индивидуальные
средства защиты. Компоненты набора не обладают
токсическими и другими свойствами, за счѐт которых
возможно негативное воздействие на человека.
Необходимое оборудование
Термостат
Амплификатор для ПЦР в реальном времени
Микроцентрифуга
4
Ламинарный и ПЦР-бокс
Набор дозаторов
Одноразовые наконечники с фильтрами для дозаторов
Одноразовые
полипропиленовые
микропробирки
объѐмом 0,2 (0,5) мл
Штативы для наконечников и микропробирок
Халат и одноразовые перчатки
Важные замечания
При работе с ДНК необходимо использовать только
одноразовые пластиковые расходные материалы,
имеющие специальную маркировку “DNase-free”.
Для приготовления смесей и добавления нуклеиновых
кислот используйте только наконечники с фильтрами.
Работать только в одноразовых перчатках.
Всѐ лабораторное оборудование, в том числе дозаторы,
лабораторная посуда, а также все рабочие растворы,
должны быть строго стационарным.
Приготовление реакционных смесей для ПЦР
необходимо проводить в ПЦР-боксе.
Перед постановкой ПЦР убедитесь, что совместно с
выделением ДНК из исследуемых проб было
проведено выделение ДНК из положительного образца
К+.
Выделение ДНК
Выделение ДНК из образцов может проводиться
различными методами, например, с помощью наборов на
5
основе
силики,
наборов
с
микроцентрифужными
колонками, наборов на основе фенол-хлороформной
экстракции и т.п.
Начиная с этапа выделения ДНК необходимо проводить
положительный контроль – выделение ДНК из
положительного образца К+. Для этого в микропробирку с
К+ добавьте 1 мл воды и тщательно перемешайте на
вортексе. Проводите выделение ДНК из К+ совместно с
выделением ДНК из исследуемых проб в соответствии с
используемым протоколом. При постановке ПЦР,
используйте продукт выделения ДНК из К+ как
положительный контроль.
Необходимые контрольные образцы
Этап выделения ДНК
Отрицательный контрольный образец (выделение
ДНК из воды)
Положительный контрольный образец (выделение
ДНК из К+, входит в состав набора)
Этап постановки ПЦР:
Отрицательный контрольный образец (вода или
продукт выделения ДНК из воды)
Положительный контрольный образец (продукт
выделения ДНК из К+)
Положительный контрольный образец всегда добавляйте
последним, после закрытия пробирок с пробами.
6
Этап I. Постановка ПЦР.
1.
Смешайте компоненты, входящие в набор, в
указанных ниже пропорциях:
Компонент
ПЦР Микс
H-Taq
полимераза
На 1
реакцию
(мкл)
14,5
0,5
На 5
реакций
(мкл)
72,5
2,5
На N реакций
14,5х(N+1) мкл
0,5х(N+1) мкл
Важно! ПЦР смесь на несколько реакций (более пяти)
готовится на одну реакцию больше, чем нужно, чтобы
избежать недостатка смеси из-за погрешности пипеток и
потерь на наконечниках.
H-Taq полимеразу следует убрать на -20 °С сразу после
использования.
2.
Перемешайте подготовленную смесь на вортексе и
осадите капли кратковременным центрифугированием (2-3
сек).
3.
После приготовления смеси перенесите по 15 мкл в
каждую пробирку для ПЦР.
4.
Внесите в первую пробирку с ПЦР смесью 10 мкл
отрицательного контрольного образца (К-).
5.
В пробу выделенной ДНК добавьте ВК в объѐме
0.05хVпробы (т.е. на 100 мкл пробы – 5 мкл ВК). Если вы не
израсходуете всю пробу ДНК, то при последующих
постановках ПЦР повторно ВК добавлять не надо.
7
Важно! Перед использованием внутренний контроль
необходимо ресуспендировать на вортексе.
6.
Внесите по 10 мкл каждого образца ДНК с ВК в
остальные пробирки с ПЦР смесью, кроме одной. Закройте
крышки пробирок.
7.
В последнюю пробирку добавьте 10 мкл
положительного контрольного образца (продукт выделения
ДНК из К+).
Важно! Пробирку с положительным контрольным
образцом, открывайте только после раскапывания и
закрытия крышек пробирок всех исследуемых проб.
8.
Поместите пробирки в амплификатор и запустите
программу амплификации:
95°С - 10 минут
45 циклов 60°С - 30 секунд
95°С - 20 секунд
Для приборов компаний “BioRad” и “Corbett Research”
(Rotor Gene) съѐмку следует установить на этапе 60 °С – 30
секунд.
Для приборов компании “BioRad” установить значение
пороговой линии (Threshold) 100.
Для приборов компании “Corbett Research” установить
значение пороговой линии (Threshold) 0,1 и значение NTS
threshold – 10%.
8
Этап II. Анализ результатов.
По каналу ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий
о накоплении продукта амплификации ДНК свинины.
По каналу R6G регистрируется сигнал, свидетельствующий
о накоплении продукта амплификации ДНК курицы.
По каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий
о накоплении продукта амплификации внутреннего
контроля.
Проверьте значения пороговых циклов (Ct) контрольных
образцов:
1) Сt для отрицательного контроля (К-) по всем
каналам должно быть >45.
2) Сt для положительного контрольного образца (К+)
по каналам ROX и R6G должно быть < 30
При соответствии всех значений контрольных образцов,
определите Сt исследуемых проб.
Если хоть одно значение контрольных образцов не
выполняется, обратитесь к разделу Проблемы и
рекомендации.
ДНК свинины обнаружена, если для данной пробы по
каналу ROX определено значение порогового цикла Сt <
30. Значение по каналу FAM в этом случае не учитывается.
ДНК свинины не обнаружена, если для данной пробы по
каналу ROX не определено значение порогового цикла (Сt
>45), но по каналу FAM для данной пробы есть значение
порогового цикла (Сt < 40).
ДНК курицы обнаружена, если для данной пробы по
каналу R6G определено значение порогового цикла Сt < 30.
Значение по каналу FAM в этом случае не учитывается.
9
ДНК курицы не обнаружена, если для данной пробы по
каналу R6G не определено значение порогового цикла (Сt
>45), но по каналу FAM для данной пробы есть значение
порогового цикла (Сt < 40).
Внимание: Сt в районе 36-40 циклов является
пограничным по чувствительности. В этом случае
рекомендуется повторить анализ с этапа выделения ДНК,
взяв в несколько раз больше материала.
Проблемы и рекомендации
Сt для
положительного
контрольного
образца не
определено (Сt >45).
Сt для проб меньше
17
Убедитесь, что не вышел срок
годности.
Обратитесь
к
производителю
Сt для
отрицательного
контрольного
образца <40
Возможно,
установлены
некорректные параметры для
расчѐта.
Контаминация.
Проведите
мероприятия
по
очистке
оборудования
и
помещения от контаминантов.
Смените
реактивы.
Не
открывайте
пробирку
с
контрольным
образцом
до
приготовления
отрицательного
контроля и анализируемых проб.
Разведите ДНК в 10-1000 раз и
повторите анализ.
10
Хранение и стабильность
Набор может храниться до 6 месяцев без изменения
качественных характеристик при температуре -20°С.
Служба технической поддержки
В случае появления вопросов обращайтесь в службу
технической поддержки: technic@fractalbio.com.
Информация для заказов
Наименование
Кат.номер
Набор для выявления ДНК жвачных
животных (на 50 реакций)
Набор для выявления ДНК жвачных
животных (на 100 реакций)
Набор «ФБиоНуклео» для выделения
нуклеиновых кислот из
биологического материала (на 4
выделения)
Набор «ФБиоНуклео» для выделения
нуклеиновых кислот из
биологического материала (на 50
выделений)
11
Вир-17-50
Вир-17-100
НК-1-4
НК-1-50
Для заметок
12
Для заметок
13
Произведено: ООО “Фрактал Био”, 190020, г. СанктПетербург, ул. Бумажная, д. 17
сайт: fractalbio.com
E-mail: info@fractalbio.com
Контактный телефон/факс: (812) 495-96-95
Дата изготовления:
14
15